專利名稱：一種白花前胡總香豆素提取物及其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥提取物、其制備方法及其應(yīng)用，具體為一種白花前胡總香豆素提取物及其制備方法、以及其在制備治療高血壓藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高血壓病是當(dāng)今世界發(fā)病率最高的慢性病，也是死亡率和致殘率最高的疾病之一。在中國(guó)，每一小時(shí)就有120人死于高血壓引起的各種心腦血管疾病，每一小時(shí)就有600人因高血壓而致殘。它嚴(yán)重危害人體健康，影響生活質(zhì)量，臨床表現(xiàn)為頭痛，頭暈，頭脹，頸部扳住感，耳鳴、眼花、健忘、失眠，煩悶，乏力，四肢麻木，心悸等。它也是造成肢體偏癱、心力衰竭、腦梗塞、腦出血、腎衰竭的重要原因，臨床上因高血壓病發(fā)生致殘致死的病例屢見(jiàn)不鮮，故學(xué)者稱之謂“隱形殺手”，是全世界醫(yī)學(xué)界一重大難題。各國(guó)都在參與高血壓的研究與探索，也研制了不少治療高血壓的藥品，它們都有較好的近期療效，但治療上有針對(duì)性、局限性、片面性、有時(shí)需要同時(shí)使用幾種藥品、也只能起到控制血壓的作用，容易發(fā)生停藥反彈，更為嚴(yán)重的是毒副作用大。目前臨床上經(jīng)常使用的西藥長(zhǎng)期服用毒副作用較大，療效較差，且價(jià)格比較昂貴。例如利血平、降壓靈可引起鼻塞、四肢無(wú)力、精神疲倦、嗤睡、陽(yáng)痿、腹瀉、大量長(zhǎng)期服用會(huì)出現(xiàn)精神憂郁癥、震顫麻痹，還可誘發(fā)胃及十二指腸潰瘍出血；受體阻斷劑，如心得安，可誘發(fā)和患支氣管痙攣、降低肌肉收縮力和病人的運(yùn)動(dòng)耐力，同時(shí)增加血中的甘油三脂，加速動(dòng)脈硬化；腎上腺受體阻滯劑如派唑嗪可使患者出現(xiàn)疲乏心悸和惡心等。而中藥治療高血壓病，療效鞏固，長(zhǎng)期服用毒副作用小，已為臨床所重視。但目前存在的主要問(wèn)題在于其發(fā)揮作用較慢，質(zhì)量較難控制等，因此藥物的使用也受到一定的局限。與西藥相比，中醫(yī)藥治療高血壓療效確切，副作用小，這是西藥所不能比擬的優(yōu)勢(shì)。因此隨著高血壓患者的增多，尋找療效確切，使用方便的治療高血壓中藥新制劑是一項(xiàng)非常有意義的工作。
白花前胡(Peucedanum praeruptorum Dunn)，又名姨媽菜、羅鬼菜、水前胡、野芹菜等，為多年生草本植物，作為藥用始于宋代，其味苦、辛，性涼。前胡在民間有較多的應(yīng)用。我國(guó)古代醫(yī)藥學(xué)家對(duì)白花前胡的功用有詳細(xì)的闡述?！秳e錄》記載前胡“味苦，微寒，無(wú)毒，主療痰滿胸肋中痞，心腹結(jié)氣，風(fēng)頭痛”?！侗静菥V目》“清肺熱，化痰熱，散風(fēng)邪”[1]。我們經(jīng)過(guò)對(duì)前胡提取分離工藝的深入研究，提取得到有效部位，經(jīng)在臨床上應(yīng)用，取得較好效果。臨床證明，本發(fā)明的提取物使用劑量小，療效好，毒性低，質(zhì)量可控，是一種比較理想的中藥治療高血壓及左心室肥大的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種白花前胡總香豆素提取物，其藥效作用強(qiáng)，毒副作用小，安全范圍大，產(chǎn)品純度高，服用劑量較小，使用攜帶方便，質(zhì)量可控。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供該白花前胡總香豆素提取物的制備方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供該白花前胡總香豆素提取物在制備治療高血壓藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明第四個(gè)目的在于提供該白花前胡總香豆素提取物的質(zhì)量控制方法。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案。
一種白花前胡總香豆素提取物，按重量百分比計(jì)，含有白花前胡丙素50-95％；優(yōu)選含白花前胡丙素65-90％；更優(yōu)選白花前胡丙素70-85％。
前述白花前胡總香豆素提取物的制備方法，其步驟包括，將白花前胡根，粉碎成粗粉，乙醇加熱回流提取，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇至無(wú)醇味，得到的膏狀物加入蒸餾水拌散，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，濃縮成稠膏狀，加入石油醚，超聲20分鐘后靜置，析出沉淀，過(guò)濾，沉淀用石油醚洗滌至淺黃色，即得到所述的提取物；其中提取所用的乙醇的濃度優(yōu)選60-95％，優(yōu)選85％-95％，更優(yōu)選乙醇的濃度為95％；乙醇的用量?jī)?yōu)選8-10倍量；更優(yōu)選乙醇加熱回流提取3次，每次0.5-2小時(shí)，第一次加10倍量的乙醇，第二、三次各加8倍量的乙醇；乙酸乙酯的用量?jī)?yōu)選為1-3倍量；乙酸乙酯萃取次數(shù)優(yōu)選為3-5次；更優(yōu)選使用1倍量的乙酸乙酯萃取3次。
本發(fā)明的提取物可制成片劑、膠囊、滴丸、注射劑等所有藥學(xué)上可接受的劑型。
前述白花前胡總香豆素提取物在制備治療高血壓藥物中的應(yīng)用。
前述白花前胡總香豆素提取物的含量測(cè)定方法1.總香豆素的含量測(cè)定對(duì)照品溶液的配制取減壓干燥至恒重的白花前胡丙素標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。
供試品溶液的配制取本發(fā)明的提取物約10mg，置10ml量瓶中，加入甲醇約8ml，超聲處理30分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0ml至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。取處方量的空白輔料，按上述方法制備空白對(duì)照溶液。照分光光度法(附錄VB)，在323nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)定法取供試品溶液在323nm處測(cè)定吸收度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總香豆素含量，即得。
2.白花前胡丙素的含量測(cè)定照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VI D)測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙腈-水(25∶60∶15)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)323nm；流速1.0ml/min，柱溫35℃；理論塔板數(shù)按白花前胡丙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。
對(duì)照品溶液的制備 取減壓干燥至恒重的白花前胡丙素對(duì)照品10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品溶液。
供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1.0ml，置100ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
測(cè)定法 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。
基于有關(guān)白花前胡的古代醫(yī)家記述及現(xiàn)代藥理和臨床研究取得的試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期摸索研究，確證白花前胡治療高血壓病的有效部位，并提取分離得到本發(fā)明的白花前胡總香豆素提取物，用以治療高血壓。本發(fā)明解決了長(zhǎng)期以來(lái)存在的發(fā)揮作用較慢，質(zhì)量較難控制等中藥使用局限，本發(fā)明提取物的藥效學(xué)和藥理學(xué)深入系統(tǒng)研究表明，本發(fā)明提取物具有藥效作用強(qiáng)，毒副作用小，安全范圍大，以及產(chǎn)品純度高，服用劑量較小，質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)。以下就通過(guò)幾個(gè)方面的研究來(lái)說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)方案的有益效果。
一、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)本發(fā)明的提取物性狀淡黃色粉末。山東大學(xué)藥學(xué)院提供。使用時(shí)，根據(jù)大鼠劑量要求用0.5％羧甲基纖維素鈉制成混懸液。根據(jù)犬劑量要求用3ml 0.5％羧甲基纖維素鈉和生理鹽水配制成所需濃度的混懸液。
硝苯地平規(guī)格10mg/片。批號(hào)020411。山東省德州制藥廠。
馬來(lái)酸依那普利片10mg×16片。批號(hào)04092203。由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司提供。
氯化鈉注射液250ml/瓶，批號(hào)04092203。山東臨淄制藥廠提供。
3.動(dòng)物雄性Wistar大鼠120只，180±10g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字20001003。自發(fā)性高血壓大鼠50只，雌雄各半，200±10g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)，許可證編號(hào)SOXK京2000-0006。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，測(cè)量各鼠血壓。雜種犬20只，體重11.58±1.23kg，雌雄兼用，購(gòu)自濟(jì)南郊區(qū)。實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)1周，擇其正常、健康、雌性無(wú)孕者供試驗(yàn)用。
4.儀器大鼠尾套法血壓計(jì)，型號(hào)GB4727-44。湖南醫(yī)科大學(xué)心血管生理研究室提供。
BioPAC多導(dǎo)生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)，美國(guó)BioPAC公司。
CBI激光多普勒血流計(jì)，美國(guó)CBI公司。
DGD-300C-2醫(yī)用電腦高頻電刀，北京貝林電子有限公司5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室條件濕度40-70％，溫度20-24℃，合格證號(hào)魯動(dòng)環(huán)字H2002120672。籠具蘇州新區(qū)楓橋凈化設(shè)備廠，許可證號(hào)SCXK(蘇)2002-0034。塊狀鼠飼料山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。魯動(dòng)飼字200001001。
6.方法6.1本發(fā)明提取物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響將自發(fā)性高血壓大鼠按血壓、體重均衡的原則分為五組，即本發(fā)明提取物大劑量組50.0mg/kg、中劑量組25.0mg/kg、小劑量組12.5mg/kg、陽(yáng)性藥硝苯地平組20mg/kg、模型對(duì)照組。每組10只。灌胃給藥。給藥體積為1ml/200g。模型對(duì)照組給予等體積的0.5％羧甲基纖維素鈉。動(dòng)物在清醒非麻醉及保溫狀態(tài)下，用大鼠尾套法血壓計(jì)測(cè)量血壓，連續(xù)測(cè)量3～4次取平均值。每天灌胃一次，分別于給藥第5、10、15、20、30天同法測(cè)量血壓。
6.2本發(fā)明提取物對(duì)腎型高血壓大鼠血壓的影響雄性Wistar大鼠，在1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下，右側(cè)臥位，在肋緣下1cm處逐層打開(kāi)腹壁，游離左腎動(dòng)脈，將直徑0.20mm的銀夾夾住腎動(dòng)脈，使其產(chǎn)生部分狹窄，右腎不作處理。假手術(shù)組的大鼠，除不鉗夾左腎動(dòng)脈外，手術(shù)步驟同上。術(shù)后大鼠均給予抗生素4天預(yù)防感染。術(shù)后4周血壓趨于穩(wěn)定，測(cè)定血壓3～4次，取其平均值，選收縮壓在150mmHg以上者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物分組和給藥劑量、方法及測(cè)量方法同6.1。
6.3本發(fā)明提取物逆轉(zhuǎn)腎型高血壓大鼠左心室肥厚試驗(yàn)?zāi)I型高血壓動(dòng)物模型的建立同6.2。參照文獻(xiàn)，腎型高血壓大鼠術(shù)后8周可形成明顯的左室肥厚，據(jù)此，我們擬定術(shù)后9周開(kāi)始給藥觀察供試品的逆轉(zhuǎn)左室肥厚作用。將已造模動(dòng)物按血壓、體重均衡的原則分為六組，本發(fā)明提取物大劑量組50.0mg/kg、中劑量組25.0mg/kg、小劑量組12.5.0mg/kg、陽(yáng)性藥依那普利片組10mg/kg、模型對(duì)照組、假手術(shù)組。灌胃給藥。給藥體積為1ml/200g。假手術(shù)組、模型對(duì)照組均給予等體積的0.5％羧甲基纖維素鈉。連續(xù)給藥9周，分別測(cè)量給藥前和給藥9周后血壓。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即處死動(dòng)物，開(kāi)胸，迅速取出心臟，用4℃生理鹽水沖洗，去掉心房、右心室及其他組織，稱左心室重量，計(jì)算左室指數(shù)，同時(shí)進(jìn)行心肌組織病理學(xué)檢查。
6.4本發(fā)明提取物對(duì)麻醉犬血流動(dòng)力學(xué)的影響將正常健康犬20只隨機(jī)分為4組，即本發(fā)明提取物大劑量組10.0mg/kg(1、2、4、5、7號(hào)犬)，本發(fā)明提取物小劑量組5.0mg/kg(8、10、13、15、16號(hào)犬)，陽(yáng)性對(duì)照藥依那普利片組2.5mg/kg(11、12、18、19、20號(hào)犬)及空白對(duì)照組(3、6、9、14、17號(hào)犬)。動(dòng)物用2.5％戊巴比妥鈉(25mg/kg)靜脈麻醉，分離頸總動(dòng)脈和氣管，頸總動(dòng)脈插管經(jīng)壓力換能器與BioPAC多導(dǎo)生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)相連記錄血壓；氣管插管備接電動(dòng)呼吸器行人工呼吸。分離十二指腸并插管供給藥用。犬右側(cè)臥位，于左側(cè)第四肋間隙開(kāi)胸，做心包床，暴露心臟。左心室尖部插管連接Biopac通用放大器記錄左心室內(nèi)壓(LVP)和左室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax)。分離冠狀動(dòng)脈左旋支及主動(dòng)脈根部，分別放置合適的血流計(jì)卡式探頭與多普勒血流計(jì)相連，分別測(cè)量冠脈血流量(CBF)及心輸出量(CO)。同時(shí)計(jì)算總外周阻力、冠脈阻力、每搏心排出量和左室作功。所有上述指標(biāo)均同步記錄于BioPAC多導(dǎo)生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)。術(shù)后緩慢恒速靜脈滴注生理鹽水，以補(bǔ)充體液。
術(shù)后穩(wěn)定30min，待觀察指標(biāo)穩(wěn)定后，記錄上述各指標(biāo)作為藥前值。然后經(jīng)十二指腸插管給藥。給藥體積為2.0ml/kg。空白對(duì)照組給予等體積的0.5％羧甲基纖維素鈉和生理鹽水。分別于給藥后30、60、90、120、180和240min記錄各項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別與空白對(duì)照組比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。
7.結(jié)果7.1本發(fā)明提取物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響結(jié)果表明，本發(fā)明提取物大劑量組灌胃給藥10天開(kāi)始明顯降低血壓，與藥前相比差異顯著(P＜0.05)，15天差異更顯著(P＜0.01)，20、30天時(shí)差異最明顯(p＜0.001)。本發(fā)明提取物中劑量組灌胃給藥15天開(kāi)始降低血壓(P＜0.05)，20、30天時(shí)差異最明顯(p＜0.001)。小劑量組與藥前比較雖無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，但有降低趨勢(shì)。結(jié)果詳見(jiàn)表1。
表1本發(fā)明提取物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠收縮期血壓(mmHg)的影響(n＝10，X±s)

注與藥前相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.0017.2本發(fā)明提取物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響結(jié)果表明，本發(fā)明提取物大劑量組灌胃給藥5天起開(kāi)始有效，降壓作用顯著(P＜0.05)，10天起差異更顯著(P＜0.01)，20天時(shí)差異最明顯(p＜0.001)。中劑量組灌胃給藥10天起有差異(P＜0.05)，30天時(shí)差異最明顯(p＜0.001)。小劑量組灌胃給藥與藥前比有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。結(jié)果詳見(jiàn)表2。
7.3本發(fā)明提取物對(duì)腎型高血壓大鼠左心室肥厚的影響從表3中可以看出，大鼠腎動(dòng)脈狹窄術(shù)后第9周，高血壓形成已經(jīng)恒定，此時(shí)左心室肥厚已經(jīng)形成。連續(xù)給藥9周后，本發(fā)明提取物大、中劑量組和依那普利片組能顯著降低腎型高血壓大鼠的血壓，與模型組相比有顯著差異(P＜0.001)，表2本發(fā)明提取物對(duì)腎型高血壓大鼠收縮期血壓mmHg影響(n＝10，X±s)


注藥前相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001表3本發(fā)明提取物逆轉(zhuǎn)腎型高血壓左心室肥厚的作用(X±s)

注與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001小劑量組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。本發(fā)明提取物大、中劑量組能夠明顯降低腎型高血壓大鼠的左室系數(shù)(P＜0.05)。說(shuō)明本發(fā)明提取物能夠逆轉(zhuǎn)腎型高血壓大鼠的左心室肥厚。結(jié)果詳見(jiàn)表3。
本發(fā)明提取物逆轉(zhuǎn)腎型高血壓大鼠左心室肥厚病理學(xué)檢查結(jié)果
假手術(shù)組心內(nèi)膜、外膜、心肌及心肌間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維未見(jiàn)變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變。
模型組心肌纖維束明顯腫脹增大，心肌纖維明顯濁腫、顆粒變性及水樣變性，部分心肌纖維可見(jiàn)少數(shù)灶狀壞死，心肌間質(zhì)中可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。在部分區(qū)域心肌組織中可見(jiàn)心肌纖維中斷現(xiàn)象。部分小血管壁明顯增厚，管腔明顯變小，管周纖維結(jié)締組織增多。
大劑量組多數(shù)動(dòng)物心肌纖維束未見(jiàn)明顯改變，僅個(gè)別動(dòng)物心肌纖維束輕度腫脹增大。個(gè)別部位少數(shù)心肌纖維輕度濁腫、變性，小血管壁未見(jiàn)增厚，管周纖維結(jié)締組織未見(jiàn)增多。
中劑量組心肌纖維束腫脹增大，心肌纖維明顯濁腫、顆粒變性，部分心肌纖維可見(jiàn)少數(shù)灶狀壞死，心肌間質(zhì)中可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。在部分區(qū)域心肌組織中偶見(jiàn)心肌纖維中斷現(xiàn)象。部分小血管壁增厚，管腔未見(jiàn)明顯變小，管周纖維結(jié)締組織也未見(jiàn)增多。
小劑量組心肌纖維束腫脹增大，心肌纖維明顯濁腫、顆粒變性，部分心肌纖維可見(jiàn)少數(shù)灶狀壞死，心肌間質(zhì)中可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。在部分區(qū)域心肌組織中偶見(jiàn)心肌纖維中斷現(xiàn)象。部分小血管壁增厚，管腔變小，管周纖維結(jié)締組織輕度增多。
陽(yáng)性對(duì)照組多數(shù)動(dòng)物心肌纖維束未見(jiàn)明顯改變，僅個(gè)別動(dòng)物心肌纖維束輕度腫脹增大。個(gè)別部位少數(shù)心肌纖維輕度濁腫、變性，小血管壁未見(jiàn)增厚，管周纖維結(jié)締組織未見(jiàn)增多。
7.4本發(fā)明提取物對(duì)麻醉犬血流動(dòng)力學(xué)的影響7.4.1本發(fā)明提取物對(duì)心輸出量及冠脈血流量的影響本發(fā)明提取物大、小劑量組均對(duì)心輸出量無(wú)明顯影響。依那普利片組給藥后60min使心輸出量降低。
本發(fā)明提取物大劑量組于給藥后180min使冠脈流量明顯增加(P＜0.01)，小劑量組有增加趨勢(shì)。依那普利片組給藥后60min使冠脈流量明顯增加(P＜0.05)。
7.4.2本發(fā)明提取物對(duì)左室內(nèi)壓、+dp/dtmax和-dp/dtmax的影響本發(fā)明提取物大、小劑量組和依那普利片均對(duì)左室內(nèi)壓無(wú)明顯影響。
本發(fā)明提取物大、小劑量組皆于給藥后120min使+dp/dtmax明顯降低。依那普利片于給藥后30～120min使+dp/dtmax明顯降低。
本發(fā)明提取物大、小劑量組和依那普利片均對(duì)-dp/dtmax無(wú)明顯影響。
7.4.3本發(fā)明提取物對(duì)總外周阻力和冠脈阻力的影響本發(fā)明提取物大、小劑量組和依那普利片對(duì)總外周阻力均無(wú)明顯影響。
本發(fā)明提取物大劑量組別于給藥180min明顯降低冠脈阻力，小劑量組和依那普利片有降低趨勢(shì)。
7.4.4本發(fā)明提取物對(duì)血壓和心率的影響與空白對(duì)照組比較，本發(fā)明提取物大、小劑量組和依那普利片組均對(duì)平均血壓和心率無(wú)明顯影響。與給藥前比較，本發(fā)明提取物大劑量組于給藥后180～240mi明顯降低平均血壓，小劑量組無(wú)明顯影響，依那普利片240min有降低趨勢(shì)。
7.4.5本發(fā)明提取物對(duì)每搏心排出量和左室作功的影響本發(fā)明提取物大、小劑量組和依那普利片組均對(duì)每搏心排出量無(wú)明顯影響。
本發(fā)明提取物大、小劑量組對(duì)左室作功無(wú)明顯影響。依那普利片組于給藥后60min明顯降低左室作功。
8.小結(jié)8.1本發(fā)明提取物50.0mg/kg、25.0mg/kg分別從灌胃給藥10天、15天開(kāi)始明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓，小劑量組12.5mg/kg雖無(wú)顯著性差異，但有降低趨勢(shì)。
8.2本發(fā)明提取物50.0mg/kg、25.0mg/kg分別從灌胃給藥5天、10天開(kāi)始明顯降低腎型高血壓大鼠收縮壓，12.5mg/kg雖無(wú)顯著性差異，但有降低趨勢(shì)。
8.3本發(fā)明提取物50.0mg/kg、25.0mg/kg能逆轉(zhuǎn)腎型高血壓大鼠的左心室肥厚，小劑量組12.5mg/kg雖無(wú)顯著性差異，但有逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)。
8.4本發(fā)明提取物10.0mg/kg給藥后180～240min能明顯降低麻醉犬平均血壓。
8.5本發(fā)明提取物10.0mg/kg、5.0mg/kg均于給藥后120min使麻醉犬+dp/dtmax明顯降低。
8.6本發(fā)明提取物10.0mg/kg于給藥180min明顯降低麻醉犬冠脈阻力，并顯著增加冠脈流量；5.0mg/kg有增加趨勢(shì)。
8.7本發(fā)明提取物10.0mg/kg、5.0mg/kg均對(duì)麻醉犬左室內(nèi)壓、-dp/dtmax、心輸出量無(wú)明顯影響。
8.8本發(fā)明提取物10.0mg/kg、5.0mg/kg均對(duì)麻醉犬總外周阻力、每搏心排出量和左室作功無(wú)明顯影響。
8.9本發(fā)明提取物在降低平均血壓和改善冠脈流量等方面顯示了一定的藥效作用。
二、白花前胡提取工藝研究根據(jù)白花前胡活性成分的化學(xué)性質(zhì)及藥理學(xué)研究，我們對(duì)本發(fā)明提取物的提取工藝、分離純化工藝進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。
1.白花前胡醇提工藝研究考察了不同醇提工藝對(duì)白花前胡丙素含量的影響，采用正交試驗(yàn)，篩選最佳醇提工藝條件。
2.白花前胡分離純化工藝研究(1)比較了不同乙酸乙酯用量對(duì)總香豆素得率及含量得影響，確定采用乙酸乙酯萃取，優(yōu)選采取等量的乙酸乙酯。
(2)比較了不同乙酸乙酯萃取次數(shù)對(duì)總香豆素得率及含量的影響，確定根據(jù)所用萃取溶劑的量，優(yōu)選采用3次萃取。
(3)提取物內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定通過(guò)以上工藝研究，制定了本品的制備工藝，并經(jīng)中試放大，成品各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)定要求，進(jìn)一步確證了本工藝合理、科學(xué)并適應(yīng)規(guī)模生產(chǎn)的需要，保證了制劑質(zhì)量。
1.1儀器與試藥Agilent 1100高效液相色譜儀所用試劑均為色譜純所用藥材由山東大學(xué)藥學(xué)院溫學(xué)森教授鑒定對(duì)照品白花前胡丙素對(duì)照品由實(shí)驗(yàn)室制備1.2試驗(yàn)方法采用正交表L9(34)篩選了乙醇回流提取的最佳工藝條件1.2.1制備工藝取白花前胡100g，共稱取9份，分別按不同的提取工藝提取，回收乙醇，并濃縮至每g相當(dāng)于1.5g原藥材的清膏。
1.2.2白花前胡丙素含量測(cè)定色譜條件流動(dòng)相甲醇-水-乙腈＝25∶15∶60，流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)323nm，進(jìn)樣量20μl。
對(duì)照品溶液的配制精取干燥至恒重的白花前胡丙素標(biāo)準(zhǔn)品約10.0mg，精密稱重，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置100ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(含白花前胡丙素10ug/ml)。
供試品溶液的配制取相當(dāng)于1.0g原藥材的清膏，置10ml量瓶中，加入甲醇約8ml，超聲處理30分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，從中精密量取1ml，置100ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。
精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液20μl，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算不同工藝白花前胡丙素含量。
1.2.3方差分析正交試驗(yàn)結(jié)果分析，A因素即醇濃度對(duì)白花前胡丙素含量有顯著差異，選擇乙醇的濃度在60％-95％，但95％醇提清膏中白花前胡丙素含量明顯高于75％醇提工藝及85％醇提工藝，故優(yōu)選85-95％醇提工藝，更優(yōu)選95％的乙醇；B因素即加醇量對(duì)白花前胡丙素含量的影響較大，故優(yōu)選加醇量為8-10倍量，更優(yōu)選10倍量；C因素即提取時(shí)間對(duì)白花前胡丙素含量無(wú)顯著影響，故選擇提取時(shí)間為60-120分鐘。
2.1不同萃取次數(shù)的考察萃取一步是該生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵步驟，它直接影響到白花前胡香豆素的產(chǎn)率，乙酸乙酯的用量和生產(chǎn)能耗等。考察萃取次數(shù)與得率，得到最佳萃取次數(shù)。
2.1.1供試品的制備取白花前胡藥材5kg，按選定的提取工藝提取，回收乙醇至無(wú)醇味，至相對(duì)密度為1.20(60℃)稠膏，平均分成3份，加水適量，分散，加1倍量乙酸乙酯分別萃取2、3、5次，回收溶劑，加入適量的石油醚，結(jié)晶析出淡黃色固體，得到白花前胡總香豆素提取物。
2.1.2白花前胡丙素的含量測(cè)定色譜條件流動(dòng)相甲醇-水-乙腈＝25∶15∶60，流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)323nm，進(jìn)樣量20μl。
對(duì)照品溶液的配制精取干燥至恒重的白花前胡丙素標(biāo)準(zhǔn)品約10.0mg，精密稱重，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置100ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(含白花前胡丙素10ug/ml)。
供試品溶液的配制取白花前胡總香豆素提取物15mg，置10ml量瓶中，加入甲醇約8ml，超聲處理30分鐘，放冷，補(bǔ)足溶劑至刻度，搖勻，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液20μl，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算不同工藝白花前胡丙素含量。
2.1.3總香豆素的含量測(cè)定對(duì)照品溶液的配制精密稱取干燥至恒重的白花前胡丙素標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.5、2.0ml分別置100ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備得對(duì)照液。
供試品溶液的配制取本發(fā)明的提取物15mg，置10ml量瓶中，加入甲醇約8ml，超聲處理30分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，從中精密量取1ml，置100ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。
照紫外分光光度法(中國(guó)藥典2005版一部附錄28頁(yè)VA)測(cè)定。分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液在323nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算總香豆素含量。
結(jié)果表明，萃取次數(shù)為3次和5次得到的提取物的得率及含量沒(méi)有明顯的差別，而萃取2次所得的的提取物的得率較低，因此確定萃取次數(shù)為3-5次，優(yōu)選3次。
2.2不同萃取劑用量得考察考察了不同乙酸乙酯用量對(duì)本發(fā)明提取物得率及含量的影響。
取白花前胡藥材5kg，按選定的提取工藝提取，回收乙醇至無(wú)醇味，至相對(duì)密度為1.20(60℃)稠膏，平均分成3份，加水適量，分散，每份200ml，分別加0.5倍、1倍量2倍量(V/V)乙酸乙酯，分別萃取3次，回收溶劑，加入適量的石油醚，結(jié)晶析出淡黃色固體，得到白花前胡總香豆素提取物。
以上不同提取工藝提取得到的供試品分別按2.1.2項(xiàng)下方法測(cè)定白花前胡丙素含量，按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定總香豆素的含量。
結(jié)果表明，萃取劑用量為1倍量和2倍量(V/V)所得提取物的得率及含量無(wú)明顯差別，為0.5倍時(shí)，得率較低，因此確定優(yōu)選的萃取劑用量為1-3倍量(V/V)，優(yōu)選1倍量(V/V)。
在上述一系列工藝條件研究后，確定了從白花前胡藥材中提取、分離、純化有效部位白花前胡丙素的各步工藝的具體條件，將各部最佳的工藝條件組合在一起確定白花前胡總香豆素提取物的制備工藝，確定采用乙酸乙酯萃取后，回收溶劑，加入適量石油醚，重結(jié)晶，得到本發(fā)明提取物，并進(jìn)一步制定了提取物的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種白花前胡總香豆素提取物，按重量百分比計(jì)，含有白花前胡丙素50％；將白花前胡根，粉碎成粗粉，8倍量60％乙醇加熱回流提取，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇至無(wú)醇味，得到的膏狀物加入蒸餾水拌散，用3倍量的乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯，濃縮成稠膏狀，加入石油醚，超聲20分鐘后靜置，析出沉淀，過(guò)濾，沉淀用石油醚洗滌至淺黃色。
實(shí)施例2
一種白花前胡總香豆素提取物，按重量百分比計(jì)，含有白花前胡丙素60％；將白花前胡根，粉碎成粗粉，8倍量75％乙醇加熱回流提取，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇至無(wú)醇味，得到的膏狀物加入蒸餾水拌散，用1倍量的乙酸乙酯萃取5次，回收乙酸乙酯，濃縮成稠膏狀，加入石油醚，超聲20分鐘后靜置，析出沉淀，過(guò)濾，沉淀用石油醚洗滌至淺黃色。
實(shí)施例3一種白花前胡總香豆素提取物，按重量百分比計(jì)，含有白花前胡丙素75％；將白花前胡根，粉碎成粗粉，10倍量95％乙醇加熱回流提取，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇至無(wú)醇味，得到的膏狀物加入蒸餾水拌散，用1倍量的乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯，濃縮成稠膏狀，加入石油醚，超聲20分鐘后靜置，析出沉淀，過(guò)濾，沉淀用石油醚洗滌至淺黃色。
實(shí)施例4一種白花前胡總香豆素提取物，按重量百分比計(jì)，含有白花前胡丙素80％；將白花前胡根，粉碎成粗粉，10倍量95％乙醇加熱回流提取，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇至無(wú)醇味，得到的膏狀物加入蒸餾水拌散，用1倍量的乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯，濃縮成稠膏狀，加入石油醚，超聲20分鐘后靜置，析出沉淀，過(guò)濾，沉淀用石油醚洗滌至淺黃色。
實(shí)施例5一種白花前胡總香豆素提取物，按重量百分比計(jì)，含有白花前胡丙90％；將白花前胡根，粉碎成粗粉，10倍95％乙醇加熱回流提取，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇至無(wú)醇味，得到的膏狀物加入蒸餾水拌散，用3倍量的乙酸乙酯萃取5次，回收乙酸乙酯，濃縮成稠膏狀，加入石油醚，超聲20分鐘后靜置，析出沉淀，過(guò)濾，沉淀用石油醚洗滌至淺黃色。


圖1為白花前胡提取工藝流程圖。
圖2為對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照液的HPLC圖譜。
權(quán)利要求
1.一種中藥組合物，其特征為其中含有白花前胡。
2.一種白花前胡總香豆素提取物，按重量百分比計(jì)，含有白花前胡丙素50-95％。
3.如權(quán)利要求1所述的提取物，按重量百分比計(jì)，含有白花前胡丙素65-90％。
4.如權(quán)利要求2所述的提取物，按重量百分比計(jì)，含有白華前胡丙素70-85％。
5.如權(quán)利要求1或2所述的提取物的制備方法，其步驟包括，將白花前胡根，粉碎成粗粉，乙醇加熱回流提取，過(guò)濾，濾液濃縮回收乙醇至無(wú)醇味，得到的膏狀物加入蒸餾水拌散，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，濃縮成稠膏狀，加入石油醚，超聲20分鐘后靜置，析出沉淀，過(guò)濾，沉淀用石油醚洗滌至淺黃色，即得到所述的提取物。
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其中提取所用的乙醇的濃度為60-95％。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其中提取所用的乙醇的濃度為95％。
8.如權(quán)利要求4-6任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中乙醇加熱回流提取3次，每次0.5-2小時(shí)，第一次加10倍量的乙醇，第二、三次各加8倍量的乙醇。
9.如權(quán)利要求4-7任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中用1-3倍量的乙酸乙酯萃取3-5次。
10.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其中用1倍量的乙酸乙酯萃取3次。
11.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的提取物在制備治療高血壓藥物中的應(yīng)用。
12.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的提取物的含量測(cè)定方法1.)總香豆素的含量測(cè)定對(duì)照品溶液的配制取減壓干燥至恒重的白花前胡丙素標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。供試品溶液的配制取前胡素約10mg，置10ml量瓶中，加入甲醇約8ml，超聲處理30分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0ml至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。取處方量的空白輔料，按上述方法制備空白對(duì)照溶液。照分光光度法(附錄VB)，在323nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定法取供試品溶液在323nm處測(cè)定吸收度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總香豆素含量，即得。2.)白花前胡丙素的含量測(cè)定照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄VID)測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙腈-水(25∶60∶15)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)323nm。理論塔板數(shù)按白花前胡丙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。對(duì)照品溶液的制備取減壓干燥至恒重的白花前胡丙素對(duì)照品10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備取本品細(xì)粉10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1.0ml，置100ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥提取物、其制備方法及其應(yīng)用，具體為一種白花前胡總香豆素提取物及其制備方法、以及其在制備治療高血壓藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期摸索研究，確證白花前胡治療高血壓病的有效部位，并提取分離得到本發(fā)明的白花前胡總香豆素提取物，用以治療高血壓。本發(fā)明解決了長(zhǎng)期以來(lái)存在的發(fā)揮作用較慢，質(zhì)量較難控制等中藥使用局限，本發(fā)明提取物的藥效學(xué)和藥理學(xué)深入系統(tǒng)研究表明，本發(fā)明提取物具有藥效作用強(qiáng)，毒副作用小，安全范圍大，以及產(chǎn)品純度高，服用劑量較小，質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1977870SQ20051012762
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日
發(fā)明者趙志全 申請(qǐng)人:魯南制藥集團(tuán)股份有限公司