專(zhuān)利名稱(chēng)：用于測(cè)量血流速度的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用光掃描顯微鏡測(cè)量微觀物體在流體例如血流中移動(dòng)的速度的方法。
該方法特別地、但是不惟一地被應(yīng)用于微循環(huán)研究，在該研究中，困難在于檢測(cè)顆粒如移動(dòng)的紅細(xì)胞或者白細(xì)胞，估計(jì)這些顆粒的移動(dòng)方向及其速度。
然而，本發(fā)明可被應(yīng)用于其他領(lǐng)域，如顯微流體學(xué)。
通常使用反映移動(dòng)中的物體的順序圖像，采用成像系統(tǒng)來(lái)估計(jì)該物體的移動(dòng)速度?；镜募僭O(shè)是，檢測(cè)系統(tǒng)的捕獲速度(acquisitionrate)使得物體從一張圖像緩慢移動(dòng)到下一張圖像。物體在圖像序列的在不同位置上的出現(xiàn)，使得可能借助于對(duì)探測(cè)系統(tǒng)的校正來(lái)確定后者的速度。
在J.Appl.Physiol.22(2)333-337，1967中出版的文章H.Wayland和RC.Johnson，“Red blood cell velocity measurement in microvessels bya two-slit photometric method”中描述了一種雙狹縫光度法，是已知的。通過(guò)雙狹縫光度法進(jìn)行測(cè)量可能是用于自動(dòng)測(cè)量血流速度的最古老方法。該方法測(cè)量紅細(xì)胞的速度，并優(yōu)選應(yīng)用于毛細(xì)血管和小靜脈中，血細(xì)胞在小靜脈中以單列縱隊(duì)、分離的或者小聚集體形式循環(huán)。使用兩個(gè)放置在顯示順序的屏幕上的裂縫，在視頻序列(videosequence)上進(jìn)行測(cè)量。這兩個(gè)裂縫是平行的，并且垂直于進(jìn)行測(cè)量的血管。發(fā)光二極管與兩個(gè)裂縫中的每一個(gè)相對(duì)放置。所用的設(shè)備提供了兩種測(cè)量方法。在第一種方法中，兩個(gè)裂縫相隔45-70μm(在組織上處于相等的距離)。通過(guò)計(jì)算源自發(fā)光二極管的兩個(gè)信號(hào)的相關(guān)度來(lái)測(cè)量速度。在第二種測(cè)量方法中，兩個(gè)裂縫十分靠近7.4μm的相等的組織距離，即稍微小于紅細(xì)胞平均直徑的距離。結(jié)果，分別由上、下游二極管發(fā)出的兩個(gè)連續(xù)信號(hào)是由同一個(gè)血細(xì)胞產(chǎn)生的，因此可能計(jì)算該血細(xì)胞的速度。然而，該方法的局限在于需要在極細(xì)的血管中進(jìn)行測(cè)量，以便將觀察限制在一個(gè)紅細(xì)胞上，所測(cè)量的速度是每秒30張圖像的圖像頻率的結(jié)果，它不能超過(guò)2mm/s。
時(shí)空投影方法(“線移圖”)也是已知的。該方法是前一種方法的延伸。不必在兩個(gè)點(diǎn)上對(duì)信號(hào)采樣，使用者可以選擇一個(gè)感興趣的區(qū)域，即標(biāo)記在血管中的矩形。在每張圖像中，根據(jù)血管軸線的各個(gè)點(diǎn)上的血管寬度，計(jì)算灰度的平均值，將感興趣的區(qū)域的信號(hào)線性投射到血管的軸線的一個(gè)方向上。然后，垂直排列所捕獲的每張圖像的一維信號(hào)，以生成一個(gè)顯示血細(xì)胞軌跡的時(shí)空?qǐng)D像。將相鄰的信號(hào)關(guān)聯(lián)來(lái)估計(jì)速度。這種方法被用于CapImage和Capiscop軟件程序中，以及Cytoscan捕獲設(shè)備中。這種方法特別地被描述在出版在NatureMedictine，51209-1213，1999的文章W.Groner，I.W.Winkelaman，A.G.Harris，G..Inde，G.I.Bouma，K.Kessmer和R.G.Nadeau，“Orthogonal Polarization Spectral ImagineA new method for study ofmicrocirculation.”。主要的局限在于由于圖像頻率(如果可選擇地在兩個(gè)視頻流的交錯(cuò)視野中進(jìn)行測(cè)量，圖像頻率為25張圖像/秒或者50張圖像/秒)，所測(cè)量的速度范圍不能超過(guò)2mm/s。
SLO(掃描激光檢眼鏡)是一種原理基于非光纖共焦顯微鏡的設(shè)備。以每秒50張交錯(cuò)圖像的速度捕獲圖像。該設(shè)備所用的測(cè)量速度的方法基于細(xì)胞監(jiān)測(cè)。同一張圖像是由對(duì)應(yīng)于兩個(gè)間隔20秒的瞬時(shí)的交錯(cuò)場(chǎng)構(gòu)成，因此移動(dòng)中的血細(xì)胞出現(xiàn)在圖像上的兩個(gè)不同位置上，一次位于偶數(shù)行，而另一次位于奇數(shù)行。一旦定位了該血細(xì)胞的兩種圖像，可立即測(cè)量速度.該設(shè)備的寬視野(最高達(dá)到1200μm)，使得可能測(cè)量幾cm/s的速度。這種設(shè)備的局限主要是由于對(duì)血細(xì)胞的監(jiān)測(cè)；要求所標(biāo)記的血細(xì)胞尺寸大(白細(xì)胞為12μm)并且數(shù)量少。這種方法似乎不能被應(yīng)用于測(cè)量紅細(xì)胞的速度，紅細(xì)胞的尺寸較小(7-8μm)處于遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高的濃度下(比白細(xì)胞濃度高1000倍)，并且更難標(biāo)記。
另一種通常與Cytoscan或者SLO結(jié)合使用的測(cè)量方法是通過(guò)多普勒效應(yīng)測(cè)量紅細(xì)胞的速度。多普勒效應(yīng)描述相對(duì)于觀察者移動(dòng)的物體所反射的光波所經(jīng)歷的頻移。對(duì)于血流來(lái)說(shuō)，移動(dòng)的物體是紅細(xì)胞。給定波長(zhǎng)的單頻波(例如激光)沿著血管被發(fā)送。通過(guò)多普勒效應(yīng)測(cè)量速度具有快速和精確的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)所用的材料和分析軟件，最大可測(cè)量速度在1mm/s到數(shù)mm/s之間變化。多普勒效應(yīng)的缺點(diǎn)在于難以精確地確定要測(cè)量速度的區(qū)域，特別是深度方面。被反射的光可來(lái)源于不同的血管，血細(xì)胞在這些血管中以不同速度循環(huán)。
時(shí)空分析方法也是已知的。這種用于測(cè)量白細(xì)胞速度的方法在Yoshinobu Sato等人，“Measuring microcirculation usingspatiotemporal image analysis”，CVRMed，302-308，1995中被描述。這種分析方法包括三個(gè)主要步驟i)首先，通過(guò)在序列框架的像素的時(shí)間變量的柱形圖上進(jìn)行區(qū)段化，來(lái)從圖像中提取血管。ii)然后，由連續(xù)的血管圖像構(gòu)建時(shí)空?qǐng)D像。如果每張順序圖像被沿著血管的軸線或者輪廓投射，該圖像可以是三維的或者平面的。iii)然后，通過(guò)在所選方向上應(yīng)用濾波器組(例如Gabor濾波器組)加強(qiáng)由白細(xì)胞移動(dòng)留在時(shí)空?qǐng)D像中的軌跡。通過(guò)設(shè)立最佳響應(yīng)的閾值，來(lái)提取軌跡。最后步驟包括將軌跡連接在一起，來(lái)重新構(gòu)建白細(xì)胞的完整軌跡。捕獲這些軌跡使得可能通過(guò)計(jì)算出其正切值，以達(dá)到估計(jì)白細(xì)胞在其軌跡上的速度的目的。
在時(shí)空分析領(lǐng)域還已知的有文章-“Two-photon imaging of neocortical microcirculation.”D.Kleinfeld和W.Denk；In Imaging NeuronsA Laboratory Manual(R.Yuste，F(xiàn).Lanni和A.Konnerth編輯)，1999，Cold Spring HarborLaboratary Press，NY，23.1-23.15；可以從如下網(wǎng)址獲得http//physics.ucsd.edu/neurophysies/publieations/kleinfeld_denk_cshl_2003.pdf；和“Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulbglomeruli”E.Chaigneau等人，PNAS，2003年10月28日；100(22)13081-13086；可以從如下網(wǎng)址獲得http//www.pnas.org/cgi/content/full/100/22/13081。
這些文章描述了一種測(cè)量速度的方法，通過(guò)使用非光纖顯微鏡，沿著血管的軸線進(jìn)行幾個(gè)連續(xù)的掃描。從而在不同的連續(xù)瞬間，從相同區(qū)段中捕獲幾張“一維”圖像。將這些圖像首尾連接放置，形成全面顯像，其縱座標(biāo)是時(shí)間軸。顆粒在血管中的移動(dòng)以斜線(obliqueband)形式顯示。通過(guò)計(jì)算全面顯像上各條線的斜率，來(lái)確定各點(diǎn)的速度。但是，該方法的缺陷在于，事實(shí)上將捕獲裝置與血管軸線平行放置是必要的。而且，為了構(gòu)建全面顯像，有必要從相同區(qū)段捕獲數(shù)張圖像。
在大部分剛介紹的技術(shù)中，速度測(cè)量基于對(duì)至少兩張連續(xù)的捕獲圖像的分析；這額外地造成圖像混亂和進(jìn)行圖像對(duì)應(yīng)的問(wèn)題。結(jié)果，通過(guò)這些方法測(cè)量的速度范圍取決于視野以及圖像頻率。對(duì)于具有小視野，如166μm×118μm量級(jí)的視野和低的捕獲速度，例如每秒12張圖像量級(jí)的速度的掃描成像系統(tǒng)，以超過(guò)1.8mm/s的速度移動(dòng)的顆粒將會(huì)穿過(guò)兩張連續(xù)圖像之間的觀察視野，這使得不可能使用大部分前面提及的方法。
本發(fā)明的目的在于通過(guò)提供一種方法克服了前面提及的缺陷，該方法特別可用于測(cè)量紅細(xì)胞的速度。
本發(fā)明的目標(biāo)在于借助于掃描成像系統(tǒng)來(lái)測(cè)量快速移動(dòng)的顆粒的速度?？焖僖苿?dòng)是指速度超過(guò)約2mm/s。
用一種方法實(shí)現(xiàn)期望的目標(biāo)，該方法使用光掃描顯微鏡測(cè)量微觀物體的速度，如紅細(xì)胞和白細(xì)胞在流體如血流中移動(dòng)的速度。按照本發(fā)明，該方法包括如下步驟-通過(guò)在含有所述物體的平面的x軸和y軸方向進(jìn)行光掃描來(lái)捕獲圖像，該平面也被稱(chēng)作為位于深入樣本或者生物組織幾μm處的表面下的圖像場(chǎng)；-在捕獲所述圖像的過(guò)程中，在平面(x，y)中檢測(cè)由所述物體移動(dòng)產(chǎn)生的脊線(ridge)；-確定平面(x，y)中的所述脊線的斜率；-從如此確定的斜率估計(jì)所述物體的速度Vg。
可以以光纖或者非光纖的模式，使用共焦或者非共焦的光掃描顯微鏡，特別是激光掃描。為了實(shí)施非光纖的實(shí)施方案，通過(guò)適應(yīng)處理電子學(xué)，可以使用SLO型設(shè)備或者任何其他(x，y)掃描圖像捕獲設(shè)備，該設(shè)備的掃描速度適合于實(shí)施按照本發(fā)明的方法。
除了上述內(nèi)容外，可能以非限制性方式將光纖，特別是單光纖的、激光的、共焦的或者非共焦的顯微鏡與遠(yuǎn)端掃描一起使用?？梢酝ㄟ^(guò)微鏡(micromirror)，通過(guò)移動(dòng)透鏡或者光學(xué)儀器，通過(guò)光譜掃描，來(lái)實(shí)現(xiàn)這種遠(yuǎn)端掃描。還有可能使用可近端掃描的單光纖系統(tǒng)，其中通過(guò)偏移靠近所觀察的物體的光學(xué)頭中的光纖的一端來(lái)進(jìn)行光掃描。
在Kleinfeld和Chaigneau的時(shí)空分析方法中，一系列“一維”圖像是從血管軸線的相同區(qū)域中捕獲的，與此相反，在本發(fā)明中，可能使用通過(guò)二維平面掃描捕獲的單一圖像。
在現(xiàn)有技術(shù)中，在時(shí)空?qǐng)D像上計(jì)算脊線(t＝f(x))，與此相反，本發(fā)明中的脊線是完全不同的，因?yàn)槠鋸钠矫鎴D像捕獲(y＝f(x))，時(shí)間概念通過(guò)“Z”方向上的點(diǎn)掃描系統(tǒng)而在該點(diǎn)引起的。有利地使用形態(tài)學(xué)圖像。例如，在現(xiàn)有技術(shù)的Yoshinobu Sato文獻(xiàn)中，為了捕獲脊線，生成數(shù)張圖像，從各張圖像中提取單一的一條線，從而產(chǎn)生最終圖像t＝f(x)。
掃描成像系統(tǒng)是一種其中在圖像的產(chǎn)生時(shí)間過(guò)程中(渡越時(shí)間的框架)觀察移動(dòng)中的物體的系統(tǒng)，使用該系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致脊線出現(xiàn)，使得可能從單一圖像估計(jì)移動(dòng)物體的速度。因而，這些脊線來(lái)源于移動(dòng)物體與掃描系統(tǒng)之間的相互作用。本發(fā)明是特別顯著的，因?yàn)檫@些脊線通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為是從掃描成像系統(tǒng)中估計(jì)的干涉。因此，在激光掃描顯微鏡中，特別是在光纖模型中，使用被認(rèn)為是偏差(aberration)的元件。為了該目的，本發(fā)明包括檢測(cè)脊線的步驟，其中實(shí)施如下步驟-應(yīng)用濾波器來(lái)增強(qiáng)一組圖像的脊線；-應(yīng)用一種閾值以保留最顯著的脊線；-將一條直線或者橢圓擬合到這些脊線的每一條上；和-鑒定所述脊線。
按照本發(fā)明，給出掃描速度和所觀察的物體的數(shù)量級(jí)，可能簡(jiǎn)化光點(diǎn)軌跡的模型。第一種簡(jiǎn)化包括將光點(diǎn)軌跡視為水平位于捕獲窗口上。光點(diǎn)的水平速度與垂直速度之間的1000倍的比例證實(shí)這種簡(jiǎn)化，計(jì)算結(jié)果驗(yàn)證了光點(diǎn)的垂直位置在捕獲窗口上的改變少于0.1μm。
第二個(gè)近似在于將光點(diǎn)水平覆蓋捕獲窗口所需的時(shí)間看作是可忽略的，即物體在掃描線的路徑上被視為是固定不動(dòng)的。所觀察的物體的速度(在所考慮的血管中，紅細(xì)胞的速度小于20nm/s)相對(duì)于光點(diǎn)的水平速度(＞1m/s)證實(shí)了這種近似。
最后，采用空間上相隔一定距離Vy/fx的瞬時(shí)水平掃描線將掃描模型化，fx是“x”掃描的頻率。
一旦模型化了掃描，必須模型化移動(dòng)物體，如紅細(xì)胞。觀察數(shù)個(gè)模型來(lái)描述紅細(xì)胞；從簡(jiǎn)單的棒狀(rod)到理想的三維模型。
能夠考慮到所觀察的變形的最簡(jiǎn)單模型包括用垂直棒表示的紅細(xì)胞。在使用這種模型的情形下，將所觀察到的脊線的角度α(相對(duì)于“x”軸)與掃描的垂直速度Vy以及血細(xì)胞的水平移動(dòng)速度Vgcos(θ)相聯(lián)系，捕獲簡(jiǎn)單的方程tanα=VyVgcos(θ)-----(1)]]>Vy是用于掃描的光點(diǎn)的垂直速度，Vg是被搜索的血細(xì)胞的速度，θ是矢量Vg與快速掃描的x軸之間的夾角。Tan(α)是脊線的斜率。
如果血細(xì)胞的軌跡被認(rèn)為是與運(yùn)載該物體的血管邊緣成線性的，有可能通過(guò)檢測(cè)血管邊緣來(lái)計(jì)算θ，從而得到血細(xì)胞的速度Vg。
在一般情形下，其中θ是未知的，但是脊線的長(zhǎng)度L是已知的，可以設(shè)想兩種可能1)已知血細(xì)胞的大小D。
在這種情形下，tv被視為血細(xì)胞的可見(jiàn)時(shí)間，它被定義為從軌跡的第一個(gè)交叉點(diǎn)到最后一個(gè)交叉點(diǎn)之間經(jīng)過(guò)的時(shí)間。血細(xì)胞具有垂直速度Vgcos(θ)和垂直伸展D。從而，將物體比作為垂直于流動(dòng)方向的棒，以足夠大的最終長(zhǎng)度伸展在數(shù)條水平掃描線上。光點(diǎn)是點(diǎn)狀的，具有垂直速度Vy，因而tv僅依賴(lài)于光點(diǎn)和血細(xì)胞的垂直速度方面的差異，以及具有根據(jù)以下方程的Dtv=D|Vy-Vgsinθ|-------(2)]]>觀察到的脊線的垂直伸展L|sin(α)|和水平伸展L|cos(α)|通過(guò)如下方程直接與tv和光點(diǎn)的垂直速度以及血細(xì)胞的水平速度相聯(lián)系L|sin(α)|＝tv|Vy|(3)L|cos(α)|＝tvVg|cos(θ)|方程2和3使得可以得出如下方程L=D|Vy-Vgsinθ|Vy2+Vg2cos2θ------(4)]]>
與方程(1)結(jié)合，生成具有兩個(gè)未知數(shù)θ和Vy的兩個(gè)方程的體系。必須根據(jù)Vy-Vgsin(θ)來(lái)求解，即依據(jù)光點(diǎn)垂直移動(dòng)是否比血細(xì)胞快或慢。
在兩個(gè)速度相等的情況下，可見(jiàn)時(shí)間變得無(wú)限長(zhǎng)，而脊線也變得無(wú)限長(zhǎng)。就有Vgsin(θ)＝Vy，替換到方程(1)中，這意味著tan(α)＝tan(θ)。結(jié)果，脊線恰好就是血細(xì)胞的軌跡，速度Vg由下列給出Vg=|Vysina|----------(5)]]>如果光點(diǎn)垂直移動(dòng)快于血細(xì)胞(Vy＞Vgsin(θ))，求解系統(tǒng)(3)給出如下tanθ=tanα-DLcosα---------(6)]]>Vg=|Vy|(1-DLsinα)2+1tan2α]]>如果光點(diǎn)垂直移動(dòng)慢于血細(xì)胞(Vy＜Vgsin(θ))，求解系統(tǒng)(3)給出如下tanθ=tanα+DLcosα--------(7)]]>Vg=|Vy|(1+DLsinα)2+1tan2α]]>2)當(dāng)可以利用反向掃描時(shí)如果有另一種掃描方法可以利用，其相對(duì)于前一種掃描方法是反方向的，即具有垂直速度為-Vy，觀察到具有角度-α和長(zhǎng)度L’的脊線。L’由下列給出L′=D|-Vy-Vgsinθ|Vy2+Vg2cos2θ---------(8)]]>
方程(4)和(8)之間的比例使得可以得出如下方程LL′=|Vy+Vgsinθ||Vy-Vgsinθ|---------(9)]]>然后必須區(qū)別兩種情況|Vy|＞|Vgsin(θ)|和|Vy|＜|Vgsin(θ)|，(如果|Vy|＝|Vgsin(θ)|，則使用方程(5))。
如果|Vy|＞|Vgsin(θ)|，則得出解tanθ=tanaL-L′L+L′--------(10)]]>Vg=|Vy|(L-L′L+L′)2+1tan2α]]>如果|Vy|＜|Vgsin(θ)|，則得出解tanθ=tanaL+L′L-L′--------(11)]]>Vg=|Vy|(L+L′L-L′)2+1tan2α]]>在上面的所有方程中，物體如紅細(xì)胞被比作為具有長(zhǎng)度D的垂直棒。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，可以用更加理想的球形(或者圓盤(pán)形)或者橢圓形或者甚至更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)來(lái)替換這種假設(shè)，評(píng)價(jià)在這種情形下觀察到的狀態(tài)與在簡(jiǎn)單情形下觀察到的狀態(tài)間的差異。這種差異是否應(yīng)當(dāng)被考慮將取決于要求的精確度。
作為例子，可將紅細(xì)胞表示為固體球體或者具有軸向?qū)ΨQ(chēng)的雙面凹狀的形式。在這兩種情形下，在觀察平面上的正交投影被比作為具有半徑R的圓盤(pán)。在捕獲的圖像中，該移動(dòng)圓盤(pán)顯示為一個(gè)橢圓，脊線與“x”軸之間的圖像的夾角α為
tan(2α)=2cos(θ)VgVy-2sin(θ)-------(12)]]>主軸的長(zhǎng)度為L(zhǎng)=2R2Vr2-2Vrsin(θ)+2-|Vr|Vr2-4Vrsin(θ)+4-------(13)]]>考慮到Vr=VgVy]]>和圓盤(pán)半徑R。
用更為復(fù)雜的描繪紅細(xì)胞的模型(圓環(huán)形表面)進(jìn)行數(shù)字模擬，顯示圓盤(pán)模型足以代表紅細(xì)胞。
如果紅細(xì)胞軌跡的方向θ是未知的，但是可以捕獲脊線的長(zhǎng)度L，有可能部分地計(jì)算速度信息。方程(12)和(13)形成了聯(lián)系對(duì)(α，L)的系統(tǒng)，對(duì)(α，L)是在捕獲被求解的參數(shù)對(duì)(θ，Vg)的過(guò)程中觀察到的參數(shù)。
按照本發(fā)明的另一個(gè)特征，提供具有光纖模式的光掃描的共焦顯微鏡，用于測(cè)量在流體如血流中移動(dòng)的微觀物體的速度，該系統(tǒng)包括-用于通過(guò)對(duì)含有所述物體的平面進(jìn)行x和y光掃描而捕獲圖像的裝置；-用于在捕獲所述圖像的過(guò)程中檢測(cè)由所述物體移動(dòng)產(chǎn)生的脊線的裝置；-用于確定所述脊線的斜率的裝置；和-用于從如此確定的斜率中估計(jì)所述物體的速度Vg的裝置。
在考察無(wú)論如何不具有限制性的具體實(shí)施方式
和如下附圖的詳細(xì)描述后，本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和特征將是顯然的-

圖1是實(shí)施按照本發(fā)明的方法的一個(gè)光纖共焦成像系統(tǒng)例子的總略圖；-圖2是舉例說(shuō)明圖1的成像系統(tǒng)的掃描方法的簡(jiǎn)化圖；-圖3是描繪脊線的概略圖，該圖像來(lái)源于一次同時(shí)捕獲；和-圖4是選擇脊線的步驟的概略圖。
盡管本發(fā)明不限于此，但是現(xiàn)在將描述在具有光纖模式的激光掃描的共焦顯微鏡中實(shí)施按照本發(fā)明的方法，該方法被應(yīng)用于微循環(huán)領(lǐng)域，其數(shù)量級(jí)如下-細(xì)動(dòng)脈的直徑在50-100μm之間變化；毛細(xì)血管更細(xì)，直徑為3-8μm；最后，小靜脈的直徑為30-50μm；-這些血管中的紅細(xì)胞的速度被包括在一定范圍內(nèi)，從最細(xì)的血管的速度為低于1mm/s到細(xì)動(dòng)脈的幾十mm/s；-紅細(xì)胞是平均直徑約7μm的細(xì)胞，而白細(xì)胞的直徑為10-15μm。
在一般情況下，為了實(shí)施本發(fā)明，在文獻(xiàn)WO2004/008952A1“Method and equipment for fibre optic high-resolution，in particularconfocal，fluorescence imaging”，Mauna Kea Technologies中描述的系統(tǒng)被用作基礎(chǔ)，在該文獻(xiàn)中，使用圖像向?qū)?，圖像向?qū)в蓴?shù)千條光纖組成，激發(fā)信號(hào)依次被光源發(fā)射、被偏轉(zhuǎn)和投射到所述向?qū)У墓饫w之一中，在光纖出口處的組織的各個(gè)激發(fā)點(diǎn)反過(guò)來(lái)發(fā)射熒光信號(hào)，由所述光纖收集，然后被檢測(cè)并數(shù)字化而形成圖像元素。根據(jù)第一個(gè)方面，在文獻(xiàn)WO2004/008952A1中描述的方法在光纖出口處聚焦的光束而激發(fā)表面下的平面，產(chǎn)生共焦圖像。按照第二個(gè)方面，該方法在光纖輸出口處產(chǎn)生發(fā)散光束，該發(fā)散光束能夠激發(fā)表面上的微小體積的組織。該激發(fā)信號(hào)以對(duì)應(yīng)于每秒捕獲許多圖像的足以用于實(shí)時(shí)應(yīng)用的速度發(fā)生偏轉(zhuǎn)，并且對(duì)應(yīng)于用于逐一對(duì)光纖取樣的最小頻率的檢測(cè)頻率檢測(cè)熒光信號(hào)。
圖1顯示構(gòu)成圖像向?qū)?的撓性光纖的相干光束，在該向?qū)У慕司哂泄庠?和光纖注入系統(tǒng)，使得光纖逐一被照亮，在其遠(yuǎn)距端具有光學(xué)頭3，使得離開(kāi)被照亮的光纖的光束被聚焦到位于所觀察物體4的一定深度的點(diǎn)上。注入系統(tǒng)包括多個(gè)光學(xué)元件5，其前面是光纖掃描系統(tǒng)6，例如偏轉(zhuǎn)單元，使得可以以非常高的速度逐一掃描光纖。各條光纖依次被用于傳遞光束以及來(lái)源于觀察物體的相應(yīng)返回光束。通過(guò)將激光束聚焦到一個(gè)點(diǎn)上以及通過(guò)由用于照明的相同光纖觀察的物體的空間濾波器的內(nèi)在共焦特性，捕獲空間分辨率。這使得可能使用光電探測(cè)器9來(lái)專(zhuān)一性地接收來(lái)源于所觀察物體的信號(hào)，從而逐點(diǎn)產(chǎn)生圖像。
圖像向?qū)?由大量的撓性光纖構(gòu)成，例如由30000根直徑為2μm并且間隔3.3μm的光纖構(gòu)成。在實(shí)踐中，可能使用圖像向?qū)е械乃泄饫w，或者選擇這些光纖的一小組，例如位于中心的光纖。
電子計(jì)算裝置7用于控制、分析和數(shù)字化處理所檢測(cè)的信號(hào)，特別用于顯示包括如下的插件-同步插件8，其功能為-以同步化方式控制掃描；-用于在任何時(shí)候及時(shí)探知激光點(diǎn)的位置，從而掃描；和-用于借助本身可被控制的微控制器管理其他插件；-探測(cè)器插件9，其包括特別實(shí)施阻抗匹配的模擬電路、模擬-數(shù)字化變換器、使信號(hào)定形的程序化邏輯元件(例如FPGA電路)。
-數(shù)字化捕獲插件10，其以可變頻率處理數(shù)字化數(shù)據(jù)流，并顯示在屏幕11上；-制圖插件12。
作為一種變化形式，可以使用組合了這些不同插件的功能的單個(gè)插件。
這些電子和計(jì)算機(jī)裝置7能夠?qū)嵤┌凑毡景l(fā)明的方法的步驟，可以以裝配了計(jì)算紅細(xì)胞速度所需的處理裝置的微型計(jì)算機(jī)形式呈現(xiàn)。
圖2是舉例說(shuō)明圖1的成像系統(tǒng)的掃描方法的簡(jiǎn)化圖。掃描激光點(diǎn)用虛線13表示，該虛線描述了長(zhǎng)方形掃描窗口14中的傳統(tǒng)掃描軌跡。激光點(diǎn)13的軌跡是一個(gè)從上到下的“Z”形。與沿著軸Ay的垂直速度Vy相比，沿著水平軸Ax的水平速度Vx非常大。該假設(shè)包括忽略兩次水平掃描之間的時(shí)間，在這期間，光點(diǎn)開(kāi)始趕上血細(xì)胞。它也是在偶數(shù)行上觀察到的結(jié)果與在奇數(shù)行上觀察到的結(jié)果的組合。作為例子，速度Vy可以為3mm/s，而速度Vx可以為5mm/s。
在圖2中，在掃描窗口14內(nèi)，還以橫剖面表示了圖像向?qū)?。光纖被以相干圓圈的形式表示。圖像化區(qū)域15僅對(duì)應(yīng)于位于長(zhǎng)方形中的有限量的光纖。激光束被連續(xù)注入到各個(gè)光纖中。圖3中表示的圖像模擬一次捕獲，即各條光纖僅被注入一次。這些圖像顯示對(duì)應(yīng)于掃描系統(tǒng)與移動(dòng)顆粒之間的相互作用的傾斜的脊線。
這些脊線的外觀可用紅細(xì)胞的圖像與圖像形成機(jī)制之間的相互作用來(lái)解釋。激光點(diǎn)執(zhí)行按照Z(yǔ)形軌跡的掃描，在一組激光位置上，例如在640條線上進(jìn)行測(cè)量，每條線進(jìn)行896次測(cè)量。移動(dòng)的紅細(xì)胞將在確定位置上與一條掃描線相交。在后面的線上，該血細(xì)胞還會(huì)相交，但是其已經(jīng)相對(duì)于先前那條線發(fā)生移動(dòng)。只要存在掃描線與血細(xì)胞相交，這種現(xiàn)象將持續(xù)。然后，這種現(xiàn)象產(chǎn)生一條脊線，該脊線的斜率為紅細(xì)胞的速度的函數(shù)。
在圖4中，在捕獲一張圖像后，顯示出脊線。設(shè)立一個(gè)閾值使得可能僅保留最顯著的脊線。然后，用一個(gè)橢圓擬合(frame)各條脊線，以便確定一個(gè)斜率。然后，電子計(jì)算裝置7確定各條脊線的斜率，以計(jì)算各個(gè)紅細(xì)胞的速度。
因此，本發(fā)明使得可能從單一圖像中確定速度。這使得可能特別能夠避免在圖像坐標(biāo)化過(guò)程中的圖像混亂的問(wèn)題。這有利于挑選出相對(duì)于視野的高速度，以及提高捕獲頻率。作為例子，一個(gè)11Hz的圖像捕獲系統(tǒng)使得可能挑選出5-25mm/s量級(jí)的速度，即采用絕大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)不可能估計(jì)的速度。
優(yōu)選地，測(cè)量血細(xì)胞的速度，該血細(xì)胞的垂直移動(dòng)未到達(dá)光點(diǎn)。通常，軌跡的角度必須位于水平角和垂直角之間，在該垂直角上，血細(xì)胞的垂直速度變得與光點(diǎn)的速度相等。
當(dāng)然，本發(fā)明不限于剛剛描述的實(shí)施例，可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行許多調(diào)整而不超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。特別地，可設(shè)想在多條脊線或者數(shù)張圖像上進(jìn)行測(cè)量來(lái)提高精確度。
權(quán)利要求
1.用光掃描顯微鏡測(cè)量微觀物體在流體如血流中移動(dòng)的速度的方法，該方法包括如下步驟-通過(guò)對(duì)含有所述物體的平面進(jìn)行x軸和y軸方向光掃描而捕獲圖像；-在捕獲所述圖像的過(guò)程中，在平面(x，y)中檢測(cè)由所述物體的移動(dòng)產(chǎn)生的脊線；-確定平面(x，y)中的所述脊線的斜率；和-從如此確定的斜率估計(jì)所述物體的速度Vg。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于檢測(cè)所述脊線的步驟包括如下步驟-應(yīng)用濾波器來(lái)增強(qiáng)一組圖像的脊線；-應(yīng)用一種閾值以保留最顯著的脊線；-將一條直線或者橢圓擬合到這些脊線的每一條上；和-鑒定所述脊線。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述物體的速度Vg通過(guò)如下方程給出Vg*cos(θ)＝Vy/tan(α)，Vy是用于掃描的光點(diǎn)的垂直速度，而“α”是水平軸“x”與脊線之間的夾角。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于通過(guò)檢測(cè)運(yùn)載該物體的血管的邊緣來(lái)捕獲角度θ。
5.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于為了捕獲角度θ，所述物體被比作為具有最終高度D的垂直棒，而角度θ是從如下方程中計(jì)算得到的L=D|Vy-Vgsinθ|Vy2+Vg2cos2θ]]>其中L是脊線的長(zhǎng)度。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其特征在于在Vg*sin(θ)＜Vy的情形下tanθ=tanα-DLcosα]]>Vg=|Vy|(1-DLsinα)2+1tan2α.]]>
7.按照權(quán)利要求5的方法，其特征在于在Vg*sin(θ)＞Vy的情形下tanθ=tanα+DLcosα]]>Vg=|Vy|(1+DLsinα)2+1tan2α.]]>
8.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于第二張圖像是從同一平面但是沿反向掃描捕獲的，并使用如下方程L′=D|-Vy-Vgsinθ|Vy2+Vg2cos2θ]]>其中L’是在反向掃描過(guò)程中的脊線的長(zhǎng)度。
9.按照權(quán)利要求8和5的方法，其特征在于當(dāng)|Vg*sin(θ)|＜|Vy|時(shí)tanθ=tanaL-L′L+L′]]>Vg=|Vy|(L-L′L+L′)2+1tan2α]]>其中L是沿第一掃描方向的脊線的長(zhǎng)度，而L’是在反向掃描過(guò)程中的脊線的長(zhǎng)度。
10.按照權(quán)利要求5和8的方法，其特征在于當(dāng)|Vg*sin(θ)|＞|Vy|時(shí)tanθ=tanaL+L′L-L′]]>Vg=|Vy|(L+L′L-L′)2+1tan2α.]]>
11.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于當(dāng)Vg*sin(θ)＝Vy時(shí)，為了確定Vg和θ，還使用如下方程Vg=|Vysinα|.]]>
12按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于當(dāng)所述物體是紅細(xì)胞時(shí)，它在所捕獲的圖像上的形式被比作為具有半徑R的橢圓，脊線與“x”軸之間的圖像的角度α由如下給出tan(2α)=2cos(θ)VgVy-2sin(θ)]]>而主軸的長(zhǎng)度由如下給出L=2R2Vr2-2Vrsin(θ)+2-|Vr|Vr2-4Vrsin(θ)+4]]>和Vr=VgVy.]]>
13.按照先前權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)的方法，其特征在于使用共焦顯微鏡。
14.按照先前權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)的方法，其特征在于使用光纖模式的光掃描顯微鏡。
15.按照權(quán)利要求1-13中的任何一項(xiàng)的方法，其特征在于使用非光纖的光掃描顯微鏡。
16.用于微觀物體在測(cè)量流體如血流中的移動(dòng)速度的光掃描顯微鏡系統(tǒng)，該系統(tǒng)實(shí)施按照先前的權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)的方法；該系統(tǒng)包括-用于通過(guò)對(duì)含有所述物體的平面進(jìn)行x和y光掃描而捕獲圖像的裝置；-用于在捕獲所述圖像的過(guò)程中檢測(cè)平面(x，y)中由所述物體移動(dòng)產(chǎn)生的脊線的裝置；-用于確定平面(x，y)中所述脊線的斜率的裝置；和-用于從如此確定的斜率中估計(jì)所述物體的速度Vg的裝置。
17.按照權(quán)利要求16的系統(tǒng)，其特征在于在檢測(cè)脊線的過(guò)程中，該系統(tǒng)包括-用于通過(guò)應(yīng)用濾波器來(lái)增強(qiáng)一組圖像的脊線的裝置；-用于通過(guò)應(yīng)用一種閾值以保留最顯著的脊線的裝置；-用于將橢圓擬合到這些脊線中的每一條上的裝置；和-用于鑒定所述脊線的裝置。
18.按照權(quán)利要求16或17的系統(tǒng)，其特征在于使用共焦顯微鏡。
19.按照權(quán)利要求16-18的任何一項(xiàng)的系統(tǒng)，其特征在于使用光纖模式的光掃描顯微鏡。
20.按照權(quán)利要求16-18的任何一項(xiàng)的系統(tǒng)，特征在于使用非光纖的光掃描顯微鏡。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用光掃描顯微鏡測(cè)量顆粒在流體中移動(dòng)的速度的方法，顆粒例如是紅細(xì)胞，流體例如是血流。本發(fā)明方法包括如下步驟通過(guò)在含有所述物體的平面上進(jìn)行x和y光掃描而捕獲圖像；在平面(x，y)上檢測(cè)平面(x，y)上的標(biāo)記；由如此確定的斜率估計(jì)物體的速度v
文檔編號(hào)G01F1/00GK1957266SQ200580016237
公開(kāi)日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月2日
發(fā)明者F·拉科姆比, G·勒高阿爾赫, A·帕詹特, N·阿雅徹 申請(qǐng)人:莫納基技術(shù)公司