專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)腦炎或腦疾發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)(確定)腦炎或腦疾發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，一種測(cè)試某種藥物是否涉及誘導(dǎo)腦炎或腦疾風(fēng)險(xiǎn)的方法，和一種篩選用于治療腦炎或腦疾的候選藥物的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，關(guān)于因流感病毒感染而導(dǎo)致或引起的腦炎或腦疾的報(bào)道正在增加。這種腦炎或腦疾是一種疾病，其主要癥狀包括迅速表現(xiàn)出意識(shí)混亂和痙攣，特別是通常致命的腦水腫的迅速表現(xiàn)。由于其引發(fā)的高死亡率和其后遺癥的高發(fā)病率，腦炎和腦疾已成為一個(gè)社會(huì)問(wèn)題。
少兒流感經(jīng)常伴隨中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，諸如意識(shí)混亂、熱痙攣、長(zhǎng)時(shí)間的痙攣和嘔吐，在某些病例中，發(fā)展迅速而且可能導(dǎo)致死亡。在一些這樣的病人中，腦疾會(huì)跟隨服用解熱劑如阿司匹林TM(乙酰水楊酸)或雙氯酚酸鈉，而且在這樣的情況下，疾病稱(chēng)作雷氏癥候群。在涉及流感病毒的感染，但原因不明的其他情況下，在日本曾用流感腦炎/腦疾的專(zhuān)門(mén)術(shù)語(yǔ)。這種流感腦炎/腦疾的發(fā)病病理學(xué)和機(jī)理未知，而且還沒(méi)有一個(gè)清楚的疾病的定義。流感腦炎/腦疾與上述的雷氏癥候群或急性壞死性的腦疾(ANE)之間的區(qū)別并不顯著。(參見(jiàn)TakehiroTogashi，“流感腦炎和腦疾(Infuenzal encephalitis andencephalopathy)”，Nippon Rinsho(Japanese Journal of Clinical Medicine)，Vol.58，No.11，第87-92，2002)；和Tsuneo Morishima，“流感腦炎和腦疾病理學(xué)和策略(Influenzal encephalitis and encephalopathyPathology and strategy)”，Sogo Rinsho(Clinic All-Around)，Vol.49，No.2，第300-305頁(yè)，2000)。
已知在日本經(jīng)常發(fā)現(xiàn)患有先天性脂肪酸代謝紊亂，特別是CPT II(肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶II)不足或是GA2(戊二酸尿2型)的嬰兒，和在歐洲和美洲經(jīng)常發(fā)現(xiàn)患有MCAD(中鏈?；o酶A脫氫酶)不足的嬰兒中，腦疾自身表現(xiàn)為沒(méi)有流感感染的類(lèi)似雷氏癥候群的病癥(參見(jiàn)Tamoki，Y.等人，“自1985年至2000年檢測(cè)的患有線(xiàn)粒體脂肪酸β-氧化和相關(guān)紊亂的日本病人的調(diào)查(A survey of Japanesepatients with mitochondrial fatty acid β-oxidation and related disordersas detected from 1985 to 2000”，Brain & Developmet，24(2002)675-680)。
在這些病例中(雷氏癥候群，流感腦炎/腦疾，先天性脂肪酸代謝紊亂的類(lèi)似雷氏癥候群病癥，等)，腦水腫和大腦功能紊亂的發(fā)病機(jī)理甚至到今天還不知道，而且在目前的狀況下，仍然還沒(méi)有建立起用于精確的鑒別診斷、治療和預(yù)防這些疾病的方法。本領(lǐng)域真的需要上述診斷方法等等被建立起來(lái)。
本發(fā)明人已經(jīng)揭示過(guò)在流感病毒感染中作為病毒增殖循環(huán)必要因素的小型纖溶酶的出現(xiàn)(參見(jiàn)Murakami，M.，等人，“在細(xì)支氣管的上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的小型纖溶酶通過(guò)廣譜流感病毒A和仙臺(tái)病毒引發(fā)感染(Mini-plasmin found in the epithelial cells of bronchioles triggersinfection by broad-spectrum influenza A viruses and sendai virus.)”Eur.J.Biochem.268(10)，2847-2855，2001)。
上述小型纖溶酶已知是一種血腦屏障的干擾因子(參見(jiàn)Nagy，Z.等人，“通過(guò)纖溶酶干擾血腦屏障的完整性(Perturbation of integrity ofthe blood-brain barrier by fibrolytic enzymes)”，Blood Coagulation &Fibrinolysis，9(6)，471-478，1998)。
在流感感染-誘導(dǎo)的腦炎/腦疾中，小型纖溶酶擾亂血腦屏障并迅速引發(fā)腦水腫。在一些例子中，它在腦血管的內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)一步誘導(dǎo)病毒的復(fù)制。此外還發(fā)現(xiàn)在與血腦屏障紊亂和病毒復(fù)制一致的位點(diǎn)上小型纖溶酶水平升高(參見(jiàn)Hiroshi Kido等人，“生物蛋白酶和抑制劑抑制流感病毒的傳染性和加重感染(Biogenic proteases and inhibitorsinhibiting the infectivity of influenza viruses and the aggravation of theinfections)”，Molecular Medicine，Vol.39，No.1，第48-53頁(yè)，2002)。
與雷氏癥候群相連，也從脂肪酸β-氧化抑制的觀點(diǎn)上作出了一篇報(bào)道(參見(jiàn)Trauner，D.A.，等人，“通過(guò)流感病毒B和唾液酸在小鼠中抑制脂肪酸β氧化牽連雷氏癥候群(Inhibition of fatty acid betaoxidation by influenza B virus and salicylic acid in miceImplications forReye’s syndrome)”，Neurology，38，239-241，1988)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是揭示流感腦炎/腦疾的病理學(xué)、發(fā)病因素和/或發(fā)病機(jī)理。更特別地，本發(fā)明的第一個(gè)目的是闡明不同類(lèi)型的腦炎/腦疾，包括流感腦炎/腦疾以及迄今還不能與流感腦炎/腦疾區(qū)分的雷氏癥候群的發(fā)病因素和/或發(fā)病機(jī)理。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是建立一種用于精確診斷，治療和預(yù)防尤其是腦炎/腦疾的方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)(確定)腦炎/腦疾發(fā)病和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種確定任何不同藥物如解熱藥和止痛藥是否涉及引發(fā)腦炎/腦疾發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)的方法，也就是一種檢測(cè)任何不同藥物對(duì)于腦炎/腦疾的發(fā)病是安全的方法。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種篩選治療腦炎/腦疾的候選藥物的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供不同的試劑以進(jìn)行上述的各種方法。
本發(fā)明人所做的深入研究旨在闡明流感腦炎/腦疾的發(fā)病因素，發(fā)病敏感因素和/或發(fā)病機(jī)理。在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在流感腦炎/腦疾的模型鼠的大腦中，小型纖溶酶在受炎癥影響的器官中產(chǎn)生，例如受肺炎影響的肺部中，通過(guò)血液在大腦血管內(nèi)皮聚集，結(jié)果是它自毀血腦屏障或進(jìn)一步使得病毒在血管內(nèi)皮細(xì)胞中復(fù)制。
連續(xù)研究的結(jié)果是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在流感腦炎/腦疾模型鼠的大腦中，定位在大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜或線(xiàn)粒體外膜上的通道蛋白VDAC(電壓依賴(lài)的陰離子通道)起小型纖溶酶，纖溶酶或纖酶溶原受體的作用，上述VDAC的表達(dá)水平的升高導(dǎo)致了血管上皮的小型纖溶酶，纖溶酶和纖酶溶原水平的升高，據(jù)此，VDAC是導(dǎo)致腦炎/腦疾發(fā)病的直接因素。
更特別地，本發(fā)明人揭示出當(dāng)VDAC的表達(dá)或其編碼基因水平升高時(shí)，產(chǎn)生對(duì)腦水腫高度敏感的狀況，而且，當(dāng)例如流感病毒感染或某些其它炎癥例如，附加作為觸發(fā)因素時(shí)，誘使血腦屏障的通透性增加和腦水腫加重，神經(jīng)機(jī)能也出現(xiàn)了障礙，導(dǎo)致腦炎/腦疾的發(fā)病。如此揭示的腦炎/腦疾發(fā)病的機(jī)理更詳述如下。
那么，上述的對(duì)腦水腫高度敏感的狀況是由下面不同因素或其它未知的因素誘導(dǎo)的。這些因素是例如通過(guò)(1)流感病毒感染，或其它病毒感染，例如RS病毒感染，腺病毒感染，麻疹病毒感染，脊髓灰質(zhì)炎病毒感染或瘧疾感染，(2)服用解熱劑，如阿司匹林，雙氯酚酸鈉或甲酚鈉酸，(3)例如由先天代謝紊亂導(dǎo)致的線(xiàn)粒體中長(zhǎng)鏈和中鏈脂肪酸的代謝紊亂，或(4)由于藥物或人工透析誘發(fā)的、血液卡胺酸(Cartinine)水平降低引起的線(xiàn)粒體中脂肪酸代謝的紊亂。在這種對(duì)腦水腫高度敏感的狀況下，VDAC的表達(dá)也在一個(gè)高水平上。當(dāng)這種狀況處于VDAC表達(dá)水平升高是伴隨著諸如流感病毒等病原體的感染時(shí)，通過(guò)體內(nèi)各種炎性反應(yīng)，VDAC的表達(dá)更會(huì)加速，或者促進(jìn)小型纖溶酶或纖溶酶的產(chǎn)生，以及小型纖溶酶或纖溶酶會(huì)在大腦血管內(nèi)皮聚集。腦炎/腦疾由此就自身表現(xiàn)出來(lái)。
如上所述，在VDAC表達(dá)水平的升高是直接導(dǎo)致腦炎/腦疾的因素這一新的發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究的結(jié)果而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了由下面1-11項(xiàng)定義的方法和藥劑。
第1項(xiàng).一種檢測(cè)腦炎/腦疾的方法，包括制備獲自疑似腦炎/腦疾發(fā)病的病人的含VDAC樣品，測(cè)定樣品中VDAC表達(dá)水平，并利用所述表達(dá)水平的升高作為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)腦炎/腦疾的發(fā)病和發(fā)病的敏感度(發(fā)病風(fēng)險(xiǎn))。
第2項(xiàng).如第1項(xiàng)所定義的方法，其中的腦炎/腦疾是流感腦炎/腦疾。
第3項(xiàng).如第1或2項(xiàng)所定義的方法，其中VDAC表達(dá)水平的測(cè)定是以測(cè)定VDAC基因轉(zhuǎn)錄的方式進(jìn)行的。
第4項(xiàng).如第1或2項(xiàng)所定義的方法，其中VDAC表達(dá)水平的測(cè)定是以測(cè)定VDAC蛋白的方式進(jìn)行的。
第5項(xiàng).如第1-4項(xiàng)所定義的方法，其中的VDAC含有至少一種選自VDAC-1，VDAC-2和VDAC-3中的同工型。
第6項(xiàng).一種確定由藥物導(dǎo)致的腦炎/腦疾發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括在所述藥物存在的系統(tǒng)中，測(cè)定表達(dá)VDAC的細(xì)胞中VDAC的表達(dá)水平，與在無(wú)所述藥物存在的系統(tǒng)中測(cè)定的表達(dá)VDAC的細(xì)胞中VDAC表達(dá)水平相比較，以及利用兩者表達(dá)水平之間的差異作為指標(biāo)來(lái)確定由藥物導(dǎo)致的腦炎/腦疾的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
第7項(xiàng).第6項(xiàng)所定義的確定由藥物導(dǎo)致的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中在藥物存在下表達(dá)VDAC的細(xì)胞系統(tǒng)是通過(guò)施用藥物給測(cè)試動(dòng)物而形成的。
第8項(xiàng).第6項(xiàng)所定義的確定的藥物導(dǎo)致的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中藥物存在的表達(dá)VDAC的細(xì)胞系統(tǒng)是通過(guò)向表達(dá)VDAC細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加藥物而形成的。
第9項(xiàng).一種篩選用于治療腦炎/腦疾的候選藥物的方法，包括在測(cè)試物質(zhì)存在的系統(tǒng)中測(cè)定表達(dá)VDAC的細(xì)胞中VDAC的表達(dá)水平，將如此測(cè)定的表達(dá)水平與在測(cè)試物質(zhì)不存在的系統(tǒng)中測(cè)得的表達(dá)VDAC的細(xì)胞中VDAC的表達(dá)水平相比較，后者的水平作為參照值，并且與參照值相比，當(dāng)測(cè)試物質(zhì)對(duì)降低表達(dá)水平有效時(shí)挑選其作為候選藥物。
第10項(xiàng).一種篩選能夠抑制小型纖溶酶，纖溶酶或纖酶溶原與作為受體的VDAC結(jié)合的候選藥物的方法，該方法包括在測(cè)試物質(zhì)存在的系統(tǒng)中測(cè)定小型纖溶酶，纖溶酶或纖酶溶原與VDAC蛋白的結(jié)合水平，將如此測(cè)定的結(jié)合水平與所述測(cè)試物質(zhì)不存在的系統(tǒng)中小型纖溶酶，纖溶酶或纖酶溶原與VDAC蛋白的結(jié)合水平相比較，后者的水平作為參考值，并且參考值相比，當(dāng)測(cè)試物質(zhì)對(duì)降低結(jié)合水平有效時(shí)，挑選其作為候選藥物。
第11項(xiàng).一種用于治療腦炎/腦疾的藥劑，即一種用于抑制與VDAC蛋白結(jié)合的小型纖溶酶和纖溶酶的產(chǎn)生從而抑制腦炎/腦疾的發(fā)病的藥劑，如通過(guò)第9或第10項(xiàng)定義的方法來(lái)挑選。
說(shuō)明書(shū)中縮寫(xiě)的氨基酸、肽、核苷酸序列、核苷酸等等的表示符合IUPAC-IUB“IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature，Eur.J.Biochem.，1399(1984)”或“核苷酸序列和/或氨基酸序列的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)等撰寫(xiě)指南(Guideline for drafting patent specifications and soforth relative to nucleotide sequences and/or amino acid sequences)”(由Japanese Patent Office編輯)推薦的規(guī)則以及符合相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中代碼或符號(hào)的使用的常規(guī)。
說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“VDAC”籠統(tǒng)地包含了在其含義范圍內(nèi)的VDAC的同工型，即VDAC-1，-2和-3，或VDAC基因和VDAC蛋白等等，在它們之間沒(méi)有做任何區(qū)分。VDAC本身是已知的，例如人源VDAC-1，-2和-3的核酸序列可以由國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的信息而獲得，編號(hào)分別是“NM003374”，“NM003375”和“NM005662”。用在后面所描述的實(shí)例部分中的腦炎模型鼠的鼠源VDAC-1，-2和-3的核苷酸序列也可采取同樣的方式獲取，編號(hào)分別是“NM011694”，“NM011695”和“NM011696”。
說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“流感腦炎/腦疾”指的是由流感病毒感染引起的且涉及發(fā)熱、痙攣和早期意識(shí)混亂，在某些情況下伴隨腦水腫和CT顯示兩側(cè)丘腦損傷的疾病。所述流感腦炎/腦疾包括所有伴隨流感傳染并顯示出VDAC表達(dá)水平升高作為發(fā)病因素的腦炎/腦疾的類(lèi)型。在某些情況下，所述流感腦炎/腦疾也包括諸如迄今為止定義為雷氏征候群、急性壞死性腦疾和HSES(出血性休克和腦疾綜合癥)等疾病。此外，不符合上面提到的那些腦炎/腦疾、但是伴隨流感傳染且作為發(fā)病機(jī)理的VDAC表達(dá)水平升高的這樣的腦炎/腦疾類(lèi)型也包括在其中。
這里提到的“腦炎/腦疾”不但包括上面提及的流感腦炎/腦疾，而且也包括不同類(lèi)型的、觀察到VDAC表達(dá)水平升高作為發(fā)病因素的腦炎/腦疾。因此，當(dāng)觀察到VDAC表達(dá)水平升高作為發(fā)病因素時(shí)，無(wú)關(guān)其起因，那些迄今已經(jīng)歸為雷氏癥候群等等類(lèi)型的腦炎/腦疾甚至都可包括在這里所定義的腦炎/腦疾中。
根據(jù)本發(fā)明，可以闡明不同類(lèi)型的腦炎/腦疾，典型的是流感腦炎/腦疾的發(fā)病因素和/或發(fā)病機(jī)理，可建立用于精確診斷、治療和預(yù)防尤其是這樣的腦炎/腦疾的方法。根據(jù)本發(fā)明，也有可能提供一種確定由藥物導(dǎo)致的腦炎/腦疾發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法(測(cè)試藥物的方法)，一種篩選用于治療腦炎/腦疾的候選藥物的方法，以及用于實(shí)施這些方法的各種試劑。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是WT和JVS小鼠的大腦、肺、肝臟和血液中流感病毒基因組拷貝數(shù)的PCR測(cè)定結(jié)果的比較表示法。
圖2是纖酶溶原、小型纖溶酶和微纖溶酶與VDAC結(jié)合水平測(cè)定結(jié)果的表示法。
圖3是RT-PCR分析揭示的由不同誘導(dǎo)發(fā)病因素，典型的是由流感傳染引起的WT小鼠大腦中VDAC-1表達(dá)水平升高結(jié)果的表示法。
圖4是WT小鼠的大腦和肺部中VDAC-1 mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定結(jié)果的圖形比較表示法。
圖5是WT小鼠的大腦和肺部中VDAC-2 mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定結(jié)果的圖形比較表示法。
圖6是WT小鼠的大腦和肺部中VDAC-3 mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定結(jié)果的圖形比較表示法。
圖7為免疫組織化學(xué)分析獲得的顯微照片，顯示了JVS小鼠的大腦中VDAC蛋白的表達(dá)。
圖8為免疫組織化學(xué)分析獲得的顯微照片，顯示了流感傳染的JVS小鼠的大腦中VDAC蛋白的表達(dá)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方法下面將一一詳述依據(jù)本發(fā)明的腦炎/腦疾的診斷方法，藥物安全性的確定方法以及候選藥物的篩選方法。
(1)確定(診斷)腦炎/腦疾的方法在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法時(shí)，首先要制備獲自疑似腦炎/腦疾發(fā)病的病人的含有VDAC的樣品。提供的樣品不受特別的限制，它含有VDAC基因的轉(zhuǎn)錄本或翻譯產(chǎn)物(VDAC蛋白)，是檢測(cè)的目標(biāo)。用于轉(zhuǎn)錄分析的樣品的實(shí)例是不同的由外周血、淋巴結(jié)、腦脊髓液、胸腔液體、腹腔液體、手術(shù)時(shí)得到的洗滌物等等中獲得的含有組織細(xì)胞和切除組織的生物樣品，或者象頭發(fā)這樣的組織的細(xì)胞。用于翻譯產(chǎn)物分析的樣品的實(shí)例除了上述提到的同樣的組織細(xì)胞外，還有得自其中的體液。這些樣品用傳統(tǒng)的方法收集或制備。
樣品中VDAC表達(dá)水平的測(cè)定既可以以測(cè)定樣品中VDAC基因表達(dá)水平(轉(zhuǎn)錄測(cè)定)的方式，以可以以測(cè)定VDAC基因的表達(dá)產(chǎn)物，VDAC蛋白的表達(dá)水平(翻譯產(chǎn)物的測(cè)定)的方式進(jìn)行。不論哪種方式，都可通過(guò)本領(lǐng)域通常已知的各種方法來(lái)進(jìn)行。要測(cè)定的VDAC可以是任何同工型VDAC-1，-2和-3或者可以是至少兩種或更多種的混合物。
更特別地，可通過(guò)測(cè)定VDAC基因的轉(zhuǎn)錄物mRNA來(lái)確定VDAC基因的表達(dá)水平，如通過(guò)RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；E.S.Kawasaki，等人，RNA擴(kuò)增。在“PCR方案，方法和應(yīng)用指南”中(Amplification of RNA.In PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications)，Academic Press，Inc.，San Diego，21-27(1991))的RNA擴(kuò)增，利用像RNA印跡這種技術(shù)的細(xì)胞水平測(cè)定的方法(分子克隆(Molecular Cloning)，Cold Spring Harbor Lab.(1989))，原位RT-PCR(Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1991))，或原位雜交，或通過(guò)NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplification)，Nature，350，91-92(1991))。
更佳的檢測(cè)方法是以RT-PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法?？筛鶕?jù)實(shí)時(shí)PCR法(參見(jiàn)，例如Proc.Natl.Acad Sci.，88，7276-7280(1991))；日本未審專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)No.H06-500021；Biotechniques，22，176-181(1997))較方便地進(jìn)行，該方法可對(duì)想要的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。
更特別地，可以通過(guò)下面的方式進(jìn)行RT-PCR。即，用傳統(tǒng)的方法從樣品中提取RNA，由RNA制備cDNA，以此為模板設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增VDAC基因區(qū)，即目標(biāo)的一對(duì)引物(正向鏈與上述cDNA的(-鏈)結(jié)合，而反向鏈與(+鏈)結(jié)合)與模板雜交。然后，用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行PCR并檢測(cè)擴(kuò)增的雙鏈DNA。該擴(kuò)增的雙鏈DNA可以用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)或其他的方法進(jìn)行檢測(cè)，如方法中包括進(jìn)行上述PCR時(shí)，使用預(yù)先用放射性同位素或熒光物質(zhì)標(biāo)記的引物，再檢測(cè)因此產(chǎn)生的標(biāo)記的雙鏈DNA，或者方法中包括將生成的雙鏈DNA例如用傳統(tǒng)的方法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，再用標(biāo)記的探針檢測(cè)雜交產(chǎn)物。
上述方法中使用的引物僅需要能夠特異性擴(kuò)增想要的VDAC即可，而且可在本領(lǐng)域已知的VDAC DNA序列信息的基礎(chǔ)上以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行設(shè)計(jì)。一般建議每個(gè)引物的核苷酸的長(zhǎng)度大約是10-35，較佳地是大約15-30。同樣地，設(shè)計(jì)的探針只要能夠特異地與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交且能夠特異檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物即可。探針可以與引物的核苷酸長(zhǎng)度大致相同，而且可以被標(biāo)記，例如用任意的報(bào)告熒光染料和任意的猝滅熒光染料標(biāo)記，從而可用在依照實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的檢測(cè)中。
這些引物和探針可用自動(dòng)化DNA合成儀，例如DNA synthesizerPharmacia LKB Gene Assembler Plus(Pharmacia出品)按照傳統(tǒng)的方法來(lái)合成。
進(jìn)行RT-PCR或?qū)崟r(shí)PCR的儀器、設(shè)備和多用試劑盒都是商用的，而且根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行這些測(cè)定時(shí)，這些商業(yè)產(chǎn)品都可適當(dāng)采用。
上述可利用的各種步驟，如RNA的提取、DNA或DNA片段的合成、用于裂解、刪除、添加或連接的酶處理、RNA或DNA的分離、純化、復(fù)制、篩選和擴(kuò)增都可用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行(參照，例如，Bunshi-Idengaku Jikkenho(分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)(Experiments in MolecularGenetics))，1983年由Kyoritsu Shuppan Co.，Ltd出版；PCR Technology，1990年由Takara Shuzo Co.，Ltd.出版)。也可以根據(jù)其應(yīng)用進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。更進(jìn)一步地，例如在對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列進(jìn)行測(cè)定時(shí)，本領(lǐng)域已知的各種方法或?qū)?lái)有可能開(kāi)發(fā)的方法都可被廣泛地采用(例如，循環(huán)測(cè)序參見(jiàn)，如Shohei Hattori，“利用PCR直接確定堿基序列(Direct base Sequence determination Usiug PCR)，”Jikken Igaku(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué))(專(zhuān)利)新PCR技術(shù)和應(yīng)用(New PCR Techniques andApplicarions，29-35(1997))，Published by Yodosha)。
VDAC蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)可根據(jù)比如像蛋白印跡或利用如VDAC蛋白抗體的ELISA這些傳統(tǒng)的方法來(lái)進(jìn)行。更特別地，例如蛋白印跡可以通過(guò)抗VDAC蛋白的抗體作為第一抗體，然后用放射性同位素如125I或熒光物質(zhì)標(biāo)記的標(biāo)記抗體(標(biāo)記抗體能與第一抗體結(jié)合)作為第二抗體，利用放射探測(cè)儀(例如BAS-1800IIproduct of Fuji PhotoFilm Co.)或熒光探測(cè)儀檢測(cè)和測(cè)量發(fā)自被標(biāo)記的結(jié)合產(chǎn)物的放射性同位素或熒光物質(zhì)的信號(hào)。
VDAC蛋白的生理活性，也就是上述的測(cè)量目標(biāo)是已知的，而且蛋白的量與其活性之間確實(shí)有一定的關(guān)聯(lián)。因此，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)(診斷)也可以通過(guò)測(cè)定蛋白的活性代替測(cè)定蛋白水平來(lái)進(jìn)行。這樣，本發(fā)明也包括一種診斷腦炎/腦疾的方法，含有通過(guò)任何已知方法測(cè)定并評(píng)價(jià)作為指標(biāo)的VDAC蛋白活性。
依照本發(fā)明的診斷方法，當(dāng)VDAC表達(dá)水平(VDAC基因表達(dá)水平，VDAC蛋白水平或VDAC活性，在這里統(tǒng)稱(chēng)為“VDAC表達(dá)水平)用上面描述的方法測(cè)定為升高時(shí)，可斷定為有腦炎/腦疾發(fā)病或發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。例如，可通過(guò)預(yù)先測(cè)定從正常受試者獲得的樣品中VDAC的表達(dá)水平，確定平均值或統(tǒng)計(jì)學(xué)中間值，用該值作為用于比較的參照值，或通過(guò)時(shí)間間隔對(duì)每個(gè)病人進(jìn)行多次測(cè)定，用在先的測(cè)定值作為參照值與在后的測(cè)定值比較來(lái)判斷這種升高。
VDAC蛋白的抗體可以利用VDAC蛋白作為免疫原來(lái)制備VDAC蛋白的抗體?？贵w包括抗血清(多克隆抗體)和單克隆抗體?？贵w的制備本身是本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉的。VDAC蛋白的抗體也可以通過(guò)傳統(tǒng)的方法來(lái)制備(參見(jiàn)，例如，Zoku Seikagaku Jikken Koza(生化實(shí)驗(yàn)講座(Lectureson Biochemical Experiments)，second series)“Men-eki SeikagakuKenkyuho(免疫生化方法(Methods in Immunobiochemistry))”，由Japanese Biochemical Society編輯))。利用由此得到的抗體可有益于，例如，純化VDAC蛋白，或通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)分析或識(shí)別該蛋白。VDAC蛋白的抗體可部分地用來(lái)銷(xiāo)售，而且這些商業(yè)產(chǎn)品也可在本發(fā)明的實(shí)踐中適當(dāng)?shù)厥褂谩?br> 例如，通過(guò)基于抗體的免疫學(xué)方法測(cè)定VDAC表達(dá)水平的一個(gè)特殊的實(shí)例在后面的實(shí)例部分說(shuō)明。那么該抗體有利于在藥用領(lǐng)域作為檢測(cè)VDAC表達(dá)水平的試劑，或用作診斷涉及VDAC的腦炎/腦疾的試劑。進(jìn)一步地，如后面所描述的，抗體也可被用來(lái)篩選能夠抑制VDAC活性的候選藥物。
用于腦炎/腦疾的診斷試劑或試劑盒(探測(cè)試劑或試劑盒)適用于本發(fā)明的腦炎/腦疾診斷方法。該試劑盒包含適用于進(jìn)行上述VDAC表達(dá)水平測(cè)定方法的試劑作為活性成分。
該試劑盒含有作為基本成分的適用于檢測(cè)VDAC表達(dá)水平的方法的特異試劑。根據(jù)所用的檢測(cè)方法可適當(dāng)?shù)剡x擇這種特異試劑。該試劑中尤其包括抗VDAC蛋白的抗體，用于檢測(cè)VDAC基因轉(zhuǎn)錄的探針和/或用于檢測(cè)的引物對(duì)等等。因此，該試劑被表征為用于本發(fā)明中特異檢測(cè)測(cè)定目標(biāo)物的方法所必需的試劑。用于進(jìn)行PCR的通用試劑不考慮作為該診斷試劑盒的必需成分，但是例如像用于雜交的試劑可以包含在該診斷試劑盒中。因此本發(fā)明也提供了用于診斷腦炎/腦疾的這種試劑盒。
(2)由藥物導(dǎo)致的腦炎/腦疾發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的確定方法(藥物測(cè)試法)本發(fā)明也提供了一種測(cè)試已知的或新的用于治療流感傳染的藥物例如對(duì)一旦服用是否導(dǎo)致引發(fā)腦炎/腦疾的風(fēng)險(xiǎn)的方法，或者一種評(píng)估這種風(fēng)險(xiǎn)水平的方法，換句話(huà)說(shuō)，一種測(cè)試藥物對(duì)腦炎/腦疾發(fā)病的安全性(安全性測(cè)試)的方法。
該藥物測(cè)試的方法是在藥物存在的系統(tǒng)中測(cè)定表達(dá)VDAC的細(xì)胞的VDAC表達(dá)水平，并與在藥物不存在的系統(tǒng)中測(cè)定的表達(dá)VDAC的細(xì)胞的VDAC表達(dá)水平相比較，以所述表達(dá)水平的差別(變化)為指標(biāo)。如果在藥物存在的系統(tǒng)中表達(dá)VDAC的細(xì)胞的VDAC表達(dá)水平與在藥物不存在的系統(tǒng)中測(cè)得的表達(dá)水平相比至少顯示沒(méi)有升高(也就是說(shuō)差別是零或負(fù)數(shù))，那么可以斷定該測(cè)試藥物不會(huì)有引發(fā)腦炎/腦疾的風(fēng)險(xiǎn)。
上述藥物存在的系統(tǒng)包括(a)通過(guò)給試驗(yàn)動(dòng)物施用藥物而形成的系統(tǒng)(體內(nèi)系統(tǒng))和(b)在表達(dá)VDAC的細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加藥物而形成的系統(tǒng)(體外系統(tǒng))。
試驗(yàn)動(dòng)物不是特別限制的，但可以?xún)?yōu)選利用處于線(xiàn)粒體應(yīng)激(mitochondrial stress)狀況下的模型動(dòng)物。這種模型動(dòng)物表現(xiàn)出升高的VDAC表達(dá)水平且處于腦炎/腦疾(腦水腫)發(fā)病的預(yù)備期(升高的腦水腫敏感階段)，而且當(dāng)諸如流感病毒的感染這樣的觸發(fā)因素作用于該模型動(dòng)物時(shí)，它自身會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的水腫(流感腦炎/腦疾發(fā)病模型)，所以這些動(dòng)物適合用于上面提到的藥物測(cè)試。
通過(guò)誘導(dǎo)線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝紊亂可以制成處于線(xiàn)粒體應(yīng)激之下的模型動(dòng)物?？杀惶岬降淖鳛榈湫偷哪Ｐ蛣?dòng)物的范例例如是肉毒堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCTN2-缺陷小鼠(例如JVS(幼態(tài)內(nèi)臟皮脂腺病)小鼠)和用肉毒堿拮抗物(例如β-(2，2，2-三甲基肼)-丙酸鹽；THP)給藥的小鼠。
用測(cè)試的藥物給藥這些測(cè)試動(dòng)物，并測(cè)定該動(dòng)物的不同組織和/或細(xì)胞，特別是腦組織中VDAC的表達(dá)水平。一旦觀察到表達(dá)水平(參照是由省略施用測(cè)試藥物得到的無(wú)藥物系統(tǒng)中的表達(dá)水平)有所升高(當(dāng)差別是正值時(shí))，可以斷定測(cè)試藥物具有腦炎/腦疾的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)表達(dá)水平?jīng)]有可疑的的升高或表達(dá)水平有所下降時(shí)，可以斷定該測(cè)試藥物是安全的，即沒(méi)有腦炎/腦疾的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，可以利用一種通過(guò)將測(cè)試藥物添加到表達(dá)VDAC細(xì)胞的培養(yǎng)液中而建立的系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行藥物的測(cè)試。在這個(gè)系統(tǒng)中可利用的表達(dá)VDAC的細(xì)胞是那些獲自不同的帶有VDAC或其基因的組織或細(xì)胞的細(xì)胞，因此，可以使用的細(xì)胞例如是腦細(xì)胞，肺部細(xì)胞，肝臟細(xì)胞或現(xiàn)成的細(xì)胞株。表達(dá)VDAC的細(xì)胞可以是人工的重組細(xì)胞，由傳統(tǒng)的方法引入VDAC基因使之表達(dá)VDAC。表達(dá)VDAC的細(xì)胞進(jìn)一步包括那些獲自處于上面提到的線(xiàn)粒體應(yīng)激狀況下的模型動(dòng)物的細(xì)胞。
用在本發(fā)明測(cè)試方法中的細(xì)胞也包括是細(xì)胞聚集體的組織，例如腦組織，肺部組織和肝臟組織。
這些細(xì)胞可維持在普通的細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且細(xì)胞中VDAC的表達(dá)水平可以用傳統(tǒng)的方法在培養(yǎng)基中預(yù)先含有一定量的測(cè)試藥物或不含測(cè)試藥物的情況下來(lái)測(cè)定。在傳統(tǒng)的程序中含測(cè)試藥物的系統(tǒng)與不含藥物的系統(tǒng)的條件(溫度、pH、培養(yǎng)基組成等)是相同的，而且要從這些條件中進(jìn)行適當(dāng)選擇，在這些條件下細(xì)胞不會(huì)死亡而VDAC可以表達(dá)。在上述測(cè)試方法中，可以通過(guò)(1)所描述的不同方法來(lái)測(cè)定VDAC的表達(dá)水平。
(3)篩選用于腦炎/腦疾治療的候選藥物的方法本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于候選藥物篩選的方法，包括測(cè)定在含有測(cè)試物質(zhì)的系統(tǒng)中表達(dá)VDAC的細(xì)胞的VDAC表達(dá)水平，將測(cè)定到的表達(dá)水平與不含所述測(cè)試物質(zhì)的系統(tǒng)中的表達(dá)VDAC的細(xì)胞的VDAC表達(dá)水平(該水平作為參照值)相比較，當(dāng)與參照值相比測(cè)試物質(zhì)產(chǎn)生起降低VDAC表達(dá)水平的作用時(shí)(具有VDAC表達(dá)水平降低的活性)，挑選其作為候選藥物。
上述篩選方法中可用作含測(cè)試物質(zhì)的系統(tǒng)和不含測(cè)試物質(zhì)的系統(tǒng)與(2)所描述的體內(nèi)和體外的含藥物和不含藥物的系統(tǒng)是同一種。用測(cè)試物質(zhì)處理(給測(cè)試動(dòng)物施用和添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中)和VDAC表達(dá)水平的測(cè)定也是用同樣的方法進(jìn)行。被篩選的測(cè)試物質(zhì)不是特別限定的，但包括核酸(包括VDAC基因的反義核苷酸)，肽，蛋白，有機(jī)化合物，無(wú)機(jī)化合物等等。
本發(fā)明篩選方法選作侯選藥物的那些測(cè)試物質(zhì)以降低VDAC表達(dá)水平為指標(biāo)。通過(guò)這種篩選，有可能挑選出有潛力的能用于預(yù)防，減輕或治愈腦炎/腦疾的候選藥物。
本發(fā)明篩選方法優(yōu)選的實(shí)施方式包括在測(cè)試物質(zhì)存在的系統(tǒng)中測(cè)定小型纖溶酶，纖溶酶或纖溶酶原與VDAC蛋白的結(jié)合水平，將如此測(cè)定的結(jié)合水平與在測(cè)試物質(zhì)不存在的系統(tǒng)中測(cè)得的小型纖溶酶或類(lèi)似的物質(zhì)與VDAC蛋白的結(jié)合水平的結(jié)果(參照值)相比較，當(dāng)與參照值相比測(cè)試物質(zhì)有效降低結(jié)合水平時(shí)，挑選其作為候選藥物。這種方法利用了VDAC蛋白功能中的一種，即VDAC蛋白作為受體容許小型纖溶酶，纖溶酶和纖溶酶原與之結(jié)合的功能。能夠抑制小型纖溶酶及類(lèi)似物質(zhì)與作為受體的VDAC蛋白結(jié)合的候選物質(zhì)有利于作為用于治療腦炎/腦疾的藥物。
這種方法可以利用本領(lǐng)域已知的VDAC蛋白和至少一種選自小型纖溶酶，纖溶酶和纖溶酶原的物質(zhì)，以及檢測(cè)測(cè)試物質(zhì)對(duì)兩者之間結(jié)合的影響來(lái)進(jìn)行。因此，這種方法可以通過(guò)檢測(cè)測(cè)試物質(zhì)降低(抑制)小型纖溶酶，纖溶酶或纖溶酶原與VDAC蛋白結(jié)合的程度來(lái)進(jìn)行。可以用傳統(tǒng)的方法對(duì)VDAC蛋白與小型纖溶酶，纖溶酶或纖溶酶原的結(jié)合水平進(jìn)行測(cè)定，例如利用已知的分別特異于VDAC蛋白，小型纖溶酶，纖溶酶和纖溶酶原的抗體。
通過(guò)本發(fā)明的篩選方法選擇的候選藥物包括上面提到的核酸，肽，蛋白等等，以及那些抑制無(wú)蛋白酶水解活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為具有蛋白酶水解活性的小型纖溶酶或纖溶酶，從而阻礙小型纖溶酶、纖溶酶與VDAC蛋白產(chǎn)生結(jié)合，也就防止腦炎/腦疾發(fā)病的藥物，例如纖溶酶原激動(dòng)子抑制劑，粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，組織蛋白酶D抑制劑，等等。
(4)用于治療腦炎/腦疾的藥物由上述(3)描述的篩選方法挑選出的候選藥物有利于作為治療腦炎/腦疾的藥物。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有這樣的藥物作為活性成分的用于治療腦炎/腦疾的藥劑。
根據(jù)本發(fā)明，上面提到的治療劑中的活性成分既可以是利用本發(fā)明的篩選方法挑選出的，也可以是依據(jù)被挑選出的藥物的信息通過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)或以傳統(tǒng)方法在商業(yè)基礎(chǔ)上制備而得的。
活性成分既可以就這么使用也可以與已知的藥學(xué)上可接受的載體(賦型劑或稀釋劑，填充劑，結(jié)合劑，潤(rùn)滑劑，等)混合等等制成藥用組合物。萬(wàn)一活性成分是蛋白，藥用組合物優(yōu)選適當(dāng)?shù)夭捎酶鞣N在通常蛋白制劑中使用的成分，例如穩(wěn)定劑，滅菌劑，緩沖劑，等滲劑(isotonizing agents)，鰲合劑，pH調(diào)節(jié)劑，表面活性劑等來(lái)制備。
藥用組合物的施用根據(jù)其制備成的形式既可以是口服，也可以是非腸道給藥(口服劑型，如片劑，丸劑，膠囊，粉劑，顆粒劑，糖漿等；非腸道劑型，如注射，輸液制劑，外用制劑，栓劑等)。本發(fā)明的藥用組合物也可以采用可貯藏的制品的形式，通過(guò)冷凍干燥溶液制劑制備而成；可以在使用時(shí)臨時(shí)在水，生理鹽水或類(lèi)似緩沖的溶液中溶解到適當(dāng)?shù)臐舛取?br> 本發(fā)明的藥用制劑含有藥理學(xué)有效量的活性成分，且其劑量可以根據(jù)活性成分的種類(lèi)，服用途徑，年齡，重量和服用對(duì)象或病人的癥狀而改變，但除此之外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可在動(dòng)物測(cè)試效果的基礎(chǔ)上做適當(dāng)?shù)倪x擇。
本發(fā)明人已經(jīng)揭示了VDAC在腦炎/腦疾發(fā)病中起著重要的作用，而且進(jìn)一步證明了導(dǎo)致VDAC表達(dá)水平升高的因素之一是線(xiàn)粒體中脂肪酸代謝的紊亂。鑒于此，可以考慮通過(guò)施用能夠恢復(fù)或改善紊亂的脂肪酸代謝的藥物使得VDAC表達(dá)水平正常化，由此產(chǎn)生對(duì)腦炎/腦疾治療和改善的作用。因此，那些依照本發(fā)明已診斷為腦炎/腦疾發(fā)病的病人，當(dāng)疑為脂肪酸代謝紊亂時(shí)，適當(dāng)?shù)赜盟幬镏委焷?lái)改善這種紊亂。這種藥物的例證是含有肉毒堿和/或葡萄糖為活性成分的藥物。該藥物可以采用上面已給出的藥用組合物同樣的形式，條件是至少含有一種選自肉毒堿和葡萄糖的活性成分。當(dāng)然，它們也可以是那些已經(jīng)用作處方藥的肉毒堿制劑和/或葡萄糖制劑。
實(shí)施例下面給出的實(shí)例進(jìn)一步詳細(xì)闡述了本發(fā)明。
實(shí)例1(測(cè)試材料和方法)(1)測(cè)試病毒菌株，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑-病毒株采用非-親神經(jīng)性的流感A/Aichi/68(H3N2)株(由Mr.Masato Tashiro，National Institute of Infectious Diseases提供)。
-實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至于野生型的小鼠，采用的是購(gòu)自Japan SLC，Inc.和Charle River Japan Inc.的正常C57BL/6J小鼠(WT)。采用表現(xiàn)為幼態(tài)內(nèi)臟皮脂腺病的肉毒堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCTN2-缺陷的C57BL/6J小鼠作為處于線(xiàn)粒體應(yīng)激狀況的模型小鼠(由Assistant Professor MasmichiKuwajima，University of Tokushima School of Medicine提供)(Kuwajima，M.等人，“系統(tǒng)性肉毒堿缺陷的動(dòng)物模型在與動(dòng)態(tài)內(nèi)臟皮脂腺病相關(guān)小鼠的C3H-H20株中的分析(Animal model of systemic carnitinedeficiencyanalysis in C3H-H2。Strain of mouse associated with juvenilevisceral steatosis)”Biochem.Biophys.Res.Commun.174，1090-1094，1999；Tamai，Z.等人，“有機(jī)陽(yáng)離子/肉毒堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在小鼠中的分子和功能特征(Molecular and functional characterization of organiccation/carnitine transporter family in mice)”.J.Biol.Chem.275，40064-40072，2000)。試驗(yàn)中主要選用出生后2天到斷奶期(出生后3周)的新生(哺乳期)小鼠，因?yàn)樾∈笏幍哪挲g最易發(fā)生流感腦炎/腦疾。
-解熱劑采用雙氯酚酸鈉和阿司匹林(乙酰水楊酸)(Sigma)。
-β-氧化紊亂誘導(dǎo)劑肉毒堿拮抗物β-(2，2，2-三甲基肼)-丙酸鹽(THP)用作暫時(shí)地和可逆地導(dǎo)致體內(nèi)脂肪酸β-氧化紊亂的試劑，以此誘導(dǎo)出與JVS小鼠中相同的內(nèi)在狀況。
(2)病毒感染的方法在受孕的雞蛋或MDCK細(xì)胞(上皮細(xì)胞株)(RIKEN CellEngineering Division所給)中增殖的流感病毒A/Aichi/68(H3N2)用生理鹽水稀釋?zhuān)⒂?μl的稀釋液(1.2×104PFU)在乙醚麻醉狀況下鼻內(nèi)感染3天大的小鼠。用8μl這樣的稀釋液(3.3×104PFU)在乙醚麻醉狀況下鼻內(nèi)感染斷奶期的小鼠。病毒感染后，每日測(cè)量體重和死亡數(shù)。在進(jìn)行病毒滴度測(cè)定時(shí)，動(dòng)物在乙醚麻醉下使之安樂(lè)死，并收集器官用于測(cè)定試驗(yàn)。
(3)解熱劑和THP的施用在每只小鼠的后頸部每日兩次皮下注射25μl份的雙氯酚酸鈉(1μl/ml)的生理鹽水溶液或25μl份的30μl/ml的阿司匹林溶液。以體重為基礎(chǔ)，雙氯酚酸鈉每日的劑量是4mg/kg/日，或阿司匹林是120mg/kg/日。將THP溶解在生理鹽水中并用25μl的溶液每日兩次在每只小鼠的后頸部位給藥。日劑量是300mg/kg/日。
(4)用伊文思藍(lán)測(cè)定腦水腫用乙醚麻醉每只小鼠，單在左側(cè)胸腔的骨頭處施以胸腔切開(kāi)術(shù)，用微毛細(xì)管將10μl的伊文思藍(lán)溶液(20mg/ml的生理鹽水)從左心室注入。十分鐘后切開(kāi)右心房，將6倍于體重的生理鹽水從左心室灌入取出全身血管中的伊文思藍(lán)，再反萃取出滲入組織中的伊文思藍(lán)并測(cè)定含量，作為水腫的指標(biāo)。
(5)流感病毒RNA的定量為了測(cè)定不同器官，如大腦，肺和肝中的流感病毒的RNA，用TRIzol試劑(Gibco BRL)從每種器官中提取總RNA，用1μl的總RNA進(jìn)行RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)檢測(cè)病毒。在自動(dòng)合成儀上合成所用的引物。以流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)的核苷酸序列為基礎(chǔ)(Verhoeyen，M.，等人，“香港流感株A/Aichi/2/68和A/Victorica/3/75的血細(xì)胞凝集素之間的抗原漂移(Antigenic driftbetween the haemagglutinin of the Hong Kong influenza strainsA/Aichi/2/68 and A/Victorica/3/75)”.Nature 286，771-776，1980；Kida，H.等人，“來(lái)自中國(guó)豬的H3N2流感病毒的血細(xì)胞凝集素基因的起源(Origin of the hemagglutinin gene of H3N2 influenza Viruses from pigsin China)”.Virology 162，160-166，1988)，引物P1SEQ ID NO1和P2SEQ ID NO2用在第一次PCR對(duì)578bp的檢測(cè)中。進(jìn)一步地，P3SEQID NO3和P4SEQ ID NO4用在第二次PCR對(duì)232bp的檢測(cè)中。在實(shí)時(shí)PCR中，使用熒光標(biāo)記的探針，P5SEQ ID NO5和P6SEQ IDNO6，與TaqManTM探針(SEQ ID NO7，F(xiàn)AM與5’端結(jié)合，TRMRA與3’端結(jié)合)一起使用，在ABI Prism 7700(Applied Biosystems)上進(jìn)行測(cè)定。用將流感病毒A/Aichi/68(H3N2)的HA cDNA嵌到pGEM-T載體(Promega)上而構(gòu)建的質(zhì)粒制作工作曲線(xiàn)，并用其作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)進(jìn)行定量。
(6)通過(guò)RT-PCR對(duì)VDAC mRNA表達(dá)水平升高的研究以上面提到的相同的方法依照廠(chǎng)家提供的手冊(cè)用TRIzol試劑(Gibco)提取試驗(yàn)動(dòng)物的大腦和肺部RNAs。
(7)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR的VDAC的定量用1μl的從組織或細(xì)胞中提取的RNA，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶H(Promega)和寡(dT)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA。以該cDNA為模板，0.3μM的含引物對(duì)的反應(yīng)混合物用QuantiTect SYBRTMGreenPCT試劑盒(Qiagen)來(lái)制備，用ABI PRISMTM7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行PCR，95℃熱變性15分鐘后，進(jìn)行94℃15秒，55-60℃30秒和72℃30秒的循環(huán)30-40次，并分析PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。
VDAC包括三種異構(gòu)體，下面的引物對(duì)(都用自動(dòng)合成儀合成)被用來(lái)檢測(cè)各自的異構(gòu)體(小鼠的情況)。
VDAC1，335bp擴(kuò)增產(chǎn)物正向引物SEQ ID NO8反向引物SEQ ID NO9VDAC2，457bp擴(kuò)增產(chǎn)物正向引物SEQ ID NO10
反向引物SEQ ID NO11VDAC3，255bp擴(kuò)增產(chǎn)物正向引物SEQ ID NO12反向引物SEQ ID NO13對(duì)于作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的β-肌動(dòng)蛋白的檢測(cè)，SEQ ID NO14的引物用作正向引物，而SEQ ID NO15的引物作為反向引物。
上述RT-PCR得到的cDNA克隆到pGEM-T載體(Promega)上，隨后用Prime-a-GeneTM標(biāo)記系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行同位素標(biāo)記，以用作蛋白印跡中的探針。
在上述內(nèi)容中，下面的用于人VDAC檢測(cè)的引物對(duì)可被用于各自的異構(gòu)體。
VDAC1，181bp擴(kuò)增產(chǎn)物正向引物SEQ ID NO16反向引物SEQ ID NO17VDAC2，486bp擴(kuò)增產(chǎn)物正向引物SEQ ID NO18反向引物SEQ ID NO19VDAC3，255bp擴(kuò)增產(chǎn)物正向引物SEQ ID NO12反向引物SEQ ID NO13(8)通過(guò)免疫化學(xué)分析檢測(cè)流感病毒抗原，小型纖溶酶和VDAC用蛋白A SepharoseTM(Amersham Biosciences)純化通過(guò)流感病毒A/Aichi/68(H3N2)免疫家兔而獲得的抗體。通過(guò)將該IgG穿過(guò)固定有小鼠全血清蛋白的SepharoseTM4B柱而除去其中無(wú)特異性反應(yīng)的IgG，而沒(méi)被吸附的IgG級(jí)分被用作第一抗流感病毒的抗體。
利用Murakami，M等人的方法制備特異于小型纖溶酶的第一抗體(Eur.J.Biochem.268，2847-2855，2001)。抗纖溶酶和纖溶酶原的第一抗體是可從American Diagnostica獲得的商用產(chǎn)品。
致癌基因的VDAC Ab-5被用作抗VDAC的第一抗體。
每種純化的特異抗體IgG(1μg/ml)與用緩沖液/低聚甲醛固定的大腦切片在4℃下反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)1小時(shí)后在室溫下與第二抗體反應(yīng)。然后，依照抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物方法檢測(cè)每種抗原。
(研究結(jié)果和討論)(1)伴隨流感傳染的腦水腫在線(xiàn)粒體中，ATP主要是借助乙酰輔酶A(乙酰-CoA)在TCA循環(huán)中產(chǎn)生，而且導(dǎo)致乙酰輔酶A水平降低的各種因素是已知的，具體的是在長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝途徑中通過(guò)β-氧化作用經(jīng)由酰基肉毒堿的紊亂，例如受損的中間脂肪酸代謝，和經(jīng)由乙酰輔酶A的葡萄糖代謝途徑中的紊亂。上面提到的JVS小鼠和給予THP的小鼠都是處于線(xiàn)粒體應(yīng)激狀況下的模型鼠，帶有細(xì)胞膜水平上誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體內(nèi)膜內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝中的紊亂。
利用這些JVS小鼠對(duì)伴隨流感感染的腦水腫的時(shí)間過(guò)程所做的研究結(jié)果(腦水腫的測(cè)定如上述(4)所描述的用伊文思藍(lán)組織浸入作為指示劑)是，腦水腫的程度加深是流感傳染之后時(shí)間的函數(shù)。與同樣方法測(cè)試的野生型小鼠(WT)相比，腦水腫程度的加深是明顯的，在大腦軟組織中觀察到伊文思藍(lán)水平隨時(shí)間而增加。在無(wú)流感傳染的情況下(不用病毒感染的小鼠中)進(jìn)行的同樣試驗(yàn)中，WT或JVS小鼠都沒(méi)有觀察到腦水腫。因此很明顯，線(xiàn)粒體應(yīng)激誘導(dǎo)對(duì)腦水腫的敏感性的升高，而其自身并不觸發(fā)腦水腫，在該測(cè)試系統(tǒng)中流感病毒感染觸發(fā)了它。
(2)大腦中的流感病毒抗原和小型纖溶酶流感感染的JVS小鼠的大腦中的病毒抗原和小型纖溶酶的免疫化學(xué)著色證實(shí)感染后幾天，伴隨著病毒在大腦血管內(nèi)皮上的增殖，小型纖溶酶在大腦血管內(nèi)皮上開(kāi)始聚集。至于在大腦中聚集的小型纖溶酶，據(jù)估計(jì)小型纖溶酶在肺部的炎癥部位大量產(chǎn)生，然后在血液流動(dòng)中運(yùn)輸?shù)饺聿⑻貏e地在大腦血管內(nèi)皮上聚集。
圖1a(RT-PCR)中，相對(duì)顯示了WT和JVS小鼠感染后的大腦(圖中的“大腦”)，肺(圖中的“肺”)，肝臟(圖中的“肝臟”)和血液(圖中的“血液”)中流感病毒基因組的拷貝數(shù)。圖中“1st-PCR”和“2nd-PCR”分別指的是在上面提到的RT-PCR中的第一次PCR和第二次PCR，“GAPDH”指的是內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果。圖中的泳道中“M”顯示的是標(biāo)志(DNA梯度標(biāo)志)。
圖1b(實(shí)時(shí)PCR)中，比較顯示了WT和JVS小鼠感染后的大腦(圖中的“大腦”)，肺(圖中的“肺”)，和肝臟(圖中的“肝臟”)中流感病毒基因組的拷貝數(shù)。圖中縱坐標(biāo)表示通過(guò)上面提到的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定的病毒基因組的拷貝數(shù)(對(duì)數(shù)值IAV log10拷貝數(shù)/μg總RNA來(lái)表示)，黑色柱形圖顯示在JVS小鼠的結(jié)果，白色柱形圖是在WT小鼠的結(jié)果。
圖1顯示的結(jié)果證實(shí)了，WT和JVS小鼠的肺部沒(méi)有觀察到病毒復(fù)制數(shù)量上有大的區(qū)別，而在JVS小鼠的大腦和肝臟中病毒的復(fù)制要比其在WT小鼠中快幾百到幾千倍。
(3)小型纖溶酶與VDAC蛋白之間的結(jié)合水平將人源的纖溶酶原，小型纖溶酶和小纖溶酶以每種50ng的量在硝酸纖維素膜上印跡成圓點(diǎn)，然后與100ng/ml的純化的小鼠VDAC蛋白溶液反應(yīng)。結(jié)合的VDAC蛋白用抗VDAC蛋白的抗體(Oncogene)和ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Amerisham)檢測(cè)。通過(guò)文獻(xiàn)(Bureau，M.H.，等人，“分離和克隆來(lái)自哺乳動(dòng)物大腦的電壓依賴(lài)的陰離子通道樣分子量36,000多肽(Isolation and cloning of a voltage-dependent anionchannel-like Mr 36,000 polypeptide from mammalian brain)”，J.Biol.Chem.，267，8679-8684，1992)描述的方法制備純化的小鼠VDAC蛋白溶液。
結(jié)果顯示在圖2中。
圖2顯示的結(jié)果指出了下面的內(nèi)容。純化的VDAC蛋白與具有Kringle結(jié)構(gòu)域1-5的纖溶酶原和具有Kringle 5的小型纖溶酶結(jié)合，但不與無(wú)Kringle結(jié)構(gòu)域的微纖溶酶結(jié)合。這就清楚地說(shuō)明至少Kringle5結(jié)構(gòu)域涉及與VDAC蛋白的結(jié)合。
VDAC蛋白是在線(xiàn)粒體外膜上發(fā)現(xiàn)的通道，其在細(xì)胞膜上的表達(dá)也已經(jīng)被證實(shí)。在鼠科動(dòng)物的大腦中發(fā)現(xiàn)VDAC蛋白在細(xì)胞膜上比在線(xiàn)粒體中還要大量表達(dá)。那么，估計(jì)小型纖溶酶與VDAC蛋白之間的結(jié)合是通過(guò)Kringle 5實(shí)現(xiàn)的，由此小型纖溶酶與供作受體的VDAC蛋白一起在細(xì)胞膜上聚集下來(lái)。
(4)VDAC表達(dá)水平有三種VDAC的異構(gòu)體(VDAC-1，-2，-3)。當(dāng)大腦處于正常的情況時(shí)，WT小鼠大腦中VDAC的表達(dá)是在一個(gè)相對(duì)較低的水平上。但是當(dāng)大腦暴露于誘導(dǎo)流感腦炎/腦疾的物質(zhì)中時(shí)，VDAC表達(dá)升高并產(chǎn)生一種腦水腫預(yù)備狀況(敏感性增加的狀況)。具體而言，在這種狀況下腦水腫很少被觀察到，但當(dāng)伴隨流感病毒感染時(shí)，嚴(yán)重的水腫自身就表現(xiàn)出來(lái)了。
在該測(cè)試中，檢測(cè)了在用不同藥物處理和/或流感病毒感染的WT小鼠的大腦中VDAC-1 mRNA的表達(dá)水平(依照上面描述的RT-PCR)。
以下述方式進(jìn)行測(cè)試用流感病毒鼻內(nèi)感染正在哺乳的WT小鼠，感染后5天測(cè)定VDAC-1 mRNA的水平(a組)；以300mg/kg/日的劑量給WT小鼠施用肉毒堿拮抗物THP 5天，然后用同樣的方法測(cè)定VDAC-1 mRNA的水平(b組)；以300mg/kg/日的劑量給流感病毒感染的WT小鼠施用肉毒堿拮抗物THP 5天，然后用同樣的方法測(cè)定VDAC-1 mRNA的水平(c組)；或以120mg/kg/日的劑量給流感感染的WT小鼠施用阿司匹林5天，然后用同樣的方法測(cè)定VDAC-1 mRNA的水平(d組)。對(duì)照組中通過(guò)注射將生理鹽水施用給沒(méi)有用流感感染的WT小鼠(e組)。每組含2只小鼠。
通過(guò)上述方法得到的結(jié)果顯示在圖3中(RT-PCR分析的結(jié)果)。
圖3中，W表示測(cè)試小鼠(WT)。對(duì)于各自泳道，“感染”下面的符號(hào)具有下面的含義-(減號(hào))表示沒(méi)有流感感染的組(對(duì)照組)；+(加號(hào))表示用流感病毒感染的組(a組)；THP表示僅用THP處理的組(無(wú)流感感染，b組)；THP+表示流感感染和用THP處理的小鼠的組(c組)；以及A+表示流感感染和用阿司匹林處理的小鼠的組(d組)。
圖3顯示的結(jié)果清楚地指出了下面的內(nèi)容。a組中在大腦中觀察到VDAC-1表達(dá)水平顯著的升高。b組和c組中，即處于線(xiàn)粒體應(yīng)激狀況，特別是脂肪酸代謝紊亂的組中，通過(guò)肉毒堿拮抗物THP處理誘導(dǎo)，觀察到VDAC-1顯著的升高。在用已知是雷氏癥候群誘導(dǎo)物質(zhì)的阿司匹林處理的d組中，也觀察到了VDAC-1表達(dá)的升高。
(5)在大腦和肺中VDAC-1，VDAC-2和VDAC-3的表達(dá)水平為了進(jìn)一步詳細(xì)研究上面(4)中所顯示的結(jié)果，WT小鼠的大腦和肺部中的VDAC-1，VDAC-2和VDAC-3的mRNA用上面提到的實(shí)時(shí)PCR在下面的組中測(cè)定。
C組施用生理鹽水的對(duì)照WT組(無(wú)流感感染)；I組流感感染后5天的WT組；A組施用120mg/kg/日阿司匹林5天的WT組；A+I組流感感染第一天及其后施用120mg/kg/日阿司匹林5天的WT組；D組施用4mg/kg/日雙氯酚酸鈉5天的WT組；THP組施用300mg/kg/日THP 5天的WT組；THP+I組流感感染第一天及其后施用300mg/kg/日THP 5天的WT組。
每組含有5只測(cè)試小鼠，且獲得的結(jié)果是以每組中五只動(dòng)物的平均值顯示。用StatviewTM4.0軟件以不配對(duì)t試驗(yàn)的方法測(cè)驗(yàn)與C組相比的區(qū)別，以確定顯著性。
結(jié)果按照各VDAC與作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的β-肌動(dòng)蛋白相比的相對(duì)水平顯示在圖4-6中。
每幅圖用圖形來(lái)表示表達(dá)水平，其獲得是以實(shí)時(shí)PCR測(cè)定的結(jié)果為基礎(chǔ)。在每幅圖中，上圖顯示的是大腦中的表達(dá)水平，下圖顯示的是肺部的表達(dá)水平。圖4顯示的是VDAC-1表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果；圖5顯示的是VDAC-2表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果；以及圖6顯示的是VDAC-3表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果。
各自圖中顯示的結(jié)果指出下面的內(nèi)容。與生理鹽水處理(C組)相比，在流感感染組(I組)，施用阿司匹林組(A組)，施用雙氯酚酸鈉組(D組)和施用THP組(THP組)的大腦和肺部都觀察到了各自VDAC mRNA表達(dá)水平的升高，盡管分別根據(jù)VDAC-1，-2和-3，對(duì)表達(dá)水平升高的敏感性有所不同。
對(duì)于VDAC-1和-2，在大腦中觀察到表達(dá)水平的升高是對(duì)上述處理直接響應(yīng)，而VDAC-3的水平是在肺部靈敏地響應(yīng)。這些事實(shí)指出在人源VDAC表達(dá)的研究中，個(gè)體中VDAC的表達(dá)情況，因此這種個(gè)體在大腦中的(腦水腫預(yù)備狀況)表達(dá)情況和程度可以通過(guò)研究在除大腦之外的其他器官中，如脊髓液或外周血液中的白細(xì)胞里的VDAC表達(dá)的改變來(lái)估計(jì)。
(6)在JVS小鼠大腦中VDAC蛋白的表達(dá)鼻內(nèi)流感病毒感染后的JVS小鼠的大腦血管內(nèi)皮和神經(jīng)細(xì)胞中的VDAC表達(dá)的升高是在各自組織用伊文思藍(lán)染色(免疫化學(xué)染色)后通過(guò)顯微鏡來(lái)檢查的。
無(wú)流感感染的JVS小鼠的大腦的顯微照相結(jié)果顯示在圖7中，流感感染后5天的JVS小鼠大腦的顯微照相結(jié)果顯示在圖8中。
圖7中，照片a)和c)放大倍數(shù)低(×140)，b)，和d)放大倍數(shù)高(×420)。如圖7所示，血管內(nèi)皮沒(méi)有被染色，而神經(jīng)細(xì)胞被染上了顏色，如d)所示。
圖8中，照片a)和d)放大倍數(shù)低(×140)，b)，c)和e)放大倍數(shù)高(×420)。如圖中a)到c)所示，VDAC蛋白的表達(dá)水平在病毒感染后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異且顯著地升高。在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)也有所升高，參見(jiàn)d)和e)。
在帶有線(xiàn)粒體內(nèi)膜中長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝紊亂的JVS小鼠中，大腦中VDAC表達(dá)水平與WT小鼠相比稍微高一些。如圖7所示，觀察到VDAC表達(dá)主要是單獨(dú)在神經(jīng)細(xì)胞中，而在血管內(nèi)皮中不能清楚地?cái)喽ā５?，鼻?nèi)流感病毒感染后5天的大腦中，觀察到了在大腦血管內(nèi)皮中VDAC表達(dá)顯著升高，在神經(jīng)細(xì)胞中也有所升高，如圖8所示。用在對(duì)照試驗(yàn)中的無(wú)免疫性的IgG完全不能著色到任何樣品上，盡管這里沒(méi)有顯示；因此，圖7和8中探測(cè)到的蛋白估計(jì)是由于與VDAC抗體特異反應(yīng)而著色的結(jié)果。
鑒于前面的內(nèi)容，流感腦炎/腦疾的發(fā)病的機(jī)理可以作如下估計(jì)。不同的因素(解熱劑，抗痙攣藥，抗生素，不同的病原體感染，先天的脂肪酸代謝紊亂，等等)造成了腦水腫發(fā)病的預(yù)備狀況(對(duì)腦水腫高度敏感的狀況)，且當(dāng)不同的感染，特別是流感病毒感染或其它的由于不同因素導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)以這種狀況下出現(xiàn)時(shí)，流感腦炎/腦疾自身就表現(xiàn)出來(lái)了。
(7)討論當(dāng)VDAC表達(dá)非正常升高時(shí)，估計(jì)由此產(chǎn)生腦水腫預(yù)備狀況(對(duì)腦水腫高度敏感的狀況)，另外的病原體感染引發(fā)進(jìn)一步的VDAC表達(dá)的升高或者由于體內(nèi)的炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生小型纖溶酶并在大腦血管內(nèi)皮中聚集，血腦屏障自毀或表現(xiàn)出不穩(wěn)定，導(dǎo)致腦炎/腦疾的發(fā)病。作為腦炎/腦疾特異的觸發(fā)因素，尤其可被提到的是，流感病毒感染和其它病毒感染，例如RS病毒，腺病毒，麻疹病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒和瘧疾感染。除了致病微生物感染之外，不同的炎癥反應(yīng)也被估計(jì)是加入到對(duì)腦水腫高度敏感的狀況中導(dǎo)致腦炎/腦疾的發(fā)病。因此，如本發(fā)明所揭示的，通過(guò)檢查VDAC表達(dá)水平，對(duì)預(yù)腦水腫發(fā)病狀況(對(duì)腦水腫高度敏感的狀況)的檢查成為可能。進(jìn)一步地，重要的是檢測(cè)VDAC表達(dá)水平作為一種測(cè)試和判斷解熱劑，抗痙攣藥，抗生素或類(lèi)似的抗流感腦炎/腦疾的藥物的安全性的方法。根據(jù)本發(fā)明的診斷方法非常有利于作為一種新的能夠診斷雷氏癥候群，流感腦炎/腦疾和由于先天的脂肪酸代謝紊亂而似雷氏癥候群的病人是否處于腦炎/腦疾發(fā)病預(yù)備狀況的方法，進(jìn)一步地作為一種在損傷或創(chuàng)傷或手術(shù)場(chǎng)合預(yù)先診斷對(duì)腦水腫發(fā)病敏感性的方法。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種檢測(cè)腦炎/腦疾發(fā)病及其風(fēng)險(xiǎn)的方法。該方法可以通過(guò)檢測(cè)VDAC表達(dá)水平來(lái)檢查腦水腫發(fā)病預(yù)備狀況(對(duì)腦水腫高度敏感狀況)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種判斷施用或應(yīng)用諸如解熱劑，抗痙攣藥或抗流感的抗生素的藥物是否安全(是否具有誘導(dǎo)流感腦炎/腦疾的風(fēng)險(xiǎn))的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于篩選可用來(lái)治療腦炎/腦疾的藥物的方法。這些方法在作為診斷，治療和預(yù)防腦炎/腦疾技術(shù)的藥物領(lǐng)域是有益的。
序列表<110>木戶(hù)博(HIROSHI KIDO)<120>檢測(cè)腦炎或腦疾發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法(A method of determining the risk of developing encephalitis/encephalopathy)<130>SCT053418-47<150>JP 2003-51678<151>2003-02-27<160>19<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence P1(influenza A virusHemagglutinine)<400>1tgaagtgact aatgctactg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence P2(influenza A virusHemagglutinine)<400>2acagacccct tacccagggt 20<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence P3(influenza A virusHemagglutinine)<400>3gcaactgtta cccttatgat 20<210>4<211>20<212>DNA
<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence P4(influenza A virusHemagglutinine)<400>4tcattgtttg gcatagtcac 20<210>5<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence P5<400>5tctggctctc ggccaaga18<210>6<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence P6<400>6ttggcaccgc atgatgtc18<210>7<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceTaq man probe<400>7ttccaggaaatga caacagcaca gcaa 24<210>8<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence VDAC1-Foward<400>8gctaaggatg actcggcttt aagg 24<210>9
<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence VDAC1-Reverse<400>9aggttaagtg atgggctagg atgg 24<210>10<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence VDAC2-Foward<400>10tcactgttgg ctggttccta gttg 24<210>11<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence VDAC2-Reverse<400>11aagacctcgt ggattatgct aggg 24<210>12<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence VDAC3-Foward<400>12cacttgtccc tggaaatgaa gag 23<210>13<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence VDAC3-Reverse<400>13catgacacta cgttgttgct gagg 24
<210>14<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence beta-actin Forward<400>14tcactattgg caacgagcgg ttc 23<210>15<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence beta-actin Revese<400>15tgtgttggca tagaggtctt tac 23<210>16<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence human VDAC1-Foward<400>16gccaagtatc agattgaccc 20<210>17<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence human VDAC1-Reverse<400>17cttgaaattc cagtcctaga cc 22<210>18<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence human VDAC2-Foward<400>18ctaccttctc accaaacaca g21
<210>19<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequenceprimer sequence human VDAC2-Reverse<400>19ccagagcaga gagtgtaagc 20
權(quán)利要求
1.一種腦炎/腦疾的檢測(cè)方法，包括制備獲自疑似腦炎/腦疾發(fā)病的病人的含電壓依賴(lài)的陰離子通道(VDAC)的樣品，測(cè)量樣品中VDAC的表達(dá)水平，并以所述表達(dá)水平的升高作為指標(biāo)檢測(cè)腦炎/腦疾的發(fā)病和發(fā)病敏感性(發(fā)病風(fēng)險(xiǎn))。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中的腦炎/腦疾是流感腦炎/腦疾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中VDAC表達(dá)水平的測(cè)量是以測(cè)量VDAC基因轉(zhuǎn)錄的方式進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中VDAC表達(dá)水平的測(cè)量是以測(cè)量VDAC蛋白的方式進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中VDAC包括至少一種選自由VDAC-1，VDAC-2和VDAC-3組成的組的同工型。
6.一種確定由藥物導(dǎo)致的腦炎/腦疾發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括在所述藥物存在的系統(tǒng)中測(cè)定表達(dá)VDAC的細(xì)胞中VDAC的表達(dá)水平，將所述表達(dá)水平與在所述藥物不存在的系統(tǒng)中所測(cè)得的表達(dá)VDAC的細(xì)胞中VDAC的表達(dá)水平相比較，并利用兩者之間表達(dá)水平的差異作為指標(biāo)確定由藥物導(dǎo)致的腦炎/腦疾的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的確定由藥物導(dǎo)致的腦炎/腦疾發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述藥物存在的系統(tǒng)是通過(guò)給測(cè)試動(dòng)物施用藥物而形成的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的確定由藥物導(dǎo)致的腦炎/腦疾發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述藥物存在的系統(tǒng)是通過(guò)將藥物添加到表達(dá)VDAC的細(xì)胞的培養(yǎng)液中而形成的。
9.一種篩選用于腦炎/腦疾治療的候選藥物的方法，包括在測(cè)試物質(zhì)存在的系統(tǒng)中測(cè)定表達(dá)VDAC的細(xì)胞的VDAC表達(dá)水平，將由此測(cè)定的表達(dá)水平與在所述測(cè)試物質(zhì)不存在的系統(tǒng)中所測(cè)得的表達(dá)VDAC的細(xì)胞的VDAC表達(dá)水平相比較，后者作為參照值，以及當(dāng)與參照值相比測(cè)試物質(zhì)對(duì)降低表達(dá)水平有效時(shí)挑選其作為候選藥物。
10.一種篩選能夠抑制小型纖溶酶，纖溶酶或纖溶酶原與作為受體的VDAC結(jié)合的候選藥物的方法，該方法包括在測(cè)試物質(zhì)存在的系統(tǒng)中測(cè)量小型纖溶酶，纖溶酶或纖溶酶原與VDAC蛋白的結(jié)合水平，將由此測(cè)得的結(jié)合水平與在測(cè)試物質(zhì)不存在的系統(tǒng)中測(cè)得的小型纖溶酶，纖溶酶或纖溶酶原與VDAC蛋白結(jié)合的水平相比較，后者作為參照值，以及當(dāng)與參照值相比測(cè)試物質(zhì)對(duì)降低結(jié)合水平有效時(shí)挑選其作為候選藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)腦炎/腦疾發(fā)病及其風(fēng)險(xiǎn)的方法；一種判斷藥物的施用或應(yīng)用是否安全(是否具有誘導(dǎo)流感腦炎/腦疾風(fēng)險(xiǎn))的方法；和一種用于篩選可用在腦炎/腦疾治療中的藥物的方法。檢測(cè)方法包括制備獲自疑似腦炎/腦疾發(fā)病的病人的含電壓依賴(lài)的陰離子通道(VDAC)的樣品，檢測(cè)樣品中VDAC的表達(dá)水平，并以所述表達(dá)水平的升高作為指標(biāo)檢測(cè)腦炎/腦疾的發(fā)病和發(fā)病敏感性(發(fā)病風(fēng)險(xiǎn))。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1756957SQ20048000555
公開(kāi)日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者木戶(hù)博 申請(qǐng)人:木戶(hù)博