專利名稱：多通道表面等離子共振影像傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種基于表面等離子體共振原理的生物傳感器，特別是涉及利用生物PCR技術(shù)和等離子體共振原理相結(jié)合制作的傳感器，可以并行檢測(cè)多個(gè)生物學(xué)信號(hào)的。
背景技術(shù)：
21世紀(jì)是生物學(xué)發(fā)展的時(shí)代，特別是生物科學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)經(jīng)融合產(chǎn)生的生物信息學(xué)將得到蓬勃的發(fā)展。傳感技術(shù)是信息科學(xué)的主要技術(shù)之一，是信息獲取的手段。利用傳感技術(shù)獲取生物樣品的信息是生物檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的重要內(nèi)容。
自1902年，Wood在光學(xué)實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)了表面等離子體共振(Surface PlasmonResonance，SPR)現(xiàn)象以來(lái)，SPR儀器和SPR生物傳感器的研究一直受到關(guān)注。表面等離子體振子共振(SPR)是存在于金屬邊緣的自由電子的等離子振蕩。這些振蕩受臨近金屬表面的材料的折射率影響。形成SPR現(xiàn)象的必要條件之一是金屬和電介質(zhì)間的界面存在。當(dāng)入射光以某一特定的角度入射時(shí)，其反射率會(huì)顯著減少，此入射角度即為SPR角。附著在金屬表面的物質(zhì)不同，其SPR角不同，而同一種物質(zhì)，附著在金屬表面的量不同，其SPR角也不相同。
SPR可以用影像的方法來(lái)顯示，這最早由Yeatman在1987年提出。目前有三種測(cè)量SPR影像的方法。第一種是通過(guò)測(cè)量在SPR傾斜角一側(cè)以特定波長(zhǎng)和共振角度的反射光強(qiáng)(即反射系數(shù)法)來(lái)實(shí)現(xiàn)；第二種固定入射角，檢測(cè)復(fù)色光的共振波長(zhǎng)(波長(zhǎng)探詢法)。第三種是偏振狀態(tài)及相位的檢測(cè)(相位探詢法)。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)在專利號(hào)為US 5,313,264描述了一種由微導(dǎo)管和閥門構(gòu)成一個(gè)具有樣液操作處理模塊網(wǎng)絡(luò)的SPR傳感器，該網(wǎng)絡(luò)被用來(lái)在構(gòu)成探測(cè)層SPR導(dǎo)體表面移動(dòng)適量的包含有探測(cè)物質(zhì)的液體，然后再移動(dòng)到位于探測(cè)層上面目標(biāo)液體。該SPR傳感器也是單色光源和光學(xué)系統(tǒng)組成。光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生由光源提供光線而形成楔型匯聚光束并且引導(dǎo)光束照射到傳感器表面。楔型光束沿著一個(gè)空間固定的，相對(duì)窄條的傳感器表面在發(fā)生共振角的范圍內(nèi)照射到探測(cè)層。共振角的范圍由楔型光束的匯聚角度決定。反射光線在一個(gè)二維光電探測(cè)器上成像。光電探測(cè)器上提供的信號(hào)是探測(cè)層表面折射率變化的度量，而附著于探測(cè)層的物質(zhì)與通過(guò)樣液處理模塊流經(jīng)探測(cè)層表面的待測(cè)溶液相互作用結(jié)果產(chǎn)生了這種變化。
許多常規(guī)的用于形成探針層SPR方法和儀器都要求樣液從探測(cè)層流過(guò)并光學(xué)掃描傳感器表面，這些方法相對(duì)復(fù)雜，不夠經(jīng)濟(jì)并且耗費(fèi)時(shí)間。該傳感器設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，體積較大，不利于儀器的小型化。這就需要一種具有可選擇性SPR傳感器，能夠具有多層次的分析探針，同時(shí)在幾個(gè)通道探測(cè)層泵送樣液。
US 2003048452專利描述了一種基于傳感器表面光學(xué)分析采樣區(qū)域的二維影像SPR儀器。該儀器包含有一個(gè)的傳感器表面層，該層由能夠響應(yīng)SPR傳導(dǎo)材料構(gòu)成，如一些帶有自由電荷的金屬金，銀，鋁等。一束由兩種或者兩種以上波長(zhǎng)的電磁波從傳感器的二維表面區(qū)域前端或者后端照射，與此同時(shí)，這兩種或兩種以上波長(zhǎng)的在傳感器表面的反射強(qiáng)度被檢測(cè)到，檢測(cè)裝置提供了二維或者多維的表面影像，表面每一點(diǎn)有效折射率以二維影像的方式顯示，二維影像構(gòu)成一幅彩色圖像。該SPR傳感器可以用于生物傳感，生化無(wú)標(biāo)記實(shí)時(shí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。但是該SPR傳感器裝置采用固定入射光角度，以波長(zhǎng)為變量的工作模式。這些裝置的靈敏度受分光計(jì)分辨率，溫度變化以及入射光波長(zhǎng)的限制，要同時(shí)使用復(fù)色光才能夠在比較大的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)獲得較高的靈敏度和精度。
核酸陣列技術(shù)在生命科學(xué)研究中的成功使用比傳統(tǒng)方法用來(lái)定量檢測(cè)復(fù)雜生物系統(tǒng)大大節(jié)省了時(shí)間，但是，由于定量檢測(cè)生物分子技術(shù)的成本高昂，并且?guī)в幸欢ǖ姆派湫院托枰M(jìn)行熒光標(biāo)定和探測(cè)，因而使得這種技術(shù)受到了限制。US20030049639描述的是基于核酸微陣列大規(guī)模鑒別生物分子的SPR影像探測(cè)的方法。校對(duì)過(guò)的復(fù)色光在SPR角度范圍內(nèi)照射到經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾金膜表面的核酸分子膜上，反射的光線經(jīng)過(guò)寬度為10nm的帶通慮波器(830nm)被CCD收集。通過(guò)CCD采集的信號(hào)能夠探測(cè)到金膜表面不同的核酸分子反射率。由于金膜表面不同的探針結(jié)合的靶分子不同因而可以迅速的檢測(cè)出DNA/RNA等生物分子。
CN1421699描述了一種基于表面等離子體共振(SPR)原理、可以并行檢測(cè)多個(gè)生物學(xué)信號(hào)的生物傳感器。該生物傳感器依次由基質(zhì)，金屬膜，化學(xué)修飾層，交聯(lián)劑層和生物單分子層構(gòu)成，其特征在于在生物單分子層的不同位置結(jié)合了多種生物分子，可并行定量檢測(cè)生物樣品中特定目標(biāo)分子的濃度。這種設(shè)計(jì)的缺點(diǎn)在于測(cè)量精度不夠。由于影響SPR傳感器測(cè)量精度的因素很多，其中樣液的成份、濃度、溫度以及樣液中非待測(cè)分子與敏感膜的作用是影響檢測(cè)精度的主要因素。除了待測(cè)分子與敏感膜上的探針?lè)肿酉嗷プ饔每梢愿淖兠舾心さ慕殡姵?shù)，從而改變共振角或共振波長(zhǎng)(特異性響應(yīng))外，樣液中其它成份及其濃度的變化、溫度變化會(huì)引起樣液介電常數(shù)的變化，而且樣液中非待測(cè)分子與敏感膜的相互作用會(huì)直接改變敏感膜介電常數(shù)；這些變化最終都將引起共振角或共振波長(zhǎng)的變化(非特異性響應(yīng))。
如上所述，這些方法有三個(gè)主要缺陷響應(yīng)時(shí)間低和角度分辨率有限，SPR傳感器測(cè)量精確度不夠高。另外，目前SPR傳感系統(tǒng)所能檢測(cè)到的生物分子材料表面最小覆蓋量為1×10-12g/mm2，這對(duì)于檢測(cè)低濃度、小分子量的樣品是不夠的。
由此可見，將PCR技術(shù)與SPR技術(shù)結(jié)合起來(lái)可以大大提高SPR技術(shù)的檢測(cè)范圍和效果。同時(shí)要提高特異性響應(yīng)的檢測(cè)精度，就必須從實(shí)際測(cè)得的響應(yīng)中剔除非特異性響應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型采用的方法是單色光入射，反應(yīng)池采用MEMS工藝，集成制造了PCR反應(yīng)池和SPR反應(yīng)池，使DNA分子的擴(kuò)增和檢測(cè)得以在一個(gè)芯片上完成；利用單色面陣CCD采集SPR影像，通過(guò)SPR影像分析，可以同時(shí)檢測(cè)各通道的共振角，實(shí)現(xiàn)了SPR響應(yīng)曲線的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)，提高了檢測(cè)精度及速度，使用方便，符合SPR傳感器發(fā)展趨勢(shì)。該傳感系統(tǒng)的光路設(shè)計(jì)使得入射光可以在可能發(fā)生共振的角度范圍內(nèi)以不同角度同時(shí)照射各個(gè)通道，通過(guò)SPR影像可以同時(shí)檢測(cè)不同角度入射光線的反射光強(qiáng)。
本實(shí)用新型的技術(shù)方案這種基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器，包括共振SPR樣品池和PCR反應(yīng)池，其特點(diǎn)是它將共振SPR樣品池和PCR反應(yīng)池結(jié)合在一起，構(gòu)成傳感器反應(yīng)池；傳感器主體上部是由硅片構(gòu)成的長(zhǎng)方體形傳感器反應(yīng)池，下部是柱面棱鏡，兩者之間是玻璃基片，玻璃基片上是敏感膜，敏感膜上是硅片的傳感器反應(yīng)池，在硅片反應(yīng)池中設(shè)置共振SPR樣品池和PCR反應(yīng)池，從硅片傳感器反應(yīng)池上部設(shè)置樣液的樣品進(jìn)口和樣品出口；在傳感器主體兩側(cè)是入射光路、出射光路和與出射光路末端連接的計(jì)算機(jī)平臺(tái)；入射光路中由發(fā)光二極管發(fā)出的光經(jīng)過(guò)球面透鏡，在針孔處會(huì)聚，再經(jīng)過(guò)一個(gè)平凸透鏡轉(zhuǎn)換為平行光，平行光先后通過(guò)濾光片和偏振片，調(diào)整偏振片的位置產(chǎn)生P偏振光，最后利用一個(gè)柱面透鏡對(duì)平行光進(jìn)行角向會(huì)聚，使其在柱面棱鏡的敏感膜處會(huì)聚成一條直線，射向柱面棱鏡底面；出射光路由一個(gè)會(huì)聚透鏡和面陣CCD組成，入射光在柱面棱鏡底面發(fā)生全反射后經(jīng)會(huì)聚透鏡成為平行光，由面陣CCD完成光信號(hào)的采集，再送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。
本實(shí)用新型率先提出了將PCR技術(shù)與SPR技術(shù)結(jié)合起來(lái)的檢測(cè)方式，解決了SPR技術(shù)對(duì)于低濃度的DNA分子難以測(cè)量的問(wèn)題，同時(shí)也簡(jiǎn)化了PCR擴(kuò)增后相對(duì)煩雜的檢測(cè)過(guò)程，提高了檢測(cè)效率。
本實(shí)用新型克服了非特異性響應(yīng)對(duì)于SPR傳感器測(cè)量精度的影響，提供一種多通道影像傳感器，以便能夠很好地克服非特異性響應(yīng)，得到特異性響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)生物分子及其相互作用的檢測(cè)，從總體上提高了SPR傳感器的性能。
本實(shí)用新型采用角向會(huì)聚入射光，使得入射光可以在可能發(fā)生共振的角度范圍內(nèi)以不同角度同時(shí)照射各個(gè)通道，避免了機(jī)械調(diào)節(jié)可能帶來(lái)的誤差。
本實(shí)用新型使用了SPR影像檢測(cè)手段，可以同時(shí)檢測(cè)各通道的共振角，實(shí)現(xiàn)了SPR響應(yīng)曲線的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)，提高了檢測(cè)精度及速度。
本實(shí)用新型還有另外一個(gè)方面是能夠?qū)PR儀器和基于SPR的傳感器小型化，這對(duì)于提高儀器和傳感器的熱穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性及在生物檢測(cè)領(lǐng)域中使用儀器和傳感器的便利性都是重要的?；诒緦?shí)用新型的SPR傳感器由于只包括一個(gè)聚焦光源、一個(gè)棱鏡和一個(gè)光電檢測(cè)器，而且獲得高角度分辨率不需要大的樣本與光電檢測(cè)器間距離，所以結(jié)構(gòu)緊湊。
本實(shí)用新型的相關(guān)原理也適用于復(fù)色光入射，檢測(cè)共振波長(zhǎng)的方法。
本實(shí)用新型的有益效果有以下四個(gè)特點(diǎn)(a)可以一次完成多個(gè)樣品的檢測(cè)，在真正意義上，實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)生物分子的相互作用所引起的特異性響應(yīng)，這在藥物篩選中是十分必要的；(b)可以一次完成同一樣品的不同特征的檢測(cè)，這一點(diǎn)可以有效降低疾病檢測(cè)中存在假陽(yáng)性的幾率；(c)在多通道中設(shè)置參考通道，可以消除非特異性響應(yīng)的影響。(d)可以對(duì)低濃度的DNA分子進(jìn)行測(cè)量，簡(jiǎn)化了PCR擴(kuò)增后相對(duì)煩雜的檢測(cè)過(guò)程。


圖1傳感器系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖圖2反應(yīng)池俯視圖圖3反應(yīng)池剖面圖圖4傳感芯片結(jié)構(gòu)圖圖5A、B、C通道的總響應(yīng)曲線圖圖6C通道的特異性響應(yīng)曲線圖其中1、樣品進(jìn)口；2、樣品出口；3、硅片反應(yīng)池；4、共振SPR樣品池；5、敏感膜；6、發(fā)光二極管；7、球面透鏡；8、針孔；9、平凸透鏡；10、濾光片；11、偏振片；12、柱面透鏡；13、柱面棱鏡；14、面陣CCD；15、入射光路；16、出射光路；17、會(huì)聚透鏡；18、玻璃基片；19、計(jì)算機(jī)；20、傳感器主體；21、PCR反應(yīng)池；22、棱鏡放置槽；23、A通道；24、B通道；25、C通道；26、清洗通道進(jìn)口；27、清洗通道出口具體實(shí)施方式
為了更好的理解本實(shí)用新型，現(xiàn)在結(jié)合附圖和實(shí)例來(lái)說(shuō)明基于片上PCR多通道影像SPR傳感器的基本結(jié)構(gòu)和工作原理以及如何能夠克服非特異性響應(yīng)，得到特異性響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)生物分子及其相互作用的檢測(cè)。
這種基于片上PCR的多通道表面等離子共振影像傳感器，包括SPR樣品池和PCR反應(yīng)池，其特點(diǎn)是它將SPR樣品池4和PCR反應(yīng)池21結(jié)合在一起，構(gòu)成傳感器硅片反應(yīng)池3；傳感器主體20上部是由硅片構(gòu)成的長(zhǎng)方體形傳感器硅片反應(yīng)池3，下部是柱面棱鏡13，兩者之間是玻璃基片18，玻璃基片上是敏感膜5，敏感膜上是硅片的傳感器硅片反應(yīng)池3，在硅片反應(yīng)池中設(shè)置SPR樣品池和PCR反應(yīng)池，從硅片傳感器反應(yīng)池上部設(shè)置樣液的樣品進(jìn)口1和樣品出口2；在傳感器主體兩側(cè)是入射光路15、出射光路16、和與出射光路末端連接的計(jì)算機(jī)平臺(tái)19；入射光路中由發(fā)光二極管6發(fā)出的光經(jīng)過(guò)球面透鏡7，在針孔8處會(huì)聚，再經(jīng)過(guò)一個(gè)平凸透鏡9轉(zhuǎn)換為平行光，平行光先后通過(guò)濾光片10和偏振片11，調(diào)整偏振片的位置產(chǎn)生P偏振光，最后利用一個(gè)柱面透鏡12對(duì)平行光進(jìn)行角向會(huì)聚，使其在柱面棱鏡13的敏感膜5處會(huì)聚成一條直線，射向柱面棱鏡底面；出射光路16由一個(gè)會(huì)聚透鏡17和面陣CCD14組成，入射光在柱面棱鏡底面發(fā)生全反射后經(jīng)會(huì)聚透鏡成為平行光，由面陣CCD完成光信號(hào)的采集，再送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。
入射光路的光線入射角必須在40°-90°之間。
在針孔(8)處會(huì)聚的孔徑Φ＝0.1-0.3mm。
濾光片用來(lái)改善入射光的單色性，濾光片的峰值波長(zhǎng)為632.8()。
利用微機(jī)電系統(tǒng)MEMS工藝制備硅片反應(yīng)池，圖4是傳感芯片的結(jié)構(gòu)23、A通道，24、B通道，25、C通道。在玻璃基片上共有A、B、C三個(gè)通道。各通道首先同時(shí)生成一層厚度為50nm的均勻金膜，然后在B通道的金膜上制備厚度約為15nm的高折射率電介質(zhì)層(Ta2O5或TiO2等)。測(cè)試前，在C通道的金膜上生成一層含有探針?lè)肿拥拿舾心?。傳感芯片的基片與柱面棱鏡的材料相同，二者通過(guò)光學(xué)耦合液結(jié)合為一個(gè)完整的半柱面棱鏡。傳感芯片上各種膜的制備采用濺射、光刻工藝。入射光路產(chǎn)生的角向會(huì)聚單色P偏振光束正好在傳感芯片金膜表面會(huì)聚為一條與三個(gè)通道正交的直線。單色面陣CCD與計(jì)算機(jī)共同完成SPR影像的實(shí)時(shí)采集。SPR影像中不同象素行對(duì)應(yīng)不同的入射角，其象素值為對(duì)應(yīng)入射角光線的反射光強(qiáng)。進(jìn)樣系統(tǒng)由PCR-SPR反應(yīng)池和溫控系統(tǒng)(由半導(dǎo)體制冷片和溫控電路組成)及微量蠕動(dòng)泵構(gòu)成。
體響應(yīng)即是指待測(cè)樣液成份、濃度、溫度等體內(nèi)變化所引起的共振角的變化。A、B、C三個(gè)通道的響應(yīng)可分別表示為ΔθA(t)＝bA(t)+sA(t)＝BAΔn(t)+SAΔNn(t)(1)ΔθB(t)＝bB(t)+sB(t)＝BBΔn(t)+SBΔNn(t)(2)ΔθC(t)＝bC(t)+sC(t)(3)＝BCΔn(t)+SC(KCΔNn(t)+ΔNSC(t))ΔθA(t)、ΔθB(t)、ΔθC(t)分別表示A、B、C通道的響應(yīng)(即共振角度的改變)，bA(t)、bB(t)、bC(t)表示A、B、C通道中體內(nèi)折射率變化引起的響應(yīng)，sA(t)、sB(t)、sC(t)表示A、B、C通道中的表面折射率變化而引起的響應(yīng)。BA、SA、BB、SB、BC、SC分別表示A、B、C通道的體靈敏度和表面靈敏度。Δn(t)、ΔNn(t)、ΔNSC(t)表示體內(nèi)折射率的變化、非特異性作用所引起的表面折射率變化和特異性作用所引起的表面折射率變化，t表示時(shí)間。
對(duì)通道C而言，特異性作用引起的響應(yīng)為ΔθSC＝SCΔNSC(t) (4)＝ΔθC(t)-BCΔn(t)-SCKCΔNn(t)為確定KC的值，可向傳感器表面通入不含目標(biāo)分子的樣液，此時(shí)C通道的響應(yīng)中不包含特異性吸收引起的響應(yīng)，即(4)式的值為0，可得
KC=θC(t)-BCΔn(t)SCΔNn(t)=θC(t)-BCBAbASCSAsA---(5)]]>再通過(guò)(1)、(2)式求得Δn(t)、ΔNn(t)并與KC一起代入(4)式就可以得到C通道的非特異性響應(yīng)。
入射光路可以提供一定角度范圍的入射光，與面陣CCD相配合，可以一次完成一定角度范圍的反射光強(qiáng)的檢測(cè)。在柱面透鏡前還加裝有濾光片和偏振片。濾光片用于改善入射光的單色性，偏振片用于產(chǎn)生P偏振光。
檢測(cè)精度由CCD決定，我們所采用的CCD的象素間距為7μm，反射光程約為120mm，經(jīng)計(jì)算理論角度分辨率達(dá)0.0033度，比0.1度提高了約2個(gè)數(shù)量級(jí)。
實(shí)施例1采用以下實(shí)驗(yàn)步驟可以確定A、B、C通道的表面靈敏度，同時(shí)完成敏感膜的制備。在確定各通道靈敏度時(shí)，采用如圖2所示的樣品池(3、硅片基底，22、棱鏡放置槽，23、A通道樣品池，24、B通道樣品池，25、C通道樣品池)，先向A、B、C三個(gè)通道同時(shí)通入摩爾比為1∶9的生物素化硫醇衍生物和OH根硫醇稀釋液的混合物(PBS緩沖液環(huán)境)，反應(yīng)足夠長(zhǎng)時(shí)間(16小時(shí)以上)，在各通道表面生成緊密覆蓋的自組裝單分子膜(SAM)，再用磷酸鹽PBS緩沖液清洗。然后在各通道順序通入磷酸鹽PBS緩沖液、濃度足夠高的鏈酶抗生物素(Streptavidin)(反應(yīng)約5-20分鐘)、磷酸鹽PBS緩沖液，同時(shí)實(shí)時(shí)檢測(cè)A、B通道的共振角，并計(jì)算反應(yīng)前后共振角的差值。由上述的(1)-(3)式計(jì)算得出表面靈敏度。
通過(guò)下面的實(shí)驗(yàn)完成C通道探針?lè)肿拥墓潭?，并可以測(cè)定體靈敏度的比值。用PBS緩沖液清洗三個(gè)通道，再將含有大鼠肝臟f蛋白基因探針的磷酸鹽PBS緩沖液通入C通道，完成探針?lè)肿拥墓潭?。通入磷酸鹽PBS緩沖液清洗C通道，再用純凈水對(duì)三個(gè)通道進(jìn)行清洗，然后同時(shí)向三個(gè)通道中依次通入純凈水和乙二醇，計(jì)算各個(gè)通道在通入純凈水和乙二醇時(shí)的共振角的差值。并由上述的(1)-(3)、(5)式計(jì)算得出體靈敏度和KC。此時(shí)傳感芯片制作完成，如圖4所示。
以下實(shí)驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)用SPR檢測(cè)方法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)化了PCR擴(kuò)增后相對(duì)煩雜的檢測(cè)過(guò)程。
PCR擴(kuò)增樣品為大鼠肝臟f蛋白基因，濃度為1.3μg/μl。反應(yīng)緩沖液中含有上游、下游引物各20pmol、Taq酶1.25u及dNTP各0.2mmol，使用蠕動(dòng)泵將反應(yīng)物注入PCR擴(kuò)增反應(yīng)池，反應(yīng)體積約為20μl。
PCR擴(kuò)增的一個(gè)熱循環(huán)周期包括以下三個(gè)步驟①.加熱樣品，當(dāng)溫度達(dá)到95℃左右時(shí)，DNA分子由雙鏈結(jié)構(gòu)分解成兩條單鏈。
②.降溫冷卻至55℃左右，使分解后的單鏈按堿基互補(bǔ)原則與引物結(jié)合。
③.再次加熱升溫至72℃，使寡核苷酸按堿基配對(duì)原則沿引物生長(zhǎng)，完成DNA的一次復(fù)制。
實(shí)驗(yàn)采用半導(dǎo)體制冷片溫控系統(tǒng)對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行溫度控制，將反應(yīng)物的溫度依次穩(wěn)定在95℃、55℃、72℃，并進(jìn)行30個(gè)溫度循環(huán)，達(dá)到DNA擴(kuò)增的目的，為后繼SPR檢測(cè)做準(zhǔn)備。
在向SPR樣品池通入待測(cè)樣液進(jìn)行檢測(cè)前，應(yīng)先通入磷酸鹽PBS對(duì)SPR樣品池各通道進(jìn)行清洗，之后再通入包含有待測(cè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物，并控制雜交溫度，實(shí)時(shí)檢測(cè)各通道共振角，結(jié)果如圖8所示。從圖中可以求得任意時(shí)刻t各通道的響應(yīng)(以PBS的共振角為基準(zhǔn))ΔθA(t)、ΔθB(t)、ΔθC(t)，結(jié)合標(biāo)定結(jié)果，利用(1)-(5)式及已求出的參數(shù)就可以求出C通道的特異性動(dòng)態(tài)響應(yīng)曲線，如圖6所示。
權(quán)利要求1.一種多通道表面等離子共振影像傳感器，包括共振SPR樣品池和PCR反應(yīng)池，其特征在于它將共振SPR樣品池(4)和PCR反應(yīng)池(21)結(jié)合在一起，構(gòu)成傳感器反應(yīng)池(3)；傳感器主體(20)上部是由硅片構(gòu)成的長(zhǎng)方體形傳感器反應(yīng)池(3)，下部是柱面棱鏡(13)，兩者之間是玻璃基片(18)，玻璃基片上是敏感膜(5)，敏感膜上是硅片的傳感器反應(yīng)池(3)，在硅片反應(yīng)池中設(shè)置共振SPR樣品池和PCR反應(yīng)池，從硅片傳感器反應(yīng)池上部設(shè)置樣液的樣品進(jìn)口(1)和樣品出口(2)；在傳感器主體兩側(cè)是入射光路(15)、出射光路(16)、和與出射光路末端連接的計(jì)算機(jī)平臺(tái)(19)；入射光路中由發(fā)光二極管(6)發(fā)出的光經(jīng)過(guò)球面透鏡(7)，在針孔(8)處會(huì)聚，再經(jīng)過(guò)一個(gè)平凸透鏡(9)轉(zhuǎn)換為平行光，平行光先后通過(guò)濾光片(10)和偏振片(11)，調(diào)整偏振片的位置產(chǎn)生P偏振光，最后利用一個(gè)柱面透鏡(12)對(duì)平行光進(jìn)行角向會(huì)聚，使其在柱面棱鏡(13)的敏感膜(5)處會(huì)聚成一條直線，射向柱面棱鏡底面；出射光路(16)由一個(gè)會(huì)聚透鏡(17)和面陣CCD(14)組成，入射光在柱面棱鏡底面發(fā)生全反射后經(jīng)會(huì)聚透鏡成為平行光，由面陣CCD完成光信號(hào)的采集，再送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多通道表面等離子共振影像傳感器，其特征在于入射光路的光線入射角必須在40°-90°之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多通道表面等離子共振影像傳感器，其特征在于在針孔(8)處會(huì)聚的孔徑Φ＝0.1-0.3mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多通道表面等離子共振影像傳感器，其特征在于濾光片用來(lái)改善入射光的單色性，濾光片的峰值波長(zhǎng)為632.8nm。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種基于表面等離子體共振原理的生物傳感器，特別是涉及利用生物PCR技術(shù)和等離子體共振原理相結(jié)合制作的傳感器。該傳感器是將SPR樣品池和PCR反應(yīng)池結(jié)合在一起，構(gòu)成傳感器反應(yīng)池；傳感器主體上部是由硅片構(gòu)成的長(zhǎng)方體形反應(yīng)池，下部是柱面棱鏡，在傳感器主體兩側(cè)是入射光路、出射光路、和與出射光路末端連接的計(jì)算機(jī)平臺(tái)；單色光入射，利用單色面陣CCD采集SPR影像，通過(guò)影像分析，檢測(cè)各通道的共振角、共振角的變化，即為各通道的響應(yīng)。本實(shí)用新型的有益效果有以下四個(gè)特點(diǎn)(a)可以一次完成多個(gè)樣品的檢測(cè)，(b)可以一次完成同一樣品的不同特征的檢測(cè)，c)在多通道中設(shè)置參考通道，消除非特異性響應(yīng)的影響，(d)可以對(duì)低濃度的DNA分子進(jìn)行測(cè)量。
文檔編號(hào)G01N33/00GK2758753SQ20042005627
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者劉國(guó)華, 牛文成, 張福海, 俞梅, 賈蕓芳, 張維, 米永巍, 王寧 申請(qǐng)人:南開大學(xué)