專利名稱：角毛藻半定量檢測(cè)試紙條及其制備使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基于膠體金免疫層析分析技術(shù)(gold immunochromato graphy assay，GICA)的浮游藻類半定量免疫層析檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及角毛藻的半定量免疫層析檢測(cè)分析試紙條及其制備檢測(cè)方法領(lǐng)域，其屬于免疫學(xué)和浮游生物學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
浮游植物的分類、鑒定和定量一直是藻類學(xué)和生態(tài)學(xué)研究中最基礎(chǔ)的課題之一。對(duì)生態(tài)動(dòng)力學(xué)、赤潮發(fā)生機(jī)制與預(yù)警預(yù)報(bào)、海水養(yǎng)殖水域常規(guī)檢測(cè)等都有著重要意義。對(duì)于常規(guī)環(huán)境監(jiān)測(cè)、漁業(yè)養(yǎng)殖水體檢測(cè)等應(yīng)用領(lǐng)域來(lái)說(shuō)，需要一種對(duì)主要赤潮藻進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)半定量檢測(cè)的方法。本發(fā)明內(nèi)容主要涉及海洋浮游植物的檢測(cè)技術(shù)和膠體金免疫層析分析技術(shù)兩個(gè)技術(shù)領(lǐng)域。
現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要有基于形態(tài)學(xué)特征的分析方法、基于細(xì)胞色素的檢測(cè)方法、基于分子探針的檢測(cè)技術(shù)，以及不同技術(shù)的交叉如流式細(xì)胞術(shù)和FLOWCAM技術(shù)等。這些技術(shù)極大地豐富了浮游植物觀測(cè)技術(shù)，推動(dòng)了相關(guān)研究的發(fā)展，各項(xiàng)技術(shù)均有著突出的優(yōu)勢(shì)也存在著難以克服的制約因素?，F(xiàn)有的浮游藻類檢測(cè)方法主要包括1、基于形態(tài)學(xué)特征的分析方法傳統(tǒng)的基于形態(tài)學(xué)的光鏡和電鏡觀測(cè)技術(shù)是浮游植物鑒定與定量的基礎(chǔ)，至今仍有著不可動(dòng)搖的地位，發(fā)揮著很重要的作用。但其存在著耗時(shí)長(zhǎng)，需要富有經(jīng)驗(yàn)的專家、專業(yè)儀器設(shè)備等限制性因素。FLOWCAM技術(shù)是形態(tài)學(xué)與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)合，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)捕獲的照片進(jìn)行識(shí)別分類。相對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)，這一技術(shù)加快了分析的速度，但是仍然存在需要專家干預(yù)，形態(tài)相似的種類無(wú)法區(qū)分的缺點(diǎn)。同時(shí)由于技術(shù)的限制，該技術(shù)獲得的圖像分辨率較差，更在一定程度上影響了識(shí)別的準(zhǔn)確度。
2、流式細(xì)胞術(shù)該技術(shù)通過(guò)逐個(gè)測(cè)量細(xì)胞的散射光、細(xì)胞自體熒光、染色熒光和免疫標(biāo)記熒光等來(lái)檢測(cè)其生理生化指標(biāo)并對(duì)其分類、收集?，F(xiàn)已成為環(huán)境微生物學(xué)中的十分有用的工具。該技術(shù)的限制主要是在環(huán)境變化的情況下，細(xì)胞的形態(tài)、大小及生理生化特性會(huì)發(fā)生顯著變化，而這正是流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)基礎(chǔ)，這將影響該技術(shù)對(duì)于各種類的正確區(qū)分。同時(shí)儀器成本較高，對(duì)工作環(huán)境要求嚴(yán)格，需要良好訓(xùn)練的專業(yè)技術(shù)人員等因素也限制了其應(yīng)用。
3、基于細(xì)胞色素的檢測(cè)方法由于不同種屬的浮游藻中含有不同的色素組成，或特征色素，基于細(xì)胞色素的檢測(cè)方法就是藉由檢測(cè)樣品中各種色素的豐度(及特征色素)對(duì)不同的浮游植物類群加以區(qū)分和定量。依據(jù)對(duì)色素的檢測(cè)方法不同而有化學(xué)分類學(xué)方法、現(xiàn)場(chǎng)熒光、遙感反演等不同的技術(shù)。這些技術(shù)均可迅速的獲取結(jié)果，但由于藻類色素的相似性，這些技術(shù)僅能提供浮游植物幾種類群的分類數(shù)據(jù)，難以提供精確到種屬結(jié)果?；瘜W(xué)分類法是以分類對(duì)象各類群中化學(xué)成分的特征為分類依據(jù)?？梢栽谠寰V一級(jí)進(jìn)行較好的分類，甚至于對(duì)于某些形態(tài)學(xué)上十分相近的種類在標(biāo)志化合物上也有著差異，可以借助這一方法區(qū)分鑒定。但在屬或種之間的分類還不能完全實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)場(chǎng)熒光方法是在光源的激發(fā)下，檢測(cè)藻類中色素發(fā)出的熒光，借助光譜的差異可以區(qū)分不同的浮游植物類群。這一方法可以迅速測(cè)定，并可以在水下等現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境連續(xù)測(cè)定，但此方法只能將浮游植物根據(jù)其色素分為幾個(gè)類群。利用衛(wèi)星遙感數(shù)據(jù)，對(duì)海域葉綠素含量進(jìn)行測(cè)量。這一方法可以迅速提供廣大區(qū)域的數(shù)據(jù)，但往往只能反演葉綠素含量，估算浮游植物總量，難以進(jìn)一步提供浮游植物的類群等信息。同時(shí)，由于環(huán)境因素的變化、不同的生長(zhǎng)周期，浮游植物的色素含量會(huì)發(fā)生變化，基于細(xì)胞色素的各種方法的檢測(cè)結(jié)果也會(huì)受到影響。
對(duì)于常規(guī)環(huán)境監(jiān)測(cè)、漁業(yè)養(yǎng)殖水體檢測(cè)來(lái)說(shuō)，需要一種對(duì)主要赤潮藻進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速簡(jiǎn)易低成本的檢測(cè)方法。在現(xiàn)有浮游植物檢測(cè)方法中尚未有完全適用的方法。而臨床檢測(cè)中的GICA技術(shù)由于具有不需儀器，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，并且可以給出半定量的結(jié)果而成為滿足這一領(lǐng)域需求的最佳選擇。目前國(guó)際國(guó)內(nèi)在應(yīng)用免疫學(xué)方法檢測(cè)浮游植物的研究，多以制備抗體和ELISA檢測(cè)居多，未有采用GICA技術(shù)檢測(cè)浮游植物的研究。與ELISA不同處是GICA反應(yīng)時(shí)間大大縮短，不需要儀器設(shè)備，僅需要數(shù)十分鐘就完成了ELISA需數(shù)小時(shí)才能顯示的結(jié)果。因?yàn)樵贕ICA中，高濃度的抗體集中固定在纖維素的微孔中，待測(cè)抗原在層析時(shí)，流經(jīng)微孔與固定的高濃度抗體緊密接觸，很快完成免疫結(jié)合反應(yīng)。這就是以膜為基礎(chǔ)的膠體金快速免疫結(jié)合分析中的免疫濃縮作用(immunoconcentraiton)。在ELISA中，待測(cè)抗原要在液相中經(jīng)過(guò)擴(kuò)散作用，逐漸與吸附在固相表面的抗體結(jié)合。同時(shí)，標(biāo)記抗體也需要同樣的擴(kuò)散結(jié)合過(guò)程形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，故需時(shí)間較長(zhǎng)。
本發(fā)明通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)，以藻細(xì)胞或提取物免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備浮游藻的多抗，利用抗體，建立GICA的免疫分析方法。不需儀器，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，并且可以給出半定量的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
膠體金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labeling technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)；膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。利用它在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)藉靜電吸引而形成牢固結(jié)合，除抗體蛋白外，膠體金還可與其他多種生物大分子結(jié)合。根據(jù)膠體金的一些物理特性，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物所具有的免疫-生物學(xué)特性，使其在免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)記研究工作中得到廣泛應(yīng)用。
本發(fā)明的內(nèi)容是首先制備抗體金探針，以GICA(膠體金免疫層析技術(shù))技術(shù)為基礎(chǔ)，通過(guò)精確控制膜上捕捉配體的量，使用多條不同濃度的平行捕捉配體線的方法，以顯色條帶的數(shù)目，判斷分析物的濃度區(qū)間，建立對(duì)角毛藻的半定量檢測(cè)試紙條。本發(fā)明主要分為九個(gè)部分1、抗體金探針(膠體金標(biāo)記的抗體)的制備。采用常用的膠體金(如抗壞血酸還原法、鞣酸—檸檬酸三鈉還原法、乙醇超聲波還原法)制備方法，優(yōu)化膠體金標(biāo)記實(shí)驗(yàn)條件，取得穩(wěn)定高效的抗體金探針。透析純化目標(biāo)藻抗體。檢驗(yàn)制備的膠體金的顆粒直徑、均勻度等指標(biāo)，選擇穩(wěn)定的方法制備20～30nm的膠體金，4℃保存。
2、藻類半定量免疫層析分析技術(shù)的建立。以GICA技術(shù)為基礎(chǔ)，通過(guò)精確控制膜上捕捉配體的量，使用多條不同濃度的平行捕捉配體線的方法，通過(guò)顯色條帶的數(shù)目，判斷分析物的濃度區(qū)間，建立對(duì)目標(biāo)藻的半定量GICA技術(shù)。
3、免疫原的制備。將生長(zhǎng)旺盛的角毛藻細(xì)胞培養(yǎng)溶液用終濃度為2％的甲醛固定過(guò)夜，10000r/min離心10min，收集藻細(xì)胞沉淀。藻細(xì)胞團(tuán)塊再用蒸餾水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通過(guò)離心收集藻細(xì)胞，離心條件均為，10000r/min，10min。將收集的藻細(xì)胞分裝于1.5mlEppendorf管，甩去殘余水分，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前取出，用滅菌的5ml PBS重新懸浮均勻。將藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)超聲波和冷熱交替處理(-75℃，15min；100℃，5min，三次循環(huán))后得到已知細(xì)胞密度的破碎藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4、多克隆抗體的制備及純化。將處理好的藻細(xì)胞用0.5mlPBS重懸，混勻，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，乳化程度盡量完全。家兔通過(guò)腹腔注射、肌肉注射和背部皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫。初次免疫劑量分別約為每只家兔1×106、2×106和4×106個(gè)細(xì)胞，通過(guò)耳緣靜脈采血。采集的血液室溫放2小時(shí)，然后離心(4000r/min，5min)分離血清。為提高測(cè)定的穩(wěn)定性與專一性，需要對(duì)抗體純化。對(duì)兔抗血清進(jìn)行親和層析柱純化處理后，可以去除大部分血清雜蛋白從IgG得到富集，純化后抗血清效價(jià)有較大的提高，對(duì)于需要包被IgG抗體或者對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記十分必要。
5、待標(biāo)記抗體的預(yù)處理。透析除鹽，由于過(guò)高的鹽類物質(zhì)會(huì)降低膠體金顆粒的Zeta電位，影響蛋白質(zhì)的吸附，需要透析除去蛋白質(zhì)溶液內(nèi)多余的電解質(zhì)。去除沉淀，蛋白質(zhì)的聚合物對(duì)標(biāo)記過(guò)程及抗體金探針的穩(wěn)定性有一定影響，標(biāo)記之前須離心以除去這些聚合物。優(yōu)化膠體金標(biāo)記抗體的實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整pH值將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定膠體金抗體最適用量比例。
6、抗體金探針的制備。采用上述選擇的條件標(biāo)記抗體金探針；將標(biāo)記好的抗體金探針在蔗糖或硅膠中濃縮保存。選用凝膠過(guò)濾法純化抗體金探針，用牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑，除去其中未標(biāo)記的抗體，未反應(yīng)的膠體金以及在標(biāo)記過(guò)程中可能形成的各種聚合物。對(duì)純化后免疫金探針的特異性，敏感性進(jìn)行鑒定，判斷其是否仍保持很好的生物學(xué)活性。
7、膠體金探針玻璃纖維素膜的制備。將玻璃纖維素膜在免疫金探針溶液中浸泡后晾干。
8、固定捕獲抗體的硝酸纖維素膜(NC)的制備。取制備的角毛藻細(xì)胞破碎物、羊抗兔抗體用固定液稀釋。用角毛藻細(xì)胞破碎物固定溶液在硝酸纖維素膜上劃三條平行線作為捕獲抗原檢測(cè)線。再用羊抗兔抗體固定溶液在三條平行線后劃一條平行的作為二抗質(zhì)控線。將固相抗體硝酸纖維素膜置封閉液中孵育后洗去未結(jié)合的抗體，晾干備用。
9、半定量檢測(cè)及試紙制備。通過(guò)已知角毛藻濃度樣品試驗(yàn)，確定檢測(cè)1010個(gè)/m3、108個(gè)/m3、106個(gè)/m3的藻細(xì)胞樣品需要的捕獲抗原(檢測(cè)線)濃度。據(jù)此在膜上劃三條平行的不同濃度的檢測(cè)線，對(duì)應(yīng)于不同的檢測(cè)物濃度，制作半定量檢測(cè)試紙條。
本發(fā)明為一種角毛藻半定量檢測(cè)試紙條，包括塑料載體板，玻璃纖維膜樣品層、玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層、硝酸纖維膜檢測(cè)層、玻璃纖維膜吸水層。所述檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜樣品層、玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層、硝酸纖維膜檢測(cè)層、玻璃纖維膜吸水層順式膠合固定在塑料載體板一側(cè)；所述檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上設(shè)有角毛藻抗原分級(jí)檢測(cè)線、二抗質(zhì)控線；所述玻璃纖維膜吸水層膠合在硝酸纖維膜檢測(cè)層右端之上；所述塑料載體板中部設(shè)有硝酸纖維膜檢測(cè)層，在該檢測(cè)層與玻璃纖維膜樣品層交界處，設(shè)有載有膠體金標(biāo)記的角毛藻抗體的玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層，該層一端置于玻璃纖維膜樣品層下，并與塑料載體板膠合，另一端設(shè)置在硝酸纖維膜檢測(cè)層之上，并與硝酸纖維膜檢測(cè)層膠合。
所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上的角毛藻抗原分級(jí)標(biāo)記線由檢測(cè)濃度分別為1010個(gè)/m3、108個(gè)/m3、106個(gè)/m3的三條標(biāo)記線組成。
所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上的二抗質(zhì)控線包被有羊抗兔IgG；角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層上載有膠體金標(biāo)記的兔抗角毛藻抗體。
所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層上的膠體金標(biāo)記的兔抗角毛藻抗體制備方法如下膠體金的制備鞣酸—檸檬酸三鈉還原法制備20～30nm的膠體金，4℃保存；兔抗角毛藻抗體的制備將生長(zhǎng)旺盛的角毛藻細(xì)胞培養(yǎng)溶液用終濃度為1～3％的甲醛固定過(guò)夜，8000～12000r/min離心10min，收集藻細(xì)胞沉淀；藻細(xì)胞團(tuán)塊再用蒸餾水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通過(guò)離心收集藻細(xì)胞，離心條件均為，8000～12000r/min，8～12min；將收集的藻細(xì)胞分裝于1.5ml Eppendorf管，將角毛藻藻細(xì)胞破碎物用滅菌的0.3～0.6mlPBS重懸，混勻，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，乳化程度盡量完全；初次免疫劑量分別約為1×106、2×106和4×106個(gè)細(xì)胞每只動(dòng)物；靜脈采血，采集的血液室溫放置2小時(shí)，然后2000～6000r/min，離心5min，分離血清，4℃冷藏保存。
本發(fā)明的另一種應(yīng)用為所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上的二抗質(zhì)控線包被有羊抗雞IgG；角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層上載有膠體金標(biāo)記的雞抗角毛藻抗體。
本發(fā)明的再一種應(yīng)用為所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上的二抗質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG；角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層上載有膠體金標(biāo)記的鼠抗角毛藻抗體。
所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條的檢測(cè)范圍是藻細(xì)胞濃度檢出下限為106個(gè)/m3，在藻細(xì)胞濃度106-1010個(gè)/m3的范圍內(nèi)提供三級(jí)區(qū)分的半定量檢測(cè)結(jié)果1010個(gè)/m3、108個(gè)/m3、106個(gè)/m3；檢測(cè)時(shí)間少于30分鐘。
本發(fā)明還包括一種角毛藻半定量檢測(cè)試紙條的使用方法，所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條的使用方法制備檢測(cè)樣品的過(guò)程是將被檢測(cè)樣品溶液過(guò)濾，濾膜對(duì)折放入5ml離心管中，加3mlPBS將濾膜完全浸泡，超聲波破碎5分鐘，去所得溶液1ml，剩余2ml溶液加入到2ml的離心管中，將角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜樣品層插入離心管中，15分鐘后可觀察結(jié)果。
本發(fā)明為常規(guī)環(huán)境監(jiān)測(cè)、漁業(yè)養(yǎng)殖水體檢測(cè)、以及赤潮生效過(guò)程監(jiān)測(cè)的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，提供快速簡(jiǎn)便的在現(xiàn)場(chǎng)對(duì)赤潮多發(fā)藻進(jìn)行半定量的檢測(cè)方法，對(duì)于我國(guó)海洋環(huán)境資源、尤其是生物資源的評(píng)價(jià)和管理有極大的促進(jìn)作用，為海洋環(huán)境管理和海水養(yǎng)殖提供最直接的技術(shù)基礎(chǔ)。在環(huán)境檢測(cè)、海洋養(yǎng)殖、港口檢疫等行業(yè)均有著對(duì)赤潮生物半定量檢測(cè)的需求，上述行業(yè)蘊(yùn)藏著大量的潛在用戶。在國(guó)內(nèi)各海洋科研和監(jiān)測(cè)單位也有著實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值，可以更好地促進(jìn)我國(guó)的海洋學(xué)研究和環(huán)境學(xué)研究。


圖1為角毛藻半定量檢測(cè)試紙條的立體結(jié)構(gòu)示意圖。圖中標(biāo)號(hào)分別為1、塑料載體板，2、玻璃纖維膜樣品層，3、附有抗體金標(biāo)記的角毛藻抗體的玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層，4、硝酸纖維膜檢測(cè)層，5、玻璃纖維膜吸水層，6、三種濃度的抗原檢測(cè)線，7、二抗質(zhì)控線。
圖2為角毛藻半定量檢測(cè)試紙條的側(cè)視圖。圖中標(biāo)號(hào)分別為1、塑料載體板，2、玻璃纖維膜樣品層，3、附有抗體金標(biāo)記的角毛藻抗體的玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層，4、硝酸纖維膜檢測(cè)層，5、玻璃纖維膜吸水層，6、三種濃度的抗原檢測(cè)線，7、二抗質(zhì)控線。
圖3為角毛藻半定量檢測(cè)試紙條梯度實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果照片。梯度實(shí)驗(yàn)中，按量取100ml藻溶液計(jì)算，各藻溶液的梯度濃度分別為1、陰性對(duì)照2、1.2×107個(gè)/立方米3、7×108個(gè)/立方米4、1.2×1010個(gè)/立方米圖4為角毛藻半定量檢測(cè)試紙條特異性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果照片。異性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，按量取100ml藻溶液計(jì)算，各編號(hào)分別代表B1、中肋骨條藻B2、赤潮異灣藻B3、裸甲藻B4、原甲藻圖5為兔抗旋鏈角毛藻抗血清效價(jià)時(shí)間曲線。如圖所示，兔抗血清的效價(jià)變化從初始免疫后第3-4周開(kāi)始顯著增加，第7周達(dá)基本達(dá)到高峰值，之后維持在這一高水平，不再有明顯的上升趨勢(shì)。免疫過(guò)程結(jié)束后，抗血清效價(jià)維持在較高水平一段時(shí)間，至第16周時(shí)開(kāi)始有下降趨勢(shì)。兔抗血清的最高效價(jià)約為16000。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施方式一免疫原的制備將生長(zhǎng)旺盛的角毛藻細(xì)胞培養(yǎng)溶液用終濃度為2％的甲醛固定過(guò)夜，10000r/min離心10min，收集藻細(xì)胞沉淀。藻細(xì)胞團(tuán)塊再用蒸餾水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通過(guò)離心收集藻細(xì)胞，離心條件均為，10000r/min，10min。將收集的藻細(xì)胞分裝于1.5ml Eppendorf管，甩去殘余水分，-20℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前取出，用滅菌的5ml PBS重新懸浮均勻。將藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)超聲波和冷熱交替處理(-75℃，15min；100℃，5min，三次循環(huán))后得到已知細(xì)胞密度的破碎藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)溶液。
實(shí)施方式二抗體效價(jià)的測(cè)定。
采用間接ELISA法測(cè)定抗體的效價(jià)，主要步驟如下(1)海藻或海藻粗提液包被(105-106個(gè)細(xì)胞/ml)，100μl/孔，4℃濕盒過(guò)夜；
(2)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(3)封閉，用1％的BSA，包被緩沖溶液稀釋，120μl/孔，37℃，3h或者4℃過(guò)夜；(4)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(5)加入海藻的多克隆抗體梯度稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(6)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(7)加入酶標(biāo)二抗的稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(8)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(9)加入底物TMB溶液，100μl/孔，37℃，15min；(10)2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，50μl/孔；(11)酶標(biāo)儀讀取A450值。
將滿足條件P(待檢血清)/N(陰性對(duì)照血清)≥2.1，且P(待檢血清)＞0.2的顯色孔判為陽(yáng)性，并將抗血清的效價(jià)定義為與50％固相抗原結(jié)合時(shí)抗血清的稀釋倍數(shù)。如圖五所示，兔抗血清的效價(jià)從初始免疫后第3-4周開(kāi)始顯著增加，第7周達(dá)基本達(dá)到高峰值，之后維持在這一高水平，不再有明顯的上升趨勢(shì)。免疫過(guò)程結(jié)束后，抗血清效價(jià)維持在較高水平一段時(shí)間，至第16周時(shí)開(kāi)始有下降趨勢(shì)。兔抗血清的最高效價(jià)約為16000。
實(shí)施方式三抗體特異性的測(cè)定。
采用間接ELISA法測(cè)定抗體的特異性，具體步驟為(1)a類海藻或海藻粗提液包被(105-106個(gè)細(xì)胞/ml)，100μl/孔，4℃濕盒過(guò)夜；(2)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(3)封閉，用1％的BSA，包被緩沖溶液稀釋，120μl/孔，37℃，3h或者4℃過(guò)夜；(4)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(5)加入b類海藻的多克隆抗體稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(6)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(7)加入酶標(biāo)二抗的稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(8)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(9)加入底物TMB溶液，100μl/孔，37℃，15min；(10)2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，50μl/孔；(11)酶標(biāo)儀讀取A450值。
將滿足條件P(待檢海藻)/N(陰性對(duì)照)≥2.1，且P(待檢海藻)＞0.2的顯色孔判為陽(yáng)性，根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)弱判斷交叉反應(yīng)的強(qiáng)弱。
實(shí)施方式四抗體特異性測(cè)定的另一方法。
采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體特異性，具體步驟為(1)海藻或海藻粗提液包被(105-106個(gè)細(xì)胞/ml)，100μl/孔，4℃濕盒過(guò)夜；(2)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(3)封閉，用1％的BSA，包被緩沖溶液稀釋，120μl/孔，37℃，3h或者4℃過(guò)夜；(4)洗板，0.5％PBST洗3次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(5)加入各類海藻細(xì)胞的梯度稀釋溶液50μl/孔和海藻的多克隆抗體稀釋溶液50μl/孔，100μl/孔，37℃，1.5h；(6)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(7)加入酶標(biāo)二抗的稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h；(8)洗板，0.5％PBST洗6次，蒸餾水沖2次，甩干殘存液體；(9)加入底物TMB溶液，100μl/孔，37℃，15min；(10)2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，50μl/孔；(11)酶標(biāo)儀讀取A450值。
根據(jù)各孔的吸光值繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，交叉反應(yīng)率通過(guò)計(jì)算抑制率50％時(shí)抗原量與近似抗原量的比值獲得。硅藻門(mén)角毛藻屬4種海藻與4種抗角毛藻抗血清之間具有強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)，P(待測(cè)樣本)/N(空白對(duì)照)≥4，與其他種屬的海藻幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)，所以抗角毛藻抗血清具有較好的屬特異性，可以用于海洋浮游微型角毛藻類的檢測(cè)。
實(shí)施方式五樣品的檢測(cè)方法現(xiàn)場(chǎng)樣品提取將被檢測(cè)樣品溶液過(guò)濾，濾膜對(duì)折放入5ml離心管中，加3mlPBS將濾膜完全浸泡，超聲波破碎5分鐘，去所得溶液1ml，剩余2ml溶液加入到2ml的離心管中，將角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜樣品層插入離心管中，15分鐘后可觀察結(jié)果。
進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，使用微量移液器吸取一定體積的樣品溶液，滴加在玻璃纖維膜樣品層2上，樣品溶液在毛細(xì)作用的拉動(dòng)下做橫向?qū)游隽鲃?dòng)樣品向玻璃纖維膜吸水層5方向流動(dòng)，途經(jīng)載有抗體金標(biāo)記的角毛藻抗體的玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層3后，將抗體金探針完全復(fù)溶，抗原與抗體金探針形成抗體金探針——抗原復(fù)合物，抗體金探針——抗原復(fù)合物與未結(jié)合的抗體金探針繼續(xù)向前流動(dòng)至硝酸纖維膜檢測(cè)層4上固定有捕捉抗體金探針的捕獲抗原線6處。當(dāng)樣品中不含有檢測(cè)物時(shí)，抗體金探針就會(huì)在6處形成抗體金探針——捕獲抗原復(fù)合物，膠體金聚合，呈現(xiàn)紅色陰性條帶；如樣品中有抗原，則抗原會(huì)在吸附抗體金標(biāo)記的角毛藻抗體的玻璃纖維層3處形成抗原——抗體復(fù)合物，未復(fù)合的抗體金探針以及抗原——抗體復(fù)合物繼續(xù)向前流動(dòng)至硝酸纖維素膜條4上，抗原——抗體復(fù)合物不被捕獲，就不顯色。只有未復(fù)合的抗體金探針會(huì)在6處形成抗體金探針——捕獲抗原復(fù)合物，膠體金聚合，呈現(xiàn)弱紅色陽(yáng)性條帶，但條帶顏色會(huì)因抗體金探針數(shù)量的減少而減弱；若待測(cè)角毛藻抗原過(guò)量，則抗體金探針全部形成抗原——抗體復(fù)合物，而沒(méi)有游離的抗體金探針，故捕獲抗原線6處不顯色，結(jié)果為陽(yáng)性。形成的抗原——抗體復(fù)合物繼續(xù)前移至固定有抗體金探針二抗的質(zhì)控線7處，被固定呈現(xiàn)紅色的陽(yáng)性條帶，表明該檢測(cè)試紙條未失效。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行無(wú)顯著特點(diǎn)和實(shí)質(zhì)性進(jìn)步的修改，添加和替換都是可能的，這些改動(dòng)都沒(méi)有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種角毛藻半定量檢測(cè)試紙條，包括塑料載體板，玻璃纖維膜樣品層、玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層、硝酸纖維膜檢測(cè)層、玻璃纖維膜吸水層，其特征在于所述檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜樣品層、玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層、硝酸纖維膜檢測(cè)層、玻璃纖維膜吸水層順式膠合固定在塑料載體板一側(cè)；所述檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上設(shè)有角毛藻抗原分級(jí)檢測(cè)線、二抗質(zhì)控線；所述玻璃纖維膜吸水層膠合在硝酸纖維膜檢測(cè)層右端之上；所述塑料載體板中部設(shè)有硝酸纖維膜檢測(cè)層，在該檢測(cè)層與玻璃纖維膜樣品層交界處，設(shè)有載有膠體金標(biāo)記的角毛藻抗體的玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層，該層一端置于玻璃纖維膜樣品層下，并與塑料載體板膠合，另一端設(shè)置在硝酸纖維膜檢測(cè)層之上，并與硝酸纖維膜檢測(cè)層膠合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上的角毛藻抗原分級(jí)標(biāo)記線由檢測(cè)濃度分別為1010個(gè)/m3、108個(gè)/m3、106個(gè)/m3的三條標(biāo)記線組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上的二抗質(zhì)控線包被有羊抗兔IgG；角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層上載有膠體金標(biāo)記的兔抗角毛藻抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層上的膠體金標(biāo)記的兔抗角毛藻抗體制備方法如下(1)膠體金的制備鞣酸—檸檬酸三鈉還原法制備20～30nm的膠體金，4℃保存；(2)兔抗角毛藻抗體的制備將生長(zhǎng)旺盛的角毛藻細(xì)胞培養(yǎng)溶液用終濃度為1～3％的甲醛固定過(guò)夜，8000～12000r/min離心10min，收集藻細(xì)胞沉淀；藻細(xì)胞團(tuán)塊再用蒸餾水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通過(guò)離心收集藻細(xì)胞，離心條件均為，8000～12000r/min，8～12min；將收集的藻細(xì)胞分裝于1.5ml Eppendorf管，將角毛藻藻細(xì)胞破碎物用滅菌的0.3～0.6mlPBS重懸，混勻，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，乳化程度盡量完全；初次免疫劑量分別約為1×106、2×106和4×106個(gè)細(xì)胞每只動(dòng)物；靜脈采血，采集的血液室溫放置2小時(shí)，然后2000～6000r/min，離心5min，分離血清，4℃冷藏保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上的二抗質(zhì)控線包被有羊抗雞IgG；角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層上載有膠體金標(biāo)記的雞抗角毛藻抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜檢測(cè)層上的二抗質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG；角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜抗體標(biāo)記層上載有膠體金標(biāo)記的鼠抗角毛藻抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條的檢測(cè)范圍是藻細(xì)胞濃度檢出下限為106個(gè)/m3，在藻細(xì)胞濃度106-1010個(gè)/m3的范圍內(nèi)提供三級(jí)區(qū)分的半定量檢測(cè)結(jié)果1010個(gè)/m3、108個(gè)/m3、106個(gè)/m3；檢測(cè)時(shí)間少于30分鐘。
8.一種角毛藻半定量檢測(cè)試紙條的使用方法，其特征在于，所述角毛藻半定量檢測(cè)試紙條的使用方法是將被檢測(cè)樣品溶液過(guò)濾，濾膜對(duì)折放入5ml離心管中，加3mlPBS將濾膜完全浸泡，超聲波破碎5分鐘，去所得溶液1ml，剩余2ml溶液加入到2ml的離心管中，將角毛藻半定量檢測(cè)試紙條玻璃纖維膜樣品層插入離心管中，15～30分鐘后可觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種基于膠體金免疫層析分析技術(shù)(gold immuno chromato graphy assay，GICA)的半定量檢測(cè)角毛藻試紙條。包括塑料載體板、硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜。檢測(cè)試紙條硝酸纖維層、玻璃纖維層分別用膠固定在塑料載體板上；檢測(cè)試紙條硝酸纖維膜上設(shè)有角毛藻抗原分級(jí)標(biāo)記線、質(zhì)控線；吸水玻璃纖維素膜層置于硝酸纖維膜檢測(cè)層右端上方；該載體中部設(shè)有硝酸纖維膜檢測(cè)層，在該檢測(cè)層與加樣端吸水層交界處，設(shè)有載有膠體金標(biāo)記的兔抗角毛藻抗體的玻璃纖維素膜抗體標(biāo)記層。本發(fā)明為常規(guī)環(huán)境監(jiān)測(cè)、漁業(yè)養(yǎng)殖水體檢測(cè)、以及赤潮生效過(guò)程監(jiān)測(cè)的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，提供快速簡(jiǎn)便的對(duì)赤潮多發(fā)藻進(jìn)行半定量的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1786716SQ20051010949
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月24日
發(fā)明者米鐵柱, 孫靜, 甄毓, 亓海剛, 何閃英, 趙麗媛, 于志剛 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)