專利名稱：用于校正檢測器間頻帶增寬效應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于校正頻帶增寬效應(yīng)的方法，尤其涉及用于校正檢測器間頻帶增寬效應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
用液相色譜技術(shù)對溶液中的大分子物質(zhì)進(jìn)行分析，通常是通過在適當(dāng)?shù)娜軇┲兄苽錁悠?，然后將它的小等份注射進(jìn)入色譜儀來完成的。該色譜儀包括各種類型的分級器件，它們在樣品經(jīng)過它們時將其分離。一旦通過這些通常是基于尺寸、質(zhì)量或柱親和力的方法將樣品分離后，便用光散射、折光指數(shù)、紫外線(UV)、粘度響應(yīng)等方法對其進(jìn)行分析。例如，為了確定通過尺寸排阻色譜柱進(jìn)行分離的特定樣品的質(zhì)量和尺寸分布，色譜儀將先后用多角度光散射MALS和差動式折射計(differential refractometer)dRI測量樣品。dRI確定濃度，而MALS儀器測定超瑞利比(excess Rayleigh ratio)，將它作為每個洗脫級分的角度函數(shù)。對于比入射光波長小得多的分子，通常在一個單一的角度上進(jìn)行光散射測量就足夠了。
當(dāng)各個級分經(jīng)過檢測器時，便產(chǎn)生了通常稱之為“頻帶(band)”或者“波峰(peak)”的信號。由于擴(kuò)散和混合效應(yīng)，樣品每次穿過不同的器件時，這些頻帶便會增寬一些。考慮由單分散性蛋白的低濃度等分樣品。在這種情況下，瑞利逾量比與摩爾質(zhì)量和濃度成正比。光散射信號和濃度信號應(yīng)該具有相同的形狀，并且當(dāng)這兩種響應(yīng)被歸一化而具有相等面積時，它們將完全重疊。然而，當(dāng)樣品從MALS檢測器經(jīng)過而進(jìn)入dRI檢測器時，它要經(jīng)過中間區(qū)域和連接部位，這會導(dǎo)致樣品的擴(kuò)散和混合。由John Wiley & Sons于1979年出版的Yau等人所著的《Modern size exclusion liquid chromatography》一書中詳細(xì)討論了頻帶增寬的許多因素和一些與其有關(guān)的補(bǔ)救措施。在上述例子中，dRI信號與MALS信號相比，總是顯得略寬。
圖1清楚地顯示了增寬效應(yīng)，該圖表示了水緩沖液中的牛血清蛋白BSA樣品的色譜圖以及未校準(zhǔn)增寬效應(yīng)的計算出的摩爾質(zhì)量。跡線1示出沒有校準(zhǔn)的摩爾質(zhì)量。該摩爾質(zhì)量是用除以單體的摩爾質(zhì)量Mw0后的結(jié)果表示，因此對于單體，縱軸上的讀數(shù)為1，二聚體的讀數(shù)為2，等等。跡線2反映作為時間函數(shù)的90°光散射信號。跡線3反映dRI信號。聚集狀態(tài)已經(jīng)被分級，于是，最右邊從16分鐘到18分鐘的波峰區(qū)域是來自純單體的數(shù)據(jù)，從14分鐘到16分鐘的波峰區(qū)域來自二聚體，等等。在每個波峰中，增寬導(dǎo)致波峰中心處的濃度降低，而在“兩翼”處的濃度增高。將此變寬的dRI信號和MALS信號結(jié)合起來確定各個洗脫時間處的摩爾質(zhì)量，導(dǎo)致了在波峰中心附近確定的摩爾質(zhì)量被系統(tǒng)地高估，而兩翼處的卻被低估。當(dāng)濃度檢測器在MALS檢測器上游時，情況就反過來。假如沒有頻帶增寬，數(shù)據(jù)將由一系列平臺組成，對于單體來說是1，對于二聚體來說是2，等等。當(dāng)被分級的樣品變成更加多分散性時，頻帶增寬效應(yīng)變得不那么明顯(但是仍然存在)。對于被恰當(dāng)?shù)胤旨壍木哂须x散的聚集狀態(tài)的樣品，該問題是明顯的。在圖1中，單體的波峰被很好地分辨出來，所以增寬問題是最清楚的。聚集體逐漸變得不能很好地分辨出來，所以它們顯現(xiàn)出該問題的程度就輕些。
人們采用了各種方法來補(bǔ)償這些變形。大多數(shù)方法都是基于L.H.Tung在其1969年的論文中介紹的成果，該論文發(fā)表在《the Journal ofApplied Polymer Science》，第13卷，第775等頁。在前面提到的Yau等人的著作討論了一些校正頻帶增寬的方法。在整個色譜技術(shù)文獻(xiàn)中，許多論文都提出了實施這些校正的方法，即，將變寬的頻帶恢復(fù)到假如沒有增寬因素時它所具有的形狀。這些技術(shù)中的大多數(shù)在數(shù)值上是不穩(wěn)定的，可能導(dǎo)致實質(zhì)上不合理的結(jié)果，例如負(fù)的濃度，或者負(fù)的散射強(qiáng)度，因此很少被使用。通過MALS測量得到的蛋白質(zhì)特征表現(xiàn)為一個相當(dāng)重要的面積，然而即便在這里，由于存在與實施相關(guān)的困難，因此很少見到對頻帶增寬進(jìn)行校正。
頻帶增寬效應(yīng)出現(xiàn)在液相色譜的各種多檢測器操作中。例如，如果要使用在線粘度計測量樣品以獲得它的特性粘度，那么也需要使用dRI。當(dāng)樣品從dRI移動到粘度計時，便會出現(xiàn)頻帶增寬，這導(dǎo)致比粘度曲線相對于由dRI測量獲得的濃度曲線出現(xiàn)擴(kuò)展。另外，在將變寬的信號恢復(fù)為符合在沒有增寬的情況下它所具有的信號時，所存在的計算上的困難常常導(dǎo)致有問題的結(jié)果，特別是當(dāng)樣品確實是單分散性的，例如非聚集的蛋白質(zhì)時。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分析方法，通過該方法可以用軟件既容易又精確地校正頻帶增寬效應(yīng)。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是為這些校正提供一種新的方法，該方法與傳統(tǒng)方法的不同之處使其明顯區(qū)別于傳統(tǒng)方法。認(rèn)為本發(fā)明用于分析蛋白質(zhì)樣品的分離最為有效。該應(yīng)用的一個結(jié)果將是更精確地表征蛋白質(zhì)綴合物及其聚集態(tài)。本發(fā)明的進(jìn)一步應(yīng)用在于它能夠改進(jìn)特性粘度測量值的確定方法，這是通過校正樣品在經(jīng)過濃度檢測器和粘度計之間時發(fā)生的頻帶增寬效應(yīng)來實現(xiàn)的。本發(fā)明的一個重要應(yīng)用是它可以用于快速測定不分級樣品的第二維里系數(shù)，例如在美國專利第6,411,383號中以及Trainoff和Wyatt于2002年7月24日提交的、現(xiàn)在正處于公布階段的美國專利申請第10/205,637號中所討論的樣品。該方法的成功實施關(guān)鍵取決于能夠準(zhǔn)確地確定每個洗脫體積處濃度的平方。這要求對每個洗脫體積處的濃度進(jìn)行準(zhǔn)確測量。后面的測定一般是在不分級樣品上進(jìn)行的，該不分級樣品的檢測器響應(yīng)是一個單峰，它的質(zhì)量組成在所選擇的每個時間間隔都是相同的。當(dāng)它從一連串檢測器經(jīng)過時，這個單峰變寬，如果不對增寬效應(yīng)進(jìn)行校正，則在獲得的結(jié)果中出現(xiàn)了系統(tǒng)誤差。
本發(fā)明包括一種對在液相色譜儀的檢測器之間出現(xiàn)的頻帶增寬效應(yīng)進(jìn)行校正的方法。該方法擴(kuò)寬第一檢測器的頻帶使其與第二檢測器處變寬了的頻帶相一致，而不是將在第二檢測器處的頻帶恢復(fù)為第一檢測器處的形式來校正第二檢測器處所產(chǎn)生的頻帶增寬。由此獲得一種更簡單、更適用和更易實施的方法來校正所有檢測器處的頻帶增寬效應(yīng)。盡管這種方法在波峰部分重疊時會導(dǎo)致波峰的分離度下降，但是大多數(shù)應(yīng)用領(lǐng)域都是針對具有被很好地被分離和分辨的波峰的單分散性樣品。本發(fā)明還可應(yīng)用于任何數(shù)目的串連的檢測器。
還應(yīng)說明，本發(fā)明所披露的方法特別與本發(fā)明的受讓人和發(fā)明人的多個專利和專利申請相關(guān)，這些專利和專利申請包括Steven P.Treainoff和Philip J.Wyatt于2002年7月24日提交的美國專利申請第10/205,637號“Method for determining average solutionproperties of macromolecules by the injection methjod”。
Philip J.Wyatt于2002年6月25日獲得授權(quán)的美國專利第6,411,383，25號“Method for measuring the 2nd virial coefficient”。
Steven P.Trainoff于2001年1月30日獲得授權(quán)的美國專利第6,180,906號“Electrode design for electrical field flow fractionation”。
Steven P.Trainoff等人于2000年10月3日獲得授權(quán)的美國專利第6,128,080號“Extended range interferometric refractometer”。
Gary R Janik等人于1999年5月4日獲得授權(quán)的美國專利第5,900,152號“Apparatus to reduce inhomogeneities in optical flow cells”。
Gary R Janik等人于1997年10月14日獲得授權(quán)的美國專利第5,676,830號“Method and apparatus for reducing band broadening inchromatographic detectors”。
Philip J.Wyatt等人于1996年6月25日獲得授權(quán)的美國專利第5,530,540號“Light scattering measurement cell very small volumns”。
David W.Shortt于1996年6月18日獲得授權(quán)的美國專利第5,528,366號“Precision determination for molecularweights”。
Philip J.Wyatt于1994年4月19日獲得授權(quán)的美國專利第5,305,071號“Differential refractometer”。


圖1顯示了BSA樣品摩爾質(zhì)量的未經(jīng)校正的曲線，dRI檢測器在MALS檢測器下游。
圖2顯示了對注射量為5μl，溶于甲苯的200kD聚苯乙烯的90°光散射跡線進(jìn)行擬合的混雜增寬模型。
圖3顯示了用本發(fā)明的方法校正的圖1的數(shù)據(jù)。
圖4顯示了BSA樣品的特性粘度對洗脫體積的未經(jīng)校正的曲線，dRI檢測器在粘度計下游。
圖5顯示了用本發(fā)明的方法校正的圖4的數(shù)據(jù)。跡線11是校正后的特性粘度。
圖6顯示了BSA樣品摩爾質(zhì)量的未經(jīng)校正的曲線，其中紫外檢測器在MALS下游。
圖7顯示了用本發(fā)明的方法校正的圖6的數(shù)據(jù)。
具體實施例方式
溶液中的分子通常是用它們的重均摩爾質(zhì)量Mw、它們的均方半徑<rg2>和第二維里系數(shù)A2來表征。后者是分子與溶劑之間的相互作用的量度。對于不分級的溶液，這些性質(zhì)可以通過測量它們的光散射行為來確定，其中可以使用Bruno Zimm于1948年發(fā)表在《the Journal ofChemical Physics》，第16卷，第1093至1099頁的開創(chuàng)性論文中描述的方法。最近，在由Trainoff和Wyatt于2002年7月24日提交的處于公布階段的審理中的申請10/205,637中討論的方法代表著一種將取代更傳統(tǒng)的Zimm方法的先進(jìn)技術(shù)。
在某個角度和濃度范圍內(nèi)測量來自小體積溶液的散射光。由光散射測量得到的性質(zhì)的關(guān)系符合Zimm的下列公式R(θ)＝K≠MwcP(θ)[1-2A2MwcP(θ)]+O(c3)(1)其中，R(θ)是在(θ)方向上測到的每單位立體角的超瑞利比，定義為R(θ)＝[Is(θ)-Isolv(θ)]r2/I0V；Is(θ)是每單位立體角的由溶液散射的光強(qiáng)度；Isolv(θ)是每單位立體角的由溶劑散射的光強(qiáng)度；I0是入射光強(qiáng)度；r是該散射體積到檢測器的距離；V是由檢測器看到的被照射的體積；P(θ)是發(fā)生散射的分子的形狀因子，定義為P(θ)=limc→0R(θ)/R(0);]]>K≠=4π2(dn/dc)2no2/(Naλ04),]]>其中Na是阿伏加德羅常數(shù)，dn/dc是折光指數(shù)增量，no是溶劑折光指數(shù)，c是濃度，λ0是入射光在真空中的波長。設(shè)定入射的準(zhǔn)直光束相對于含有光散射檢測器的平面為垂直偏振。形狀因子與均方半徑<rg2>的關(guān)系滿足P(θ)=1-16π2no23λ02<rg2>sin2(θ/2)+O(sin4(θ)/2)---(2)]]>多角度光散射儀測量來自流體樣品的散射光的量，它是角度和時間的函數(shù)。對于小到可以與入射光的波長相比較的分子來說，光散射測量可以限制在一個單一的散射角，例如90°，原因在于測量不到散射光強(qiáng)度隨角度的變化，但是，在這種限度內(nèi)，可以測量摩爾質(zhì)量卻不能測量均方半徑。
當(dāng)該儀器被用來分析一個分離系統(tǒng)例如尺寸排阻色譜儀SEC的洗脫物時，樣品的組成和濃度隨時間變化。進(jìn)一步地，SEC柱通常稀釋該樣品的濃度，以致于等式(1)的右邊的第二和第三項與第一項相比可以忽略。這種情況在形式上表示為2A2cMw＜＜1(3)對于與光散射儀器聯(lián)合使用的色譜分離來說，通常設(shè)定上述條件，除非從先前的實驗已經(jīng)知道A2，在這種情況下該數(shù)值可以在式1中直接使用。另外，如果恰當(dāng)?shù)貙嵤┝朔蛛x，在每一個時間點該樣品的大小基本上是單分散性的，其質(zhì)量通常也是單分散性的。如果該樣品在質(zhì)量上也是單分散性的，我們可以進(jìn)一步簡化得到R(θ，t)＝K≠Mc(t)P(θ，t) (4)所以，光散射信號應(yīng)該與濃度信號成正比，摩爾質(zhì)量可以通過下述比例式計算M=1K≠c(t)limθ→0R(θ,t)----(5)]]>對于一個MALS系統(tǒng)的正確操作而言，一種普通的實驗是注射近單分散性的樣品使其通過分離柱，然后測量光散射和濃度信號，得到單分散性的波峰。假如進(jìn)行歸一化，則它們就應(yīng)該在所有的洗脫時間都精確地重疊，與等式(5)表達(dá)的常數(shù)對應(yīng)。然而，如果濃度檢測器在MALS檢測器的下游，兩種效應(yīng)將會改變波峰的形狀混合和擴(kuò)散。在這種情況下，波峰會變寬；波峰的中心變低，而“兩翼”增高。所以，當(dāng)計算式(5)中的比值時，不會得到常數(shù)，從波峰附近得到的摩爾質(zhì)量將被系統(tǒng)地高估，而在兩翼附近得到的摩爾質(zhì)量將被低估。當(dāng)濃度檢測器在MALS檢測器上游時，情況相反。
應(yīng)該指出，未經(jīng)分級而注射進(jìn)入色譜儀的樣品，常常被描述為流式注射，在它們從一個檢測器到達(dá)另一個檢測器的過程中，也發(fā)生帶的增寬。盡管期望每個連續(xù)的洗脫體積的摩爾質(zhì)量分布都保持固定，但是頻帶增寬效應(yīng)會影響從在所選擇的檢測器處發(fā)生增寬的下游獲得的各種重均性質(zhì)。所以，當(dāng)被注射的樣品經(jīng)過，例如，光散射檢測器和dRI濃度檢測器之間時，具有多分散性摩爾質(zhì)量分布的樣品波峰將會變寬。當(dāng)未分級的光散射信號與變寬的濃度檢測器信號結(jié)合時，在波峰的中心附近獲得的重均摩爾質(zhì)量的計算結(jié)果將偏大，而在兩翼獲得的對應(yīng)數(shù)值將偏小。這個結(jié)果和在分級樣品中看到的結(jié)果是完全一樣的。
樣品的混合主要取決于系統(tǒng)的幾何性質(zhì)管的長度和直徑、連接器的數(shù)目、表面的粗糙程度和機(jī)械缺陷導(dǎo)致的夾雜物的數(shù)目，以及測量池的幾何性質(zhì)?；旌闲?yīng)在一定限度內(nèi)基本上與樣品的組成無關(guān)，在該限度內(nèi)，體流體性質(zhì)例如粘度不隨樣品而發(fā)生明顯的變化。相反，擴(kuò)散明顯地取決于樣品的性質(zhì)。
估計樣品在兩個檢測器之間流動時擴(kuò)散和混合的相對重要性是具有指導(dǎo)意義的。對于均一的球體，Stokes-Einstein關(guān)系式DT=kBTcπηr----(6)]]>將擴(kuò)散常數(shù)DT和球體半徑r聯(lián)系在一起，其中kB是波耳茲曼常數(shù)，T是絕對溫度，η是溶劑粘度。
存在許多導(dǎo)致混合的因素，但是，為了估計范圍，考慮被充分混合的儲水器的簡單模型。假定光散射流動池是一個體積為V的混合室。用f表示流速，并假定進(jìn)入該室的樣品的濃度為ci(t)。從流動室流出的樣品的濃度用下式給出c′(t)＝[ci(t)-c(t)]/tf(7)其中tf＝V/f，是充滿該儲水器的時間。考慮到窄脈沖效應(yīng)，在該脈沖中有質(zhì)量為m0的樣品進(jìn)入流動池，結(jié)果即有ci(t)＝m0δ(t)。從該池流出的樣品的濃度則是c(t)=m0tfexp(-t/tf)θ(t)----(8)]]>其中，當(dāng)t＜0時，θ(t)＝0；t≥0時，θ(t)＝1。結(jié)合上下文來看，假定流動池的體積V＝80μl，該池的進(jìn)樣流速f＝1.0ml/min。增寬的指數(shù)時間常數(shù)tf＝4.8sec。假如流體通過內(nèi)直徑為0.25mm的毛細(xì)管流入和流出混合室，最初的局部濃度脈沖要在管長超過1.6m以上才會逐漸消失。當(dāng)然，當(dāng)樣品流經(jīng)光散射池時，它并沒有“充分混合”，但是這仍然能夠恰當(dāng)?shù)毓烙嫽旌系拈L度范圍。
接著，考慮小分子的擴(kuò)散效應(yīng)。平均來說，分子將擴(kuò)散一定距離<x>=2DTt----(9)]]>其中，DT是分子的平移擴(kuò)散常數(shù)，而t是時間。結(jié)合上下文，考慮蛋白質(zhì)牛血清蛋白，BSA，它的擴(kuò)散常數(shù)為7.7×10-7cm2/sec。濃度峰信號在4.8sec內(nèi)能擴(kuò)散多遠(yuǎn)呢？等式(9)指出，它將沿著管子擴(kuò)散僅僅27μm！所以，可得出結(jié)論，根本性的主要混合機(jī)理是非擴(kuò)散性的，因此它不依賴于分子的擴(kuò)散常數(shù)及其大小。檢測器間增寬的主要機(jī)理是混合，而與樣品無關(guān)。所以，如果能用一種參照樣品來表征系統(tǒng)的幾何增寬，由此獲得的增寬參數(shù)就能用來校正所有后續(xù)數(shù)據(jù)處理。
考慮檢測器間增寬的一種簡單線性模型。出于討論的目的，假定濃度檢測器位于MALS檢測器的下游。而且，假定滿足等式(3)，并已經(jīng)收集到一種單分散性的參照樣品的數(shù)據(jù)。所以，被測量的濃度是以在MALS檢測器中的濃度作為基礎(chǔ)，通過使用用參數(shù)表示的增寬函數(shù)B(α0，α1，...，αn，τ)進(jìn)行卷積積分獲得?？梢缘玫絚m(t)=∫-∞∞c(t-τ)B(α0,α1···,αn,τ)dτ,----(10)]]>其中，cm(t)是發(fā)生增寬后在下游檢測器處測量到的濃度，c(t)是樣品通過光散射檢測器時它的濃度。參數(shù)αn則視具體模型而定，包括增寬函數(shù)的寬度和檢測器間的滯留體積。增寬校正的目標(biāo)是找到這些參數(shù)的最佳擬合值。根據(jù)式(5)，可以得到cm(t)=1K≠M∫-∞∞R(0,t-τ)B(α0,α1,···,αn,τ)dτ----(11)]]>其中R(0,t)=limθ→0R(θ,t).]]>這里，已經(jīng)利用了這個事實波峰是單分散性的，以致于在該波峰的范圍內(nèi)摩爾質(zhì)量M不變，可挪到積分之外。為了確定最佳的擬合參數(shù)，計算在下游測到的濃度信號cm(t)和被增寬的上游光散射信號之間的χ2差，并在整個單分散性樣品的波峰內(nèi)對其積分χ(α0,α1,···,αn,τ)2=∫-∞∞(cm(t)-1K≠M∫-∞∞R(0,t-τ)B(α0,α1,···,αn,τ)dτ)2dt---(12)]]>然后可以用標(biāo)準(zhǔn)的非線性最小二乘方擬合程序包來尋找使χ2最小化的最佳擬合參數(shù)K≠M和αi。將這些最佳的參數(shù)表示為αi′。
在實踐中，可以在上述擬合中引入其他系統(tǒng)特定的參數(shù)。例如，在等式(12)中的超瑞利比被定義為帶有樣品的溶劑的瑞利比與純?nèi)軇┑娜鹄戎g的差值。純?nèi)軇┑娜鹄瓤梢宰鳛榭烧{(diào)整的擬合參數(shù)被引入，由此取代通過設(shè)定溶劑基線來手工地確定它。類似地，假如濃度檢測器有一個緩慢的漂移，那么該漂移的偏移量和斜率同樣可以引入該擬合中。重要的是，要注意到基本的一點是，在整個波峰范圍內(nèi)摩爾質(zhì)量是固定的，所以，等式(12)中的內(nèi)部積分∫-∞∞R(0,t-τ)B(α0,α1,···,αn,τ)dτ]]>只含有被測到的瑞利比和增寬函數(shù)。假如質(zhì)量不是固定的，就不可能唯一地確定最佳擬合參數(shù)αi′。
一旦確定了最佳擬合參數(shù)，在隨后的分析中有兩種方法可以使用?？梢栽噲D通過對式(10)進(jìn)行去卷積積分來“變窄”濃度測量，并且由此試圖回答這樣的問題假如濃度檢測器與光散射檢測器一致，那么該濃度檢測器測量到的是多少？作為選擇，可以人工地使光散射的結(jié)果變寬，從而回答概念上的問題假如光散射在下游與濃度檢測器一致地進(jìn)行，光散射的結(jié)果會是什么？我們將證明前一種方法，即構(gòu)成傳統(tǒng)途徑的方法，在數(shù)值上是不穩(wěn)定的，常常給出不合理的結(jié)果，而后一種方法在數(shù)值上是穩(wěn)定的，但是要以降低測量的分離度作為代價。既然增寬通常是一種小的校正，那么分離度的損失是次要的，后一種方法是優(yōu)選的。
考慮傳統(tǒng)的去卷積積分的方法。可以通過作傅立葉變換，由已知的cm(t)重新構(gòu)建c(t)c(t)=12π∫-∞∞e-iωc~m(ω)B~(α1′,···,αn′,ω)dω,----(13)]]>其中，c~m(ω)=12π∫-∞∞eiωtcm(t)dt---(14)]]>是被測量的濃度的傅立葉變換，B~(α1′,···,αn′,ω)]]>類似地是用上面發(fā)現(xiàn)的擬合參數(shù)評估的增寬核函的傅立葉變換。然后可以用式(5)計算作為時間函數(shù)的摩爾質(zhì)量。這個步驟的問題在于計算比值c~m(ω)/B~(α1′,···,αn′,ω).]]>當(dāng)ω→±∞時， 和B~(α1′,···,αn′,ω)]]>都趨向于零。所以，比值趨向于0/0，它是不定的。因為 含有實驗噪音，對于大的ω，比值將有更大的波動。所以，當(dāng)使用式(13)計算c(t)時，結(jié)果會含有更高頻噪音和不合理的“震蕩效應(yīng)(ringing)”，包括負(fù)的濃度。噪音可以被濾去，不合理的震蕩效應(yīng)卻不能被濾去。
第二種方法，即是本發(fā)明的主題，是增寬光散射波峰。
表示為M(t)=1K≠cm(t)limθ→0∫-∞∞R(θ,t-τ)B(α1′,···,αn′,τ)dτ,----(15)]]>這構(gòu)成了作為時間函數(shù)的摩爾質(zhì)量的測量，它對檢測器間的增寬作了校正。注意，等式(15)的右邊只含有可被測量的量和用前面確定的參數(shù)估算的增寬函數(shù)。增寬函數(shù)的模型上面描述的算法允許人們針對檢測器間頻帶增寬效應(yīng)校正光散射的結(jié)果，只要給出了參數(shù)化增寬核函模型。然而，為了應(yīng)用該算法，必須選擇要使用的模型。在這一部分，我們將描述一種具體的模型，它對于由美國加利福尼亞州Santa Barbara的懷雅特技術(shù)公司所構(gòu)建的DAWN儀器的MALS硬件來說工作良好。然而，重要的是，要注意到該算法同樣適用于任何確定的模型。
在懷雅特技術(shù)公司的Wyatt MALS儀器中使用的光散射池是一個直徑為1.25mm的圓筒，它通過直徑為0.1mm的毛細(xì)管以90度進(jìn)樣，通過直徑為0.2mm的毛細(xì)管排出液體。典型的流速是1ml/min的數(shù)量級?？梢酝ㄟ^計算雷諾數(shù)(Reynolds number)來確定流動是層流還是紊流，雷諾數(shù)Re＝vd/v，其中v是平均流動速率，d是系統(tǒng)的表征尺寸，v是樣品粘度。對于在入口毛細(xì)管中的流動，v＝127mm/sec，d＝0.1mm，v＝0.89cm2/sec，由此Re＝14。流體流動直到雷諾數(shù)達(dá)到幾百時才會變得不穩(wěn)定。因此，可斷定在入口毛細(xì)管中的流動是層流。接著，考慮流體進(jìn)入流動池時它的噴射。流動速率不變，但是表征尺寸增加到d＝1.25mm。所以，雷諾數(shù)增加到Re＝178。由此，可推斷在該池的進(jìn)入口附近有一些紊流混合，其混合體積為該池體積的一小部分。同樣地，在濃度檢測器流動池的進(jìn)入口處有一些混合。
還存在著一些儀器增寬，這是由于系統(tǒng)測量有限體積的流體，以及測量系統(tǒng)有某一固有的過濾時間常數(shù)。所以，我們將要考慮的模型是指數(shù)增寬與高斯項的卷積，前者代表在流動池中的混合，后者代表儀器的增寬。增寬核函的模型是B(δ,w,τ)=1δ2πe-r2/2δ2⊗1we-τ/wθ(τ),-----(16)]]>其中，δ是儀器的高斯寬度，w是由在池子的進(jìn)入口處的混合產(chǎn)生的增寬，卷積被定義為a(t)⊕b(t)≡∫-∞∞a(t-t′)b(t′)dt′----(17)]]>為了測試該模型是否恰當(dāng)，可進(jìn)行了下面的試驗。用溶于甲苯的200kD聚苯乙烯填充5μm的注射環(huán)，并將它直接注射到光散射流動池。流動速率是0.5ml/min，樣品的收集間隔是0.25sec。將數(shù)據(jù)建模成δ函數(shù)與增寬模型的卷積，該δ函數(shù)代表注射環(huán)。為了將其與90°光散射信號比較，計算χ2為 其中，t0是樣品從注射器流到流動池所需的時間，而a是將無量綱的單位轉(zhuǎn)換為瑞利比的標(biāo)度因子。有四個擬合參數(shù)a、t0、σ和w。
圖2顯示了擬合的結(jié)果。光散射數(shù)據(jù)點4被歸一化，所以波峰具有單位振幅。增寬函數(shù)的擬合結(jié)果是5。這僅僅包括在注射環(huán)和進(jìn)行測量的流動池中心之間發(fā)生的增寬。明顯地，增寬函數(shù)很好地對數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合。這個增寬模型將在下面描述的示例中被使用。將所述方法應(yīng)用于任意串列的檢測器在這一部分，將針對兩個或更多個串連連接的任意的檢測器，對該方法進(jìn)行推廣。定義在樣品順次流經(jīng)D1，到D2，...，到Dn時檢測器的響應(yīng)為Di(t)。一般來說，在樣品穿過該系統(tǒng)洗脫時，樣品波峰逐漸地變寬。對數(shù)據(jù)(D1(t)，D2(t)，...，Dn(t))所作的任何分析都要考慮到這種逐漸的變寬。如前所述，變寬上游的檢測器使其與具有最寬響應(yīng)的檢測器一致，在數(shù)值上更加穩(wěn)定。具有最寬響應(yīng)的檢測器通常會是這條鏈中的最后一個檢測器。然而，假如中間的某個檢測器具有大的儀器增寬，這些結(jié)果可以轉(zhuǎn)而以它作為參照。出于討論的目的，假定上游檢測器信號被變寬以配合Dn。
該步驟分為兩個階段。在第一階段，通過測量單分散性的樣品來確定增寬參數(shù)，該單分散性的樣品具有足夠低的濃度，以致于在沒有增寬時檢測器信號之間成正比。在實踐中，注射近單分散性的樣品讓其穿過色譜儀，并選擇單聚體子峰來確定增寬參數(shù)。對于從1到n-1的每個檢測器i，計算χi2(βi,τi,αij)=∫peak(Dn(t)-βi∫-∞∞Di(t-τ)B(αij,τ-τi)dτ)2dt,----(19)]]>其中χi2(βi，τi，αij)是第i個檢測器的χ2參數(shù)。參數(shù)βi是把檢測信號化為同樣標(biāo)度的比例因子，τi是與樣品從一個檢測器流到下一個檢測器所用的時間有關(guān)的檢測器間延遲，而αij是第i個檢測器的j個增寬參數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)的非線性最小二乘方擬合算法最小化χ2，由此確定最佳的擬合參數(shù)，βi′、τi′和αij′。能夠進(jìn)行這種擬合的軟件很容易在各種商業(yè)程序包中獲得。這些步驟和各種軟件方法中的一些已經(jīng)在Hiebert于1981年發(fā)表在《the ACM Transactions on Mathematical software》第7卷，第1-16頁的論文“An Evaluation of Mathematical Software That SolvesNonlinear Least Squares Problems”中被詳細(xì)地討論。
在第二階段，應(yīng)用在第一階段確定的增寬參數(shù)來校正所有后續(xù)數(shù)據(jù)處理。在這個階段，所有的上游檢測器信號都被變寬，就像它們重合于該鏈中最后一個檢測器似的。然后，可以將它們直接與最后一個檢測器Dn比較。被變寬的數(shù)據(jù)是Dib(t)=∫-∞∞Di(t-τ)B(α′ij,τ-τ′i)dτ----(20)]]>然后在數(shù)據(jù)組(D1b(t)，...，Dn-1b(t)，Dn(t))上繼續(xù)進(jìn)行原來的分析。
算法示例本部分將針對下面的儀器組合在樣品數(shù)據(jù)上說明該算法MALS+dRI、粘度計+dRI和UV+MALS。圖1顯示了來自注射進(jìn)入由日本ShowaDenko制造的Shodex OH pack KW蛋白分離柱的100μl BSA的數(shù)據(jù)。流動速率是0.5ml/min。被分級的樣品首先經(jīng)過光散射檢測器，然后經(jīng)過dRI檢測器。BSA樣品主要由單體組成，但是也有一定含量的聚集體，它們通過該柱被分離。在16min和18min之間的波峰主要由純單體組成。在14.4min和16min之間的波峰是純二聚體，隨后的波峰是更高的聚集體，它們的分離要差一些。橫軸是時間，單位是分鐘(min)。跡線1是算出的摩爾質(zhì)量Mw(t)除以單體的摩爾質(zhì)量Mw0的結(jié)果。所以，對于單體，縱軸上的讀數(shù)為1，二聚體的讀數(shù)為2，等等。跡線2是90°光散射信號，跡線3是折光指數(shù)信號。折光指數(shù)和光散射已經(jīng)被歸一化，因此它們的波峰具有同樣的最大高度。跡線2和3的縱軸標(biāo)度是任意的。
該算法的第一步是選擇增寬模型。對于圖1中的數(shù)據(jù)，使用了式(16)所描述的混雜模型。該算法的第二步是選擇一個用來確定擬合參數(shù)的單分散性的波峰。在16min和18min之間的單體峰被使用。當(dāng)計算式(19)中的χ2時，將有四個參數(shù)通過非線性最小二乘方擬合被確定。增加一個額外的參數(shù)來解釋在兩套數(shù)據(jù)之間可能存在的基線偏移。所以，被最小化的χ2是χ2(β,τ0,δ,w,x0)=∫peak(dRI(t)-β∫-∞∞LS(t-τ)B(δ,w,τ-τ0)dτ+x0)2dt---(21)]]>其中，LS(t)是作為時間函數(shù)的90°光散射信號，dRI(t)是作為時間函數(shù)的dRI數(shù)據(jù)。這個模型可以通過使用商業(yè)上的馬夸特(Marquart)非線性最小二乘方程序包最小化，例如在D.W.Marquart于1963年發(fā)表在《the Journal of the Society of Industrial and Applied Mathematics》第11卷，第431-441頁的論文“An algorithm for least squares estimationof nonlinear parameters”中描述的。注意，進(jìn)行式(20)所描述的增寬校正，并不需要β或者x0，所以它們沒有出現(xiàn)在下面的結(jié)果表格中，但是，為了確保正確地進(jìn)行非線性最小化，需要將它們引入。

可以這樣來解釋這些結(jié)果，注意到δ＜＜w，這意味著主導(dǎo)性的增寬效應(yīng)是混合，而非高斯擴(kuò)散或儀器增寬，正如被預(yù)料的那樣。參數(shù)τ0僅僅說明樣品在兩個儀器之間穿行需要21秒。結(jié)合上下文，式(20)還可以寫成LSb(t)=∫-∞∞LS(t-τ)B(δ′,w′,τ-t0′)dτ---(22)]]>圖3顯示了采用在上面第一步中得到的擬合參數(shù)，使用等式(22)算出的變寬的光散射信號7。使用跡線7代替最初的光散射數(shù)據(jù)，如前面一樣地繼續(xù)進(jìn)行光散射分析。結(jié)果如跡線6所示。有許多需要注意的特征。首先是跡線7現(xiàn)在和跡線2在單體峰處重疊。這說明模型是正確的，并且非線性最小化恰當(dāng)?shù)仄鸬搅俗饔?。觀察到的第二點是在14.5min和16min之間的二聚體峰現(xiàn)在也是一個平臺，正如所期望的。在13.5min和14.5min之間的三聚體峰也變得更平，但是由于它與鄰近的峰沒有被基線分離，所以結(jié)果不太清晰。接著可以看到，這些平臺現(xiàn)在彼此成整數(shù)倍關(guān)系。這是預(yù)料之中的，因為二聚體的摩爾質(zhì)量應(yīng)該正好是單體的摩爾質(zhì)量的兩倍。類似地，三聚體平臺現(xiàn)在是單體平臺的三倍。
圖4顯示了來自注射進(jìn)入Shodex OH pack KW蛋白分離柱的100μlBSA的數(shù)據(jù)。流動速率是0.5ml/min。被分級的樣品首先經(jīng)過一個在線橋式粘度計，然后經(jīng)過一個dRI檢測器。該粘度計測量比粘度，比粘度被定義為ηsp(t)＝η(t)/η0-1(23)其中，η(t)是流體樣品聯(lián)合物的粘度，而η0是純流體的粘度。dRI檢測器測量樣品的折光指數(shù)，如果已知樣品dn/dc，該折光指數(shù)可轉(zhuǎn)換為濃度。然后，可以計算出特性粘度ηint(t)=limc→0ηsp(t)/c(t)----(24)]]>假如濃度足夠低，那么特性粘度近似為ηint(t)≈ηsp(t)/c(t). (25)跡線9是比粘度，跡線10是dRI信號。跡線9和10已經(jīng)被歸一化，由此具有相同的最大高度。這兩條跡線的縱軸標(biāo)度是任意的。測量結(jié)果如跡線8所示，跡線8以ml/g為單位在縱軸上表示特性粘度。每個樣品峰范圍內(nèi)的特性粘度應(yīng)該是固定的。所看到的彎曲是由于檢測器間的增寬，但是，在這種情況中，粘度信號實際上要比dRI信號寬。這是因為與dRI相比，粘度計在大得多的流體體積范圍內(nèi)測量粘度。在這個實施例中，占主導(dǎo)地位的增寬是粘度計所固有的儀器增寬。事實上，樣品在兩個檢測器之間通過使得dRI信號變寬，這降低了峰寬的總體差別。可以和前面一樣地應(yīng)用本發(fā)明的這個方法，但是，在這種情況中，要將dRI信號變寬以配合粘度信號。該算法的第一步是選擇增寬模型。依然選用混雜高斯-混合模型。在該算法中的第二步是選擇一個用來確定擬合參數(shù)的單分散性的波峰。在15.2min和16.2min之間的單體峰被使用。如上所述，式(19)可以改寫成χ2(β,τ0,δ,w,x0)=∫peak(ηsp(t)-β∫-∞∞dRI(t-τ)B(δ,w,τ-τ0)dτ+x0)2dt----(26)]]>對于可調(diào)整的參數(shù)，通過最小化χ2來確定這些擬合參數(shù)。得到的擬合參數(shù)為

在這種情況中，參數(shù)w是9.04秒，該參數(shù)出現(xiàn)如此大的值不是因為檢測器間的混合，而是因為相對于dRI流動池的體積而言，粘度計毛細(xì)管具有一個巨大的內(nèi)部體積。高斯項是極小的，它再次說明擴(kuò)散是不重要的。通過將等式(20)改寫為下式，可以將dRI信號變寬，dRIb(t)=∫-∞∞dRI(t-τ)B(δ′,w′,τ-τ0′)dτ----(27)]]>可以用變寬的dRI信號繼續(xù)進(jìn)行分析。圖5的跡線12顯示了變寬的dRI信號，跡線11顯示了被校正的特性粘度信號?，F(xiàn)在這些結(jié)果由代表每個波峰的平臺組成。
如圖6所示，最后一個實施例由濃度為3.0mg/ml的BSA的100μl樣品所組成，該樣品依次由UV檢測器和MALS檢測器測量。在這種情況中，用14表示的LS信號明顯要比15表示的UV信號寬，從而得到了用13表示的彎曲的摩爾質(zhì)量跡線。對于這個實施例，將UV信號變寬以配合LS信號。等式(19)被改寫為χ2(β,τ0,δ,w,x0)=∫peak(LS(t)-β∫-∞∞UV(t-τ)B(δ,w,τ-τ0)dτ+x0)2dt,---(28)]]>
混雜混合和高斯模型再次被使用，在13.5min和15min之間單體峰被用來確定擬合參數(shù)。最小化χ2，得到這些擬合參數(shù)的值

同樣，增寬的主要因素是內(nèi)部混合?，F(xiàn)在將等式(20)改寫為下式，通過計算將UV數(shù)據(jù)變寬，如圖7中所示。
UVb(t)=∫-∞∞UV(t-τ)B(δ′,w′,τ-τ0′)dτ----(29)]]>變寬的UV信號如跡線17所示，摩爾質(zhì)量如跡線16所示。和前面兩種情況一樣，數(shù)據(jù)由平臺組成，檢測器間的增寬效應(yīng)明顯降低了。
本發(fā)明方法的上述示例僅僅說明了可以用本說明書所公開的發(fā)明方法實施和修正的頻帶增寬校正的一些可能類型。對于色譜技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，明顯的是，在本發(fā)明之前，頻帶增寬效應(yīng)嚴(yán)重阻礙著提高多檢測器使用時的測量精度。本發(fā)明的方法和各種變化都實現(xiàn)了明顯降低頻帶增寬效應(yīng)這一期望。
權(quán)利要求
1.一種確定增寬模型的最佳擬合參數(shù)的方法，該增寬模型用于對其中含有一個分離器件且該分離器件后有兩個或兩個以上檢測器的色譜分離中的頻帶增寬效應(yīng)進(jìn)行校正，所述方法包括以下步驟a)選擇一個含有一套可調(diào)參數(shù)的增寬模型；b)注射一種含有單分散性成分的樣品；c)從每個所述的檢測器收集對應(yīng)于所述單分散性成分的信號；d)利用變得最寬的檢測器信號的所述收集到的信號作為所述其他檢測器信號增寬的參照，形成χ2模型，該χ2模型將在所述單分散性成分的波峰上進(jìn)行最小化；最小化χ2模型，為每一個將被增寬的所述檢測器信號確定所述最佳擬合參數(shù)，由此使它們的增寬和歸一化的形狀最符合產(chǎn)生所述最寬暫時響應(yīng)的檢測器的形狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述χ2模型的最小化是通過使用非線性最小二乘方算法實現(xiàn)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述非線性最小二乘方算法屬于由馬夸特開發(fā)的類型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述被最小化的χ2模型是xi2(βi,τi,αij)=∫pcak(Dn(t)-βi∫-∞∞Di(t-τ)B(αij,τ-τi)dτ)2dt,]]>其中所述的最佳擬合參數(shù)是βi、αij和τi；作為時間的函數(shù)的i-檢測器的響應(yīng)表示為Di(t)；并且所述的模型是在所述波峰上進(jìn)行最小化的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述頻帶增寬是由稀釋引起的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述增寬是由混合引起的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述混合是由在檢測池和/或連接器內(nèi)的機(jī)械缺陷導(dǎo)致的夾雜物引起的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述增寬是由內(nèi)在的儀器效應(yīng)引起的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，所述內(nèi)在的儀器效應(yīng)是由電子濾波引起的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，所述內(nèi)在的儀器效應(yīng)是由每個檢測器所測量的樣品體積差別引起的。
11.一種獲得連續(xù)地經(jīng)過一組檢測器的樣品的選定物理性質(zhì)的方法，其在某些所述的檢測器表現(xiàn)出信號頻帶增寬時，采用由所述檢測器產(chǎn)生的響應(yīng)于所述流經(jīng)樣品的信號組合，所述方法包括以下步驟a)將參數(shù)化的增寬函數(shù)應(yīng)用于所述的檢測器組，由此獲得一組對應(yīng)的檢測器信號，所有這些檢測器信號都具有可比較的增寬；和b)在應(yīng)用了所述的增寬函數(shù)之后，利用所述的此時已變寬的檢測器信號來獲得被測樣品的選定物理性質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述參數(shù)化增寬函數(shù)的應(yīng)用由Dib(t)=∫-∞∞Di(t-τ)B(α′ij,τ-τ′i)dτ]]>給出，其中Dib(t)是所述的此時已變寬的檢測器信號，α′ij和τ′i是權(quán)利要求2所述的最佳擬合參數(shù)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述選定物理參數(shù)是利用關(guān)系式R(θ)＝K≠MwcP(θ)[1-2A2MwcP(θ)]+O(c3)而從濃度信號c(t)和超瑞利比R(θ，t)獲得的所述樣品的重均摩爾質(zhì)量Mw和均方根半徑rg，其中超瑞利比R(θ，t)和濃度信號c(t)由來自含有光散射檢測器的檢測器組的第i個光散射信號Di(t)和dRI檢測器依次獲得，所述dRI檢測器產(chǎn)生的濃度信號相對于所述光散射檢測器信號出現(xiàn)增寬，而其中所述的光散射檢測器信號已經(jīng)發(fā)生了增寬。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述檢測器信號來自紫外檢測器，該紫外檢測器之后有一多角度光散射檢測器，且所述多角度光散射信號發(fā)生增寬。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述檢測器信號來自折光指數(shù)檢測器，該折光指數(shù)檢測器之后有一粘度檢測器，且所述折光指數(shù)檢測器信號發(fā)生增寬。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的增寬函數(shù)由B(t)=∫-∞∞1δ2πe-τ2/2δ21wU(t-τ)e-(t-τ)/ωdτ]]>給出，其中當(dāng)t≥τ時，U(t-τ)＝1，而當(dāng)t＜τ時，U(t-τ)＝0。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述增寬函數(shù)的最佳參數(shù)已經(jīng)通過權(quán)利要求1的方法確定。
18.一種確定在色譜分離系統(tǒng)中的N個檢測器之間的滯留體積τi的方法，其中i＝1至N-1，在所述色譜分離系統(tǒng)中應(yīng)用了權(quán)利要求2所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新方法，可由此校正大多數(shù)類型的頻帶增寬以便對這些物理性質(zhì)作更精確計算。校正頻帶增寬效應(yīng)的傳統(tǒng)方法是基于試圖使已變寬的波峰變窄為它變寬前的形式的數(shù)學(xué)方法，缺點是非常不穩(wěn)定，而且常常得出不合理的結(jié)果。本發(fā)明所公開的方法則可用于表征在色譜系統(tǒng)中出現(xiàn)的增寬，由此可以將上游檢測器的窄峰變寬，從而使其可與下游檢測器的變寬的波峰相互比較。雖然本技術(shù)會導(dǎo)致部分損失分離度，但是它的穩(wěn)定性和普適性使其能得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號G01N30/74GK1598571SQ20041006267
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者S·P·特拉伊諾夫 申請人:懷雅特技術(shù)公司