專利名稱：生物實(shí)體的分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析生物實(shí)體的方法，具體地說(shuō)(但不限于)，涉及分析生物細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及適合于執(zhí)行這種方法的計(jì)算機(jī)軟件和設(shè)備。
背景技術(shù)：
目前在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)以及在一般生物學(xué)研究上，都采用用于準(zhǔn)確地進(jìn)行基于細(xì)胞的測(cè)定的方法和設(shè)備。基于細(xì)胞的測(cè)定有利地用來(lái)評(píng)定化合物的生物活性。
在化合物的生物活性評(píng)定中，需要迅速而成本低廉地篩選大量的化合物。這種需要在制藥工業(yè)中出現(xiàn)，在所述工業(yè)中必須測(cè)試化合物對(duì)各種各樣生化靶，例如，受體、酶和核酸的活性。這些化合物被收集在龐大的文庫(kù)中，有時(shí)超過(guò)一百萬(wàn)種截然不同的化合物。在這里化合物這一術(shù)語(yǔ)的使用要作廣義的解釋，以便包括，但不限于簡(jiǎn)單的有機(jī)和無(wú)機(jī)分子、蛋白質(zhì)、肽、核酸和低核苷酸、碳水化合物、脂類或在生物學(xué)上感興趣的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)。
在化合物篩選領(lǐng)域中，基于細(xì)胞的測(cè)定是對(duì)細(xì)胞的群體進(jìn)行的。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO99/47963描述了一種易位測(cè)定，其中兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞物質(zhì)，例如生物細(xì)胞核和生物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)是用熒光標(biāo)記的。在所述測(cè)定中，采集圖像，既包括核又包括轉(zhuǎn)錄因子物種。為了分析細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的遷移，這樣處理這些圖像，以便可以確定所述兩種物質(zhì)的共存(co-localisation)。在所述易位測(cè)定的時(shí)間過(guò)程中，利用核染料，用熒光標(biāo)志所述細(xì)胞核。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO 03/031612描述了用于通過(guò)分析細(xì)胞的細(xì)胞核的核酸(例如DNA)隨著時(shí)間的變化來(lái)確定生物細(xì)胞周期階段的過(guò)程。在所述測(cè)定過(guò)程中記錄細(xì)胞的圖像，并且為了利用這些圖像分析細(xì)胞核，利用核染料將所述核著色。
利用諸如Hoechst(普匹碘銨)或DRAQ5等核染料將細(xì)胞的核酸(例如DNA)著色，用來(lái)標(biāo)識(shí)細(xì)胞核的空間定界(spatial definition)，由此形成核掩模。所述細(xì)胞的特性可以通過(guò)測(cè)量所述核掩模區(qū)域內(nèi)外所述細(xì)胞的特性來(lái)確定。但是，核染料對(duì)核酸的結(jié)構(gòu)是破壞性的，因此需要多個(gè)細(xì)胞樣品來(lái)研究所述生物活性隨著時(shí)間的進(jìn)展。在要分析好幾百個(gè)樣品的情況下，所述核酸的退化作用會(huì)成為一種速率限制。
這樣的核染料的組成分子通過(guò)核酸堿基對(duì)之間的嵌入而與核酸分子的分子結(jié)合。但是，在時(shí)限長(zhǎng)的試驗(yàn)過(guò)程中這種嵌入證實(shí)是對(duì)核酸呈毒性的。毒性造成核酸結(jié)構(gòu)的損傷，導(dǎo)致遺傳密碼的突變。這些突變干擾細(xì)胞的正確功能，并在針對(duì)化合物對(duì)生物細(xì)胞系統(tǒng)的作用來(lái)對(duì)化合物進(jìn)行篩選的情況下，在所收集的結(jié)果數(shù)據(jù)中引入了不希望有的誤差。
本發(fā)明的目的是應(yīng)付先有技術(shù)中與諸如核染料等標(biāo)記的使用有關(guān)的問(wèn)題。
發(fā)明概要按照本發(fā)明的第一方面，提供一種利用成像設(shè)備分析多個(gè)生物實(shí)體的方法，所述方法包括a)為所述多個(gè)生物實(shí)體提供一種標(biāo)記，當(dāng)利用成像設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述標(biāo)記能夠識(shí)別所述多個(gè)生物實(shí)體內(nèi)的目標(biāo)，這樣安排所述方法，使得所述標(biāo)記在第一時(shí)限過(guò)程中能夠識(shí)別所述目標(biāo)，而在第二時(shí)限過(guò)程中所述標(biāo)記不太能夠識(shí)別所述目標(biāo)；b)在第一時(shí)限過(guò)程中，記錄具有標(biāo)記的圖像，其中可以從所述標(biāo)記識(shí)別所述目標(biāo)的空間定界；c)在第二時(shí)限過(guò)程中，記錄多個(gè)生物實(shí)體的第一圖像；和d)利用從所述具有標(biāo)記的圖像推算的數(shù)據(jù)，產(chǎn)生所述第一圖像中目標(biāo)的空間定界。
第一時(shí)限最好在所述第二時(shí)限以前，或所述第一時(shí)限最好在所述第二時(shí)限之后。
所述生物實(shí)體最好是生物細(xì)胞。
所述目標(biāo)最好包括生物細(xì)胞核。
所述方法最好還包括通過(guò)利用所述生成空間定界分析所述第一圖像來(lái)分析所述多個(gè)生物實(shí)體的特性。
利用為多個(gè)生物細(xì)胞提供的能夠識(shí)別所述具有標(biāo)記的圖像中細(xì)胞核的空間定界的標(biāo)記，可以在其中所述標(biāo)記不太能夠識(shí)別所述細(xì)胞核的第一圖像中產(chǎn)生細(xì)胞核的空間定界。因此，利用在記錄所述具有標(biāo)記的圖像的第一時(shí)限以前或以后的第二時(shí)限過(guò)程中記錄的第一圖像，在所述第一時(shí)限以外的任何時(shí)限過(guò)程中就沒(méi)有必要讓所述標(biāo)記出現(xiàn)在生物細(xì)胞中。因而，便有可能分析所述多個(gè)細(xì)胞的特性，并獲得更準(zhǔn)確的和屬性可靠的結(jié)果數(shù)據(jù)，用于在較長(zhǎng)的時(shí)限內(nèi)對(duì)例如化合物進(jìn)行篩選分析。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種圖像分析方法，用于從利用成像設(shè)備產(chǎn)生的圖像分析多個(gè)生物實(shí)體，所述方法包括a)獲得多個(gè)生物實(shí)體的具有標(biāo)記的圖像，所述具有標(biāo)記的圖像已經(jīng)在第一時(shí)限過(guò)程中記錄，其中為所述多個(gè)生物實(shí)體提供的標(biāo)記能夠識(shí)別實(shí)體內(nèi)的目標(biāo)；b)獲得多個(gè)生物實(shí)體的第一圖像，所述第一圖像已經(jīng)在第二時(shí)限過(guò)程中記錄，其中所述標(biāo)記不太能夠識(shí)別所述目標(biāo)；c)利用從所述具有標(biāo)記的圖像推算的數(shù)據(jù)，產(chǎn)生第一圖像的目標(biāo)的空間定界。
具體地說(shuō)，本發(fā)明的這個(gè)方面涉及圖像分析方法，它可以在不同于記錄所述圖像的時(shí)間和/或位置進(jìn)行。
從參照附圖進(jìn)行的對(duì)僅僅作為例子給出的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的以下描述中，可以明白本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖的簡(jiǎn)短描述

圖1是用于將多個(gè)生物實(shí)體成像的線掃描共焦顯微鏡的示意圖；圖2a和2b分別示意地顯示按照本發(fā)明實(shí)施例的用來(lái)將多個(gè)生物實(shí)體成像的多波長(zhǎng)線掃描共焦顯微鏡的頂視圖和側(cè)視圖；圖2c示意地表示按照本發(fā)明實(shí)施例的單一光束自動(dòng)聚焦系統(tǒng)的射線路徑的頂視圖；圖3a和3b分別表示按照本發(fā)明實(shí)施例的具有掃描反射鏡的多波長(zhǎng)線掃描共焦顯微鏡的射線路徑的頂視圖和側(cè)視圖；圖3c是按照本發(fā)明實(shí)施例的單一光束自動(dòng)聚焦系統(tǒng)的射線路徑的示意的頂視圖；圖4示意地表示按照本發(fā)明實(shí)施例的雙光束自動(dòng)聚焦系統(tǒng)的側(cè)視圖；圖5a、5b和5c示意地舉例說(shuō)明按照本發(fā)明實(shí)施例的矩形CCD攝像機(jī)和讀出寄存器；圖6示意地舉例說(shuō)明按照本發(fā)明實(shí)施例的成像數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的數(shù)據(jù)處理部件；圖7是按照本發(fā)明實(shí)施例的多個(gè)生物實(shí)體內(nèi)各目標(biāo)的圖像和關(guān)聯(lián)的空間定界的示意圖；圖8是按照本發(fā)明實(shí)施例的多個(gè)生物實(shí)體的各目標(biāo)的周圍空間的示意圖；圖9是說(shuō)明按照本發(fā)明實(shí)施例的分析多個(gè)生物實(shí)體的方法的流程圖；圖10-13示意地表示按照本發(fā)明不同的實(shí)施例的生物實(shí)體圖像分析的時(shí)間方向。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明對(duì)識(shí)別用于治療疾病的藥劑是有用的。它提供一種用于進(jìn)行各種各樣生物測(cè)定的高產(chǎn)方法，其中使用一個(gè)或多個(gè)發(fā)光標(biāo)記來(lái)測(cè)量生物響應(yīng)?？梢詫?duì)在生物學(xué)上感興趣的化合物或任何分子(包括但是不限于候選藥物，諸如在組合文庫(kù)找到的候選藥物)進(jìn)行這樣的測(cè)定，因而，允許對(duì)這樣的化合物進(jìn)行高產(chǎn)篩選。
本發(fā)明的技術(shù)可以應(yīng)用在測(cè)定中，其中，采集關(guān)于多個(gè)生物實(shí)體，例如各個(gè)生物細(xì)胞的數(shù)據(jù)，其方法是在細(xì)胞或亞細(xì)胞級(jí)別上足夠快速地采集這種數(shù)據(jù)以便允許采集關(guān)于足以構(gòu)成有統(tǒng)計(jì)意義的細(xì)胞群體樣品的足夠數(shù)量的細(xì)胞的這種數(shù)據(jù)。
這些測(cè)定可以利用各種不同的標(biāo)記，包括已知的熒光團(tuán)或熒光標(biāo)簽，包括(但是不限于)熒光黃；堿性蕊香紅；Texas紅；Amersham公司著色劑Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7；Hoechst的核著色劑和香豆素著色劑(見Haugland R.P.Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals 6thEd.，1996，Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon.)。
光學(xué)配置圖1表示成像設(shè)備，包括本發(fā)明實(shí)施例的線掃描共焦顯微鏡。所述顯微鏡包括電磁輻射源100或110(例如在350-750nm的光學(xué)范圍內(nèi))、柱面透鏡120、第一狹縫掩蔽130、第一中繼透鏡140、分光鏡150、物鏡170、包含樣品孔的二維陣列182的微量滴定板180、管式透鏡190、濾光鏡200、第二狹縫掩模210和檢測(cè)器220。這些元件沿著光軸OA排列，使蔽模130、210上的狹縫開孔132、212垂直于圖1平面。透鏡140、170和190的焦距和這些透鏡之間的間隔以及掩模130和透鏡140之間的間隔、物鏡170和微量滴定板180之間以及透鏡190和掩模210之間的間隔具有這樣的值，以便形成共焦顯微鏡。在所述實(shí)施例中，來(lái)自燈100或激光110的電磁輻射利用柱面透鏡120聚焦為一條直線。所述直線的形狀通過(guò)第一狹縫掩模130優(yōu)化。狹縫掩模130畫在與物平面共扼的光學(xué)系統(tǒng)圖像平面上。通過(guò)狹縫掩模130中的孔132形成的照明條紋由透鏡140、分光鏡150和物鏡170中繼在微量滴定板180上，后者包含樣品孔的二維陣列182。為舉例說(shuō)明方便起見，以剖面圖的形式描繪圖1的光學(xué)元件，而以透視圖的形式描繪孔板。用線條184描繪照明線條在孔板180上的投影，并且所述投影顯然垂直于圖1的平面。如箭頭A和B所表明的，孔板180可以在與所述陣列的尺寸平行的二維上通過(guò)未示出的裝置移動(dòng)。
在一個(gè)替代實(shí)施例中，狹縫掩模130駐留在光學(xué)系統(tǒng)的富里葉平面上，就是說(shuō)，在與物鏡后焦平面(BFP)160共扼的平面上。在這種情況下，孔132處在圖平面上，透鏡140中繼由孔132在物鏡170的后焦平面160上形成的照明條紋，物鏡170將其變換為垂直于圖1平面的物平面上的線條184。
在附加的替代實(shí)施例中，狹縫掩模130完全取消。按照所述實(shí)施例，照明光源是激光110，來(lái)自激光110的光聚焦在物鏡170的后焦平面160中。這可以通過(guò)柱面透鏡120和球面透鏡140的組合完成，如圖1所示，或者所述照明可以通過(guò)柱面透鏡120直接聚焦在平面160中。
通過(guò)把照明線條投影在樣品內(nèi)的平面上來(lái)獲得樣品區(qū)域(例如樣品孔182中多個(gè)生物細(xì)胞的樣品)的圖像，使由此產(chǎn)生的熒光發(fā)射在檢測(cè)器220上成像，并使孔板180在與所述照明線條垂直的方向上與檢測(cè)器220的讀數(shù)同步地移動(dòng)。在圖1所描繪的實(shí)施例中，通過(guò)物鏡170收集熒光發(fā)射，通過(guò)二色分光鏡150投影，并通過(guò)濾光鏡200和第二狹縫掩模210利用透鏡190成像在檢測(cè)器220上，諸如適合于具有無(wú)限校正的物鏡170的共焦成像系統(tǒng)的檢測(cè)器。二色分光鏡150和濾光鏡200優(yōu)先阻擋照明波長(zhǎng)的光線。檢測(cè)器220作為例證是一個(gè)攝像機(jī)，而且可以或者是一維或者是二維的。若使用一維檢測(cè)器，則不需要狹縫掩模210。照明、檢測(cè)和平移程序一直繼續(xù)到預(yù)定區(qū)域已被成像為止。若樣品以連續(xù)的速率平移，則簡(jiǎn)化了機(jī)械運(yùn)動(dòng)。若攝像機(jī)讀入時(shí)間比曝光時(shí)間短，則連續(xù)運(yùn)動(dòng)最有用。在優(yōu)選實(shí)施例中，連續(xù)地讀出攝像機(jī)。在組合的曝光時(shí)間和讀入時(shí)間內(nèi)，樣品的位移d可以大于或者小于照明線條的寬度W，例如，0.5W≤d≤5W。可以以類似的方式將多孔板的全部孔成像。
作為另一方案，顯微鏡可以配置成使照明線條跨越若干相鄰孔，主要受光學(xué)系統(tǒng)視場(chǎng)的限制。最后，可以同時(shí)使用一個(gè)以上顯微鏡。
照明條紋184的尺寸和形狀由物鏡后焦平面160上富里葉變換條紋的寬度和長(zhǎng)度確定。例如，線條184的長(zhǎng)度由所述直線在160上的寬度確定，反之，線條184的寬度由160上的長(zhǎng)度確定。對(duì)于受衍射限制的性能，選擇照明條紋在160的長(zhǎng)度，以便過(guò)量填注物鏡后孔。對(duì)本專業(yè)技術(shù)人員顯而易見的是，照明條紋184的尺寸和形狀可以由柱面透鏡120的焦距和120處的光束尺寸結(jié)合控制，就是說(shuō)，在物鏡像差所加的限制范圍內(nèi)，受每一維的有效數(shù)值孔徑和物鏡的視域控制。
選擇照明線條184的尺寸，以便優(yōu)化信噪比。因而，它們與樣品有關(guān)。取決于所述測(cè)定，分辨率可以在受衍射限制的尺寸，亦即小于0.5μm和約5μm之間改變。光束的長(zhǎng)度最好由物鏡的視域確定，例如，在0.5和1.5mm之間。例如，Nikon ELWD，0.6NA，10X物鏡具有約0.75mm的視域。利用這種物鏡，對(duì)于633nm輻射，受衍射限制的分辨率約為0.6μm或約1100個(gè)分辨元。
有效深度分辨率主要由狹縫掩模210中孔212的寬度或一維檢測(cè)器的寬度和由物鏡170和透鏡190結(jié)合建立的圖像放大倍數(shù)確定。共焦顯微鏡的最佳深度分辨率接近1μm。在目前的應(yīng)用下，5-10μm的深度分辨率可能是足夠的或甚至是有利的。
例如，當(dāng)感興趣的樣品，諸如活細(xì)胞在受衍射限制的容積中包含的熒光團(tuán)不足以在足夠短的圖像采取時(shí)間中允許獲得適當(dāng)信噪比的圖像時(shí)，最好進(jìn)行照射并從大于受衍射限制的容積采集發(fā)射。在暫態(tài)事件(諸如離子溝道開孔)的視頻動(dòng)力學(xué)研究的情況下，類似的情況占優(yōu)勢(shì)。實(shí)際上，這是由填充不足(underfilling)的物鏡后孔完成的，這等效于增大照明孔的直徑。所述照明的有效數(shù)值孔徑(″NA″)小于物鏡的NA。但是，熒光發(fā)射是用物鏡的全NA收集的?？?12的寬度必須增大，以便檢測(cè)來(lái)自較大照明容積的發(fā)射。在比衍射極限大幾倍的孔寬度下，幾何光學(xué)元件提供檢測(cè)容積元素的尺寸的適當(dāng)近似側(cè)向?qū)挾萢d＝dd/M，軸向?qū)挾萙d＝√2ad√tanα，其中M是放大倍數(shù)，dd是孔212的寬度，而α是物鏡170所對(duì)的半角。在沒(méi)有孔而檢測(cè)孔212獨(dú)立可控的實(shí)施例中，照明孔132或它的等效物是本發(fā)明的重要的一部分。
多波長(zhǎng)配置對(duì)于某些類型的測(cè)定，推薦利用能夠進(jìn)行多波長(zhǎng)熒光成像的成像設(shè)備的不同的實(shí)施例。這樣，便可以同時(shí)在多個(gè)不同的顏色通道針對(duì)正在成像的同一區(qū)域產(chǎn)生圖像數(shù)據(jù)。
獨(dú)立波長(zhǎng)或顏色通道的數(shù)目取決于正在完成的特定的測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施例中，使用三個(gè)照明波長(zhǎng)。圖2A和2B分別從頂視圖和側(cè)視圖描繪三色線掃描共焦成像系統(tǒng)中的射線路徑。一般，所述系統(tǒng)包括幾個(gè)電磁輻射源Sn；準(zhǔn)直透鏡Ln和反射鏡Mn，用于產(chǎn)生由圓柱形透鏡CL在第一空間濾光鏡SF1上聚焦成長(zhǎng)形光束的準(zhǔn)直光束；第一空間濾光鏡SF1和第二空間濾光鏡SF2之間的共焦顯微鏡和成像透鏡IL；分束器DM1和DM2以及檢測(cè)器Dn，用于分離和檢測(cè)來(lái)自樣品的熒光輻射的不同的波長(zhǎng)分量?？臻g濾光鏡SF，以及SF1和SF2最好是狹縫蔽模。
具體地說(shuō)，圖2A描述用于顏色通道λ1、λ2和λ3的源S1、S2和S3以及用于準(zhǔn)直來(lái)自各自源的光的透鏡L1、L2和L3。透鏡L1、L2和L3最好調(diào)整成補(bǔ)償所述系統(tǒng)中其他透鏡的色度。反射鏡M1、M2和M3用來(lái)結(jié)合來(lái)自各源Sn的照明顏色通道。反射鏡M2和M1部分地透射部分地反射，而且最好是二色性的。例如，M2應(yīng)優(yōu)先透射λ3，和優(yōu)先反射λ2。因而，最好λ3大于λ2。
顯微鏡在共焦點(diǎn)方式下的操作要求來(lái)自源Sn的合成激發(fā)光束聚焦在物平面OP上一條″直線″上或高度偏心的橢圓。如上面聯(lián)系圖1所討論的，可以用各種各樣的配置來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。在圖2中描繪的實(shí)施例中，所述合成照明光束由柱面透鏡CL聚焦在與空間濾光鏡SF1中的狹縫一致的伸長(zhǎng)的橢圓上。如圖2A和2B所描繪的，狹縫掩模SF1位于系統(tǒng)的圖像平面上，調(diào)整成與照明光的傳播方向垂直，而其長(zhǎng)軸在圖2A頁(yè)面的平面內(nèi)。透鏡TL和OL把來(lái)自包含SF1的平面的照明線條中繼到物平面OP。轉(zhuǎn)動(dòng)的反射鏡TM是為方便而采用的。在另一各實(shí)施例中，DM3處在TL和OL之間，而CL把照明光線直接聚焦在BFP中。對(duì)于本專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯然將會(huì)有其它實(shí)施例。
參見圖2B，光通過(guò)樣品透射，由所述物鏡OL收集，由管式透鏡TL成像在空間濾光鏡SF2上。SF2最好是狹縫對(duì)準(zhǔn)的，使得其沿著與頁(yè)面平面垂直的方向延伸。因而，通過(guò)濾光鏡SF2的光基本上是一條照明線條。SF2可以設(shè)置在主圖像平面或與其共扼的任何平面內(nèi)。DM3部分地反射部分地透射并且最好是″多色的″。多波長(zhǎng)″二色的″反射鏡或″多色的″反射鏡可以獲得優(yōu)先反射某些波長(zhǎng)的頻帶，并優(yōu)先透射其他頻帶。
這里，δλ1已定義為由λ1激勵(lì)的熒光發(fā)射。一般，這將是波長(zhǎng)略為長(zhǎng)于λ1的分布。δλ2和δλ3作類似的定義。DM3最好反射λn并最好透射δλn，n＝1、2、3。由SF2透射的光成像在檢測(cè)裝置上，后者駐留在與主圖像平面共扼的平面上。在圖2A中，通過(guò)透鏡IL在全部三個(gè)檢測(cè)器Dn上建立空間濾光鏡SF2的圖像。所述實(shí)施例最好用于在由各自檢測(cè)器產(chǎn)生的圖像之間需要接近完善的登錄庫(kù)的應(yīng)用中。在另一個(gè)實(shí)施例中，各個(gè)透鏡ILn與檢測(cè)裝置相聯(lián)系，透鏡對(duì)IL和ILn用來(lái)把空間濾光鏡SF2的圖像中繼到各自檢測(cè)器Dn。所述光在各檢測(cè)器當(dāng)中被反射鏡DM1和DM2分光。所述反射鏡部分地透射，部分地反射而且最好是二色的。DM1優(yōu)先反射δλ1和優(yōu)先透射δλ2和δλ3。遮光濾光鏡BF1優(yōu)先透射δλ1并有效地阻擋出現(xiàn)的全部其它波長(zhǎng)。DM2優(yōu)先反射δλ2和優(yōu)先透射δλ3。遮光濾光鏡BF2和BF3分別優(yōu)先透射δλ2和和δλ3，有效地阻擋出現(xiàn)的全部其它波長(zhǎng)。
掃描反射鏡配置在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，通過(guò)成幀圖像以視頻速率提供快速的數(shù)據(jù)采集。視頻速率成像允許多達(dá)每秒30或甚至60幀。在目前的使用中，企圖包含30Hz數(shù)量級(jí)的幀速率。在優(yōu)選實(shí)施例中，視頻速率成像是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的沿著所述樣品平面的一維照明，并使照明光束在與其垂直的方向上掃描，以便實(shí)現(xiàn)照明和樣品的相對(duì)平移。掃描級(jí)一般是笨重的。因而，不能足夠快速地移動(dòng)掃描級(jí)。
圖3描述本發(fā)明利用掃描反射鏡SM的實(shí)施例。反射鏡最好設(shè)置在與物鏡后焦平面(BFP)共扼的平面內(nèi)BFP(或與其共扼的平面)內(nèi)的旋轉(zhuǎn)引起物平面(OP)和它的共扼平面上的平移。對(duì)于透鏡RL1和RL2的典型焦距值，全掃描范圍SM只需要幾度。如圖3所示，透鏡對(duì)以1的放大倍數(shù)把BFP成像在SM上，但是各種各樣的放大倍數(shù)都可以有利地使用。對(duì)圖像采集速率的限制因素是攝像機(jī)的讀速度和信號(hào)的強(qiáng)度。在上述成像方式下，可以以攝像機(jī)的讀速度，例如，1MHz連續(xù)地采集數(shù)據(jù)。采用掃描反射鏡，最好單向采集數(shù)據(jù)。允許連續(xù)地采集數(shù)據(jù)的理想化的掃描運(yùn)動(dòng)是鋸齒形。在實(shí)踐中，周轉(zhuǎn)時(shí)間和回掃時(shí)間的組合將構(gòu)成掃描周期的大約1/3-2/3。假定50％的空載時(shí)間、50Hz的反射鏡振動(dòng)頻率和1MHz的像素采集速率，則在每秒50幀下每幀采集大約10,000個(gè)像素，這足以逐幀地定義和跟蹤各個(gè)目標(biāo)，諸如細(xì)胞。但是，每個(gè)圖像104個(gè)像素，比上面一般地考慮的少102倍。取決于用途，最好以高的分辨率(例如50μm×50μm)在0.5μm×0.5μm像素化條件下采集相對(duì)較小的圖像，或者以較低的分辨率(例如200μm ×200-μm)在2μm像素化條件下采集相對(duì)較大的圖像。
自動(dòng)聚焦在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，樣品位于成像系統(tǒng)的物平面上。相應(yīng)地，自動(dòng)聚焦機(jī)構(gòu)用來(lái)把樣品的所述部分保持在所述成像系統(tǒng)的物平面內(nèi)該系統(tǒng)的視場(chǎng)中。系統(tǒng)的視場(chǎng)深度確定了平面性精度。在優(yōu)選實(shí)施例中，視場(chǎng)深度約為10μm，而視場(chǎng)約為1mm2。
自動(dòng)聚焦系統(tǒng)以可以忽略的延遲時(shí)間運(yùn)行，就是說(shuō)，響應(yīng)時(shí)間相對(duì)于圖像采集時(shí)間是短的，例如，0.01-0.1s。另外，自動(dòng)聚焦光源與照明光源和樣品特性無(wú)關(guān)。在其它優(yōu)點(diǎn)當(dāng)中，所述配置允許與物平面的位置無(wú)關(guān)地確定樣品載體沿成像系統(tǒng)光軸的位置。
圖2C和3C中示出單光束自動(dòng)聚焦的實(shí)施例，其中示出波長(zhǎng)λ4的單獨(dú)光源S4和檢測(cè)器D4。波長(zhǎng)λ4必須與樣品熒光截然不同，最好是無(wú)法在所述樣品中激勵(lì)感覺得到的熒光的波長(zhǎng)。因而，λ4最好是在近紅外，例如，800-1000nm。所述部分地透射、部分地反射的反射鏡DM4最好是二色的，反射λ4而透射λn和δλn，n＝1、2、3。適用于本申請(qǐng)的基于光學(xué)的自動(dòng)聚焦機(jī)制是已知的。例如，在AppliedOptics(應(yīng)用光學(xué))23 565-570(1984)公開了一種基于像散透鏡的系統(tǒng)，用于產(chǎn)生適用于伺服裝置控制的位置誤差信號(hào)。SPIE 200 73-78(1979)公開了一種利用″歪斜光束″的焦點(diǎn)誤差檢測(cè)系統(tǒng)。后一種方法容易按照?qǐng)D2C和3C實(shí)現(xiàn)，其中D4是分光檢測(cè)器。
但是，為了用在具有駐留在孔底部的樣品的微量滴定板上，必須斷開伺服裝置回路以便在孔與孔之間移動(dòng)。這可能造成相當(dāng)大的時(shí)間延遲，因?yàn)槊看伟颜彰饕苿?dòng)到另一個(gè)孔都需要重新聚焦。
在圖4中描繪的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例提供對(duì)樣品平面和物平面的相對(duì)位置的連續(xù)閉環(huán)控制。所述系統(tǒng)利用兩個(gè)獨(dú)立的電磁輻射光束。一個(gè)源自S5，聚焦在連續(xù)表面上，例如，微量滴定板的底部。另一個(gè)源自S4，聚焦在不連續(xù)的表面上，例如，微量滴定板的孔底部。在一個(gè)實(shí)施例中，源自S4和S5的光束分別具有波長(zhǎng)λ4和λ5。λ4通過(guò)L4準(zhǔn)直，利用虹膜14作為光圈，并通過(guò)物鏡OL聚焦在不連續(xù)表面上。λ5通過(guò)L5準(zhǔn)直，利用虹膜I5作為光圈，利用與物鏡OL協(xié)作的透鏡CFL聚焦在連續(xù)表面上。反射光分別通過(guò)透鏡IL4和IL5聚焦在檢測(cè)器D4和D5上。部分地透射、部分地反射的反射鏡DM4最好是二色的，反射λ4和λ5，并透射λn和δλn，n＝1、2、3。反射鏡M4、M5和M6是部分地透射、部分地反射的。在λ4和λ5截然不同的情況下，M6最好是二色的。
按照本實(shí)施例，其中樣品駐留在微量滴定板上，λ4聚焦在孔底部上。物平面可以偏離孔底部可變距離。這是通過(guò)調(diào)整L4或者作為另一方案，通過(guò)伺服裝置控制回路中的偏移量調(diào)整完成的。為方便描述起見，假定λ4聚焦在物平面上。
自動(dòng)聚焦系統(tǒng)的操作如下。若樣品孔的底部不在物鏡OL的焦平面上，則檢測(cè)器D4產(chǎn)生通過(guò)開關(guān)SW提供給Z控制的誤差信號(hào)。Z控制控制電動(dòng)機(jī)(未示出)，以便使電動(dòng)機(jī)向著或離開物鏡的微量滴定板的方向移動(dòng)。作為另一方案，Z控制可以移動(dòng)所述物鏡。若微量滴定板的底部PB不在透鏡CFL和物鏡OL的組合的焦平面上，則檢測(cè)器D5產(chǎn)生誤差信號(hào)，通過(guò)開關(guān)SW施加在Z控制上。XY控制控制用于在透鏡OL的物平面OP上移動(dòng)所述微量滴定板的電動(dòng)機(jī)(未示出)。
如所表明的，整個(gè)掃描都處在計(jì)算機(jī)的控制之下。示例性掃描如下在完成特定孔的圖像時(shí)，計(jì)算機(jī)操作SW來(lái)把伺服裝置機(jī)構(gòu)的控制從由D4產(chǎn)生的誤差信號(hào)切換到由D5產(chǎn)生的誤差信號(hào)；然后計(jì)算機(jī)指導(dǎo)XY控制，以便把平板移動(dòng)到下一個(gè)孔，此后伺服裝置被切換回到D4。
利用來(lái)自平板底部的信號(hào)的″粗″聚焦機(jī)構(gòu)用來(lái)把樣品平面的位置維持在平板底部厚度的孔到孔變化的范圍內(nèi)，以便把要求″細(xì)″機(jī)構(gòu)搜索的范圍減到最小。例如，若虹膜Is的直徑為2mm，而IL5為100mm，則檢測(cè)器上圖像的尺寸將為～100μm。類似地，若虹膜I4的直徑為0.5mm，而IL4為100mm，則檢測(cè)器上圖像的尺寸將為～400μm。選擇不那么敏感的后者，以便起″粗″聚焦作用。
與上述單光束實(shí)施例一樣，波長(zhǎng)λ4和λ5必須與樣品熒光截然不同，最好是無(wú)法激勵(lì)所述樣品內(nèi)感覺得到的熒光的波長(zhǎng)。因而，λ4和λ5最好在近紅外，諸如800-1000nm。另外，所述兩個(gè)波長(zhǎng)最好截然不同，例如λ4＝830nm，λ5＝980nm。
在雙光束自動(dòng)聚焦的替代方案實(shí)施例中，λ4＝λ5，而且雙光束可以源自同一輻射源。所述雙光束最好是彼此垂直偏振的，而M6是偏振分束器。
在單光束自動(dòng)聚焦的優(yōu)選實(shí)施例中提供偽閉環(huán)回路控制，其操作如下。掃描結(jié)束時(shí)，計(jì)算機(jī)操作SW把控制切換到采樣保持裝置上，后者把Z控制輸出保持在恒定的電平上，而同時(shí)所述平板在SW切換回到D4之后被移動(dòng)到下一個(gè)孔。
檢測(cè)裝置使用在與物平面共扼的平面上具有多個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)元件的檢測(cè)裝置。如上面討論的，線照明主要在要求迅速的成像的應(yīng)用中是有利的。但是，與點(diǎn)照明相比，線照明的并行操作中固有的潛在的速度增大只有所述成像系統(tǒng)能夠同時(shí)檢測(cè)來(lái)自所述樣品沿著照明線條的每一個(gè)點(diǎn)的光發(fā)射時(shí)才能實(shí)現(xiàn)。
可以在上述先有技術(shù)成像系統(tǒng)(White等人，美國(guó)專利5,452,125以及Brakenhoff和Visscher的J.Microscopy 171 17-26(1993))的輸出端設(shè)置電荷耦合器件(CCD)或其它攝像機(jī)。所得設(shè)備和本發(fā)明對(duì)比具有三個(gè)重大的缺點(diǎn)。一個(gè)是要求再掃描所述二維檢測(cè)器上的圖像，這不必要地增加了設(shè)備的復(fù)雜性。另一個(gè)是要求完全的二維檢測(cè)器，具有足夠的質(zhì)量，一般構(gòu)成攝像機(jī)的超過(guò)1000像素×1000像素的陣列。第三個(gè)缺點(diǎn)是從所述二維裝置讀入整個(gè)圖像要求的額外的時(shí)間。
為了避免這些缺點(diǎn)并且不僅在高靈敏度和低噪音檢測(cè)的約束下優(yōu)化成像速度，而且優(yōu)化通過(guò)量，使用連續(xù)讀出的線掃描攝像機(jī)，并在優(yōu)選實(shí)施例中，矩形CCD用作線掃描攝像機(jī)。兩個(gè)實(shí)施例都在圖像內(nèi)各行之間或圖像之間沒(méi)有停滯時(shí)間。附加的優(yōu)點(diǎn)是，在下面討論的分階段掃描的實(shí)施例中可以使用較大的有效視場(chǎng)。
通過(guò)考慮以下的優(yōu)選實(shí)施例可以進(jìn)一步明白所述檢測(cè)裝置的所需的特性。物鏡分辨率極限是＜1μm，一般為0.5μm，而且檢測(cè)器包括1000個(gè)獨(dú)立元件的陣列。分辨率、視場(chǎng)(FOV)和圖像采集速率不是獨(dú)立的變量，必須在性能參數(shù)當(dāng)中折衷。一般，把光學(xué)系統(tǒng)的放大倍數(shù)設(shè)置成使圖像在不犧牲分辨率的情況下以盡可能大的FOV成像。例如，可以以1μm像素化(pixelation)將～1mm的視場(chǎng)成像在1000個(gè)元件的陣列上。若檢測(cè)元件是20μm正方形，則系統(tǒng)的放大倍數(shù)被設(shè)置為20X。應(yīng)當(dāng)指出，這不會(huì)得出1μm的分辨率。像素化不等效于分辨率。例如，若物鏡的固有分辨率極限是0.5μm，而物平面上每一個(gè)0.5μm×0.5μm區(qū)域映射在像素上，則所得數(shù)字圖像的真實(shí)的分辨率不是0.5μm。為了達(dá)到0.5μm的真實(shí)分辨率，像素化需要對(duì)應(yīng)于物平面上的0.2μm×0.2μm的區(qū)域。在優(yōu)選實(shí)施例中，把成像系統(tǒng)的放大倍數(shù)設(shè)置成達(dá)到光學(xué)元件的真實(shí)分辨率。
當(dāng)前，用于當(dāng)前應(yīng)用的具有足夠高的讀出速度的最高檢測(cè)效率、最低噪音的檢測(cè)裝置是CCD攝像機(jī)。圖5中描繪了一個(gè)矩形CCD攝像機(jī)，具有m×n個(gè)檢測(cè)器陣列元件，其中m比n小得多。熒光發(fā)射的圖像覆蓋最好接近讀入寄存器的一行。這把轉(zhuǎn)移時(shí)間減到最小，并避免把假計(jì)數(shù)累積到來(lái)自舉例說(shuō)明的行和讀數(shù)寄存器的信號(hào)中。
原理上可以這樣設(shè)置所述光學(xué)系統(tǒng)的放大倍數(shù)，使得狹縫SF2在CCD攝像機(jī)上的圖像高度是一個(gè)像素，如圖5所描繪的。在實(shí)踐中，難以在照明線條和攝像機(jī)行軸線之間維持完美對(duì)齊，而且在圖2和3舉例說(shuō)明的多波長(zhǎng)實(shí)施例中在三個(gè)攝像機(jī)和照明當(dāng)中維持對(duì)齊就更困難。通過(guò)把攝像機(jī)每一列中的幾個(gè)檢測(cè)器元件，例如，兩個(gè)到五個(gè)共同組成一組，可以放松對(duì)齊條件，而同時(shí)在讀出噪音或讀出時(shí)間上付出最小的代價(jià)。
具有與可變寬度的檢測(cè)空間濾光鏡(圖2和3中的SF2和圖1中的210，每一個(gè)都設(shè)置在與物平面共扼的平面上)協(xié)作的作為檢測(cè)裝置的一個(gè)或多個(gè)矩形CCD攝像機(jī)的優(yōu)選實(shí)施例的附加優(yōu)點(diǎn)闡明如下。如上面討論的，在本發(fā)明的實(shí)施例中，省去檢測(cè)空間濾光鏡，而線掃描攝像機(jī)用作組合的檢測(cè)空間濾光鏡和檢測(cè)裝置。但也如上面討論的，可變寬度的檢測(cè)空間濾光鏡允許檢測(cè)容積最佳化，以便優(yōu)化取決于樣品的信噪比。以下優(yōu)選實(shí)施例保留了線掃描攝像機(jī)的優(yōu)點(diǎn)，就是說(shuō)，可變檢測(cè)容積的速度和靈活性。這樣設(shè)置放大倍數(shù)，以便把高度h的受衍射限制的線條成像在攝像機(jī)的一行上。檢測(cè)空間濾光鏡的寬度d最好是可變的(h≤d≤10h)。在讀數(shù)之前，把攝像機(jī)的被照明的列中的檢測(cè)器分倉(cāng)(binned)，和曝光和讀入時(shí)間對(duì)比，所述分倉(cāng)操作是一種所需時(shí)間短到可以忽略的操作。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，攝像機(jī)是Princeton InstrumentsNTE/CCD-1340/100-EMD。優(yōu)選實(shí)施例中，在幾個(gè)電子的讀出噪音條件下的讀速度是1MHz。像素格式是1340×100，而且攝像機(jī)可以是有線的，以便把大多數(shù)行(80％)移出感興趣的區(qū)域，使攝像機(jī)實(shí)際上是1340×20。
除了連續(xù)讀出的攝像機(jī)的上述優(yōu)點(diǎn)(亦即相繼的采集之間不存在停滯時(shí)間)以外，附加的優(yōu)點(diǎn)是，它允許對(duì)長(zhǎng)度只受樣品范圍限制的矩形圖像的采集。長(zhǎng)度由攝像機(jī)的寬度和線照明的范圍中較小的一個(gè)確定。在優(yōu)選實(shí)施例中，樣品設(shè)置在96孔微量滴定板(其直徑是7mm)中孔的底部。被照明的1μm×1mm的條紋和從被照明的區(qū)域發(fā)射來(lái)的輻射成像在檢測(cè)裝置上。這樣設(shè)計(jì)所述光學(xué)系統(tǒng)，使得所述視場(chǎng)為～1mm2。按照本發(fā)明，可以在1×7mm的視場(chǎng)上產(chǎn)生1μm像素化的孔底圖像。
環(huán)境控制在本發(fā)明的實(shí)施例中，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定?；罴?xì)胞測(cè)定往往需要合理地逼近生理學(xué)條件，以便正確地進(jìn)行所述測(cè)定。在重要的參數(shù)當(dāng)中有溫度。最好包含一種裝置來(lái)提高和降低溫度，具體地說(shuō)，以便把樣品的溫度維持在37℃。在另一個(gè)實(shí)施例中，必須控制相對(duì)濕度和/或CO2和/或O2，以便維持活細(xì)胞的活力。另外，控制濕度，把蒸發(fā)減到最小對(duì)小的樣品體積是重要的。
三個(gè)實(shí)施例提供在升高的溫度(最好37℃)下與下述的LCI系統(tǒng)兼容的微量滴定板。
成像系統(tǒng)最好駐留在不透光的外殼內(nèi)。在第一實(shí)施例中，通過(guò)把所述外殼的整個(gè)內(nèi)部維持在所述溫度下來(lái)把樣品板維持在所需的溫度下。但是，在37℃下，除非有意地維持升高的濕度，否則蒸發(fā)冷卻將降低樣品體積限制的測(cè)定持續(xù)時(shí)間。
第二實(shí)施例為微孔板提供加熱覆蓋層，所述覆蓋層允許微孔板在固定式覆蓋層下移動(dòng)。覆蓋層具有在與顯微鏡的光軸對(duì)準(zhǔn)的孔上面的單一的開孔。所述開孔允許向工作的孔中配送物料，而同時(shí)維持加熱和到所述板其余部分的有限的循環(huán)。加熱覆蓋層平板和微孔板之間的間隔約為0.5mm，允許所述微孔板的自由運(yùn)動(dòng)，并把蒸發(fā)減到最小。被檢查的孔的內(nèi)容通過(guò)分配器開孔曝露于周圍條件下最多幾秒時(shí)，在所述測(cè)量過(guò)程中所述內(nèi)容不會(huì)遭受重大的溫度變化。
在第三實(shí)施例中，用薄的加熱藍(lán)寶石窗口作為板底部外殼。沿著孔分隔板的電阻加熱器圖案把所述窗口的溫度維持在所需的水平上。
在附加的實(shí)施例中，可以以不同方式組合所述三個(gè)公開的方法。
在本發(fā)明的在自動(dòng)篩選測(cè)定中使用的附加的優(yōu)選實(shí)施例中，所述成像系統(tǒng)與板處理機(jī)器人(諸如Zymark Twister)結(jié)合在一起。
數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)圖6表示對(duì)按照本發(fā)明設(shè)置的系統(tǒng)的數(shù)據(jù)處理部件的示意的說(shuō)明。根據(jù)the Amersham Biosciences IN Cell Analyzer system(細(xì)胞分析器系統(tǒng))，所述系統(tǒng)包括如上面描述的共焦顯微鏡400，后者包括檢測(cè)器D1、D2、D3、D4、D5；開關(guān)SW；控制器401；圖像數(shù)據(jù)存儲(chǔ)402和輸入/輸出(I/O)裝置404。關(guān)聯(lián)的計(jì)算機(jī)終端405包括中央處理單元(CPU)408；存儲(chǔ)器410；數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置，諸如硬盤驅(qū)動(dòng)器412和I/O裝置406，它分別便于計(jì)算機(jī)與MDPU的互連以及計(jì)算機(jī)通過(guò)屏幕I/O裝置與屏幕428的顯示元件432的互連。操作系統(tǒng)程序414存儲(chǔ)在硬盤驅(qū)動(dòng)器412中，并以已知的方式控制所述計(jì)算機(jī)終端405的低層操作。程序文件和數(shù)據(jù)420還存儲(chǔ)在硬盤驅(qū)動(dòng)器412中，以已知的方式控制通過(guò)關(guān)聯(lián)的裝置向操作者的輸出和存儲(chǔ)在所述硬盤驅(qū)動(dòng)器的數(shù)據(jù)的輸出。所述關(guān)聯(lián)的裝置包括顯示器432，作為屏幕428的組成部分；指點(diǎn)器(未示出)和鍵盤(未示出)，它們通過(guò)其他I/O裝置(未示出)從操作者接收輸入并輸出信息。包括在程序文件420存儲(chǔ)在硬盤驅(qū)動(dòng)器412中的是圖像處理和分析應(yīng)用程序416、測(cè)定控制應(yīng)用程序418和用于存儲(chǔ)從顯微鏡400接收的圖像數(shù)據(jù)并輸出在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的文件的數(shù)據(jù)庫(kù)422。圖像處理和分析應(yīng)用程序416可以是已知的圖像處理和分析軟件包(諸如可從Media Cybernetics購(gòu)得的Image-Prow)的定制版本。
利用控制應(yīng)用程序418來(lái)控制利用共焦顯微鏡400測(cè)定的性能并采集圖像數(shù)據(jù)。在通過(guò)至少一個(gè)檢測(cè)器D1、D2、D3采集微量滴定板中至少一個(gè)孔的圖像數(shù)據(jù)的操作結(jié)束之后，將所述圖像數(shù)據(jù)發(fā)送到計(jì)算機(jī)405并存儲(chǔ)在所述計(jì)算機(jī)終端硬盤驅(qū)動(dòng)器412上的數(shù)據(jù)庫(kù)422中，此刻，可以利用圖像處理和分析應(yīng)用程序416來(lái)分析來(lái)自圖像的數(shù)據(jù)。
圖像記錄與分析圖7表示多個(gè)生物實(shí)體和所述多個(gè)生物實(shí)體內(nèi)目標(biāo)的空間定界集合的圖像的示意圖。
在本發(fā)明的第一實(shí)施例中，所述多個(gè)生物實(shí)體是包括第一細(xì)胞500和第二不同的細(xì)胞501的多個(gè)生物細(xì)胞。每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)是細(xì)胞核。第一核502包含在第一細(xì)胞500內(nèi)，而第二不同的核503包含在第二細(xì)胞501內(nèi)。在為多個(gè)細(xì)胞提供標(biāo)記，例如加上核標(biāo)記之前，利用線掃描共焦成像系統(tǒng)的所描述的多波長(zhǎng)配置來(lái)記錄一個(gè)樣品孔182中所述多個(gè)細(xì)胞的樣品的一系列先前圖像。在所述實(shí)施例中，兩個(gè)獨(dú)立的波長(zhǎng)集合用于所述共焦成像系統(tǒng)，因此只使用以下部件工作在兩個(gè)波長(zhǎng)λ1、λ2的兩個(gè)源S1、S2；兩個(gè)透鏡L1、L2；兩個(gè)反射鏡M1、M2；兩個(gè)遮光濾光鏡BF1、BF2；和兩個(gè)檢測(cè)器D1、D2。先前圖像是利用第一輻射源S1、第一透鏡L1、第一反射鏡M1、第一遮光濾光鏡BF1和第一檢測(cè)器D1記錄的。包括發(fā)生熒光蛋白質(zhì)激勵(lì)波長(zhǎng)λ1和發(fā)生結(jié)果第一熒光發(fā)射波長(zhǎng)δλ1的第一顏色通道亦稱生物活性顏色通道，因?yàn)橐治隼盟鲱l道記錄的圖像來(lái)產(chǎn)生生物活性數(shù)據(jù)。
第一遮光濾光鏡BF1是第一帶通濾波器，選擇性地通過(guò)第一熒光發(fā)射波長(zhǎng)δλ1。在所述實(shí)施例中，生物活性顏色通道是綠色通道，檢測(cè)當(dāng)被熒光蛋白質(zhì)激發(fā)輻射所激勵(lì)時(shí)由綠熒光蛋白質(zhì)(GFP)發(fā)射的熒光輻射。第一濾波器在約488nm的第一發(fā)射波長(zhǎng)δλ1具有最大透射率。另外，第一濾光器在最大透射率一半處具有約50nm的全寬度，對(duì)應(yīng)于約740-590nm之間(亦即約565nm+/-25nm)的選擇波長(zhǎng)。
加上標(biāo)記之前記錄的所述一系列先前圖像包括在第四先前時(shí)限tN-3過(guò)程中記錄的第三先前圖像504；在第三先前圖像之后在第三不同時(shí)限tN-2過(guò)程中記錄的第二不同的先前圖像506；以及在第二先前圖像之后在第二不同時(shí)限tN-1過(guò)程中記錄的第一不同的先前圖像。
利用所述生物活性顏色通道記錄所述多個(gè)生物細(xì)胞記錄另外的圖像。所述另外的圖像是在加上所述標(biāo)記之后的時(shí)限tN過(guò)程中記錄的隨后的圖像510。
在第一時(shí)限tN過(guò)程中，利用第二輻射源S2、第二透鏡L2、第二反射鏡M2、第一遮光濾光鏡BF2和第二檢測(cè)器D2記錄具有標(biāo)記的圖像512。包括發(fā)生熒光標(biāo)記激勵(lì)的波長(zhǎng)λ2和發(fā)生結(jié)果第二熒光發(fā)射波長(zhǎng)δλ3的第二顏色通道亦稱為核標(biāo)記顏色通道，因?yàn)閷⒎治隼盟鐾ǖ烙涗浀膱D像來(lái)產(chǎn)生與所述圖像中檢測(cè)出來(lái)核標(biāo)記的位置有關(guān)的空間定界。
當(dāng)核染料是Hoechst類型時(shí)，所述核標(biāo)記激發(fā)輻射具有約364nm的波長(zhǎng)。對(duì)于Hoechst核染料，第二遮光濾光鏡BF2是選擇性地通過(guò)第二熒光發(fā)射δλ2波長(zhǎng)的帶通濾波器。所述第二濾光鏡在約450nm的第一發(fā)射波長(zhǎng)δλ2處具有最大透射率。另外，所述濾光鏡在最大透射率(FWHM)一半處具有約25nm的全寬度，對(duì)應(yīng)于約437.5-462.5nm(亦即約450nm+/-12.5nm)之間的選擇波長(zhǎng)。
當(dāng)核染料是DRAQ5類型時(shí)，核標(biāo)記激發(fā)頻道具有約633nm的波長(zhǎng)。對(duì)于DRAQ5核染料，第二遮光濾光鏡BF2是為第二熒光發(fā)射δλ2波長(zhǎng)選擇的帶通濾波器。第二帶通濾波器為約695nm的波長(zhǎng)選擇第二發(fā)射δλ2的最大透射率。另外，所述濾光鏡在最大透射率(FWHM)一半處具有約55nm的全寬度，對(duì)應(yīng)于約667.5-722.5nm(亦即，約略695nm+/-27.5nm)之間的選擇波長(zhǎng)。
從所述具有標(biāo)記的圖像512，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)能夠利用閾值處理識(shí)別包括第一和第二核502、503的細(xì)胞核，所述閾值處理根據(jù)具有高于閾值的強(qiáng)度識(shí)別出現(xiàn)核標(biāo)記的像素。接著，如上所述，以給定尺寸的這樣的超閾值像素組的形式識(shí)別核。從細(xì)胞核的這種識(shí)別標(biāo)志，從具有標(biāo)記的圖像512檢測(cè)所述核的多個(gè)空間定界，包括第一核502的第一空間定界514和第二核503的第二不同的空間定界516。空間定界既包括空間范圍(例如采取像素映射形式)和位置數(shù)據(jù)(例如采取所述核的形心點(diǎn)的圖像像素地址形式)。
在第一時(shí)限tN內(nèi)構(gòu)造基本上包括具有標(biāo)記的圖像512的全部空間定界并且包括第一和第二空間定界514、516的后續(xù)空間定界組518。在第一時(shí)限tN過(guò)程中記錄具有標(biāo)記的圖像512，使得可以假定來(lái)自具有標(biāo)記的圖像512的空間定界在空間上定義多個(gè)細(xì)胞核，包括后續(xù)圖像510中的第一核502和第二核503。
第一先前生成空間定界組524是在第二時(shí)限tN-1內(nèi)構(gòu)造的并且包括第一先前圖像508中核的多個(gè)生成空間定界，在所述第一先前圖像508中所述核標(biāo)記不太能夠識(shí)別所述細(xì)胞核，所述核的多個(gè)生成空間定界包括與第一核502對(duì)應(yīng)的第一生成空間定界520；以及與第二核503對(duì)應(yīng)的第二不同的生成空間定界522。類似地，分別在時(shí)限tN-2和tN-3內(nèi)構(gòu)造生成空間定界的第二先前組526和第三先前組528。
圖8示意地表示圍繞多個(gè)生物細(xì)胞的核周圍的空間。
在所述實(shí)施例中，每一個(gè)核的周圍空間是Voronoi區(qū)域。第一Voronoi形心點(diǎn)632周圍的第一Voronoi區(qū)域630處于至少另一個(gè)不同的緊接的Voronoi區(qū)域(例如第二不同的Voronoi形心點(diǎn)634周圍的第二不同的緊接的Voronoi區(qū)域633)附近。第一Voronoi區(qū)域630通過(guò)邊界635與至少另一個(gè)不同的緊接的Voronoi區(qū)域(包括第二Voronoi區(qū)域633)隔開。邊界635處于第一Voronoi形心點(diǎn)632和至少另一個(gè)不同的緊接的Voronoi形心點(diǎn)之間基本上中間位置。Voronoi區(qū)域是針對(duì)細(xì)胞核每一個(gè)不同的Voronoi形心點(diǎn)確定的，所得的多個(gè)Voronoi區(qū)域形成Voronoi圖636。每一個(gè)不同的Voronoi形心點(diǎn)是不同的細(xì)胞核的形心點(diǎn)。圖8不直接代表后續(xù)圖像510中多個(gè)核的Voronoi圖，但是應(yīng)該把它看做是針對(duì)描述性目的的，即上面所指的第一形心點(diǎn)和第二形心點(diǎn)分別是第一和第二Voronoi形心點(diǎn)632、634。
圖9以流程圖的形式示出按照本發(fā)明分析多個(gè)生物細(xì)胞以便產(chǎn)生細(xì)胞核的空間定界的方法的實(shí)施例。
在第一步驟738，順序地記錄生物細(xì)胞的一系列先前圖像，包括第一先前圖像508。此后，給多個(gè)細(xì)胞加上核標(biāo)記(740)，隨后利用共焦成像系統(tǒng)的第一顏色通道λ1進(jìn)一步記錄多個(gè)細(xì)胞的圖像(742)。然后利用共焦成像系統(tǒng)的核標(biāo)記頻道λ2，在基本上第一時(shí)限tN過(guò)程中記錄具有標(biāo)記的圖像512(744)。
后續(xù)空間定界組518用來(lái)從后續(xù)圖像510推算數(shù)據(jù)。所述推算的數(shù)據(jù)包括第i組與每一細(xì)胞核相聯(lián)系的一個(gè)或多個(gè)特性中的至少一個(gè)值。在所述實(shí)施例中，每一個(gè)數(shù)值都是具有第i組中K特性的矢量ZNx。從后續(xù)圖像510推算第一核矢量ZN1(746)，其方法是把第一空間定界514應(yīng)用到后續(xù)圖像510并計(jì)算應(yīng)用于由后續(xù)圖像510中第一核502的空間定界識(shí)別的區(qū)域的特性。在所述實(shí)施例中，第i組中的特性數(shù)目K是2，這些特性是平均強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。然后使用第一核502的第i組中計(jì)算的特性來(lái)構(gòu)造第一核矢量ZN1。
以類似的方式把第二空間定界516應(yīng)用于后續(xù)圖像510，以便允許利用后續(xù)圖像510的第二核503的區(qū)域的第i組中計(jì)算的特性推算第二核矢量ZN2(746)。
類似地，推算空間定界組518的每一個(gè)空間定界的核矢量ZNx，所述每一個(gè)空間定界在空間上定義后續(xù)圖像510中多個(gè)細(xì)胞核的核。利用后續(xù)圖像510的對(duì)應(yīng)于多個(gè)核之一的區(qū)域的第i組中的特性來(lái)推算每一個(gè)核矢量ZNx。
接著，在步驟748確定細(xì)胞核每一個(gè)形心點(diǎn)的Voronoi區(qū)域，如圖8中舉例說(shuō)明的。為了確定(748)每一個(gè)Voronoi區(qū)域，使用Voronoi算法。Voronoi算法定義每一個(gè)Voronoi形心點(diǎn)周圍的邊界。對(duì)于第一和第二Voronoi形心點(diǎn)632、634，Voronoi算法定義邊界635的一部分處于第一和第二Voronoi形心點(diǎn)632、634之間基本上中間位置。
然后在步驟750在第一Voronoi區(qū)域630內(nèi)定義第一核502的第一測(cè)試空間定界(未示出)。第一核502的第一測(cè)試空間定界的測(cè)試空間范圍和測(cè)試位置數(shù)據(jù)與第一空間定界514的空間范圍和位置數(shù)據(jù)相同。利用第一測(cè)試空間定界，計(jì)算第一先前圖像508中第一核502的區(qū)域的第i組中的一個(gè)或多個(gè)特性的值。在所述實(shí)施例中，所述數(shù)值是第一先前圖像508中第一核502的第一測(cè)試矢量ZN-11a。第一核502的第一測(cè)試矢量ZN-11a在第i組中具有整數(shù)數(shù)目K個(gè)特性，它們是平均強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
通過(guò)計(jì)算成本函數(shù)來(lái)把第一核502的第一測(cè)試矢量ZN-11a與第一核矢量ZN1相比較，在所述實(shí)施例中，成本函數(shù)涉及利用以下關(guān)系式為第一核502計(jì)算第一歐幾里得距離EN-11a(752)E=Σi=1K(ZN1[i]-ZN-11a[i])2---(1)]]>
一旦在步驟752計(jì)算第一核502的第一歐幾里得距離EN-11a，便確定第一先前圖像508中第一核502的第二不同的測(cè)試空間定界(未示出)。通過(guò)選擇性地清除第一測(cè)試空間定界的測(cè)試空間范圍的周邊像素并且以不同方式把所述像素加到第一測(cè)試空間定界的測(cè)試空間范圍的周邊來(lái)確定第二測(cè)試空間定界，。
然后利用第二測(cè)試空間定界計(jì)算第一核502的第二不同的測(cè)試矢量ZN-11b。類似于第一核502的第一測(cè)試矢量ZN-11a，第一核502的第二測(cè)試矢量ZN-11b包括第一先前圖像508區(qū)域的第i組中的特性。
通過(guò)利用上面的關(guān)系式(1)計(jì)算第一核502的第二不同的歐幾里得距離EN-11b(752)來(lái)把第一核502第二測(cè)試矢量ZN-11b與第一核矢量ZN1相比較。
通過(guò)以不同方式清除和添加第一核502的測(cè)試空間范圍的周邊的像素來(lái)確定第一先前圖像508的第一核502的包括第三不同的測(cè)試空間定界(未示出)的多個(gè)其他不同的測(cè)試空間定界(未示出)。當(dāng)確定第一先前圖像508中第一核502的其他測(cè)試空間定界時(shí)，從已經(jīng)確定的并與計(jì)算的歐幾里得距離EN-11y基本上最小值對(duì)應(yīng)的第一核502的不同的測(cè)試空間定界來(lái)確定所述其他測(cè)試空間定界。例如，第一核502的第一歐幾里得距離EN-11a有可能小于第一核502的第二歐幾里得距離EN-11b。因此，從第一核502的第一測(cè)試空間定界而不是第一核502的第二測(cè)試空間定界來(lái)確定第三測(cè)試空間定界。但是，若第一核502的第一歐幾里得距離EN-11a大于第一核502的第二歐幾里得距離EN- 11b，則代之以從第一核502的第二測(cè)試空間定界來(lái)確定所述第三空間定界。
連續(xù)地以迭代方式確定第一核502的其他測(cè)試空間定界，直到基本上把第一核502的其他測(cè)試矢量ZN-11y和第一核矢量ZN1之間的計(jì)算的歐幾里得距離EN-11y減到最小為止(756)。選定與第一核502的基本上最小的歐幾里得距離EN-11y對(duì)應(yīng)的測(cè)試空間定界，并用來(lái)產(chǎn)生第一先前圖像508中第一核502的空間定界520(758)。
基本上最小的歐幾里得距離EN-11y起′細(xì)胞核置信因子′的作用，指示生成空間定界的置信水平，在這種情況下，所述第一核502第一生成空間定界520準(zhǔn)確地對(duì)應(yīng)于第一核502。例如約為0的最小歐幾里得距離EN-11y，對(duì)應(yīng)于約100％的置信水平。
在產(chǎn)生第一先前圖像508中的第一核的第一生成空間定界520(758)之后，以類似于產(chǎn)生第一生成空間定界520的方式在第二Voronoi區(qū)域633內(nèi)定義所述第二核503的第一測(cè)試空間定界(未示出)。計(jì)算第二核503的第一測(cè)試矢量ZN-12a，所述第一測(cè)試矢量ZN-12a具有第二核503的第一先前圖像508的區(qū)域的第i組中的特性。通過(guò)計(jì)算第二核503的第一歐幾里得距離EN-12a，來(lái)將第二核503的第一測(cè)試矢量ZN-12a與第二核矢量ZN2相比較。接著，確定第一先前圖像508中的第二核503的第二不同的測(cè)試空間定界(未示出)。如前所述，通過(guò)選擇性地清除和添加第一測(cè)試空間定界的周邊像素的方法來(lái)確定第二測(cè)試空間定界。利用第二測(cè)試空間定界計(jì)算第二核503的第二不同的測(cè)試矢量ZN-12b，并通過(guò)計(jì)算第二核503的第二歐幾里得距離ZN-12b，來(lái)將第二核503的第二不同的測(cè)試矢量ZN-12b與第二核矢量ZN2相比較。
如已經(jīng)針對(duì)第一先前圖像508中的第一核503類似地描述的，通過(guò)選擇性地清除和添加在第一先前圖像508中已經(jīng)確定的第二核503的不同的測(cè)試空間定界的周邊像素，來(lái)以迭代的方式確定多個(gè)其他不同的測(cè)試空間定界。選擇第一先前圖像508中第二核503的測(cè)試空間定界，并且所述測(cè)試空間定界對(duì)應(yīng)于第二矢量ZN2和所述選定的測(cè)試空間定界之間的基本上最小歐幾里得距離EN-12b。所述選定測(cè)試空間定界用來(lái)產(chǎn)生與所述第二核503對(duì)應(yīng)的第二不同的生成空間定界522(758)。類似地，所述基本上最小歐幾里得距離對(duì)于所述第二核起′細(xì)胞核置信因子′的作用。
類似地，為了產(chǎn)生第一生成空間定界520和第二生成空間定界522，相繼地(760)為所述第一先前圖像508的每一個(gè)核產(chǎn)生(758)另外不同的生成空間定界。
利用第一先前圖像508的每一個(gè)核的生成空間定界(分別包括第一和第二生成空間定界520、522)構(gòu)造(762)生成空間定界的第一先前組524。基本上在第二時(shí)限tN-1內(nèi)構(gòu)造第一先前組524(762)。第一先前組524包括已經(jīng)按照質(zhì)量判據(jù)進(jìn)行篩選的第一先前圖像508的生成空間定界的一部分。在該實(shí)施例中，所述質(zhì)量判據(jù)是關(guān)于與每一個(gè)生成空間定界對(duì)應(yīng)的基本上最小的歐幾里得距離EN-1xy的閾值。所述閾值是關(guān)于生成空間定界的′細(xì)胞核置信因子′的可以接受的值、而且是在第一先前圖像508的空間定界產(chǎn)生之前確定的。對(duì)于每一個(gè)生成空間定界，若與所述生成空間定界對(duì)應(yīng)的基本上最小的歐幾里得距離EN-1xy具有大于確定閾值的數(shù)值，則所述生成空間定界具有無(wú)法接受的′細(xì)胞核置信因子′值，而且不被包括在所述構(gòu)造的第一先前空間定界組524內(nèi)。但若所述基本上最小歐幾里得距離EN-1xy具有小于確定的閾值的值，則所述生成空間定界具有可以接受的′細(xì)胞核置信因子′值，而且包括在第一先前組524內(nèi)。
還計(jì)算包括第一先前組524的每一個(gè)先前組的′圖像置信因子′，所述圖像置信因子表示每一個(gè)核的生成空間定界準(zhǔn)確地對(duì)應(yīng)于多個(gè)細(xì)胞中各自的核的置信水平。通過(guò)把第一先前組524的每一個(gè)核的最小歐幾里得距離EN-11Y的和除以第一先前組524中細(xì)胞核總數(shù)，來(lái)計(jì)算第一先前組524的所述′圖像置信因子′。
以與所描述的用于利用后續(xù)組518和后續(xù)圖像510產(chǎn)生第一先前圖像508的生成空間定界的方法類似的方法，利用生成空間定界構(gòu)造第二不同的先前空間定界組526，后者是利用第一先前組524和第一先前圖像508針對(duì)第二先前圖像506中的多個(gè)核產(chǎn)生的。
以與用于產(chǎn)生第一先前組524的第一生成空間定界的方法類似的方法，產(chǎn)生第二先前生成空間定界組526的第一核502的第一生成空間定界。在產(chǎn)生第一核502的第一生成空間定界時(shí)，確定第二先前圖像506中第一核502的形心點(diǎn)的Voronoi區(qū)域。在第二先前圖像506中確定多個(gè)測(cè)試空間定界，并且對(duì)于每一個(gè)測(cè)試空間定界計(jì)算第二先前圖像506中第一核502的區(qū)域的測(cè)試矢量ZN-21y，后跟第一核502的歐幾里得距離EN-21Y。根據(jù)第一核502的歐幾里得距離EN-21y的基本上最小值，選定第二先前圖像506中第一核502的測(cè)試空間定界并將其用來(lái)產(chǎn)生第二先前圖像506中的第一核502的第一生成空間定界。按照與剛剛描述的方法類似的方法，產(chǎn)生第二先前圖像506的多個(gè)生成空間定界?？梢砸耘c用于第一先前組524的方式類似的方式計(jì)算′細(xì)胞核置信因子′和′圖像置信因子′兩者。
通過(guò)類似地重復(fù)用于構(gòu)造第二先前空間定界組526的方法，構(gòu)造包括第三不同的生成空間定界組528的多個(gè)先前組。每一個(gè)先前組包括生物細(xì)胞的先前圖像中核的多個(gè)生成空間定界。
圖10示意地示出先前圖像系列的分析的時(shí)間方向。對(duì)于第一實(shí)施例，利用相同的標(biāo)號(hào)(增大800)標(biāo)記以前已經(jīng)利用不同的圖描述的先前圖像的各組成部分。這里還需要應(yīng)用這些組成部分的相應(yīng)的特征和描述。
圖10分別示出在第一時(shí)限tN過(guò)程中記錄的后續(xù)圖像810和包括第一、第二和第三先前圖像808、806、804的先前圖像。時(shí)間軸864表示在其中記錄先前圖像的彼此相對(duì)的時(shí)限tN-x和在其中記錄后續(xù)圖像810的第一時(shí)限tN。反向分析箭頭866表示相對(duì)于時(shí)間軸864的相反方向，其中產(chǎn)生先前圖像的各先前空間定界組。反向分析箭頭866表示對(duì)先前圖像的分析是在與它們沿著時(shí)間軸864被記錄的順序相反的方向出現(xiàn)的。
已經(jīng)構(gòu)造了多個(gè)生成空間定界組，可以利用所述細(xì)胞的相應(yīng)的先前生成空間定界來(lái)分析與每一個(gè)先前圖像中細(xì)胞的生物活性有關(guān)的特性。一個(gè)可以設(shè)想的示例涉及執(zhí)行確定生物細(xì)胞周期的階段的方法(如在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 03/031612中描述的，所述國(guó)際專利申請(qǐng)的內(nèi)容附此作參考)，在整個(gè)測(cè)定過(guò)程不需要用核染料，例如Hoechst使細(xì)胞核著色。
例如，可以利用第二生成空間定界組526來(lái)分析第二先前圖像506，以便確定所述生物細(xì)胞在每一周期tN-3，tN-2和tN-1過(guò)程中細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)?？梢酝ㄟ^(guò)利用各先前生成空間定界組分析多個(gè)先前圖像，確定在記錄所述細(xì)胞的先前圖像的所述系列時(shí)限中這些細(xì)胞的細(xì)胞周期數(shù)據(jù)。另外，可以把后續(xù)空間定界組與所述細(xì)胞的后續(xù)圖像一起使用，以便確定大約時(shí)限tN內(nèi)細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)。
圖11示意地表示按照本發(fā)明的第二實(shí)施例對(duì)一系列圖像的分析的時(shí)間方向。在具有標(biāo)記的圖像是在第一時(shí)限tN過(guò)程中記錄的而且所述系列的圖像是針對(duì)多個(gè)生物細(xì)胞記錄的這一點(diǎn)上，所述第二實(shí)施例類似于第一實(shí)施例。但是，所述系列圖像是在第一時(shí)限tN之后記錄的。所述系列后續(xù)圖像包括在第二時(shí)限tN+1過(guò)程中記錄的第一后續(xù)影像圖像970、在第三時(shí)限tN+2過(guò)程中記錄的第二后續(xù)圖像972和在第四時(shí)限tN+3過(guò)程中記錄的第三后續(xù)圖像。另外，所述多個(gè)生物細(xì)胞的其他圖像975是在第一時(shí)限tN過(guò)程中記錄的。類似于以前的實(shí)施例，時(shí)間軸964表示彼此相對(duì)的時(shí)限tN+x，在其過(guò)程中記錄后續(xù)圖像。類似于所述第一實(shí)施例，前向分析箭頭976表示產(chǎn)生各后續(xù)圖像的各空間定界組的方向。在所述實(shí)施例中，前向分析箭頭976表示在后續(xù)圖像的前向上出現(xiàn)的分析，所述前向?qū)?yīng)于沿著時(shí)間軸964記錄所述系列后續(xù)圖像的順序。
在所述實(shí)施例中，所述標(biāo)記是已經(jīng)提供給所述細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記，所述細(xì)胞難以將所述細(xì)胞標(biāo)記維持一段相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)限，因而所述細(xì)胞標(biāo)記不太能夠識(shí)別細(xì)胞核。經(jīng)過(guò)相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)限，所述標(biāo)記可能擴(kuò)散開來(lái)或被主動(dòng)地排出所述細(xì)胞。作為另一方案，所述標(biāo)記或者由于光漂白過(guò)程而衰落或者所述標(biāo)記需要用高強(qiáng)度紫外輻射來(lái)激勵(lì)，在此過(guò)程中若所述細(xì)胞重復(fù)曝光于高強(qiáng)度紫外輻射一段相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)限，其結(jié)果將是所述細(xì)胞受損害。
圖12示意地表示按照本發(fā)明的第三實(shí)施例的一系列圖像的分析的時(shí)間方向。在第一具有標(biāo)記的圖像是在第一時(shí)限tN過(guò)程中記錄的而且一系列圖像是針對(duì)多個(gè)生物細(xì)胞記錄的這一點(diǎn)上，第三個(gè)實(shí)施例類似于以前描述的實(shí)施例。任選地另外在第一時(shí)限tN過(guò)程中記錄第二具有標(biāo)記的圖像。所述系列圖像的一部分是在第一時(shí)限tN以前記錄的，所述圖像的一部分是在第一時(shí)限tN之后記錄的。先前圖像分別包括在第一、第二和第三先前時(shí)限tN-1、tN-2、tN-3過(guò)程中記錄的第一、第二和第三先前圖像1078、1080、1082，而且后續(xù)圖像分別包括在第一、第二和第三后續(xù)時(shí)限tN+1、tN+2、tN+3過(guò)程中記錄的第一、第二和第三后續(xù)圖像1084、1086和1088。在第一時(shí)限tN過(guò)程中，記錄多個(gè)細(xì)胞的第一和任選的第二或更多其他圖像1090、1092，它們分別對(duì)應(yīng)于第一和第二具有標(biāo)記的圖像。時(shí)間軸1064表示彼此相對(duì)的時(shí)限，在此過(guò)程中記錄先前的和后續(xù)的圖像。類似于以前的實(shí)施例，第一其他圖像1090用來(lái)在先前圖像中，在相對(duì)于記錄先前圖像的順序的相反方向上和任選地在前向上(如反向第一分析箭頭1094.所表明的)產(chǎn)生細(xì)胞核的空間定界。第二其他圖像用來(lái)在對(duì)應(yīng)于記錄后續(xù)圖像的順序、用前向第二分析箭頭1096表示的前向上產(chǎn)生后續(xù)圖像中的細(xì)胞核的生成空間定界。
在所述實(shí)施例中，所述標(biāo)記是由于在經(jīng)受時(shí)間調(diào)制的細(xì)胞內(nèi)生物過(guò)程而瞬時(shí)地為這些細(xì)胞提供的。在所述示例中，所述標(biāo)記是來(lái)自每一個(gè)細(xì)胞的報(bào)道基因隨時(shí)間變化的信號(hào)，這在第一時(shí)限tN過(guò)程中表示。所述報(bào)道基因是遺傳結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，它能夠表示可檢測(cè)出的蛋白質(zhì)。在這里Naylor L.H.(1999)Biochemical Pharmacology58，749-757的參考文獻(xiàn)描述眾所周知的利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞中各種各樣的報(bào)道基因的方法。所述報(bào)道基因允許基因的產(chǎn)物在存在其它細(xì)胞的蛋白質(zhì)的情況下可測(cè)，而且在響應(yīng)宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的變化的選擇的調(diào)節(jié)序列的控制下提供給所述細(xì)胞。例如，這種調(diào)節(jié)序列對(duì)激素、第二信使或其它細(xì)胞的控制和信令因子作出反應(yīng)。這樣適當(dāng)?shù)剡x定所述調(diào)節(jié)序列，使得報(bào)道基因可以用來(lái)測(cè)定例如添加的細(xì)胞介質(zhì)或涉及選擇的調(diào)節(jié)序列的細(xì)胞過(guò)程的效果。在所述示例中，當(dāng)報(bào)道基因激活時(shí)，它通過(guò)激活細(xì)胞可滲透基底，產(chǎn)生熒光發(fā)射信號(hào)的增大。所述報(bào)道基因例如是硝基還原酶之一(在國(guó)際專利申請(qǐng)WO0157237中描述)、β內(nèi)酰胺酶(在美國(guó)專利申請(qǐng)US 5741657中描述)和綠熒光蛋白質(zhì)(GFP)(在美國(guó)專利申請(qǐng)US 6306600中描述)。
作為另一方案，在所述第三實(shí)施例中，所述標(biāo)記，例如是細(xì)胞核用的藍(lán)熒光蛋白質(zhì)。為了成功地將所述標(biāo)記成像，必須利用紫外輻射用熒光激勵(lì)所述標(biāo)記。多個(gè)細(xì)胞在相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)限內(nèi)對(duì)紫外輻射的累積曝光，對(duì)所述細(xì)胞是毒性的，因此所述標(biāo)記只用這樣的方法在第一時(shí)限tN過(guò)程中激勵(lì)。
圖13示意地表示按照本發(fā)明第四實(shí)施例的一系列圖像的分析的時(shí)間方向。類似于以前的實(shí)施例，記錄多個(gè)細(xì)胞的一系列圖像。所述多個(gè)細(xì)胞被分成多個(gè)亞系。圖13示出第一亞系1194，所述第一亞系1194包括在第一亞系第一時(shí)限tN1過(guò)程中記錄的第一亞系其他圖像1196，還包括分別在第一時(shí)限tN1以前在第一亞系第二、第三和第四時(shí)限tN-11、tN-21、tN-31過(guò)程中記錄的第一亞系第一、第二和第三先前圖像1198、1200、1202。另外，在第一亞系第一時(shí)限tN1過(guò)程中記錄第一亞系具有標(biāo)記的圖像。時(shí)間軸1164表示在其過(guò)程中記錄包括第一亞系1194各圖像的所述系列圖像的彼此相對(duì)的時(shí)限。類似于以前的實(shí)施例，反向第一亞系分析箭頭1214表示與記錄第一亞系1194各圖像、利用第一亞系其他圖像1196產(chǎn)生第一亞系先前圖像中細(xì)胞核各空間定界的時(shí)間方向相反的方向。
第二亞系1204包括在第二亞系第一時(shí)限tN2過(guò)程中記錄的第二亞系其他圖像1206，還包括第二亞系先前圖像、分別包括在第一時(shí)限tN2以前在第二亞系第二、第三和第四時(shí)限tN-12、tN-22、tN-32過(guò)程中記錄的第一、第二和第三先前圖像1208、1210、1212。
反向第二亞系分析箭頭1216表示與記錄第二亞系各圖像、產(chǎn)生第二亞系先前圖像中的細(xì)胞核的空間定界的順序相反的方向。每一個(gè)亞系包括其他圖像和三個(gè)先前圖像，如在圖13舉例說(shuō)明的，盡管可以設(shè)想所述亞系包括的更多先前圖像，例如，10個(gè)。作為另一方案，先前圖像可以代之以是在亞系第一周期之后記錄并在與記錄后續(xù)圖像的順序?qū)?yīng)的前向分析的后續(xù)圖像。作為另一方案，所述圖像可以既包括先前圖像又包括后續(xù)圖像，可以利用其他圖像既在反向又在前向產(chǎn)生所述圖像的空間定界。
在所描述的本發(fā)明的全部實(shí)施例中，所述標(biāo)記能夠識(shí)別細(xì)胞核。還可以設(shè)想，或者，生物細(xì)胞的目標(biāo)可以是其它細(xì)胞目標(biāo)，例如生物細(xì)胞線粒體、生物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、生物細(xì)胞溶酶體或束縛的抗體，而且所述標(biāo)記能夠識(shí)別細(xì)胞線粒體、細(xì)胞質(zhì)、溶酶體或抗體。顯然，從本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例記錄的圖像識(shí)別的目標(biāo)，不限于一種類型，而是可以包括至少兩個(gè)細(xì)胞目標(biāo)，包括例如細(xì)胞核、細(xì)胞線粒體、細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞溶酶體或束縛的抗體。此外，顯然，可以使用替換Hoechst或DRAQ5類型的細(xì)胞核標(biāo)記，因而，這些替換標(biāo)記可以通過(guò)適當(dāng)波長(zhǎng)的核標(biāo)記激發(fā)通道激勵(lì)。包括例如所述共焦顯微鏡的輻射源Sn、透鏡Ln、反射鏡Mn、遮光濾光鏡BFn和檢測(cè)器Dn的元件適合于選定的核標(biāo)記激發(fā)通道和相應(yīng)的核標(biāo)記通道。當(dāng)細(xì)胞目標(biāo)包括束縛抗體時(shí)，可以設(shè)想，在為細(xì)胞提供適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，例如碘化丙錠并記錄具有標(biāo)記的圖像之前所述生物細(xì)胞是固定的。
還可以設(shè)想，除了使用能夠在第一時(shí)限過(guò)程中識(shí)別細(xì)胞目標(biāo)(例如細(xì)胞核)而在第二時(shí)限過(guò)程中不太能夠識(shí)別細(xì)胞目標(biāo)的所述標(biāo)記(原發(fā)的)之外，還使用能夠在至少第一時(shí)限和第二時(shí)限過(guò)程中識(shí)別細(xì)胞目標(biāo)的第二標(biāo)記。利用適當(dāng)?shù)念伾ǖ罊z測(cè)出所述第二標(biāo)記，以便記錄所述多個(gè)細(xì)胞的二次具有標(biāo)記的圖像。把從這些二次具有標(biāo)記的圖像推算的數(shù)據(jù)與從利用所述原發(fā)標(biāo)記記錄的原發(fā)的具有標(biāo)記的圖像推算的數(shù)據(jù)一起使用，以便可以更準(zhǔn)確地產(chǎn)生所述細(xì)胞圖像中細(xì)胞目標(biāo)的空間定界。這樣的二次標(biāo)記可以是熒光線粒體著色劑，例如Mito Tracker(Molecular Probes(分子探針))；熒光溶酶體著色劑，例如LysoTracker(Molecular Probes(分子探針))；或熒光非特異細(xì)胞著色劑，例如Cell Tracker(細(xì)胞跟蹤器(MolecularProbes(分子探針))。
還可以設(shè)想，所述線掃描共焦顯微鏡的多波長(zhǎng)配置可以與兩個(gè)以上的獨(dú)立的波長(zhǎng)集合一起使用。例如，有可能記錄包括不同類型的目標(biāo)，例如細(xì)胞核和細(xì)胞線粒體的生物實(shí)體的圖像。因此，可以把兩個(gè)以上的顏色通道用來(lái)記錄所述生物實(shí)體的不同圖像，以便以不同的方式識(shí)別不同的細(xì)胞目標(biāo)。可以把具有兩個(gè)以上源Sn、透鏡Ln、反射鏡Mn、遮光濾光鏡BFn和檢測(cè)器Dn的線掃描共焦成像系統(tǒng)用于不同的顏色通道。
按照所描述的本發(fā)明的實(shí)施例的空間定界既包括形心點(diǎn)周圍的空間范圍又包括所述形心點(diǎn)的像素地址。還可以設(shè)想，可以利用在空間上定義多個(gè)生物實(shí)體內(nèi)目標(biāo)的替換參數(shù)來(lái)提供空間定界。
可以把上述質(zhì)量判據(jù)(在這些實(shí)施例中是閾值)設(shè)想為由用戶設(shè)定而且可用嘗試法改變。作為另一方案，可以設(shè)想，一種自動(dòng)算法可以允許在產(chǎn)生不同的先前圖像的空間定界過(guò)程中自適應(yīng)地修改閾值的值。作為再一方案，可以設(shè)想，所述質(zhì)量判據(jù)是不同形式的閾值，使得可以選擇目標(biāo)的空間定界。
通過(guò)選擇性地清除和添加例如空間定界的空間范圍的周邊像素，有可能適應(yīng)該目標(biāo)區(qū)域形狀的變化，例如在所述描述的實(shí)施例中的核。還可以設(shè)想，可以利用可供選擇的受控的形態(tài)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)經(jīng)過(guò)一系列時(shí)限，目標(biāo)例如核的空間定界的變動(dòng)。
所描述的本發(fā)明的實(shí)施例包括在一系列時(shí)限過(guò)程中記錄多個(gè)生物細(xì)胞的一系列圖像。最好每一個(gè)順序時(shí)限，例如tN-1和tN彼此隔開一段持續(xù)時(shí)間相等的時(shí)間。例如，可以設(shè)想，所述相等的持續(xù)時(shí)間約在2和20分鐘之間。但是，可以設(shè)想，所述持續(xù)時(shí)間可以比它大或小。另外，例如，所述系列的圖像包括約多達(dá)60個(gè)圖像(N＜60)，但是還可以設(shè)想，可以在所述序列中記錄數(shù)目更多的圖像。作為另一方案，可以設(shè)想、不同的順序時(shí)限彼此隔開一段不同的不相等的持續(xù)時(shí)間。
在所描述的實(shí)施例中建立Voronoi圖，它為每一個(gè)核的形心點(diǎn)確定Voronoi區(qū)域，并隨后在定義測(cè)試空間定界時(shí)使用?？梢栽O(shè)想，Voronoi算法以外的替換算法可以用來(lái)確定所述核或所述核的形心點(diǎn)的周圍空間，用來(lái)在生物細(xì)胞的先前圖像中產(chǎn)生核的空間定界。
在上述實(shí)施例中，第i組的特性采用所記錄的生物細(xì)胞圖像中核的平均強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。但是，可以計(jì)算可供選擇的或附加的特性，用于目標(biāo)空間定界的產(chǎn)生。這些包括方差、峭度、自相關(guān)函數(shù)、空間相關(guān)量度、文本(textual)相關(guān)量度、自相關(guān)函數(shù)、分形維數(shù)、面積、周長(zhǎng)、主軸長(zhǎng)度、主軸寬度、緊致性和取向中的至少一個(gè)。
當(dāng)選擇測(cè)試空間定界之一時(shí)，計(jì)算歐幾里得距離E，以便把所述生物細(xì)胞圖像中核的矢量與同樣的核的測(cè)試矢量比較?？梢栽O(shè)想，可以在選擇測(cè)試空間定界過(guò)程中作為另一方案計(jì)算以下函數(shù)中的至少一個(gè)cityblock函數(shù)、車比雪夫(chebyshev)距離、閔可夫斯基(minkowski)m階函數(shù)、二次函數(shù)、Q正有限函數(shù)、堪培拉(Canberra)距離、非近距離函數(shù)或角度離隔。另外，可以預(yù)見，可以利用這些函數(shù)中的至少兩個(gè)的組合來(lái)選定測(cè)試空間定界。
還可以設(shè)想，可以以不同的方法計(jì)算′細(xì)胞核置信因子′和′圖像置信因子′，而且′細(xì)胞核置信因子′可以對(duì)應(yīng)于不同于細(xì)胞核的細(xì)胞目標(biāo)。
在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，可以設(shè)想，代替以迭代方法定義測(cè)試空間定界和把測(cè)試矢量與核的矢量進(jìn)行比較，通過(guò)把所述細(xì)胞先前圖像中核的第i組特性與所述細(xì)胞不同的先前圖像中第i組特性進(jìn)行比較來(lái)產(chǎn)生生成空間定界。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)化算法，諸如模擬退火算法可以應(yīng)用于至少某些生成空間定界。所述模擬退火算法可以用來(lái)保證，選定的測(cè)試空間定界已經(jīng)利用所述基本上最小歐幾里得距離E而不是表觀基本上最小歐幾里得距離E來(lái)選定。
在上述實(shí)施例中，利用相應(yīng)的空間定界組分析所述生物細(xì)胞的圖像，以便確定所述生物細(xì)胞在所述時(shí)限過(guò)程中細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)。作為另一方案，可以設(shè)想、本發(fā)明的所述方法可能用來(lái)檢測(cè)生物細(xì)胞其它參數(shù)例如所述細(xì)胞中的軸突或熒光的顆粒。
顯然，聯(lián)系任何一個(gè)的實(shí)施例描述的任何特征都可以單獨(dú)使用，或與所描述的其它特征組合使用，還可以用于與其它任何實(shí)施例的一個(gè)或多個(gè)特征組合，或任何其它實(shí)施例的任何組合。另外，在不脫離后附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的范圍的情況下，還可以使用上面沒(méi)有描述的等效和修改。
權(quán)利要求
1.一種利用成像設(shè)備分析多個(gè)生物實(shí)體的方法，所述方法包括a)提供用于所述多個(gè)生物實(shí)體的標(biāo)記，當(dāng)利用所述成像設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述標(biāo)記能夠識(shí)別多個(gè)生物實(shí)體內(nèi)的目標(biāo)，這樣安排所述方法，使得所述標(biāo)記在第一時(shí)限過(guò)程中能夠識(shí)別所述目標(biāo)，而在第二時(shí)限過(guò)程中所述標(biāo)記不太能夠識(shí)別所述目標(biāo)；b)在所述第一時(shí)限過(guò)程中，記錄具有標(biāo)記的圖像，其中所述目標(biāo)的空間定界是可以從所述標(biāo)記識(shí)別的；c)在第二時(shí)限過(guò)程中，記錄所述多個(gè)生物實(shí)體的第一圖像；以及d)利用從所述具有標(biāo)記的圖像推算的數(shù)據(jù)，產(chǎn)生所述第一圖像中目標(biāo)的空間定界。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一時(shí)限在所述第二時(shí)限以前。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一時(shí)限在所述第二時(shí)限之后。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中包括在記錄所述第一圖像之后把所述標(biāo)記加到所述多個(gè)生物實(shí)體上。
5.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述標(biāo)記具有隨時(shí)間變化的信號(hào)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述標(biāo)記是通過(guò)遺傳結(jié)構(gòu)系統(tǒng)提供的。
7.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述生成空間定界包括所述目標(biāo)的空間范圍和位置數(shù)據(jù)中的至少一個(gè)。
8.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述生成空間定界是利用從所述具有標(biāo)記的圖像檢測(cè)出來(lái)的目標(biāo)的空間定界產(chǎn)生的。
9.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括e)在所述第一時(shí)限過(guò)程中，記錄所述多個(gè)生物實(shí)體的其他圖像；以及f)從所述其他圖像推算數(shù)據(jù)；以及在步驟d)中，利用從所述其他圖像推算的數(shù)據(jù)分析所述第一圖像。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中在第一顏色通道中記錄所述其他圖像，而在第二不同的顏色通道中記錄所述具有標(biāo)記的圖像。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中在所述第一顏色通道中記錄所述第一圖像。
12.如權(quán)利要求9、10或11所述的方法，其中包括在步驟f)中，利用從所述具有標(biāo)記的圖像推算的數(shù)據(jù)來(lái)從所述其他圖像推算數(shù)據(jù)。
13.如權(quán)利要求9至12中任何一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟f)中推算的數(shù)據(jù)包括與所述目標(biāo)相關(guān)聯(lián)的一種或多種特性的一個(gè)或多個(gè)數(shù)值。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述一種或多種特性包括平均強(qiáng)度、標(biāo)準(zhǔn)偏差、方差、峭度、自相關(guān)函數(shù)、空間相關(guān)量度、文本相關(guān)量度、自相關(guān)函數(shù)、分形維數(shù)、面積、周長(zhǎng)、主軸長(zhǎng)度、主軸寬度、緊湊性和取向中的至少一個(gè)。
15.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中步驟d)包括i)定義多個(gè)測(cè)試空間定界之一；ii)利用所述測(cè)試空間定界計(jì)算所述第一圖像的一種或多種特性的值；iii)針對(duì)所述多個(gè)測(cè)試空間定界中不同的測(cè)試空間定界重復(fù)步驟i)-ii)；iv)按照在步驟ii)計(jì)算的一個(gè)或多個(gè)數(shù)值選擇所述多個(gè)測(cè)試空間定界中的一個(gè)。
16.如權(quán)利要求15和權(quán)利要求9至14中任何一項(xiàng)所述的方法，其中步驟iv)包括把在步驟ii)中計(jì)算的所述數(shù)值與在步驟f)中從所述其他圖像推算的數(shù)值比較。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述比較包括計(jì)算歐幾里得距離E，通過(guò)以下關(guān)系式計(jì)算所述歐幾里得距離EE=Σi=1K(ZN[i]-ZN-1[i])2]]>其中在步驟ii)中計(jì)算的所述數(shù)值和在步驟f)中從所述其他圖像推算的數(shù)值都是矢量，分別為ZN-1和ZN，與特性i的整數(shù)K有關(guān)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟iv)包括選擇所述歐幾里得距離E的基本上最小的值。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述比較包括計(jì)算cityblock函數(shù)、車比雪夫距離、閔可夫斯基m階函數(shù)、二次函數(shù)、Q正有限函數(shù)、堪培拉距離、非近距離函數(shù)或角間距中的至少一個(gè)。
20.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中包括重復(fù)步驟d)，以便產(chǎn)生所述第一圖像中多個(gè)目標(biāo)的多個(gè)空間定界。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中按照質(zhì)量判據(jù)篩選所述多個(gè)生成空間定界。
22.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中步驟d)包括確定從所述具有標(biāo)記的圖像檢測(cè)出來(lái)的目標(biāo)的周圍空間，所述周圍空間的邊界把所述周圍空間與緊接的不同的目標(biāo)的至少一個(gè)不同的周圍空間隔開；以及把所述生成空間定界設(shè)置成處在所述目標(biāo)的所述確定的周圍空間內(nèi)。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中包括利用Voronoi算法確定所述目標(biāo)的周圍空間。
24.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中包括在第三時(shí)限過(guò)程中記錄所述多個(gè)生物實(shí)體的第二圖像以及產(chǎn)生所述第二圖像中目標(biāo)的空間定界。
25.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物實(shí)體是生物細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述目標(biāo)包括生物細(xì)胞核。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述目標(biāo)包括生物細(xì)胞線粒體、生物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、生物細(xì)胞溶酶體或束縛抗體。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述目標(biāo)包括生物細(xì)胞核、生物細(xì)胞線粒體、生物細(xì)胞溶酶體、生物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和束縛抗體中的至少兩個(gè)。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中當(dāng)所述目標(biāo)包括束縛抗體時(shí)，在提供所述標(biāo)記之前所述生物細(xì)胞是固定的。
30.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括為所述多個(gè)生物實(shí)體提供第二不同的標(biāo)記，所述第二標(biāo)記還用來(lái)為所述第一圖像中的目標(biāo)產(chǎn)生空間定界。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述第二標(biāo)記是生物細(xì)胞染料、生物細(xì)胞線粒體染料、生物細(xì)胞溶酶體染料或生物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染料中的一種。
32.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其中還包括通過(guò)利用所述生成空間定界分析所述第一圖像來(lái)分析所述多個(gè)生物實(shí)體的特性。
33.一種圖像分析方法，用于從利用成像設(shè)備產(chǎn)生的圖像分析多個(gè)生物實(shí)體，所述方法包括a)獲得所述多個(gè)生物實(shí)體的具有標(biāo)記的圖像，所述具有標(biāo)記的圖像在第一時(shí)限過(guò)程中已經(jīng)記錄，其中為所述多個(gè)生物實(shí)體提供的標(biāo)記能夠識(shí)別所述多個(gè)實(shí)體內(nèi)的目標(biāo)；b)獲得所述多個(gè)生物實(shí)體的第一圖像，所述第一圖像在第二時(shí)限過(guò)程中已經(jīng)記錄，其中所述標(biāo)記不太能夠識(shí)別所述目標(biāo)；以及c)利用從所述具有標(biāo)記的圖像推算的數(shù)據(jù)產(chǎn)生所述第一圖像的目標(biāo)的空間定界。
34.一種計(jì)算機(jī)軟件，它設(shè)置成執(zhí)行上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法。
35.一種數(shù)據(jù)載體，用于存儲(chǔ)權(quán)利要求34的計(jì)算機(jī)軟件。
36.一種設(shè)備，它設(shè)置成執(zhí)行權(quán)利要求1至33中任何一項(xiàng)的方法。
全文摘要
一種利用成像設(shè)備分析多個(gè)生物實(shí)體的方法。所述方法包括為所述多個(gè)生物實(shí)體提供標(biāo)記，當(dāng)利用成像設(shè)備檢測(cè)時(shí)，所述標(biāo)記能夠識(shí)別多個(gè)生物實(shí)體內(nèi)的目標(biāo)，這樣設(shè)置所述方法，使得在第一時(shí)限過(guò)程中所述標(biāo)記能夠識(shí)別所述目標(biāo)，而在第二時(shí)限過(guò)程中所述標(biāo)記不太能夠識(shí)別所述目標(biāo)；在第一時(shí)限過(guò)程中記錄具有標(biāo)記的圖像，其中可以從所述標(biāo)記識(shí)別所述目標(biāo)的空間定界；在第二時(shí)限過(guò)程中記錄所述多個(gè)生物實(shí)體的第一圖像；以及利用從所述具有標(biāo)記的圖像推算的數(shù)據(jù)產(chǎn)生所述第一圖像中目標(biāo)的空間定界。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1829907SQ200480021510
公開日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月29日
發(fā)明者N·S·阿里尼, I·D·古德耶, D·O·呂爾曼, N·托馬斯 申請(qǐng)人:通用電氣醫(yī)療集團(tuán)英國(guó)有限公司