專利名稱：檢測生物聚合物的方法；生物芯片；固定抗體的方法；以及在其上固定抗體的基質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了檢測生物聚合物如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白質(zhì)的方法；以及使用這些方法的生物芯片。此外，本發(fā)明涉及固定抗體的方法，以及其上固定抗體的基質(zhì)。
背景技術(shù)：
通過使用微點(diǎn)陣(microarray)檢測生物聚合物(在下文中以DNA作為例子)的技術(shù)是公知的，例如在未審的公開的日本專利申請No.(JP-A)2000-131237中所描述的那種技術(shù)。這些類型的DNA微點(diǎn)陣通常按如下所述來形成和用于檢測DNA將含有與靶mRNA(或cDNA)互補(bǔ)的序列的DNA探針的陣列(arrays)點(diǎn)樣(spot)并隨后固定在玻璃(或塑料)基質(zhì)(substrate)上。使該基質(zhì)與溶液中的一組熒光標(biāo)記的靶mRNA(或cDNA)接觸。此時，互補(bǔ)探針與靶mRNA(或cDNA)雜交并結(jié)合形成復(fù)合物。其序列不與探針互補(bǔ)的那些靶不發(fā)生雜交。當(dāng)已充分進(jìn)行雜交時，用緩沖液清洗基質(zhì)的表面，洗掉任何未結(jié)合的靶分子。
靶mRNA(或cDNA)的存在或不存在，以及它們的量，可以從雜交所處的樣斑處的熒光強(qiáng)度來光學(xué)測定。這樣的光學(xué)測定方法已是很成熟的，并在JP-A2000-235035中詳細(xì)描述了一個這樣的例子。
傳統(tǒng)的DNA微點(diǎn)陣方案的使用，例如以上所描述的那一方案未能提供滿意的結(jié)果。每種方案中的每一步驟都造成許多問題，包括數(shù)據(jù)的精確性、再現(xiàn)性(reproducibility)、可重復(fù)性(repeatability)和靈敏性，這妨礙了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。除了靶cDNA選擇中的困難即疾病內(nèi)容序列選擇(diseasecontents sequence selection)的困難外，這些問題阻礙了DNA微點(diǎn)陣技術(shù)成功進(jìn)入臨床應(yīng)用。
在解決上述問題中，根本的是改善S/N比率、檢測靈敏度、檢測時間、數(shù)據(jù)精確度，以及再現(xiàn)性。
發(fā)明概述本發(fā)明意在解決上述問題。具體地，本發(fā)明的一個目的是提供一種基于抗原-抗體相互作用和珠技術(shù)的檢測生物聚合物的方法，以改善S/N比率和檢測靈敏度，以及縮短檢測時間。本發(fā)明的另一個目的是提供用于所發(fā)明的方法中的生物芯片。


圖1是本發(fā)明檢測生物聚合物的方法實(shí)例的原理的示意圖。
圖2是本發(fā)明中檢測生物聚合物的方法實(shí)例的原理的第二示意圖。
圖3是本發(fā)明中檢測生物聚合物的方法實(shí)例的原理的第三示意圖。
圖4是本發(fā)明的另一個實(shí)施例的、固定抗體分子的方法的原理的示意圖。
圖5是說明抗體分子是如何被固定到聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)上的示意圖。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，組合了珠和DNA微點(diǎn)陣技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。珠比平板提供了更大的表面積(每體積)，因此允許結(jié)合更多的探針DNA。另外，增加了探針DNA與靶分子之間的碰撞頻率，這是由于與平板相比在溶液中的珠具有增大了的移動性。因此，溶液中的靶DNA捕獲的靈敏性提高了。
作為缺點(diǎn)，需要鑒別在其上結(jié)合了探針DNA的個別珠。已試用各種技術(shù)，如使用彩色珠和兩色光源，來解決此問題。然而，能成功鑒別的珠的數(shù)目仍然較小，設(shè)備變得更復(fù)雜、更昂貴、更大和更難以操作。本發(fā)明通過利用在固定在珠上的肽抗原與固定在陣列中的抗體(反之亦然)之間發(fā)生的抗原-抗體相互作用提供了這些問題的完美的解決方案。
以下參照圖1至3詳細(xì)地描述本發(fā)明。圖1至3是說明本發(fā)明的檢測生物聚合物的方法的示意圖。請注意，在這里這些解釋針對DNA生物聚合物。
如圖1中所示，探針DNA(2)被固定到珠(1)的表面。所述珠可以是，例如，磁性的、金屬的、和/或塑料的。地址接頭(address linker)(3)被連結(jié)到珠(1)的表面上以能實(shí)現(xiàn)珠的鑒別信息(ID)的識別。地址接頭(3)可以是抗原或(單克隆或多克隆)抗體。熒光標(biāo)記(5)用于標(biāo)記靶(4)，靶(4)可以是RNA、cDNA、或蛋白質(zhì)(在下文中這些以“RNA”代表)。
珠(1)和靶RNA(4)如上所述制備，根據(jù)需要通過物理或電的方法混合在容器(7)中的緩沖液(6)中。結(jié)果，靶RNA(4)結(jié)合到通過互補(bǔ)堿基配對固定在珠(1)表面的探針DNA(2)上。
然后將攜帶著前述復(fù)合物的珠與圖2中所示生物芯片基質(zhì)(10)上部位(11)的陣列一起保溫。圖2A和圖2B分別顯示生物芯片的側(cè)視圖和平面圖。
地址探針蛋白(12)，如抗原或抗體，被預(yù)固定到部位(11)上以通過抗原-抗體相互作用來捕獲固定在珠(1)表面的ID-識別型地址接頭(3)。請注意，圖3是在圖2中圈出的區(qū)域A的放大圖。
地址接頭(3)通過抗原-抗體相互作用結(jié)合到地址探針蛋白(12)上。熒光標(biāo)記(5)可用于鑒別探針部位(11)中的哪個地址探針蛋白(12)已結(jié)合到珠(1)上。使用熒光讀出器(未示出)可以容易地檢測熒光標(biāo)記。
因此，可以有效地測定靶RNA(4)的存在和量。
例如，除了多克隆抗體，地址探針肽或生物聚合物也可以用做地址接頭。在這種情況下，一種地址探針肽、生物聚合物或多克隆抗體被固定到基質(zhì)上，其每一種都與一種特異性地址接頭具有抗原-抗體關(guān)系。
本發(fā)明包括下列優(yōu)點(diǎn)(1)可以固定大量的探針DNA，因?yàn)橹榫哂邢喈?dāng)大的表面積與體積的比率。因此，可以以非常高的靈敏度捕獲溶液中的痕量的靶聚合物。
(2)每個珠上增加了量的探針DNA可與更多靶DNA雜交，從而可提高S/N比率。
(3)由于珠的移動性，探針DNA和靶DNA相互間的碰撞機(jī)會增加了。因此，縮短了檢測時間(主要是雜交所需要的時間)，并且靶DNA與探針DNA之間的雜交會非常靈敏。
下列具體實(shí)施方案描述了固定抗體的方法，以及在其上固定抗體的基質(zhì)，其中這些方法可以用于以上所述的檢測生物聚合物的方法，并可用于應(yīng)用這些檢測方法的生物芯片。
如上述實(shí)施例所說明的，抗體結(jié)合分子可特異性地結(jié)合到特異性抗原分子上。這些抗體通常在被固定到不溶性基質(zhì)如塑料或金屬(相當(dāng)于上述實(shí)施例的基質(zhì))之后被使用。大多數(shù)這些不溶性物質(zhì)非特異性地吸附生物聚合物。
將抗體分子固定到不溶性物質(zhì)上的一種方法是通過利用被固定到該不溶性物質(zhì)上的抗體結(jié)合分子。在這種情況下，通過共價鍵或通過非共價鍵如靜電相互作用將抗體結(jié)合分子固定到不溶性物質(zhì)上。例如，在JP-A2001-147229中描述了這種方法。
然而，傳統(tǒng)方法具有以下缺點(diǎn)(1)由于不溶性物質(zhì)非特異性地吸附生物聚合物，可能會妨礙免疫測定、分級分離和純化。
(2)由于不溶性物質(zhì)和抗體結(jié)合分子之間的第二(非特異性的)相互作用，分子會失去抗體結(jié)合能力；當(dāng)抗體結(jié)合分子被放置得與不溶性物質(zhì)極其近時就會發(fā)生所述的第二(非特異性的)相互作用。
下列實(shí)施例通過使用含有酰胺基團(tuán)的凝膠來防止抗體結(jié)合分子的非特異性吸附，以及通過將抗體結(jié)合分子包埋到該含有酰胺基團(tuán)的凝膠中來防止抗體結(jié)合活性的退化，解決了這些問題。這樣，在本發(fā)明中，抗體分子被固定到含有酰胺基團(tuán)的凝膠上或固定到在不溶性物質(zhì)上的含有酰胺基團(tuán)的凝膠上。
在這一實(shí)施例中，本發(fā)明使用聚丙烯酰胺凝膠作為基質(zhì)材料。另外，以這樣的方式制備基質(zhì)以使得抗體結(jié)合分子被包埋到聚丙烯酰胺凝膠中，并且通過與該凝膠中的酰胺基團(tuán)載體的結(jié)合可以防止它們的抗體結(jié)合活性的退化。
本發(fā)明的這一實(shí)施例還包括下列特征由于抗體結(jié)合分子被包埋在聚丙烯酰胺凝膠中，它們的抗體結(jié)合活性不會因與載體的結(jié)合而退化。通過將抗體結(jié)合分子引入到凝膠中，這些分子保持在一種接近于溶液中的狀態(tài)，此狀態(tài)中它們是功能上活躍的。此外，通過包埋進(jìn)行的固定化不依賴于抗體結(jié)合分子的官能團(tuán)，而主要依賴于由被包埋物質(zhì)所形成的孔的大小。
如上所述制備的、包埋著抗體結(jié)合分子的聚丙烯酰胺凝膠可以直接地提供，或者用一不溶性物質(zhì)做背襯(back up)。通過將聚丙烯酰胺凝膠或支撐聚丙烯酰胺凝膠的不溶性物質(zhì)浸入在抗體溶液中來固定抗體分子。
以下參考圖4和圖5詳細(xì)地描述本發(fā)明。圖4是說明用于結(jié)合抗體分子的方法的原理的示意圖，圖5是說明抗體分子如何被固定到聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)上的示意圖。
結(jié)合抗體分子的過程描述如下如圖4(A)中所示，將含有酰胺基團(tuán)的單體(101)和抗體結(jié)合分子(102)混合在一起。將該混合物施加到基質(zhì)(103)(一種不溶性物質(zhì))的表面上，如圖4(B)中所示，然后進(jìn)行聚合反應(yīng)。不溶性聚合物復(fù)合物如金屬、塑料或玻璃用做基質(zhì)(103)。通過該聚合反應(yīng)，抗體結(jié)合分子(102)被捕獲于由含有酰胺基團(tuán)的凝膠(在下文中聚丙烯酰胺凝膠用做這樣的凝膠的例子)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)中(見圖4(C))。
當(dāng)固定抗體時，通過滴加方式施用包含抗體分子(104)的溶液，如圖4(D)中所示。抗體分子可以是單克隆或多克隆抗體?？贵w結(jié)合分子(102)被固定在聚丙烯酰胺凝膠中。抗體分子(104)在抗體結(jié)合分子(102)的特異性結(jié)合部位(105)的一點(diǎn)或多點(diǎn)處結(jié)合這個抗體結(jié)合分子(102)。如此來設(shè)置抗體結(jié)合分子(102)以使得其物理地包埋在聚丙烯酰胺的網(wǎng)格(cage)中。結(jié)果，抗體分子(104)的基部被固定到抗體結(jié)合分子(102)上，其抗原結(jié)合部位暴露并可接近抗原分子。
圖5是說明用于基于上述原理固定抗體分子的基質(zhì)的示意圖。此圖說明抗體分子(104)是如何通過包埋在聚丙烯酰胺凝膠(110)中的抗體結(jié)合分子(102)被固定到基質(zhì)上的。此圖也顯示了被許多不同抗體定位(addressed)的抗體結(jié)合分子(102)，所述抗體例如對抗抗原A和B的抗體。
在此圖中，物質(zhì)(120)是一種不溶性物質(zhì)，如玻璃。玻璃基質(zhì)(120)的表面用甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(methacryloxypropyltrimethoxysilane)130處理。通過聚合反應(yīng)將聚丙烯酰胺凝膠(110)施加到該表面，這有助于將聚丙烯酰胺凝膠(110)粘附到玻璃(120)上。
如圖4中所示，抗體結(jié)合分子(102)(一種生物聚合物或一種具有抗體結(jié)合活性的聚合物復(fù)合物，如蛋白G或其類似物)通過非共價鍵包埋在聚丙烯酰胺凝膠(110)中?？贵w分子(104)的基部結(jié)合于抗體結(jié)合分子(102)，如圖5中所示，使得其抗原識別部位(106)與溶液接觸(在圖中面朝上)。以此種方式，相應(yīng)的抗原結(jié)合到抗體分子(104)的抗原識別部位106。更具體地，對應(yīng)抗體A的抗原107a結(jié)合到抗體A的抗原識別部位106a，對應(yīng)于抗體B的抗原107b結(jié)合到抗體B的抗原識別部位106b。
含有酰胺基團(tuán)的物質(zhì)如聚丙烯酰胺凝膠(110)顯著地減小了非特異性吸附，并因此增大了抗原識別部位(106)向溶液的暴露。這兩個優(yōu)點(diǎn)進(jìn)一步提高了抗體-抗原相互作用的效率和特異性。
上述實(shí)施例說明了本發(fā)明的下列效果(1)因?yàn)?)抗體結(jié)合分子與含有酰胺基團(tuán)的凝膠相組合，和2)抗體結(jié)合分子捕獲抗體基部而不是抗體-抗原結(jié)合部分，和3)抗體上的抗體-抗原結(jié)合部分因此自由地與抗原結(jié)合，所以減少了非特異性結(jié)合并且改善了均一方向的排列。因此，改善了抗體-抗原結(jié)合特異性。
(2)因此，可以設(shè)計一種固定了抗體的基質(zhì)，其對于高靈敏的免疫測定或?qū)τ诜旨壏蛛x或?qū)τ诶每乖M(jìn)行的純化是有用的。
在此具體地描述的優(yōu)選實(shí)施例只是為了解釋和說明本發(fā)明，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例；更確切地說，在不背離本發(fā)明的思想和基本技術(shù)的情況下可以做出各種變化和改進(jìn)。下列實(shí)施例就包含了這樣的變化和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.通過將靶生物聚合物捕獲到基質(zhì)面(substrate side)來檢測生物聚合物的方法，該方法包括以下步驟a)添加熒光標(biāo)記的靶生物聚合物和珠，其中探針生物聚合物和特異于所述珠的ID的地址接頭被固定在溶液中所述珠的表面(該地址接頭可以是抗體、肽或其他生物聚合物)；b)使所述靶生物聚合物與所述探針生物聚合物雜交；和c)利用固定在基質(zhì)上并與所述地址接頭有抗原-抗體關(guān)系的地址探針肽、生物聚合物或抗體，通過抗原-抗體相互作用捕獲所述的地址接頭。
2.權(quán)利要求1的方法，其中緩沖溶液與靶生物聚合物和珠一起添加；并且所述溶液通過物理或電的方式攪拌。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述珠是一種磁性的、金屬的或塑料的珠。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶生物聚合物是RNA，cDNA，或蛋白。
5.一種生物芯片，其中1)地址探針肽、生物聚合物或抗體被固定在基質(zhì)上，所述地址探針肽，生物聚合物，或抗體均能夠通過抗原-抗體反應(yīng)來捕獲地址接頭，2)其中所述地址接頭用于珠的ID識別，并且是抗體、地址探針肽或生物聚合物，和3)其中所述地址接頭和通過雜交與靶生物聚合物相結(jié)合的探針聚合物一起被固定在所述珠的表面。
6.一種固定抗體的方法，該方法包括以下步驟1)將含有酰胺基團(tuán)的凝膠固定在由不溶性物質(zhì)組成的物質(zhì)上，所述凝膠中包埋了抗體結(jié)合分子；和2)將抗體分子的基部結(jié)合到抗體結(jié)合分子上。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體結(jié)合分子被非共價鍵地包埋在含有酰胺基團(tuán)的凝膠中，并且它是一種包含抗體結(jié)合活性的生物聚合物或聚合物化合物，例如蛋白G或該家族的一種蛋白。
8.權(quán)利要求6的方法，其中不溶性聚合物化合物如金屬、塑料或玻璃被用做所述的不溶性物質(zhì)。
9.權(quán)利要求6的方法，其中含有酰胺基團(tuán)的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述的抗體結(jié)合分子在抗體分子上的一個或多個部位與該抗體分子相結(jié)合。
11.一種基質(zhì)，其通過與抗體結(jié)合分子結(jié)合而固定了抗體，其中所述抗體結(jié)合分子通過非共價結(jié)合作用包埋在不溶性物質(zhì)上的含有酰胺基團(tuán)的凝膠中。
12.權(quán)利要求11的基質(zhì)，其中所述的抗體結(jié)合分子被非共價鍵地包埋在酰胺基團(tuán)中，它是一種含有抗體結(jié)合活性的生物聚合物或聚合物復(fù)合物，如蛋白G或該家族的一種蛋白。
13.權(quán)利要求11的基質(zhì)，其中一種不溶性聚合物化合物如金屬、塑料或玻璃用做不溶性物質(zhì)。
14.權(quán)利要求11的基質(zhì)，其中所述含有酰胺基團(tuán)的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠。
15.權(quán)利要求11的基質(zhì)，其中所述不溶性物質(zhì)的表面用甲基聚丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷處理，并且通過聚合將含有酰胺基團(tuán)的凝膠施加在該表面上。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述地址接頭通過權(quán)利要求6所述的方法固定在所述基質(zhì)上。
17.權(quán)利要求5的生物芯片，其中權(quán)利要求11所述的基質(zhì)用于固定所述地址探針肽、生物聚合物或多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于抗原－抗體相互作用的生物聚合物檢測方法，其中該方法顯示出提高了的S/N比率、提高了的檢測靈敏度和減少了的檢測時間。本發(fā)明還涉及這些方法在生物芯片上的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及抗體固定方法，其中抗體分子被固定到含有酰胺基團(tuán)的凝膠、或不溶性物質(zhì)上的含有酰胺基團(tuán)的凝膠上。使用這樣的凝膠防止了抗體結(jié)合分子的非特異性吸附。通過將這些抗體結(jié)合分子包埋在這樣的凝膠中，防止了它們的抗體結(jié)合活性的退化。通過將靶生物聚合物捕獲到基質(zhì)面來檢測生物聚合物的方法，包括以下步驟(1)將靶生物聚合物，連同探針生物聚合物和由抗體或地址探針肽或連結(jié)于它們的表面的生物聚合物地址接頭所識別的珠一起，置入溶液中；(2)使靶生物聚合物與探針生物聚合物雜交；以及(3)通過抗原－抗體相互作用、通過地址探針肽或生物聚合物或多克隆抗體分子來識別結(jié)合到基質(zhì)上的地址接頭。固定抗體的方法包括以下步驟(1)在二或三維空間中將用抗體結(jié)合分子包埋的含有酰胺基團(tuán)的凝膠施加在不溶性物質(zhì)的基質(zhì)上；和(2)將抗體分子的基部附著到抗體結(jié)合分子上。
文檔編號G01N33/543GK1629636SQ200410090010
公開日2005年6月22日 申請日期2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月6日
發(fā)明者嶋本伸雄, 須佐太樹, 福島和久 申請人:情報系統(tǒng)研究機(jī)構(gòu), 橫河電機(jī)株式會社