專利名稱：通過(guò)系列組合稀釋定量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生物分子的復(fù)雜混合物中生物分子的定量方法，方法包括將復(fù)雜混合物分級(jí)為級(jí)分，隨后將級(jí)分進(jìn)行系列組合稀釋以及通過(guò)具有定義的靈敏度閾和鑒定能力的方法檢測(cè)每一初始級(jí)分和每一稀釋級(jí)分中的生物分子。
當(dāng)前用于生物分子(例如蛋白)的檢測(cè)方法是進(jìn)行雙向凝膠電泳并隨后對(duì)經(jīng)染色凝膠進(jìn)行容量分析。然而，很難確定被分析的生物分子的量，尤其是如果要比較它在不同樣品中的量時(shí)。為了解決樣品間生物分子濃度的不同，凝膠必須平行處理并且必須進(jìn)行凝膠對(duì)凝膠的匹配。
需要一種用于生物分子的復(fù)雜混合物中對(duì)生物分子定量的簡(jiǎn)單方法。
本發(fā)明提供了一種用于生物分子的復(fù)雜混合物中定量生物分子的方法，其包括a.提供來(lái)自于對(duì)生物分子的復(fù)雜混合物進(jìn)行分級(jí)獲得的至少兩種級(jí)分，其中所述每一級(jí)分包含至少一種不同的生物分子組分，b.將所述級(jí)分進(jìn)行系列組合稀釋步驟，c.用具有穩(wěn)定的和充分定義的靈敏度閾和鑒定信息的方法檢測(cè)和鑒定在每一初始級(jí)分和每一稀釋級(jí)分中的生物分子，以及d.通過(guò)考慮各自的稀釋因子，加和每一稀釋水平上每一級(jí)分中生物分子的鑒定數(shù)目，從而定量生物分子復(fù)雜混合物中的生物分子。
為了歸一化，可以用d)的總數(shù)除以全部稀釋水平上全部級(jí)分(初始級(jí)分和稀釋級(jí)分)中全部生物分子的鑒定總數(shù)目。
用于定量生物分子的本發(fā)明方法提供了將來(lái)自一種來(lái)源的生物分子復(fù)雜混合物中一種或多種生物分子與來(lái)自其它來(lái)源的復(fù)雜混合物中相應(yīng)的分子進(jìn)行比較的相對(duì)定量法。
生物分子的復(fù)雜混合物可以來(lái)自任何來(lái)源，包括生物來(lái)源，生物來(lái)源包括細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、生物液體例如血清、血漿、尿、支氣管灌洗液、痰液、活組織解剖物像腦脊髓液。生物分子的復(fù)雜混合物包含至少兩種不同生物分子。本發(fā)明中的生物分子可以是任何生物分子，包括多聚核苷酸、多肽、碳水化合物、脂類、糖蛋白、脂蛋白、或它們的其它修飾形式或代謝物。檢測(cè)和鑒定方法可以限制為對(duì)單種生物分子進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，或一次可以檢測(cè)和分析幾類生物分子。
用于本發(fā)明方法的分級(jí)方法應(yīng)該有效地將生物分子的復(fù)雜混合物分離為不同級(jí)分。優(yōu)選地，生物分子的復(fù)雜混合物被分級(jí)成不同級(jí)分，使得每一不同的生物分子至多僅存在于n-1個(gè)級(jí)分中，其中n是級(jí)分的總數(shù)并且n等于或大于2。優(yōu)選地，不同生物分子存在于兩個(gè)不同的級(jí)分中，更優(yōu)選地在一個(gè)級(jí)分中?？梢杂糜诒景l(fā)明的分級(jí)方法可以選自適用于目標(biāo)種類生物分子復(fù)雜混合物分離的任何方法?？梢杂糜诒景l(fā)明方法的分級(jí)方法可以選自基于吸附、重力或沉降速度的分級(jí)方法、電泳分級(jí)方法或這些方法的組合。例如，在蛋白作為目標(biāo)分子的情況下，所述分級(jí)方法包括但不限于色譜分級(jí)法、超速離心法、蛋白沉淀法、親和純化法或免疫沉淀法。在肽(例如從蛋白水解消化物得到)作為目標(biāo)分子的情況下，所述分級(jí)方法包括但不限于高壓液相色譜法(HPLC)。
級(jí)分然后用以系列的組合稀釋。所述系列組合稀釋要求至少兩種級(jí)分來(lái)開(kāi)始。優(yōu)選地，將生物分子的復(fù)雜混合物分級(jí)為盡可能多的級(jí)分，以允許在接著的檢測(cè)步驟中檢測(cè)和鑒定足夠數(shù)量的不同目標(biāo)生物分子。優(yōu)選地，初始級(jí)分的數(shù)目不是素?cái)?shù)，更優(yōu)選地初始級(jí)分的數(shù)目是偶數(shù)，并且優(yōu)選地，每一初始級(jí)分包含至少一種不同的組分。
用來(lái)開(kāi)始系列組合稀釋的級(jí)分的數(shù)目取決于生物分子混合物的復(fù)雜度，取決于生物分子復(fù)雜混合物中的單個(gè)生物分子的濃度、分離方法的效率，以及取決于分級(jí)和系列組合稀釋后使用的檢測(cè)和鑒定方法。
對(duì)于系列組合稀釋，將至少兩種不同的包含至少一種不同生物分子的級(jí)分進(jìn)行合并。優(yōu)選地，合并兩種級(jí)分。這將改變合并的級(jí)分中生物分子的濃度，所述合并級(jí)分中生物分子的濃度為將每一級(jí)分中生物分子濃度與每一級(jí)分的體積相乘所獲得的點(diǎn)值除以所有合并級(jí)分總體積的比值。一般的，和初始級(jí)分中的各個(gè)生物分子的最大濃度相比較，這將導(dǎo)致稀釋的級(jí)分中任何生物分子組分的更小濃度。在下面的稀釋步驟中，將單個(gè)蛋白質(zhì)的濃度降低至低于接著進(jìn)行的檢測(cè)和鑒定方法的靈敏度閾。
稀釋步驟的數(shù)目取決于初始級(jí)分中生物分子的起始濃度、分級(jí)后初始級(jí)分的數(shù)目以及檢測(cè)和鑒定方法的檢測(cè)限。
本發(fā)明方法還包括檢測(cè)和鑒定方法。檢測(cè)方法必須描述明確的靈敏度閾和提供關(guān)于被檢測(cè)生物分子的鑒定信息。因此，可確定初始級(jí)分或稀釋的級(jí)分中特定生物分子的存在或不存在。本發(fā)明的檢測(cè)和鑒定方法可以依賴生物分子的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)，或序列以及由此產(chǎn)生的物理-化學(xué)或酶促特性。這些包括使用特定探針的雜交、與特定抗體或凝集素反應(yīng)、和特定分子探針的酶促或化學(xué)反應(yīng)、等電點(diǎn)、分子量、從生物分子的酶消化物中產(chǎn)生的片斷的分子質(zhì)量、NMR譜或它們的組合。以蛋白質(zhì)定量為例，本發(fā)明的檢測(cè)和鑒定方法可以選自單向或雙向凝膠電泳和質(zhì)譜的組合、免疫檢測(cè)法(例如western印跡法)、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(GS/MS)、或使用特定標(biāo)記分子例如熒光標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記(例如生物素)或放射性標(biāo)記的電泳法的這類方法。
為了得到生物分子的定量，對(duì)每一稀釋步驟的級(jí)分的鑒定或特定指紋譜(肽質(zhì)量指紋譜)進(jìn)行了計(jì)算，其中考慮了每個(gè)稀釋步驟各自的稀釋因子。得到的生物分子的鑒定數(shù)目在全部稀釋水平上得以加和。為了歸一化，可以用這個(gè)總數(shù)處以全部級(jí)分(初始級(jí)分和稀釋級(jí)分)中的全部生物分子的鑒定總數(shù)目。
相對(duì)量(q)=Σ(di×Ni)Ntotal]]>其中Ni是稀釋水平i上的單種生物分子的鑒定數(shù)目N，di是各個(gè)稀釋水平i的稀釋因子d，以及Ntotal是全部稀釋水平上全部級(jí)分中全部生物分子的鑒定總數(shù)目N。
本發(fā)明與不同生物分子的特性無(wú)關(guān)。對(duì)多核苷酸和多肽或碳水化合物均同樣可定量。本發(fā)明的其它優(yōu)勢(shì)是它以簡(jiǎn)單的方式將定量和鑒定結(jié)合而不需要針對(duì)生物分子定量進(jìn)行額外努力。而且，如果需要將來(lái)自一種來(lái)源的生物分子的量與來(lái)自另一來(lái)源的生物分子的量進(jìn)行比較，則可對(duì)生物分子混合物相互獨(dú)立地處理。
現(xiàn)在已經(jīng)一般地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考具體的實(shí)施例及下列附圖將能更好地理解本發(fā)明，其中所述的具體實(shí)施例除非另有說(shuō)明在此僅是為了闡述的目的而不用于限制本發(fā)明。


圖1說(shuō)明了本發(fā)明的方法在第一步中將復(fù)雜混合物分級(jí)成不同級(jí)分。然后將這些級(jí)分進(jìn)行系列組合稀釋。在第二步中對(duì)樣品庫(kù)用例如雙向凝膠電泳法和隨后的質(zhì)譜法鑒定檢測(cè)生物分子。(AU吸收單位；8到23級(jí)分)圖2展示了生物分子的相對(duì)量的計(jì)算。
q生物分子的相對(duì)量；Ni稀釋水平i上單個(gè)生物分子的鑒定數(shù)目N；di各個(gè)稀釋水平i的稀釋因子d；Ntotal全部稀釋水平上所有級(jí)分中的所有生物分子的鑒定總數(shù)目N。(圖解N1未稀釋，N22倍稀釋，N34倍稀釋，N48倍稀釋)圖3顯示了在雙向凝膠電泳中從水平1(未稀釋)、水平2(2倍稀釋)、水平3(4倍稀釋)和水平4(8倍稀釋)上對(duì)糖蛋白磷酸化酶(a)，波形蛋白和熱休克蛋白105(c)的鑒定的數(shù)目。從重復(fù)三次進(jìn)行的試驗(yàn)加和值。(對(duì)照5mM葡萄糖；高葡萄糖10mM)實(shí)施例除非另外指出，實(shí)施例中涉及的市售試劑根據(jù)生產(chǎn)商指導(dǎo)手冊(cè)使用。
實(shí)施例1細(xì)胞培養(yǎng)將INS-1細(xì)胞(Asfari，Janjic等，1992)培養(yǎng)于補(bǔ)充有10％FCS(Invitrogen，熱滅活)、10mM Hepes溶液(Invitrogen)、1mM丙酮酸鈉(Sigma)、50μM β-巰基乙醇(Sigma)、1％青霉素/鏈霉素溶液(SIGMA)和低(5mM)或高(10mM)濃度葡萄糖(SIGMA)的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中。細(xì)胞一般培養(yǎng)于低葡萄糖濃度中。為了準(zhǔn)備培養(yǎng)，將細(xì)胞傳代然后在低葡萄糖濃度培養(yǎng)基中孵育直到細(xì)胞融合。然后將培養(yǎng)基換成低葡萄糖或高葡萄糖培養(yǎng)基，并且繼續(xù)孵育四天。為了收獲細(xì)胞，將細(xì)胞首先用Hanks平衡鹽溶液(HBSS，Invitrogen)洗滌一次，然后用胰蛋白酶/EDTA溶液覆蓋1-2分鐘直到細(xì)胞變圓并從瓶表面分離。棄去胰蛋白酶/EDTA溶液，并將細(xì)胞懸浮于胰蛋白酶抑制劑溶液中(SIGMA)，轉(zhuǎn)移進(jìn)離心管中并在1200×g下離心5分鐘。之后，將細(xì)胞在HBSS中洗滌三次，用同樣的參數(shù)再次離心。吸出上清液并棄去，然后將細(xì)胞沉淀在-80℃下冷凍儲(chǔ)存直到用于細(xì)胞溶質(zhì)制備。
細(xì)胞溶質(zhì)制備將所有溶液冷卻至4℃(HBSS除外)而且所有步驟在冰冷環(huán)境中進(jìn)行(冰浴)。將約108個(gè)細(xì)胞重懸于細(xì)胞勻漿培養(yǎng)基(CHM；150mMMgCl2，10mM KCl，10mM Tris，0.25M葡萄糖，1mM EDTA，pH7.4)中。然后置于冰上2分鐘。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到Potter Elvehjem勻漿器容器中。將Potter Elvehjem勻漿器的冷的杵和高架高扭矩電動(dòng)機(jī)連接，然后1000轉(zhuǎn)/分鐘下用10沖程將細(xì)胞勻漿化。通過(guò)相差顯徽技術(shù)確認(rèn)勻漿化效率(＞90％的破裂細(xì)胞)。1000×g離心5分鐘除去細(xì)胞碎片和細(xì)胞核。5000×g離心分離線粒體。200000×g離心并通過(guò)將上清液轉(zhuǎn)移至潔凈試管內(nèi)，最后富集的細(xì)胞溶質(zhì)級(jí)分得以回收。在該制備物中最終的蛋白質(zhì)濃度為2.5-5.0mg/ml。
色譜分級(jí)全部分級(jí)步驟用KTAexplorer 10色譜系統(tǒng)(Amersham)在室溫下進(jìn)行。將細(xì)胞溶質(zhì)制備物(10mg的全部蛋白質(zhì))通過(guò)0.45μM Milex-HV針筒式過(guò)濾器，上樣到脫鹽柱上(串聯(lián)連接的三個(gè)5ml HiTrap脫鹽柱，Amersham)。用緩沖液A(25mM NaHPO4-pH7.5；1mM EDTA；0.5mM二硫赤蘚糖醇；1×Complete EDTA-free(購(gòu)自Roche Diognostics的蛋白酶抑制劑混合片劑；pH調(diào)整到7.5))以1.5ml/分鐘流速洗脫蛋白質(zhì)。以UV吸光值(280nm)增加和最小電導(dǎo)率作為蛋白質(zhì)級(jí)分的界限，將蛋白質(zhì)回收在20ml注入式套管(injectionloop)中。然后通過(guò)使用TSK DEAE-5PW7.5cm×7.5mm柱(TOSOH BIOSEP)的陰離子交換色譜在1ml/分鐘流速下分離蛋白質(zhì)。將緩沖液A用作結(jié)合緩沖液，緩沖液B(25mM NaHPO4-pH7.5；1mM EDTA；0.5mM二硫赤蘚糖醇；1×Complete EDTA-free(購(gòu)自Roche Diognostics的蛋白酶抑制劑混合片劑；1M NaCl，pH調(diào)整到7.5))作為洗脫緩沖液。將樣品上樣到柱上，用7個(gè)柱體積(CV)的緩沖液A洗脫未結(jié)合物質(zhì)。隨后用三段梯度(第一段3CV0-11％的緩沖液B；第二段10CV11-30％的緩沖液B；1.5CV30-50％的緩沖液B)洗脫結(jié)合的蛋白。最后用5CV50％的緩沖液B洗滌柱子。以1ml的量收集級(jí)分并且加上流透液組合形成八個(gè)庫(kù)。電導(dǎo)率邊界為FTUV280增加到電導(dǎo)率的增加；1(電導(dǎo)率增加開(kāi)始到12ms)；2(12到15ms)；3(15到18ms)；4(18到21ms)；5(21到24ms)；6(24到27ms)；7(27到30ms)；8(30到40ms)。
雙向電泳通過(guò)使用充填有100mg POROS 20 R1材料(PerSeptive Biosystems)的自填充針筒式小型柱(MoBiTec M1002)進(jìn)行反相色譜將級(jí)分濃縮和脫鹽。用10ml 0.1％的三氟乙酸(TFA)和用70％乙腈/0.1％TFA洗滌柱。上樣樣品后，柱用10ml 0.1％TFA洗滌，并用2ml 70％乙腈/0.1％TFA洗脫。洗脫物隨后在SpeedVac蒸發(fā)器中干燥然后置于IEF樣品緩沖液(7M尿素，2M硫脲，50mM Tris pH7.5，2％(w/v)CHAPS，0.4％(w/v)二硫赤蘚糖醇，0.5％(w/v)兩性電解質(zhì))。將包含0.5mg蛋白的等分試樣從各個(gè)級(jí)分中留出并標(biāo)記為樣品1到8。后面的樣品從剩余級(jí)分制備樣品90.25mg級(jí)分1+0.25mg級(jí)分2；樣品100.25mg級(jí)分3+0.25mg級(jí)分4；樣品110.25mg級(jí)分5+0.25mg級(jí)分6；樣品120.25mg級(jí)分7+0.25mg級(jí)分8；樣品130.125mg級(jí)分1+0.125mg級(jí)分2+0.125mg級(jí)分3+0.125mg級(jí)分4；樣品140.125mg級(jí)分5+0.125mg級(jí)分6+0.125mg級(jí)分7+0.125mg級(jí)分8；樣品150.0625mg級(jí)分1+0.0625mg級(jí)分2+0.0625mg級(jí)分3+0.0625mg級(jí)分4+0.0625mg級(jí)分5+0.0625mg級(jí)分6+0.0625mg級(jí)分7+0.0625mg級(jí)分8；因而，樣品1-8包含0.5mg蛋白質(zhì)級(jí)分，樣品9-12各自對(duì)應(yīng)這些樣品的兩倍稀釋，樣品13和14對(duì)應(yīng)四倍稀釋，以及樣品15對(duì)應(yīng)這些初始級(jí)分的八倍稀釋。用具有pH3到10的固相pH梯度(IPG)膠條(IPG3-10L；Amersham)在Protean IEF Cell(BioRad)中20℃下進(jìn)行等電聚焦。將干膠條在包含7M尿素、2M硫脲、2％(w/v)CHAPS、0.4％(w/w)二硫赤蘚糖醇和0.5％(w/v)兩性電解質(zhì)的溶液中重泡脹。在膠條的陰極端將蛋白質(zhì)級(jí)分杯狀上樣。將電壓在8小時(shí)內(nèi)直線上升到5000V，接著在5000V的穩(wěn)定水平進(jìn)行10小時(shí)。通過(guò)依次在平衡溶液I(6M尿素，50mM Tris pH7.5，30％甘油，2.0％SDS，30mM二硫赤蘚糖醇)和平衡溶液II(6M尿素，50mM Tris pH8.8，30％甘油，2.0％SDS，0.23M碘乙酰胺)中洗滌，各10分鐘，膠條得以平衡和烷基化。將膠條上樣到11％丙烯酰胺/PDA(37∶1)梯度凝膠(240mm×200mm×1.5mm)上。在80V O/N下于ETTAN Dalt電泳儀器(Amersham)中，伴隨持續(xù)冷卻(20℃)，通過(guò)電泳使蛋白質(zhì)得以分辨。
凝膠染色和處理將凝膠在50％甲醇/10％乙酸中固定并用考馬斯藍(lán)(膠體藍(lán)，Invitrogen，Carlsbad，CA)染色過(guò)夜，接著在超高純水中多次洗滌總共7小時(shí)。掃描凝膠并且用自動(dòng)膠點(diǎn)挖取設(shè)備切取直徑為1.2mm的凝膠點(diǎn)。在包含100mM碳酸氫銨和30％乙腈的溶液中退染凝膠點(diǎn)。干燥的退染凝膠片在5μl 10μg/ml胰蛋白酶溶液(Roche Diagnostics)中室溫下消化過(guò)夜。加入10μl超高純水后，用5μl包含75％乙腈和0.3％(v/v)TFA的溶液提取蛋白質(zhì)。將肽溶液點(diǎn)樣到MALDI靶上，它和α-氰基-4-羥基肉桂酸一起作為基質(zhì)。
質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)鑒定在Bruker Ultraflex Instrument(Bruker，Bremen，德國(guó))上，用促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和緩激肽(Bradykinin)作為內(nèi)部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。如下面解釋，單種同位素的肽段質(zhì)量從質(zhì)譜中自動(dòng)監(jiān)測(cè)并且和來(lái)自蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(例如SwissProt或NCBI大鼠基因組草圖)的源自計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化液的肽的理論質(zhì)量比較。
MALDI質(zhì)譜的峰值注釋質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)用低通中值參數(shù)樣條濾波器兩次過(guò)濾以便確定儀器的基準(zhǔn)線。將對(duì)基準(zhǔn)線的平滑化的殘余平均標(biāo)準(zhǔn)偏差用于數(shù)據(jù)中儀器噪音水平的估計(jì)。
在基線校正和噪音水平上的坐標(biāo)中的數(shù)據(jù)重新調(diào)節(jié)后，具有對(duì)基準(zhǔn)線最大偏差的數(shù)據(jù)點(diǎn)被用來(lái)產(chǎn)生一個(gè)非線性(Levenberg-Marquardt算法)數(shù)據(jù)擬合程序以檢測(cè)可能的肽峰。特別地，擬合程序準(zhǔn)備用于產(chǎn)生最好擬合的用峰高度、分辨率和單種同位素質(zhì)量參數(shù)化的平均理論肽同位素分布。用平常的方法通過(guò)跟蹤σ值確定收斂到有效的擬合。
收斂成功之后，通過(guò)使用十六次重復(fù)1/3的數(shù)據(jù)點(diǎn)的隨機(jī)交換的引導(dǎo)程序可以產(chǎn)生對(duì)經(jīng)確定參數(shù)的誤差估計(jì)。
將得到的擬合值從數(shù)據(jù)中減除，將擬合值附近的噪音水平調(diào)整到外推的噪音水平和對(duì)峰值擬合值的偏差之和，并且將此過(guò)程迭代，只要候選的峰多于五倍的噪音水平，就找到下一個(gè)峰。當(dāng)找到多于50個(gè)峰停止這一過(guò)程。
自檢測(cè)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)峰線性外推校正飛行時(shí)間對(duì)質(zhì)量換算的第零和第一階，并且從峰的質(zhì)量精確度和標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)對(duì)單種同位素質(zhì)量的置信區(qū)間。
譜峰對(duì)計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)酶解物的概率匹配將質(zhì)譜的峰質(zhì)量列表直接和對(duì)于整個(gè)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的理論酶解物比較。對(duì)每個(gè)理論酶解物，計(jì)算[1-П(1-NP(pi))]cMatches，其中N是酶解物中肽的數(shù)目，p(pi)是匹配對(duì)于峰的單種同位素質(zhì)量的置信區(qū)間的肽的數(shù)目除以序列數(shù)據(jù)庫(kù)中所有肽的數(shù)目，cMatches是酶解物和質(zhì)譜之間匹配的數(shù)目。可以看出這個(gè)值與獲得酶解物和質(zhì)譜之間的假陽(yáng)性匹配概率成比例。將概率值進(jìn)一步過(guò)濾尋找產(chǎn)生匹配的譜峰高的顯著性。第一輪鑒定后，將在同一條件下獲得的質(zhì)譜鑒定的偏差用來(lái)校正飛行時(shí)間對(duì)質(zhì)量換算的第二和第三階項(xiàng)。得到的質(zhì)量值通常具有不到10ppm的絕對(duì)偏差。這些質(zhì)量值接著用于最后一輪的匹配，其中所有具有不到0.01/N蛋白(用Bonferoni校正具有1％顯著水平)的Pmism的匹配得以接受。
數(shù)據(jù)庫(kù)分析對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的每個(gè)蛋白質(zhì)，統(tǒng)計(jì)本研究中分析的每一2D-PAGE膠的鑒定數(shù)目。在本實(shí)例中將稀釋水平1設(shè)為參考。然后得到下列值●稀釋水平1鑒定的數(shù)目(未稀釋樣品，樣品1-8)＝N1；●稀釋水平2鑒定的數(shù)目(2倍稀釋，樣品9-12)＝N2；●稀釋水平3鑒定的數(shù)目(4倍稀釋，樣品13，14)＝N3；●稀釋水平4鑒定的數(shù)目(8倍稀釋，樣品15)＝N4；正如期望的，對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)N值從一級(jí)到下一級(jí)降低大概兩倍?？紤]稀釋因子以及為了得到對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)的粗略絕對(duì)量，用下式計(jì)算量值qq＝(N1+2×N2+4×N3+8×N4)/對(duì)全部稀釋水平上同一來(lái)源的所有樣品確定的蛋白點(diǎn)的總數(shù)目除以對(duì)同一來(lái)源的所有樣品鑒定的總數(shù)目，被用來(lái)解決蛋白質(zhì)濃縮物中樣品間的不同。
對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)，計(jì)算和比較對(duì)于混合物樣品(高和低糖)兩者的q值。
選擇下列三種蛋白質(zhì)作為實(shí)例以說(shuō)明本定量方法的可行性糖原磷酸化酶(肝臟中的形式)；波形蛋白和熱休克蛋白105(表1，圖3)。
表1對(duì)于三個(gè)實(shí)例蛋白從三個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞溶質(zhì)中存在的蛋白質(zhì)的相對(duì)量(q值)。
實(shí)施例2膠原蛋白αI(IV)來(lái)自三個(gè)胰島素抗性和胰島素敏感病人(白種人，女性)的血清樣品按下面描述分級(jí)。如通過(guò)高胰島素正常血糖鉗方法(Garvey等Diabetes34(1985)222-234)測(cè)定的體重指數(shù)(BMI)和葡萄糖處理率(GDR)在表2中有簡(jiǎn)要說(shuō)明。組合系列稀釋按專利申請(qǐng)中描述的實(shí)施而且得到的樣品按下面描述用于雙向-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)。將所有可檢測(cè)的蛋白斑點(diǎn)從每一凝膠上切取。將蛋白用胰蛋白酶降解并且將所得的肽用于基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-MS)。蛋白鑒定可以通過(guò)如下面描述的肽質(zhì)量指紋圖譜分析得到，而且將蛋白列表如實(shí)施例1中描述的比較。
表2六個(gè)受試者的通過(guò)高胰島素正常血糖鉗方法檢測(cè)的體重指數(shù)(BMI)和葡萄糖處理率(GDR)。對(duì)于GDRs，認(rèn)為15以上為胰島素抗性鑒定的斷點(diǎn)，在方格左邊的病人歸為胰島素敏感(IS)，而在右邊的那些為胰島素抗性(IR)。來(lái)自這些個(gè)體的血漿通過(guò)系列組合稀釋，隨后進(jìn)行2D-PAGE、斑點(diǎn)切取、胰酶處理、MALDI-MS，并且最后通過(guò)肽質(zhì)量指紋圖譜比較鑒定蛋白質(zhì)而得以分析。
樣品制備通過(guò)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立一種方法用來(lái)搜索人類血漿中的胰島素抗性標(biāo)記。用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)很難分析血漿，因?yàn)檠獫{包含約十種高豐度蛋白，它表現(xiàn)了大約98％的總蛋白質(zhì)量。通過(guò)應(yīng)用色譜技術(shù)除去高豐度蛋白、清蛋白和抗體鏈，并在離子交換器上分級(jí)流通級(jí)分。描述的方案包括三個(gè)層析步驟(matrix blue、G蛋白和離子交換)，并且是高度可重復(fù)的。所有層析步驟在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)上實(shí)施。
通過(guò)在Mimetic Blue上親和層析除去清蛋白和通過(guò)在G蛋白上親和層析除去免疫球蛋白從三個(gè)對(duì)照個(gè)體和三個(gè)患糖尿病II型的病人獲得人類血漿。將蛋白酶抑制混合劑(Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))加至血漿(每片劑對(duì)50ml)。用25mM MES，pH6.0，三倍稀釋血漿，以減少鹽的濃度并調(diào)整PH至約6.0。順序連接兩個(gè)柱，Mimetic Blue SA P6XL(50ml，ProMetic生物科學(xué)有限公司)和HiTrap G蛋白HP(5ml，Amersham生物科學(xué))，并用25mM MES，pH6.0平衡。將對(duì)應(yīng)大約一克血漿蛋白的體積(15ml，66mg/ml)濾過(guò)0.22μm過(guò)濾器并以5ml/分鐘施加到Mimetic Blue柱上。將此柱子的流透液直接上樣到G蛋白柱上并且收集來(lái)自后面柱的流透級(jí)分(約120mg)。用100ml的25mM MES，pH6.0，洗滌這兩個(gè)柱，隨后將它們分開(kāi)。Mimetic Blue柱用分步梯度以在50mM Tris-HCL，pH7.5中的2M NaCl洗脫以及用100mM甘氨酸-HCL，pH2.8洗脫G蛋白并且用1M Tris堿中和洗出液。通過(guò)雙向凝膠分析此流透級(jí)分和這兩個(gè)洗出液并且通過(guò)MALDI-MS鑒定蛋白。在來(lái)自Mimetic Blue的洗出液中，檢測(cè)到了主要為全長(zhǎng)和片斷化的清蛋白。在來(lái)自G蛋白柱的洗脫液中，主要檢測(cè)到重和輕的Ig鏈。在流透級(jí)分中大多數(shù)其它血漿蛋白得以回收。
通過(guò)離子交換層析進(jìn)行蛋白質(zhì)分級(jí)將來(lái)自Mimetic Blue和G蛋白柱的流透級(jí)分和洗滌級(jí)分合并，用2MTris堿調(diào)整到pH8.0并施加到HiTrap Q HP柱(5ml，AmershamBiosciences)，用50mM Tris-HCL，pH8.0，以5ml/分鐘平衡。用在50mMTris-HCL，pH7.5中的從0到1M NaCl的線性梯度上升的鹽濃度洗脫柱子。收集5ml級(jí)分并用單向凝膠分析。大約50mg總蛋白從此柱得以回收?；谀z分析，將級(jí)分合并以形成八種組合，使得每種組合包括約5mg的總蛋白。用Utrafree-15離心過(guò)濾器(5kMWCO，Millipore)濃縮并且通過(guò)2-D凝膠分析八個(gè)組的每一個(gè)。從各個(gè)膠上切取大約400個(gè)斑點(diǎn)并用MALDI-MS分析。
2D-PAGE從Amersham Biosciences(Uppasla，瑞典)購(gòu)買固相PH梯度(IPG)膠條。從Biosolve(Valkenswaard，荷蘭)獲得丙烯酰胺并且用于聚丙烯酰胺凝膠制備的其它試劑來(lái)自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA，美國(guó))。CHAPS來(lái)自Roche Diognostics(Mannheim，德國(guó))，尿素來(lái)自Applichem(Darmstadt，德國(guó))，硫脲來(lái)自Fluka(Buchs，瑞士)以及二硫赤蘚糖醇來(lái)自Merck(Darmstadt)。
將0.5mg總蛋白的樣品施加到3-10NL IPG膠條上，在它們的堿性和酸性端位于樣品杯中。在200V開(kāi)始聚焦，并且用計(jì)算機(jī)-控制電源將電壓以3V/分鐘逐漸上升到5000V，并接下來(lái)保持恒定6小時(shí)。40mA/膠下在12％的恒定SDS聚丙酰胺凝膠(18×200×1.5mm)上實(shí)施雙向凝膠電泳分離。在40％的包含5％磷酸的甲醇中固定蛋白12小時(shí)后，用膠體考馬斯藍(lán)(Novex，San Diego，CA，美國(guó))染色凝膠24小時(shí)。用H2O將多余的染料從凝膠上洗掉，并且將凝膠用Agfa DUOSCAN光密度計(jì)(分辨率400)掃描。凝膠的電子圖像用Photoshop(Adobe)軟件記錄。圖像以tiff(約5兆字節(jié)/文件)和jpeg(約50千字節(jié)/文件)格式存儲(chǔ)。凝膠保存在4℃直到用于MS分析。
MALDI-MS用國(guó)產(chǎn)斑點(diǎn)挖取器(在歐洲申請(qǐng)EP 1 384 994中描述)切取1.2mm直徑的經(jīng)選取斑點(diǎn)，放入96-孔微量滴定板并且用100μl在50mM碳酸氫銨中的30％乙腈在CyBiTM-Well儀器(Cybio AG，Jena，德國(guó))中將每一凝膠塊脫色。脫色后，用100μl H2O洗滌凝膠塊5分鐘，并在speedvac蒸發(fā)器中不加熱干燥5分鐘。每個(gè)干燥凝膠塊用5μl包含50ng胰蛋白酶(RocheDiognostics，Mannheim，德國(guó))的1mM碳酸氫銨重泡脹。室溫下16小時(shí)后，將20μl 50％的乙腈(其包含0.3％三氟乙酸)加至每一凝膠塊。將凝膠塊孵育15分鐘，保持恒定搖動(dòng)。將肽混合物(1.5μl)和1μl基質(zhì)溶液同時(shí)施加至AnchorChipTM，其中所述基質(zhì)溶液由0.025％的α-氰基-4-羥基肉桂酸(Sigma)組成，并且包含在65％乙醇、32％乙腈和0.03％三氟乙酸中的標(biāo)準(zhǔn)肽脫精氨酸血管舒緩激肽(des-Arg-bradykinin)(Sigma，20nM，904.4681Da)和促腎上腺皮質(zhì)激素片段18-39(Sigma，20nM，2465.1989Da)。用CyBi-Well儀器進(jìn)行樣品施加。樣品以反射模式在飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Ultraflex TOF-TOF，Bruker Daltonics)中分析。使用20KV的加速電壓?；陔?質(zhì)量匹配鑒定蛋白。
MALDI質(zhì)譜的譜峰注解質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)用低通中值參數(shù)樣條濾波器兩次過(guò)濾以便確定儀器的基準(zhǔn)線。將對(duì)基準(zhǔn)線的平滑化殘差平均標(biāo)準(zhǔn)偏差用于數(shù)據(jù)中儀器噪音水平的估計(jì)。在基準(zhǔn)線校正和噪音水平上的坐標(biāo)中的數(shù)據(jù)重新調(diào)節(jié)后，具有對(duì)基準(zhǔn)線最大偏差的數(shù)據(jù)點(diǎn)被用來(lái)產(chǎn)生一個(gè)非線性(Levenberg-Marquardt算法)數(shù)據(jù)擬合程序去檢測(cè)可能的肽峰值。特別地，擬合程序嘗試用來(lái)產(chǎn)生最好擬合的用峰值高度、分辨率和單種同位素質(zhì)量參數(shù)化的平均理論肽同位素分布。用常規(guī)的方法通過(guò)跟蹤σ值確定收斂到有效的擬合。收斂成功之后，通過(guò)使用十六次重復(fù)1/3數(shù)據(jù)點(diǎn)的隨機(jī)交換的引導(dǎo)程序可以產(chǎn)生對(duì)所確定參數(shù)的誤差估計(jì)。將得到的擬合值從數(shù)據(jù)中減除，將擬合值附近的噪音水平調(diào)整到外推的噪音水平和對(duì)峰值擬合值的偏差之和，并且將此過(guò)程迭代，只要候選的峰多于五倍的噪音水平，就找到下一個(gè)峰。當(dāng)找到多于50個(gè)峰停止這一過(guò)程。用從檢測(cè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)峰的線性外推校正飛行時(shí)間對(duì)質(zhì)量換算的第零和第一階，并且從峰的質(zhì)量精確度和標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)對(duì)單種同位素質(zhì)量的置信區(qū)間。
譜峰對(duì)計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)酶解物的概率匹配將質(zhì)譜的峰質(zhì)量列表直接和對(duì)于整個(gè)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的理論酶解物比較。對(duì)每一理論酶解物，計(jì)算[1-П(1-NP(pi))]cMatches，其中N是酶解物中肽的數(shù)目，p(pi)是匹配對(duì)于峰的單種同位素質(zhì)量的置信區(qū)間的肽的數(shù)目除以序列數(shù)據(jù)庫(kù)中所有肽的數(shù)目，cMatches是酶解物和質(zhì)譜之間匹配的數(shù)目。可以看出這個(gè)值與獲得酶解物和質(zhì)譜之間的假陽(yáng)性匹配概率成比例。將概率值進(jìn)一步過(guò)濾尋找產(chǎn)生匹配的譜峰高的顯著性。第一輪鑒定后，將在同一條件下獲得的質(zhì)譜鑒定的偏差用來(lái)校正飛行時(shí)間對(duì)質(zhì)量換算的第二和第三階項(xiàng)。得到的質(zhì)量值通常具有不到10ppm的絕對(duì)偏差。這些質(zhì)量值接著用于最后一輪的匹配，其中所有具有不到0.01/N蛋白(用Bonferoni校正具有1％顯著水平)的Pmism的匹配得以接受。
結(jié)果在兩個(gè)胰島素抗性病人(IR2和IR3，見(jiàn)表3)中獨(dú)有地檢測(cè)到膠原蛋白αI(IV)(膠原蛋白IV；Swissprot登錄號(hào)P12109；O00117；O00118；Q14040；Q14041；Q16258)。在一個(gè)病人(IR2)中，在第二水平上(二倍稀釋樣品)檢測(cè)到斑點(diǎn)，然而在第二個(gè)病人(IR3)中在第四水平(八倍組合稀釋)上檢測(cè)到蛋白兩次。將鑒定數(shù)目和稀釋因子相乘(在這個(gè)例子，分別是一和四)并且用各自樣品鑒定的蛋白斑點(diǎn)的總數(shù)校正。
另外按照供應(yīng)商的方法用免疫檢測(cè)法(Biotrin膠原蛋白IV EIA；目錄號(hào)NoBIO82；Biotrin，Dublin，愛(ài)爾蘭)測(cè)定膠原蛋白IV水平。來(lái)自兩種檢測(cè)法的結(jié)果在表3中比較。
表3來(lái)自系列組合稀釋的結(jié)果和來(lái)自免疫檢測(cè)的結(jié)果比較。
IS＝胰島素敏感病人，IR＝胰島素抗性病人。
系列組合稀釋用稀釋因子和全部斑點(diǎn)數(shù)目調(diào)整鑒定的數(shù)目。
免疫檢測(cè)(膠原蛋白IV EIA)通過(guò)使用Biotrin膠原蛋白IVEIA檢測(cè)膠原蛋白IV水平。所給出的結(jié)果是重復(fù)測(cè)量的平均。
描述的蛋白質(zhì)組學(xué)方法的檢測(cè)限度在用于免疫檢測(cè)的限度之上，其大約是150ng/ml。在此水平以上，通過(guò)與描述的鑒定方法相結(jié)合的系列組合稀釋，蛋白質(zhì)可以得以檢測(cè)并且能粗步定量。雖然沒(méi)有觀察到絕對(duì)的定量，但有一些等級(jí)相關(guān)性，也就是具有最高和第二高水平的樣品得以正確的鑒定。
與蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合進(jìn)行系列組合稀釋而進(jìn)行大規(guī)模蛋白鑒定是一種有效的工具，用以平行定量成百上千的蛋白和鑒定在濃度上具有顯著不同的能用于差異蛋白表達(dá)分析例如用于生物標(biāo)記物鑒定研究的蛋白。
權(quán)利要求
1.用于在生物分子的復(fù)雜混合物中定量生物分子的方法，所述方法包括a.提供來(lái)自于對(duì)生物分子的混合物進(jìn)行分級(jí)獲得的至少兩種級(jí)分，其中所述每一級(jí)分包含至少一種不同的組分，b.將所述級(jí)分進(jìn)行系列組合稀釋，c.通過(guò)提供靈敏度閾和鑒定信息的方法檢測(cè)和鑒定在每一初始級(jí)分和每一稀釋級(jí)分中的生物分子，以及d.通過(guò)考慮各自的稀釋因子，加和每一稀釋水平上每一級(jí)分中生物分子的鑒定數(shù)目，從而定量復(fù)雜混合物中的生物分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將d)的和除以全部稀釋水平上全部級(jí)分中全部生物分子的鑒定總數(shù)目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中a)的級(jí)分?jǐn)?shù)目取決于生物分子混合物的復(fù)雜度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中a)的級(jí)分?jǐn)?shù)目取決于生物分子的復(fù)雜混合物中不同生物分子的濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中a)的級(jí)分?jǐn)?shù)目取決于c)的檢測(cè)和鑒定方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中b)的稀釋水平數(shù)目取決于級(jí)分中生物分子的起始濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中b)的稀釋水平數(shù)目取決于分級(jí)后級(jí)分的數(shù)目。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中b)的稀釋水平數(shù)目取決于檢測(cè)和鑒定方法的檢測(cè)限度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生物分子至多存在于n-1個(gè)級(jí)分中，其中n是級(jí)分的總數(shù)并且其中n等于或大于2。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生物分子存在于兩個(gè)級(jí)分中。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生物分子存在于一個(gè)級(jí)分中。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中c)的檢測(cè)和鑒定方法包括雙向凝膠電泳。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中c)的檢測(cè)和鑒定方法額外包括質(zhì)譜分析。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中c)的檢測(cè)和鑒定方法包括免疫檢測(cè)法。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中c)的檢測(cè)和鑒定方法包括結(jié)合質(zhì)譜的氣相色譜法。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中c)的檢測(cè)和鑒定方法包括使用特定標(biāo)記分子的電泳法。
17.根據(jù)權(quán)利要求1到16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中a)的級(jí)分通過(guò)色譜分級(jí)法、超速離心法、蛋白沉淀法或免疫沉淀法分離。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生物分子是多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求1到17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生物分子是多核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求1到17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生物分子是碳水化合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1到17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生物分子是脂類。
22.根據(jù)權(quán)利要求1到17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生物分子是糖蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求1到17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生物分子是脂蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于對(duì)生物分子的復(fù)雜混合物中定量生物分子的方法，其包括將生物分子混合物分級(jí)以提供至少兩個(gè)級(jí)分，其中每個(gè)級(jí)分具有至少一種不同組分。這些級(jí)分隨后接受系列組合稀釋。接著，通過(guò)提供了靈敏度閾和鑒定信息的方法使在級(jí)分中的生物分子得以檢測(cè)和鑒定。通過(guò)考慮各自的稀釋因子，加和各個(gè)稀釋水平上各個(gè)級(jí)分中鑒定的生物分子數(shù)目，生物分子的量得以確定。為了歸一化，用此和除以所有稀釋水平上所有級(jí)分中所有生物分子的鑒定總數(shù)目。
文檔編號(hào)G01N33/92GK1629638SQ200410101309
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2004年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者P·伯恩特, S·埃弗斯, H·朗根 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司