專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的方法及其專(zhuān)用引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物防治、分子診斷和線(xiàn)蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域中一種檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的方法及其專(zhuān)用引物和探針，特別涉及一種檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的方法及其專(zhuān)用引物和探針與包括該引物和探針的檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
松材線(xiàn)蟲(chóng)病，又稱(chēng)松枯萎病，是極具危險(xiǎn)性的松林病害之一，植物染病40天后即可死亡，從發(fā)病到整片松林毀滅僅需3-5年時(shí)間，因此也被稱(chēng)為松樹(shù)的“癌癥”。松材線(xiàn)蟲(chóng)病主要通過(guò)松墨天牛、木材和木質(zhì)包裝材料三種渠道進(jìn)行傳播。該病最早在北美發(fā)現(xiàn)，我國(guó)1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)，以后在安徽、山東、浙江、廣東等省的局部地區(qū)發(fā)生并流行成災(zāi)，現(xiàn)在受害林面積近130萬(wàn)畝，直接經(jīng)濟(jì)損失25億元，間接損失高達(dá)250億元，而且該病害現(xiàn)已直接威脅到我國(guó)5億多畝的松林資源。
對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的防治措施主要是通過(guò)檢疫進(jìn)行隔絕，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)感染了松材線(xiàn)蟲(chóng)的樹(shù)木或木質(zhì)材料，就要立即對(duì)其進(jìn)行焚燒銷(xiāo)毀，因此研究出對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法至關(guān)重要。目前的檢測(cè)手段主要是根據(jù)松材線(xiàn)蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行判斷。松材線(xiàn)蟲(chóng)屬于傘滑刃線(xiàn)蟲(chóng)屬(Bursaphelenchus)，該屬現(xiàn)報(bào)道有60余種，其中松材線(xiàn)蟲(chóng)與擬松材線(xiàn)蟲(chóng)的形態(tài)極為相似，尤其在幼蟲(chóng)階段更難以區(qū)分。在亞洲(尤其是中國(guó)和日本)，擬松材線(xiàn)蟲(chóng)是優(yōu)勢(shì)種群，但其致病性弱，單純通過(guò)形態(tài)觀察難以對(duì)二者進(jìn)行鑒別。Tares等人(1993)和Harmey(1994)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的微衛(wèi)星DNA及核DNA進(jìn)行了研究，Beckenbach等人(1992)和Harmey(1993)利用PCR和DNA指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行了松材線(xiàn)蟲(chóng)的檢測(cè)、鑒定等研究。但普通的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，一般都需電泳或酶切等操作，檢測(cè)速度較慢(至少6個(gè)小時(shí))。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime fluorence quantative PCR)技術(shù)由美國(guó)AppliedBiosystems公司于1996年推出，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種TaqMan熒光探針和SYBR熒光染料。其中，TaqMan熒光探針是指PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。該項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它具有特異性更強(qiáng)、無(wú)污染、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已應(yīng)用于對(duì)一些重要檢疫對(duì)象的檢測(cè)中，尤其是對(duì)病毒的檢測(cè)，如蘋(píng)果褪綠葉斑病毒、番茄斑點(diǎn)萎焉病毒(TSWV)等；此外，用該方法檢測(cè)細(xì)菌(如大腸桿菌)和真菌(如鐮刀菌)亦有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的專(zhuān)用引物和探針。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的專(zhuān)用引物由正向引物和反向引物組成，正向引物是3’末端序列為3’-TCAGT的16-30個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列，反向引物是3’末端序列為3’-CCAAG的16-30個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列；探針是3’末端序列為3’-GGTAGTACGCGCC的16-25個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列。
所述探針的3’端還標(biāo)記有一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)(TAMRA)，5’端標(biāo)記有一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)(FAM)。
所述正向引物優(yōu)選為具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物優(yōu)選為具有序列表中序列2的核苷酸序列。所述探針具有序列表中序列3的核苷酸序列。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的方法。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的方法，是以線(xiàn)蟲(chóng)樣品的基因組DNA為模板，用上述檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)。
所述線(xiàn)蟲(chóng)樣品可為同一種線(xiàn)蟲(chóng)的純樣品或多種線(xiàn)蟲(chóng)的混合樣品，其蟲(chóng)態(tài)可為幼蟲(chóng)和/或成蟲(chóng)和/或卵等蟲(chóng)態(tài)。
上述方法中，如從擴(kuò)增產(chǎn)物中可檢測(cè)到熒光信號(hào)，說(shuō)明所述檢測(cè)樣品為松材線(xiàn)蟲(chóng)或含有松材線(xiàn)蟲(chóng)，而且可根據(jù)Ct(循環(huán)域值)的大小確定樣品中的起始模板的量。
所述線(xiàn)蟲(chóng)樣品經(jīng)提取液和蛋白酶K處理、離心，取上清，即得到所述線(xiàn)蟲(chóng)樣品的基因組DNA；所述提取液為25mM Tris-HCl，125mM KCl，0.3mM Mg2+，0.25mMDTT，1.2％Tween-20，pH9-10。
所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系除含有所述線(xiàn)蟲(chóng)樣品的基因組DNA外，還含有PCR預(yù)混液2.5-3.5mM Mg2+，0.2-0.3mM dNTP，檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正、反向引物各300-500nM，探針150-250nM，Taq DNA聚合酶3-3.5U/50μL；所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)橄?5℃預(yù)變性3min，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95℃變性45sec、55-61℃延伸15sec。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的試劑盒包括上述檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的引物和探針。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的試劑盒還包括線(xiàn)蟲(chóng)樣品提取液，PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶。
所述線(xiàn)蟲(chóng)樣品提取液可為25mM Tris-HCl，125mM KCl，0.3mM Mg2+，0.25mMDTT，1.2％Tween-20，pH9-10。
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有松材線(xiàn)蟲(chóng)的檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的缺點(diǎn)，提供了一種能快速、簡(jiǎn)易和準(zhǔn)確地檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的方法和試劑盒。本發(fā)明的方法及其專(zhuān)用引物和試劑盒對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)具有很強(qiáng)的專(zhuān)化性，并通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，不僅能大幅度提高松材線(xiàn)蟲(chóng)檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性，此外，還能對(duì)受檢樣品進(jìn)行定量分析。應(yīng)用本發(fā)明所提供的松材線(xiàn)蟲(chóng)檢測(cè)試劑盒，普通操作人人員(而非松材線(xiàn)蟲(chóng)專(zhuān)家)就能快速準(zhǔn)確地對(duì)該種線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)A.快速簡(jiǎn)單只需少量的蟲(chóng)體DNA，用熒光PCR儀僅需30分鐘即可得出檢驗(yàn)結(jié)果，避免了普通分子檢測(cè)技術(shù)中的電泳、酶切等處理工序；B.靈敏度高由熒光PCR儀自動(dòng)收集熒光信號(hào)，避免常規(guī)PCR終點(diǎn)分析法中的人為因素干擾，進(jìn)一步提高靈敏度，探針靈敏度可達(dá)到8pg DNA；C.特異性強(qiáng)采用一對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的特異引物進(jìn)行目標(biāo)基因片段的擴(kuò)增及一條可與模板(松材線(xiàn)蟲(chóng)的基因組DNA)互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針進(jìn)行檢測(cè)，提高了特異性，有效地避免假陽(yáng)性和假陰性；D.干擾性污染低采用全封閉反應(yīng)體系，在線(xiàn)式實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)，PCR產(chǎn)物不用進(jìn)行凝膠電泳，可有效地防止PCR產(chǎn)物的污染。E.應(yīng)用本發(fā)明的方法不僅能檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)成蟲(chóng)，還能檢測(cè)其幼蟲(chóng)，解決了單純依靠形態(tài)難以對(duì)幼蟲(chóng)進(jìn)行鑒定的問(wèn)題，且檢測(cè)工作不一定需要專(zhuān)家的介入，普通人員即可完成。本發(fā)明的方法也為其它檢疫性線(xiàn)蟲(chóng)的檢測(cè)提供了新思路。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的專(zhuān)用引物和探針的設(shè)計(jì)具體過(guò)程包括以下步驟1、松材線(xiàn)蟲(chóng)的分離將來(lái)自日本、德國(guó)、意大利、美國(guó)及中國(guó)江蘇、山東、浙江、安徽、廣東的不同種群的松材線(xiàn)蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)及其相關(guān)種用貝曼漏斗法進(jìn)行分離。具體步驟為1)將受害的松樹(shù)切成小段，用8層紗布包起，放入帶有膠管的漏斗中，向漏斗中加入無(wú)菌水，靜置12-24h，收集線(xiàn)蟲(chóng)；2)加入200mL濃度為3mg/100ml的四環(huán)素鹽和0.5g/100ml的硫酸鏈霉素對(duì)其進(jìn)行消毒，再將線(xiàn)蟲(chóng)懸液置于離心管中，2000rpm離心3min，棄上清，然后加入0.9％NaCl溶液，2000rpm離心3min，棄上清，最后用無(wú)菌水再將線(xiàn)蟲(chóng)離心洗滌3次。最后，在倒置顯微鏡下挑取線(xiàn)蟲(chóng)，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、松材線(xiàn)蟲(chóng)基因組DNA的提取挑取步驟1中的單條線(xiàn)蟲(chóng)，切成2-3段，加入線(xiàn)蟲(chóng)提取液(含125mM KCl，25mMTris-Cl，0.3mM Mg2+，0.25mM DTT，1.2％Tween-20)及蛋白酶K(24μg/mL)(Merck)，提取松材線(xiàn)蟲(chóng)基因組DNA。
3、PCR擴(kuò)增松材線(xiàn)蟲(chóng)核糖體ITS區(qū)的DNA片段選用ITS區(qū)的通用引物，引物1(上游引物)5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’引物2(下游引物)5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’以步驟2提取的線(xiàn)蟲(chóng)基因組DNA為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增松材線(xiàn)蟲(chóng)核糖體ITS區(qū)的DNA片段(約900bp)，50μL PCR反應(yīng)體系為5μL10×PCR反應(yīng)緩沖液，4μL MgCl2(25mM)，4μL dNTP(2.5mM)，引物1和引物2(10μM)各4μL，0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，2μL模板DNA(終濃度約0.2ng/μL)，最后用雙蒸水補(bǔ)充到50μL；PCR反應(yīng)條件為先94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35次；再72℃保溫10min。
4、所收集線(xiàn)蟲(chóng)核糖體ITS區(qū)的克隆及測(cè)序具體步驟為1)將步驟3的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，用DNA回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN公司)回收該長(zhǎng)度約900bp的DNA片段；2)將回收的DNA片段與載體pMD 18-T(Takara)制備重組載體ITS/pMD 18-T；3)將重組載體ITS/pMD18-T用CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，將重組菌涂20mg/mlX-gal和0.8M IPTG的LB抗性平板上，37℃培養(yǎng)12-24h進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；4)挑取白色單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12-24h后，質(zhì)粒直接送公司進(jìn)行測(cè)序(上海基康)。
5、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的專(zhuān)用引物和探針的設(shè)計(jì)與篩選用Clustalx1.8.1軟件對(duì)上述步驟4中的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，再根據(jù)引物和探針設(shè)計(jì)的一般原則，用primer express軟件設(shè)計(jì)探針及引物，通過(guò)篩選最終確定一對(duì)引物及一條探針。其中上游引物(正向引物)結(jié)合位點(diǎn)在松材線(xiàn)蟲(chóng)ITS1區(qū)30-60bp之間，其序列為5’-GATGATGCGATTGGTGACT-3’(序列1)，引物長(zhǎng)度19nt；下游引物(反向引物)結(jié)合位點(diǎn)在ITS1區(qū)70-100bp之間，其序列為5’-AACGACGCGAATCGAACC-3’(序列2)，引物長(zhǎng)度18nt；確定的探針序列為5’FAM-CGGTTGCCGCGCATGATGG-TAMRA 3’(序列3)，探針長(zhǎng)度為19nt。
實(shí)施例2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化以實(shí)施例1中步驟2獲得的松材線(xiàn)蟲(chóng)基因組DNA為模板，分別對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系中的鎂離子濃度、dNTP濃度、Taq DNA聚合酶濃度、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的引物和探針的濃度及熒光定量PCR循環(huán)條件中的延伸溫度進(jìn)行優(yōu)化，具體步驟如下一、鎂離子濃度的優(yōu)化按如下實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對(duì)鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，50μL反應(yīng)體系為5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液、鎂離子(25mM)(選擇體積分別為2、3、4、5、6、7、8、9μL)、4μL dNTP(2.5mM)、4μL檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正向引物(序列1)(10μM)、4μL檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的反向引物(序列2)(10μM)、2μL探針(序列3)(10μM)、0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2μL模板DNA(終濃度約0.2ng/μL)，最后用雙蒸水補(bǔ)充到50μL；反應(yīng)條件為第一階段95℃3min；第二階段95℃45s，60℃15s，40次循環(huán)。結(jié)果表明鎂離子最佳終濃度為3mM。
二、Taq DNA聚合酶濃度的優(yōu)化按如下實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對(duì)Taq DNA聚合酶濃度進(jìn)行優(yōu)化，50μL反應(yīng)體系為5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液、4μL MgCl2(25mM)、4μL dNTP(2.5mM)、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各4μL(10μM)、2μL探針(序列3)(10μM)、2μL模板DNA(終濃度約0.2ng/μL)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)(選擇體積分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μL)，最后用雙蒸水補(bǔ)充到50μL；反應(yīng)條件為第一階段95℃3min；第二階段95℃45s，60℃15s，40次循環(huán)。結(jié)果表明Taq DNA聚合酶最佳濃度為3U/50μL。
三、dNTP濃度的優(yōu)化按如下實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對(duì)dNTP濃度進(jìn)行優(yōu)化，50μL反應(yīng)體系為5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液、4μL MgCl2(25mM)、dNTP(2.5mM)(選擇加入體積分別為0.4、1、2、4、6、8、10μL)、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各4μL(10μM)、2μL探針(序列3)(10μM)、2μL模板DNA(終濃度約0.2ng/μL)、0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，最后用雙蒸水補(bǔ)充到50μL；反應(yīng)條件為第一階段95℃3min；第二階段95℃45s，60℃15s，40次循環(huán)。結(jié)果表明dNTP最佳濃度為0.2mM。
四、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的引物濃度的優(yōu)化按如下實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，50μL反應(yīng)體系為5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液、4μL MgCl2(25mM)、4μL dNTP(2.5mM)、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正向引物(序列1)(10μM)、反向引物(序列2)(10μM)(加入體積分別為0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4μL)、2μL探針(序列3)(10μM)、0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2μL模板DNA(終濃度約0.2ng/μL)，最后用雙蒸水補(bǔ)充到50μL；反應(yīng)條件為第一階段95℃3min；第二階段95℃45s，60℃15s，40次循環(huán)。結(jié)果表明正向、反向引物的最佳濃度為400nM。
五、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的探針濃度的優(yōu)化按如下實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對(duì)探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，50μL反應(yīng)體系為5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液、4μL MgCl2(25mM)、4μL dNTP(2.5mM)、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各4μL(10μM)、0.4μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，探針(序列3)(10μM)(體積分別為0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2μL)、2μL模板DNA(終濃度約0.2ng/μL)，最后用雙蒸水補(bǔ)充到50μL；反應(yīng)條件為第一階段95℃3min；第二階段95℃45s，60℃15s，40次循環(huán)。結(jié)果表明探針最佳濃度為200nM。
六、實(shí)時(shí)熒光定量PCR循環(huán)條件中延伸溫度的優(yōu)化按如下實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR循環(huán)條件中延伸溫度進(jìn)行優(yōu)化，50μL反應(yīng)體系為5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液、4μL MgCl2(25mM)、4μL dNTP(2.5mM)、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各4μL(10μM)、2μL探針(序列3)(10μM)、0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2μL模板DNA(終濃度約0.2ng/μL)，最后用雙蒸水補(bǔ)充到50μL；反應(yīng)條件為第一階段95℃3min，第二階段95℃45s，延伸15s，40次循環(huán)，延伸溫度分別是55℃，58℃，60℃，61℃，62℃，63℃。結(jié)果表明循環(huán)條件中最佳延伸溫度為60℃。
其中，優(yōu)選的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系為3mM Mg2+，0.2mM dNTP，檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各400nM，檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的探針(序列3)200nM，Taq DNA聚合酶3U/50μL，延伸溫度60℃。
實(shí)施例3、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的探針的靈敏度檢測(cè)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定實(shí)施例1中提取的松材線(xiàn)蟲(chóng)基因組DNA的濃度，并將其稀釋為50μL中分別含有800pg、80pg、8pg、0.8pg、0.08pg、0.008pg及0.0008pg核酸，以上述7個(gè)不同濃度的松材線(xiàn)蟲(chóng)基因組DNA為模板，用實(shí)施例2優(yōu)選的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系檢測(cè)探針的靈敏度，反應(yīng)條件為第一階段95℃3min，第二階段95℃45s，60℃15s，40次循環(huán)。結(jié)果表明該探針可檢測(cè)到的最小DNA含量為8pg。
實(shí)施例4、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的專(zhuān)化性實(shí)驗(yàn)分別來(lái)自日本、德國(guó)、意大利、美國(guó)及中國(guó)江蘇、山東、浙江、安徽、廣州等地不同種群的松材線(xiàn)蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)、擬松材線(xiàn)蟲(chóng)(B.mucronatus)、B.fraudulentus、B.tusciae，及其模式種Caenorhabditis elegans共17個(gè)，其中松材線(xiàn)蟲(chóng)8個(gè)不同種群，擬松材線(xiàn)蟲(chóng)6個(gè)不同種群，B.fraudulentus、B.tusciae各1個(gè)，模式線(xiàn)蟲(chóng)1個(gè)。
按如下實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR循環(huán)條件中延伸溫度進(jìn)行優(yōu)化，50μL反應(yīng)體系為5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液、3mM Mg2+、0.2mM dNTP、2μL模板DNA(終濃度約0.2ng/μL)、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正向引物(序列1)、反向引物(序列2)各400nM、檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的探針(序列3)200nM、Taq DNA聚合酶3U/50μL；反應(yīng)條件為第一階段95℃3min；第二階段95℃45s，延伸15s，40次循環(huán)，延伸溫度為60℃。8個(gè)松材線(xiàn)蟲(chóng)種群都能檢測(cè)出來(lái)，而其他線(xiàn)蟲(chóng)沒(méi)有信號(hào)。
序列表<160>3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gatgatgcga ttggtgact 19<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aacgacgcga atcgaacc 18<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cggttgccgc gcatgatgg 19
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的專(zhuān)用引物及探針，所述專(zhuān)用引物由正向引物和反向引物組成，正向引物是3’末端序列為3’-TCAGT的16-30個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列，反向引物是3’末端序列為3’-CCAAG的16-30個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列；所述探針是3’末端序列為3’-GGTAGTACGCGCC的16-25個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專(zhuān)用引物及探針，其特征在于所述探針的3’端標(biāo)記有一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，5’端標(biāo)記有一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的專(zhuān)用引物及探針，其特征在于所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列；所述探針具有序列表中序列3的核苷酸序列。
4.一種利用權(quán)利要求1或2或3所述的引物及探針檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的方法，是以線(xiàn)蟲(chóng)樣品的基因組DNA為模板，用所述檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述線(xiàn)蟲(chóng)樣品為同一種線(xiàn)蟲(chóng)的純樣品或多種線(xiàn)蟲(chóng)的混合樣品，其蟲(chóng)態(tài)為成蟲(chóng)和/或卵和/或幼蟲(chóng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述線(xiàn)蟲(chóng)樣品經(jīng)提取液和蛋白酶K處理、離心，取上清，即得到所述線(xiàn)蟲(chóng)樣品的基因組DNA；所述提取液為25mMTris-HCl，125mM KCl，0.3mM Mg2+，0.25mM DTT，1.2％Tween-20，pH 9-10。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系除含有所述線(xiàn)蟲(chóng)樣品的基因組DNA外，還含有PCR預(yù)混液2.5-3.5mM Mg2+，0.2-0.3mM dNTP，Taq DNA聚合酶3-3.5U/50μL，檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的正、反向引物各300-500nM，檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的探針150-250nM。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)橄?5℃預(yù)變性3min，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95℃變性45sec、55-61℃延伸15sec。
9.一種檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的試劑盒，它包括權(quán)利要求1或2或3所述的專(zhuān)用引物及探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括線(xiàn)蟲(chóng)樣品提取液，PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的方法及其專(zhuān)用引物和探針，其目的是提供一種檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的方法及其專(zhuān)用引物和探針與包括該引物和探針的檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的試劑盒。該專(zhuān)用引物由正向引物和反向引物組成，正向引物是3’末端序列為3’－TCAGT的16－30個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列，反向引物是3’末端序列為3’－CCAAG的16－30個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列；該探針是3’末端序列為3’－GGTAGTACGCGCC的16－25個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列。用本發(fā)明的方法檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)具有快速簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、干擾性污染低的優(yōu)點(diǎn)，不僅可檢測(cè)同一種線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)的純樣品或多種線(xiàn)蟲(chóng)的混合樣品，還可檢測(cè)成蟲(chóng)等不同蟲(chóng)態(tài)的樣品。
文檔編號(hào)G01N21/76GK1614396SQ200410098620
公開(kāi)日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2004年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日
發(fā)明者劉杏忠, 曹愛(ài)新, 朱水芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所