專(zhuān)利名稱(chēng)：飼料中碘化酪蛋白的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種碘化酪蛋白的測(cè)定方法，特別是一種采用催化動(dòng)力學(xué)分光光度法，測(cè)定飼料中微量碘化酪蛋白的方法。
背景技術(shù)：
甲狀腺素是動(dòng)物甲狀腺分泌的重要激素，其生理功能是全面提高基礎(chǔ)代謝，對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體三大物質(zhì)代謝，維持機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育及能量代謝都起著廣泛而重要的作用。碘化酪蛋白是一種人工合成的蛋白質(zhì)同化類(lèi)激素，是甲狀腺素T3和T4的前驅(qū)物質(zhì)，經(jīng)腸道消化吸收后具有類(lèi)似T3和T4的生理功能。該制品由美國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)公司首先研制成功，曾經(jīng)被美國(guó)藥品和食品管理局(FDA)批準(zhǔn)作為一種飼料添加劑使用，以50-200mg/Kg的量添加于飼料中可作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，促進(jìn)幼畜生長(zhǎng)發(fā)育，增加瘦肉比例，提高泌乳量，增加產(chǎn)蛋率，但也引起動(dòng)物體況下降，死亡率上升，受孕率降低，產(chǎn)仔數(shù)下降等一系列病變狀況。鑒于畜禽肉制品中這種類(lèi)激素的殘留問(wèn)題及上述毒副作用，美國(guó)FDA已于1999年撤消碘化酪蛋白的畜藥許可。碘化酪蛋白的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，網(wǎng)上隨處可見(jiàn)推銷(xiāo)廣告，可以想像碘化酪蛋白已應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)的廣泛程度，因此迫切需要發(fā)展快速、簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確的碘化酪蛋白檢測(cè)技術(shù)。
碘化酪蛋白是一種不均一的混合物，直接測(cè)定困難大。國(guó)內(nèi)外檢測(cè)碘化酪蛋白或碘化酪蛋白中碘化氨基酸的含量曾有活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)——蝌蚪變態(tài)實(shí)驗(yàn)和琢鼠服用碘化酪蛋白耗氧量測(cè)定法、二向薄層色譜法、衍生氣相色譜法、高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)等方法。前兩者因系活體生物學(xué)檢測(cè)，個(gè)體差異難以控制，僅能定性且不穩(wěn)定，后幾種則需使用昂貴復(fù)雜儀器，樣品需要復(fù)雜的前處理，而且需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，很難遏制量大面廣的濫用此類(lèi)激素現(xiàn)狀。因此，目前急需一種技術(shù)簡(jiǎn)單、成本低廉、快速、監(jiān)控樣品量大，適宜篩選工作、特異性高，靈敏度符合要求的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種飼料中碘化酪蛋白的測(cè)定方法，即利用碘催化砷鈰反應(yīng)的原理，建立一種技術(shù)簡(jiǎn)易、成本低廉、快速和靈敏度高的飼料中碘化酪蛋白的檢測(cè)方法。
由于碘催化高鈰離子還原，在一定濃度范圍內(nèi)，高鈰離子褪色程度和碘離子濃度成正相關(guān)，其催化動(dòng)力學(xué)方程如下Ln([Ce4+]bt/[Ce4+]t)＝Kc[As3+]*[I+]t因[As3+]/[Ce4+]＞7.5時(shí)，反應(yīng)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模式，反應(yīng)速率與砷離子的濃度無(wú)關(guān)，由此上述方程式可以進(jìn)一步改寫(xiě)為L(zhǎng)n([Ce4+]bt/[Ce4+]t)＝K[I+]t，其中K＝Kc[As3+]若反應(yīng)時(shí)間固定，則在體系中其它因素恒定條件下，Ln([Ce4+]bt/[Ce4+]t)與是碘離子的濃度成正比，因而可以用于定量分析微量碘的含量。又據(jù)比爾定律有吸光度A＝K[Ce4+]，則上式進(jìn)一步改寫(xiě)為L(zhǎng)n(A0/At)＝K[I+]t，由此可以得出吸光度與碘離子濃度成正比。
根據(jù)上述原理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種飼料中碘化酪蛋白的測(cè)定方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下a.工作曲線(xiàn)的繪制首先配制濃度在0.04μg/ml～0.5μg/ml范圍內(nèi)的一系列碘化鉀的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并分別移取0.2ml碘化鉀的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10ml的具刻度比色管中，再依次加入0.01mol/l的亞砷酸1.68ml、2.5mol/l的硫酸4ml和蒸餾水4ml，混勻，在20℃-30℃溫度下溫浴15分鐘，同時(shí)將0.002mol/L硫酸高鈰銨溶液同溫溫浴，15分鐘后迅速將0.78ml的硫酸高鈰銨溶液依次加入至各比色管中，加蒸餾水至刻度混勻，控制水浴反應(yīng)時(shí)間為15-20分鐘，以蒸餾水為參比，用1ml的比色皿在317nm波長(zhǎng)處依次測(cè)定比色管中各溶液的吸光度，記為At；同時(shí)，測(cè)定裝有蒸餾水的空白管在317nm波長(zhǎng)處的吸光度，記為A0；然后繪制出Ln(A0/At)-碘離子濃度C的關(guān)系曲線(xiàn)；根據(jù)該關(guān)系曲線(xiàn)，可求出曲線(xiàn)方程；b.飼料樣品的準(zhǔn)備飼料經(jīng)粉碎后，以無(wú)水乙醇為提取液，用索氏提取器提取直至索氏提取器內(nèi)液體呈無(wú)色，取出樣品包，在70℃烘干；倒入燒杯中，用pH值為4.7的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌樣品包，離心分離，分離上清，再加入的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌，離心分離，分離上清，再合并上清；以1ml上清加入100μl的濃度為100％(W/V)的三氯乙酸進(jìn)行沉淀，合并沉淀并烘干；轉(zhuǎn)移到瓷坩堝中，以碳酸鉀固定碘，硫酸鋅助灰化助熔進(jìn)行樣品灰化處理，過(guò)濾坩堝中內(nèi)容物，再用熱水洗滌濾渣，將濾液和洗液收集到100ml的容量瓶中，并加蒸餾水定容到刻度，搖勻，此液待測(cè)；
c.飼料中碘化酪蛋白的測(cè)定取0.2ml上述待測(cè)液于10ml具刻度比色管中，按步驟a的方法，測(cè)定該待測(cè)液的吸光度At，以及空白的吸光度A0，然后計(jì)算出Ln(A0/At)，將該Ln(A0/At)值代入上述的曲線(xiàn)方程，即可求出對(duì)應(yīng)的碘離子的濃度，根據(jù)溶液中碘離子的濃度，計(jì)算飼料中碘化酪蛋白的量。
試劑用量?jī)?yōu)化選取亞砷酸、硫酸和硫酸高鈰三個(gè)因素進(jìn)三因素三水平的正交優(yōu)化。從非催化反應(yīng)發(fā)生程度和吸光度大小化反應(yīng)發(fā)生的程度和吸光度大小兩個(gè)方面進(jìn)行考查，發(fā)現(xiàn)砷酸對(duì)非催化反應(yīng)和吸光度影響都很??；砷鈰和吸光度影響都有很小，砷鈰反應(yīng)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)的前提是亞砷酸濃度遠(yuǎn)大于酸高鈰濃度，我們選用亞砷酸的用量為0.01mol/L1.680ml；硫酸高鈰對(duì)吸光度影響最大，考慮到儀器靈敏度、測(cè)定線(xiàn)性范圍的寬度，故選用0.002mol/L0.780ml；硫酸高鈰在弱酸性及堿性條件下會(huì)沉淀析出，隨硫酸濃度的增加，吸光度增大，當(dāng)大于0.6mol/l時(shí)趨于穩(wěn)定，又硫酸對(duì)磷酸引起的吸收波長(zhǎng)向短波移動(dòng)有糾正作用，故選用2.5mol/L硫酸4ml。
反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間在確定的最佳試劑用量條件下，分別改變反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在低溫下，反應(yīng)緩慢，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率小

靈敏度低當(dāng)反應(yīng)溫度過(guò)高時(shí)，反應(yīng)速度加快，靈敏度太高，操作不易控制，產(chǎn)生的誤差大。所以反應(yīng)溫度選用范圍為20℃～30℃，反應(yīng)時(shí)間范圍為25分鐘～20分鐘。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有如下顯而易見(jiàn)的特點(diǎn)和突出的優(yōu)點(diǎn)1.本方法中樣品經(jīng)過(guò)索氏抽提、等電點(diǎn)沉淀和三氯乙酸沉淀，除去了干擾的有機(jī)碘和無(wú)機(jī)碘化物，使樣品中的碘僅以碘化蛋白形式存在，因此使用本方法測(cè)定樣品中的蛋白碘含量，回收率高，相對(duì)偏差小。采用本發(fā)明方法與以不含碘化酪蛋白的飼料及加入準(zhǔn)確量的碘化酪蛋白的飼料為樣品，采用本發(fā)明方法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果列于下表1表1 碘化酪蛋白加標(biāo)回收分析結(jié)果(n＝3)

注 1上海強(qiáng)大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司仔豬前期配合飼料；2上海市北洲城糧油食品有限公司生長(zhǎng)肥豬前期配合飼料
3上海飛帆飼料有限公司生長(zhǎng)肥豬前期配合飼料4上海市北洲城糧油食品有限公司瘦肉型豬配合飼料根據(jù)上表結(jié)果表明，其測(cè)定結(jié)果令人滿(mǎn)意。
2.繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)具有較高的精密度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為7.5％。
3.本發(fā)明方法的碘離子的檢出限度為0.03μg/ml，靈敏度高。
4.本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，成本低，，是一種切實(shí)可行的檢測(cè)方法。


圖1是本發(fā)明方法建立的工作曲線(xiàn)圖，即Ln(A0/At)-碘離子濃度C的關(guān)系曲線(xiàn)。
圖2是5種不同組份溶液190～500nm波長(zhǎng)范圍的吸收光譜曲線(xiàn)圖。其中，1——硫酸高鈰銨+硫酸；2——硫酸高鈰銨+硫酸+亞砷酸；3——硫酸高鈰銨+硫酸+亞砷酸+碘化鉀(10min)；4——硫酸高鈰銨+硫酸+亞砷酸+碘化鉀(11min)；5——硫酸+亞砷酸+碘化鉀。
具體實(shí)施例方式1.吸收波長(zhǎng)的確定首先在5支10ml具刻度比色管中配置一系列不同組分的溶液，1-0.002mol/L硫酸高鈰銨0.78ml+2.5mol/l的硫酸4ml；2-0.002mol/L硫酸高鈰銨0.78ml+2.5mol/l的硫酸4ml+0.01mol/l的亞砷酸1.68ml；3-0.002mol/L硫酸高鈰銨0.78ml+2.5mol/l的硫酸4ml+0.01mol/l的亞砷酸1.68ml+0.1μg/ml碘化鉀0.2ml(10min)；4-0.002mol/L硫酸高鈰銨0.78ml+2.5mol/l的硫酸4ml+0.01mol/l的亞砷酸1.68ml+0.1μg/ml碘化鉀0.2ml(11min)；5--2.5mol/l的硫酸4ml+0.01mol/l的亞砷酸1.68ml+0.1μg/ml碘化鉀0.2ml，加水至刻度混勻，用UV-260紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～500nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行光譜掃描，可得到上述5種樣品的吸收光譜曲線(xiàn)，參見(jiàn)圖2。從該光譜曲線(xiàn)中可知，樣品5在此掃描范圍內(nèi)幾乎無(wú)吸收，其它吸收曲線(xiàn)的最大吸收均在317nm，且形狀相似，說(shuō)明吸收變化是單純由硫酸高鈰銨的濃度變化引起；其中樣品1、2的吸收曲線(xiàn)，說(shuō)明在沒(méi)有碘離子的催化作用，砷鈰之間反應(yīng)微弱；樣品3、4的吸收曲線(xiàn)說(shuō)明碘能催化砷鈰反應(yīng)，所以選取317nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。
2.儀器與試劑的準(zhǔn)備(1)UV-260紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；752型紫外光柵分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)
(2)取0.1380g碘化鉀，經(jīng)120℃干燥2小時(shí)，于干燥器中冷卻至室溫的碘化鉀溶解于水，定容至100ml，配制成1mg/ml的碘標(biāo)準(zhǔn)貯備液，待用。
(3)取三氧化二砷0.9892g，加熱溶解于10ml 1mol/l的NaoH，加入5ml 2.5mol/l的硫酸并定容至100ml，配制成0.1mol/l的亞砷酸溶液。臨用前適當(dāng)稀釋成0.01mol/L的亞砷酸溶液，即為工作液；(4)取硫酸鈰銨3.3431g用1.25mol/l的硫酸定容到250ml，配制成0.02mol/l硫酸鈰銨溶液。臨用前用1.25mol/l的硫酸適當(dāng)稀釋成0.002mol/L的硫酸鈰銨溶液，即為工作液。
實(shí)施例一現(xiàn)將具體實(shí)施例敘述如下，其具體步驟為1.工作曲線(xiàn)的繪制將上述配置好的1mg/ml的碘標(biāo)準(zhǔn)，分別稀釋成0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml200μl的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取其中0.2ml置于6支10ml具刻度比色管中，再依次加入0.01mol/l的亞砷酸1.68ml、2.5mol/l的硫酸4ml和水4ml，混勻，在30℃溫度下溫浴15分鐘，同時(shí)將0.002mol/L硫酸高鈰銨溶液同溫溫浴，15分鐘后迅速將0.78ml的硫酸高鈰銨溶液依次加入至各比色管中，加水至刻度混勻，控制水浴反應(yīng)時(shí)間為20分鐘，在317nm波長(zhǎng)處以水為參比依次測(cè)定比色管中各溶液的吸光度，記為At；同時(shí)，測(cè)定以蒸餾水替代標(biāo)準(zhǔn)品，其它同上的空白管在317nm波長(zhǎng)處的吸光度，記為A0；然后繪制出Ln(A0/At)-碘離子濃度C的關(guān)系曲線(xiàn)按實(shí)驗(yàn)方法操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，參見(jiàn)圖1；實(shí)驗(yàn)表明碘離子濃度在0.05μg/ml～0.5μg/ml范圍內(nèi)與Ln(A0/At)呈線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為L(zhǎng)n(A0/At)＝2.6038 C-0.0078，R2＝0.9995；以0.3μg/m200μl的標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)11次實(shí)驗(yàn)以測(cè)定工作曲線(xiàn)的精密度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.6％；方法的檢出限為0.03μg/ml(S/＝3，表示的是空白樣品經(jīng)11次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
2.試樣制備準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)充分粉碎的樣品飼料1g，用索氏提取器(100ml的無(wú)水乙醇)提取直至索氏提取器內(nèi)液體呈無(wú)色，取出樣品包70℃烘干，倒入400ml的燒杯中，用乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH＝4.7)溶解，6000r.p.m離心10分鐘，分離上清，再加入100ml的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌沉淀，離心，合并上清，以1ml上清加入100μl的三氯乙酸(100％W/V)進(jìn)行沉淀，合并上述沉淀并烘干，轉(zhuǎn)移到瓷坩堝中，以碳酸鉀固定碘，硫酸鋅助熔進(jìn)行樣品灰化處理，過(guò)濾坩堝中內(nèi)容物，多次用熱水洗滌濾渣，將濾液和洗液收集到100ml的容量瓶中，并定容到刻度，搖勻，此液待測(cè)。
3.飼料中碘化酪蛋白的測(cè)定
(1)色測(cè)定取0.2ml上述待測(cè)液于10ml具刻度比色管中，按工作曲線(xiàn)繪制的方法，測(cè)定該待測(cè)液在317nm波長(zhǎng)處的吸光度At＝0.528，空白管0.794；(2)計(jì)算分別計(jì)算出Ln(A0/At)，其值分別為0.407，將計(jì)算出的Ln(A0/At)值代入回歸方程Ln(A0/At)＝2.6038 C-0.0078，即可得到對(duì)應(yīng)的碘離子的濃度分別為0.16μg/ml100ml待測(cè)樣品碘含量(μg/g)＝0.16μg/ml*100ml＝16μg由于碘化酪蛋白為混合物，市場(chǎng)上各商品碘化酪蛋白中含碘量并不一致，一般在8％左右，此處為便于計(jì)算，以8％計(jì)，即可計(jì)算該飼料中碘化酪蛋白的含量為碘化酪蛋白含量＝碘含量/8％＝16μg/8％＝200μg即1g飼料中碘化酪蛋白含量＝200μg/g即200ppm蛋白質(zhì)中的碘化主要發(fā)生在酪氨酸上，從而使碘化蛋白具有類(lèi)似甲狀腺素生理作用(生成T2、T3、T4)或作為體內(nèi)合成甲狀腺素直接前體(MIT、DIT)。并非只有碘化酪蛋白具有類(lèi)似甲狀腺素作用，碘化蛋白只要碘化達(dá)到一定程度，均有此作用。通過(guò)測(cè)定蛋白碘化的存在，來(lái)監(jiān)測(cè)飼料中碘化酪蛋白非法添加，是一種切實(shí)可行的方法。
權(quán)利要求
1.一種飼料中碘化酪蛋白的測(cè)定方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下a.工作曲線(xiàn)的繪制首先配制濃度在0.04μg/ml～0.5μg/ml范圍內(nèi)的一系列碘化鉀的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并分別移取0.2ml碘化鉀的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液置于10ml的具刻度比色管中，再依次加入0.01mol/l的亞砷酸1.68ml、2.5mol/l的硫酸4ml和蒸餾水4ml，混勻，在20℃-30℃溫度下溫浴15分鐘，同時(shí)將0.002mol/L硫酸高鈰銨溶液同溫溫浴，15分鐘后迅速將0.78ml的硫酸高鈰銨溶液依次加入至各比色管中，加蒸餾水至刻度混勻，控制水浴反應(yīng)時(shí)間為15分鐘-20分鐘，以蒸餾水為參比，用1ml的比色皿在317nm波長(zhǎng)處依次測(cè)定各比色管中各溶液的吸光度，記為At；同時(shí)，測(cè)定裝有蒸餾水的空白管在317nm波長(zhǎng)處的吸光度，記為A0；然后繪制出Ln(A0/At)-碘離子濃度C的關(guān)系曲線(xiàn)，根據(jù)該關(guān)系曲線(xiàn)，可求出曲線(xiàn)方程；b.飼料樣品的準(zhǔn)備飼料經(jīng)粉碎后，以無(wú)水乙醇為提取液，用索氏提取器提取直至索氏提取器內(nèi)液體呈無(wú)色，取出樣品包，在70℃烘干；倒入燒杯中，用pH值為4.7的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌樣品包，離心分離，分離上清，再加入的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌，離心分離，分離上清，再合并上清；以1ml上清加入100μl的濃度為100％(W/V)的三氯乙酸進(jìn)行沉淀，合并沉淀并烘干；轉(zhuǎn)移到瓷坩堝中，以碳酸鉀固定碘，硫酸鋅助熔進(jìn)行樣品灰化處理，過(guò)濾坩堝中內(nèi)容物，再用熱水洗滌濾渣，將濾液和洗液收集到100ml的容量瓶中，并加蒸餾水定容到刻度，搖勻，此液待測(cè)；c.飼料中碘化酪蛋白的測(cè)定取0.2ml上述待測(cè)液于10ml具刻度比色管中，按步驟a的方法，測(cè)定該待測(cè)液的吸光度At，以及空白吸光度A0，然后計(jì)算出Ln(A0/At)，將該Ln(A0/At)值代入上述的曲線(xiàn)方程，即可求出對(duì)應(yīng)的碘離子的濃度，根據(jù)溶液中碘離子的濃度，計(jì)算飼料中碘化酪蛋白的量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種飼料中碘化酪蛋白的測(cè)定方法。該方法包括如下步驟碘離子催化鈰銨反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的繪制，飼料樣品的準(zhǔn)備以及飼料中碘化酪蛋白的測(cè)定，本方法中飼料樣品經(jīng)過(guò)索氏抽提、等電點(diǎn)沉淀和三氯乙酸沉淀，除去了干擾的有機(jī)碘和無(wú)機(jī)碘化物，使樣品中的碘僅以特有的有機(jī)結(jié)合碘碘化蛋白形式存在，因此使用本方法測(cè)定樣品中的蛋白碘含量，回收率高，相對(duì)偏差小。而且該方法操作簡(jiǎn)單，成本低，靈敏度高，是一種切實(shí)可行的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N21/31GK1609595SQ200410054319
公開(kāi)日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月7日
發(fā)明者胡建軍, 陳宇光 申請(qǐng)人:上海大學(xué)