專(zhuān)利名稱(chēng)：一種廣譜的生物分子檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測(cè)技術(shù)，更具體地說(shuō)涉及一種定性定量檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)及生物大分子的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
生物大分子除核酸和蛋白質(zhì)外，還包括糖類(lèi)和脂類(lèi)物質(zhì)，還可包括其它存于生物體的有機(jī)物以及這些物質(zhì)的結(jié)合產(chǎn)物。生物檢測(cè)是對(duì)生物大分子進(jìn)行檢測(cè)或是通過(guò)生物大分子對(duì)生物體進(jìn)行檢測(cè)，生物的檢測(cè)是一種定性或定量的分析。定性分析，檢測(cè)生物的種類(lèi)、種群或變種或某種特殊的抗原或基因序列或其它生物大分子的存在，例如鑒定含轉(zhuǎn)基因的動(dòng)植物；定量分析，檢測(cè)物種的數(shù)量或濃度，或某種細(xì)胞或病毒或分子的濃度，測(cè)定的方法可以是細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法、血清免疫方法以及核酸擴(kuò)增方法等，細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法(培養(yǎng)、分離、鑒定)為直接方法，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)樣，其它為間接方法，需要有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣作對(duì)照。核酸是生物物種的遺傳物質(zhì)，它包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。如一核酸鏈與另一核酸鏈有完全互補(bǔ)的堿基序列，則這兩條核酸鏈稱(chēng)為互補(bǔ)核酸鏈，互補(bǔ)的核酸鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，由互補(bǔ)的兩單鏈分子結(jié)構(gòu)形成雙鏈分子結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱(chēng)為分子雜交。非完全互補(bǔ)的核酸鏈(部分互補(bǔ))在特定條件下也會(huì)形成雙鏈分子結(jié)構(gòu)。在生物體及試管中，單鏈的核酸鏈可在酶的作用下復(fù)制出互補(bǔ)的核酸鏈，在復(fù)制過(guò)程中，被復(fù)制的核酸鏈稱(chēng)為模板分子，所需的酶為聚合酶，聚合酶可分為DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA互補(bǔ)鏈，RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA互補(bǔ)鏈，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA互補(bǔ)鏈。引物為核酸片段，它與模板分子互補(bǔ)，并可與其雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。核酸聚合酶反應(yīng)的始點(diǎn)決定于引物的位置，DNA的聚合反應(yīng)從引物的3’末端開(kāi)始(DNA及cDNA聚合反應(yīng))。RNA聚合酶反應(yīng)需要有雙鏈的被RNA聚合酶識(shí)別的結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為驅(qū)動(dòng)子。引物核酸片段可以由幾個(gè)或幾十個(gè)堿基(核苷酸)組成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通過(guò)降解自然核酸而取得的片段，也可以通過(guò)人工化學(xué)合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的組成單位(結(jié)構(gòu))，非自然的組成單位(結(jié)構(gòu))包括在自然界中不是核酸組分的結(jié)構(gòu)，也包括不存在于自然界的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過(guò)引物與模板分子的雜交，可以控制模板分子的復(fù)制以及模板分子的擴(kuò)增。DNA可以在聚合酶等的作用下被復(fù)制，即由模板鏈復(fù)制出互補(bǔ)鏈，DNA的復(fù)制需要有一引物，引物一般為一含有幾個(gè)或幾十個(gè)堿基的核酸鏈，核酸復(fù)制前引物與模板在3’端有特異性地根據(jù)堿基配對(duì)原理結(jié)合成雙鏈結(jié)構(gòu)(這一過(guò)程稱(chēng)為分子雜交)，此后聚合酶可從引物的3’端開(kāi)始沿5’→3’方向合成與模板相互補(bǔ)的新鏈，新形成的雙鏈可在高溫下(＞90℃)分離成獨(dú)立的單鏈，當(dāng)溫度下降時(shí)余下的引物分子可再與相應(yīng)的模板核酸分子雜交，并可在聚合酶的作用下復(fù)制出新的核酸鏈，反復(fù)如上過(guò)程，一個(gè)核酸片段可被擴(kuò)增出大量相同的分子片段，如上過(guò)程即為聚合酶鏈反應(yīng)過(guò)程(PCR)。另外一種擴(kuò)增方法為轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，即把一個(gè)帶驅(qū)動(dòng)子的DNA分子轉(zhuǎn)錄成多個(gè)RNA分子，然后可把所產(chǎn)生的RNA分子再逆轉(zhuǎn)錄成多個(gè)DNA分子。一核酸樣品需擴(kuò)增的部分為靶片段，進(jìn)行PCR反應(yīng)一般在靶片段兩端要有相應(yīng)的引物。靶物或靶分子即被檢查的物質(zhì)或分子(蛋白、核酸、多糖等)或是一化學(xué)反應(yīng)中所需探明的物質(zhì)。基因芯片是一種把不同核酸分子分別排列于特定位置，并用于核酸分子雜交的裝置，固定于基因芯片上的核酸分子為探針?lè)肿?，與探針?lè)肿舆M(jìn)行特異性雜交的為靶分子，根據(jù)探針?lè)肿蛹皹?biāo)記在芯片的位置可對(duì)靶分子進(jìn)行識(shí)別，標(biāo)記可有多種形式，如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、納米顆粒標(biāo)記、酶標(biāo)記、色素標(biāo)記等，用以區(qū)別不同基因型的核酸探針?lè)肿訛榛蛐吞结?。由引物引發(fā)的聚合反應(yīng)或擴(kuò)增反應(yīng)常用于分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，基因工程，以及遺傳診斷和與分子生物學(xué)相關(guān)的檢測(cè)。RNA包括mRNA、rRNA、tRNA及基因組RNA，mRNA為信使RNA，作為蛋白質(zhì)合成的模板，帶有指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的密碼，rRNA為核糖體RNA，是蛋白質(zhì)合成過(guò)程中所需的核糖體的組成部分，tRNA為轉(zhuǎn)移RNA是用于識(shí)別mRNA上的密碼并攜帶相應(yīng)氨基酸的RNA，基因組RNA為病毒RNA。細(xì)菌中的(不包括病毒)rRNA有如下特點(diǎn)①一細(xì)胞內(nèi)有大量的rRNA，當(dāng)用rRNA作為靶物(靶分子)時(shí)，可以提高檢查的靈敏度；②不同的微生物種類(lèi)在rRNA結(jié)構(gòu)上有差異，因此也可根據(jù)rRNA的序列進(jìn)行微生物(細(xì)菌、真菌)的物種鑒別(識(shí)別)。對(duì)RNA(包括mRNA、rRNA、tRNA及基因組RNA)進(jìn)行擴(kuò)增前，必須把RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，用RNA做為模板所合成的DNA鏈，cDNA可用常規(guī)的PCR方進(jìn)行擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增前需進(jìn)行提取，或叫純化，RNA的提取出方法與DNA的提取有差異，具體方法為已知技術(shù)。抗原是一類(lèi)能刺激人或動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與這些抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?？贵w是由抗原刺激人體或動(dòng)物體的B細(xì)胞，由B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞所產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白。特異性，即專(zhuān)一性或選擇性，或非隨機(jī)性，但這種特異性在生物化學(xué)反應(yīng)中不一定是絕對(duì)的，一般要根據(jù)反應(yīng)的條件和對(duì)結(jié)果的要求而定。通過(guò)化學(xué)偶連可把核酸片段連接到抗體或抗原，因此通過(guò)對(duì)與核酸片段相偶連的抗原或抗體進(jìn)行特異性富集，可提取到相關(guān)的核酸片段。在應(yīng)用中，所需要的試劑為反應(yīng)試劑，要進(jìn)行混合然后在試管或其他反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)。在一組或多個(gè)反應(yīng)中反應(yīng)試劑根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)可分為通用試劑如水、緩沖液等；和專(zhuān)一試劑，如核酸引物、抗體及酶等。一種反應(yīng)試劑在某個(gè)反應(yīng)中可能是專(zhuān)一試劑，在另一反應(yīng)中可能是通用試劑。一般來(lái)說(shuō)通用試劑指的是同一批的多個(gè)反應(yīng)中的共同試劑，專(zhuān)一試劑是多個(gè)反應(yīng)中，個(gè)別反應(yīng)所需的試劑。另外反應(yīng)中可以加入添加劑，添加劑在反應(yīng)中不參與反應(yīng)。常用的添加劑包括蛋白質(zhì)(如牛血清蛋白、明膠)、多糖類(lèi)化合物(如淀粉、藻膠)等，另外有些人工合成的化合物也可以用作添加劑(如線形聚丙烯酰胺)。添加劑一般為水溶性的，在低溶度下(＜10％)不會(huì)影響酶反應(yīng)。添加劑的特性包括溶于水后會(huì)膨脹并可形成膠狀物態(tài)，可起到膠合劑作用；去水后會(huì)收縮、結(jié)塊，也可以固化，形成固化物。在有些反應(yīng)中也可使用親和分子，或叫親和物，即一種有機(jī)分子或有機(jī)物，它對(duì)另一種有機(jī)分子(物)有特異性(或?qū)Ｒ恍?的親和結(jié)合能力?？贵w可以是抗原的親和物。對(duì)大多數(shù)微生物或生物大分子都能找到或制出相應(yīng)的抗體蛋白，這些抗體可以用來(lái)富集、識(shí)別和檢測(cè)相應(yīng)的微生物或生物大分子，親和分子也可是核酸分子，一核酸片段與另一核酸片段有互補(bǔ)序列(能相互雜交)，則其中一種核酸片段可以是另一種核酸片段的親和分子(物)，被認(rèn)識(shí)的叫靶分子。親和物(分子)可與相應(yīng)的靶物(如細(xì)菌)或靶分子(如核酸或蛋白質(zhì)或其它生物大分子)結(jié)合，親和物(分子)也可連接到含鐵或具順磁性(能被磁力吸引)物體的微顆粒表面，在磁力的作用下可將被檢樣品中靶物(靶分子)分離出來(lái)。靶分子(物)可以通過(guò)特異性反應(yīng)與另一分子結(jié)合，然后通過(guò)對(duì)后者的測(cè)定來(lái)檢測(cè)原靶分子(物)，后者可定義為原靶分子(物)的派生靶分子，因此靶分子(物)包括原靶分子(物)和派生靶分子(物)。已有的生物檢測(cè)方法有細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法，這種方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，人工操作工作量大，易出錯(cuò)。免疫學(xué)方法主要是利用抗體可以特異地與抗原分子結(jié)合，通過(guò)抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，已有技術(shù)中有許多不同的方法來(lái)檢測(cè)抗體與其目標(biāo)抗原的結(jié)合，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)就是其中的一種方法，ELISA是一種在固相載體上進(jìn)行的酶免疫反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫測(cè)定過(guò)程中，抗體上通常還連接有一種酶，如堿性磷酸酶等，這些酶能夠催化一種化學(xué)反應(yīng)將無(wú)色底物轉(zhuǎn)化為有色物質(zhì)，通過(guò)顏色的變化就能判斷出被測(cè)樣品中是否含有目標(biāo)分子(靶分子)，常用的ELISA有直接型、間接型、雙抗體夾心型等。液相蛋白定量技術(shù)(CBA)的基本原理近似于ELISA的檢測(cè)，即利用微小、分散的顆粒捕獲液體待測(cè)物，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)類(lèi)似“三明治”的顆粒所散發(fā)的熒光，從而測(cè)定待測(cè)物的數(shù)量。免疫學(xué)方法(ELISA等)對(duì)定性定量的檢測(cè)快速簡(jiǎn)單，但不足是測(cè)量通量低，靈敏度較低。由于PCR擴(kuò)增的高度靈敏性，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增，因此常常使PCR與其它技術(shù)結(jié)合，目前常用的PCR種類(lèi)有普通PCR、槽式PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、PCR-ELISA等，PCR反應(yīng)具有高度特異性和敏感性，只需對(duì)少量的DNA進(jìn)行測(cè)定便可檢測(cè)靶分子，但對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求很高，其結(jié)果易受許多因素的干擾而產(chǎn)生誤差。PCR反應(yīng)一般在反應(yīng)管中進(jìn)行，也可以在平面反應(yīng)器的微型不透孔或微管中進(jìn)行。生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片以及其它形式的芯片。在已有的生物芯片方法中，蛋白質(zhì)芯片與酶免方法相關(guān)，但其不能檢測(cè)核酸；基因芯片與PCR方法相關(guān)，但其需進(jìn)行分子雜交并且不能檢測(cè)蛋白，而且常規(guī)生物芯片方法的樣品處理方法較麻煩。納米材料技術(shù)是新興起的技術(shù)，可用納米材料作為檢測(cè)生物分子的載體制成親和分子進(jìn)行分子檢測(cè)，如制作成金標(biāo)試紙可以直接快速檢測(cè)病毒等。已有的免疫學(xué)方法(ELISA)，納米技術(shù)方法、生物芯片、核酸擴(kuò)增方法(PCR)等生物檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，已有的技術(shù)組合中有將以上生物檢測(cè)技術(shù)中的二種進(jìn)行了組合，如PCR-ELISA方法，但沒(méi)有一種能夠貫通四大生物檢測(cè)技術(shù)，集合其優(yōu)點(diǎn)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種廣譜的生物分子檢測(cè)方法，其原理是用親和試劑(納米技術(shù))、固化引物技術(shù)，有機(jī)地將免疫學(xué)方法的抗原抗體反應(yīng)及順磁性納米顆粒的親和試劑等優(yōu)點(diǎn)與生物芯片的多元的平行的反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，以及PCR高度靈敏擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合了起來(lái)，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的基本構(gòu)思是用親和試劑對(duì)檢驗(yàn)樣品中的靶物進(jìn)行特異性富集，提取靶分子，然后把靶分子放入生物芯片(反應(yīng)器)內(nèi)置有固化引物的反應(yīng)孔中，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)各孔內(nèi)的固化引物融化并共同參與擴(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)做出結(jié)果分析。
實(shí)施一種廣譜的生物分子檢測(cè)方法所用的裝置，其特征是反應(yīng)器上設(shè)置有數(shù)個(gè)微型不透孔，微型不透孔內(nèi)置有固化引物。
本發(fā)明的檢測(cè)方法包括以下幾個(gè)步驟①靶物的富集，用親和試劑進(jìn)行靶物的富集，把要進(jìn)行PCR擴(kuò)增的靶分子富集(純化)起來(lái)，把不需要擴(kuò)增的排除掉；②提取靶分子(核酸提取)；③把用親和試劑富集的將要擴(kuò)增的靶分子放入反應(yīng)器(生物芯片)中與固化引物結(jié)合；④DNA(cDNA)擴(kuò)增；⑤信號(hào)采集；⑥結(jié)果分析。
作為本發(fā)明基本構(gòu)思的第一種技術(shù)方案是制作一種親和試劑，用這種親和試劑來(lái)富集待檢樣品中的靶物，然后提取靶分子，再把靶分子放入反應(yīng)器內(nèi)置有固化引物的孔中，將反應(yīng)器放入普通PCR中進(jìn)行分子擴(kuò)增，擴(kuò)增后將反應(yīng)器取出，放到熒光儀上，根據(jù)反應(yīng)器中各孔的熒光信號(hào)進(jìn)行比較，得出分析結(jié)果。
作為本發(fā)明基本構(gòu)思的第二種技術(shù)方案是制作一種親和試劑，用這種親和試劑來(lái)富集待檢樣品中的靶物，然后提取靶分子，再把靶分子放入反應(yīng)器內(nèi)置有固化引物的孔中，然后將反應(yīng)器放入實(shí)時(shí)PCR中進(jìn)行分子擴(kuò)增，信號(hào)采集與結(jié)果分析是實(shí)時(shí)讀出結(jié)論。(與第一技術(shù)方案比較)減少了信號(hào)采集與結(jié)果分析步驟。
作為本發(fā)明基本構(gòu)思的第三種技術(shù)方案是檢測(cè)蛋白質(zhì)或同時(shí)檢測(cè)核酸與蛋白質(zhì)或生物大分子，親和試劑是利用特異性的抗體分子吸附抗原，并與與核酸靶分子直接連接起來(lái)的抗體形成復(fù)合體結(jié)構(gòu)，在親和富集的過(guò)程中與抗原分子(蛋白)相對(duì)應(yīng)的核酸靶分子被富集，并將提取的核酸靶分子擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行DNA的定性定量分析，根據(jù)DNA的分析并由此間接推出蛋白質(zhì)的性質(zhì)與數(shù)量，即通過(guò)對(duì)核酸的檢測(cè)進(jìn)行蛋白質(zhì)的間接檢測(cè)。
作為本發(fā)明基本構(gòu)思的第四種方案是親和試劑是納米級(jí)的順磁性的微顆粒(如極小的鐵屑顆粒)，其上附有特異性的抗體蛋白；或者這種微顆粒上附有特異性核酸探針?lè)肿印?br> 作為本發(fā)明基本構(gòu)思的第五種技術(shù)方案是固化引物是專(zhuān)一試劑和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99％。固化引物是固定在反應(yīng)器內(nèi)的各孔內(nèi)。
做為上述第一種技術(shù)方案的改進(jìn)，在進(jìn)行靶分子的定量分析過(guò)程中，要加進(jìn)做為參照物的標(biāo)準(zhǔn)樣(內(nèi)標(biāo))，標(biāo)準(zhǔn)樣做為靶分子的參照物從第①步靶物的富集一直到結(jié)果分析共同參與全過(guò)程，是進(jìn)行定量分析的重要參照指標(biāo)。
作為上述本發(fā)明所用的裝置的改進(jìn)，可以在該裝置上設(shè)連接溝3。
作為上述第五種技術(shù)方案的改進(jìn)，固化引物可以是一種成小顆粒狀的，機(jī)械生產(chǎn)后粘接固定在反應(yīng)器內(nèi)的孔內(nèi)。
由于本發(fā)明是利用了抗體及順磁性的納米顆粒制作了親和試劑，用親和試劑富集了靶物，然后放入多孔的反應(yīng)器(生物芯片)中與固化引物結(jié)合，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是貫通了免疫學(xué)方法、生物芯片、PCR技術(shù)集合了其優(yōu)勢(shì)，能同時(shí)檢測(cè)多種核酸、蛋白質(zhì)或其它生物大分子以及相應(yīng)的微生物。提高了檢測(cè)精度和效率，減少了檢測(cè)樣品和工序，對(duì)樣品的處理簡(jiǎn)化使操作和使用更加簡(jiǎn)便。本方法可對(duì)人體、動(dòng)植物、微生物、食品、環(huán)境等進(jìn)行檢測(cè)，用于疾病診斷、食品檢測(cè)、商檢、環(huán)保評(píng)估檢疫等。


附圖1為裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中各部件名稱(chēng)如下1、反應(yīng)器；2、微型不透孔；3、連接溝。微型不透孔2內(nèi)置有固化引物。
附圖2為本發(fā)明的工作程序圖。這一圖是用于圖解第一技術(shù)方案的，如果按照第二技術(shù)方案實(shí)施可省略該圖的后三步驟。
附圖3是本發(fā)明進(jìn)行靶分子富集的復(fù)合體的示意圖。1、順磁性顆粒；2、抗體；3、親和試劑，它是順磁性顆粒1與抗體2的連接體；4、原靶物(抗原、蛋白質(zhì)分子、細(xì)菌、病毒等)，原靶物是可以吸附到抗體2、抗體5上；5、抗體；6、核酸片段(派生靶物)是納米金顆粒偶連物，它與抗體與連接，可以吸附到原靶物4上。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一。通過(guò)核酸檢測(cè)對(duì)8種微生物進(jìn)行定性定量檢測(cè)?？蓹z的微生物種類(lèi)為沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、糞鏈球菌、大腸菌、糞大腸菌、肉毒梭菌、創(chuàng)傷弧菌，試劑盒包括以下幾個(gè)部分。1、標(biāo)準(zhǔn)樣，按微生物學(xué)方法，制備微生物菌種，使每種微生物的濃度均為每毫升液體有1×106群落單位，存于25％的甘油和75％的培養(yǎng)液中(-20°)，微生物的濃度也可根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的最高限而設(shè)定。標(biāo)準(zhǔn)樣要做定期檢查鑒定其群落單位濃度。標(biāo)準(zhǔn)樣是已知的定性定量的經(jīng)過(guò)計(jì)算的比照物(是與未知的待檢測(cè)的樣品中的微生物相比較的)。標(biāo)準(zhǔn)樣分裝成多個(gè)1毫升的標(biāo)準(zhǔn)樣管(一次性使用)并存于-80℃或-20℃的冰柜中。2、親和試劑，親和試劑是附有親和分子的微顆粒，此實(shí)施例中是順磁性的微顆粒(順磁性物體是會(huì)被磁力吸引，但本身不具有磁性，如鐵屑等)，體積為1mm3左右，微顆粒外附有與上述8種微生物具特異性的抗體分子，這些抗體可用已知的方法取得(如常規(guī)免疫學(xué)方法)，把此試劑分裝于多個(gè)小管，每個(gè)小管的親和試劑能足夠吸附所有8種微生物的細(xì)胞(共8×107個(gè)或10倍大于標(biāo)準(zhǔn)樣)，親和試劑存放于磷酸緩沖液中。3、固化引物及反應(yīng)器，分別用已知的分子生物學(xué)方法設(shè)計(jì)并合成8組(種)反應(yīng)引物(核酸引物分子)(將用于PCR擴(kuò)增)，每組相對(duì)應(yīng)于一種微生物，核酸靶片段可為微生物的rRNA中的特殊序列或基因組中的特殊序列(這些是已知)。把每組引物與添加劑如淀粉混合，加熱溶解使淀粉濃度為5％，引物的濃度為5μM，然后把10μl的混合物放到設(shè)定的反應(yīng)器孔中。反應(yīng)器是具有96孔(8×12)的平面裝置，孔的橫向排列(排)編號(hào)為A、B、C、D、E、F、G、H，縱向排列(列)編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，其96個(gè)孔的編號(hào)分別為A1、A2……A12……H1、H2……H12。把8組溶解的引物分別放于相應(yīng)的96個(gè)孔內(nèi)(每孔10μl)，使同一排中的12孔具有相同的引物(如A1、A2……A12是一種引物；B排是另一種)。全部填置溶解的引物與淀粉的混合物后，用已知的方法使引物的水分蒸發(fā)，使得引物分子固定于淀粉塊中形成固化引物。把反應(yīng)器加封封存待用。4、核酸純化試劑，此試劑可根據(jù)已知的方法配制或購(gòu)置，本實(shí)施例中使用RNA純化試劑。5、酶試劑，用于對(duì)核酸靶分子進(jìn)行擴(kuò)增，第一部分是用于cDNA合成的逆轉(zhuǎn)錄酶試劑，可購(gòu)置，對(duì)cDNA或DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR試劑也可購(gòu)置。6、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的電腦軟件。7、其它，用于完成檢測(cè)過(guò)程的必要緩沖液及用具；說(shuō)明書(shū)，說(shuō)明書(shū)規(guī)定了詳細(xì)嚴(yán)格的操作程序及注意事項(xiàng)。
本實(shí)施例的操作程序及方法①微生物(靶物)的富集，把2.0ml的待測(cè)的樣品原液(勻液)轉(zhuǎn)種于18.0ml的增菌液內(nèi)，然后分成兩份裝管，分別標(biāo)為甲管、乙管。甲管中再加入1管親和試劑，再加入1.0ml增菌液；乙管中再加入1管標(biāo)準(zhǔn)樣再加入1管親和試劑。把甲乙兩管在37℃搖動(dòng)60分鐘后，用磁鐵把親和試劑與微生物的復(fù)合體吸引到管壁，把增菌液除去，撤掉磁鐵，加入10ml冰冷的生理鹽水進(jìn)行清洗，再加磁鐵，反復(fù)清洗一次，除去清洗液后甲乙兩管各加入1ml核酸抽提液。以上過(guò)程稱(chēng)為對(duì)樣品中靶物進(jìn)行特異性富集。②核酸提取(提取靶分子)，用已知的方法進(jìn)行RNA提取，最后把RNA溶解于50μl超凈水中，仍分為甲乙兩管。③逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用已知的方法進(jìn)行，反應(yīng)后RNA被轉(zhuǎn)錄成cDNA，至此分別產(chǎn)生了兩個(gè)cDNA樣品，分別稱(chēng)為(樣品)甲管，(標(biāo)準(zhǔn)樣)乙管，每樣為160μl。④DNA(cDNA)擴(kuò)增，用本方法所提供的具固化引物的(96孔)反應(yīng)器進(jìn)行。首先用已知方法配制12管相同的PCR反應(yīng)液，每管720μl，反應(yīng)液包括PCR反應(yīng)所需的酶和其他成分(如對(duì)雙鏈DNA有專(zhuān)一的熒光劑)，但不包括靶物和引物。把12管反應(yīng)液分成兩組(每組6個(gè))即甲組、乙組，12管的編號(hào)分別為甲0、甲-4、甲-3、甲-2、甲-1、甲1；乙0、乙-4、乙-3、乙-2、乙-1、乙1。取經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的樣品甲管中的樣品80μl加入甲1中(80μl+原720μl共800μl)將甲1中的800μl液體均分為8份，分別加入到反應(yīng)器A6、B6、C6、D6、E6、F6、G6孔中。然后對(duì)樣品甲管中余留的80μl樣品液進(jìn)行10倍梯度稀釋。分別把80μl稀釋樣加入到相應(yīng)的反應(yīng)液管中，如1/10稀釋樣放入到甲-1；1/100稀釋樣放入到甲-2；1/1000的稀釋樣放入到甲-3；1/10000稀釋樣放入到甲-4；在甲0中加入80μl水做為零對(duì)照。甲-1內(nèi)800μl液體同樣均分為8份，分別加入到反應(yīng)器第五列的8孔A5、B5、C5、D5、E5、F5、G5、H5孔中，甲-2同樣均分，分別加入到第四列的8孔A4、B4……G4、H4孔中；甲-3同樣均分，分別加入到第三列的8孔A3……H3孔中；甲-4同樣均分，分別加入到第二列的8孔A2……H2孔中；甲0同樣均分，分別加入到第一列的8孔A1……H1孔中。標(biāo)準(zhǔn)樣乙管如同樣品甲管同樣做反應(yīng)液稀釋處理，分別成為乙0、乙-4、乙-3、乙-2、乙-1、乙1，然后各管同樣均分，分別加入到A7、B7、C7……F12、G12、H12(第七列至第十二列的)孔中。以上甲類(lèi)管是樣品稀釋液，乙類(lèi)管是標(biāo)準(zhǔn)樣稀釋液。96個(gè)孔裝好后，每個(gè)孔內(nèi)都有不同的固化引物加樣品稀釋液或標(biāo)準(zhǔn)樣稀釋液。以上工作也可由自動(dòng)化的機(jī)械手進(jìn)行操作。如上工作完成后用透光密封片將反應(yīng)器加封然后放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增時(shí)各孔內(nèi)的固化引物融化并共同參與擴(kuò)增。⑤信號(hào)采集，經(jīng)過(guò)約2小時(shí)的PCR反應(yīng)后，對(duì)每孔的反應(yīng)物進(jìn)行熒光測(cè)定(不開(kāi)封)，也可用附有熒光儀的實(shí)時(shí)PCR儀在PCR反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)同步熒光測(cè)定。⑥結(jié)果分析，獲取熒光信號(hào)后做一圖表，把熒光信號(hào)強(qiáng)度做Y軸，稀釋度的X軸，X軸與Y軸交叉點(diǎn)為O，把樣品甲的熒光信號(hào)與稀釋度對(duì)比在圖中標(biāo)出6個(gè)點(diǎn)來(lái)連成一條曲線；把標(biāo)準(zhǔn)樣乙的熒光信號(hào)與稀釋度對(duì)比做出另一條曲線。這樣每一種相應(yīng)的微生物都在圖中有兩條曲線(一為樣品的對(duì)數(shù)曲線，一為加標(biāo)準(zhǔn)樣的對(duì)數(shù)曲線)，由于標(biāo)準(zhǔn)樣的菌數(shù)已知，從兩曲線的差值中就可推算出樣品中某種微生物的菌數(shù)(單位體積，或重量所含某種微生物的數(shù)量)。當(dāng)樣品的微生物數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)樣的微生物數(shù)一樣時(shí)，樣品曲線的斜率應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)樣曲線的一半。當(dāng)樣品曲線的斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同時(shí)，樣品中的這種微生物必定大于標(biāo)準(zhǔn)物的微生物的最高濃度。數(shù)據(jù)分析也可采取別的半自動(dòng)或全自動(dòng)方法，如用先設(shè)定的電腦軟件進(jìn)行比較、作圖、輸入基本數(shù)據(jù)作出曲線，可以簡(jiǎn)化操作減少誤差。
另一種定量的方法是制作標(biāo)準(zhǔn)樣的梯度稀釋液，如標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度(菌落形成單位濃度)為108、107、106、105、104、103、102、101，然后使每一濃度與相同量的樣品混合，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，可得一標(biāo)準(zhǔn)濃度與反應(yīng)周期數(shù)相關(guān)的曲線，如樣品中沒(méi)有待檢的微生物，此曲線為一直線，如樣品中待檢的微生物濃度為105，則曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)樣的105濃度點(diǎn)相關(guān)。
作為實(shí)施例的變更，反應(yīng)器可具有384個(gè)反應(yīng)孔(16×24)反應(yīng)器可分為4個(gè)部分，每個(gè)部分96個(gè)孔(8×12)，可同時(shí)進(jìn)行4個(gè)樣品、8種微生物或2個(gè)樣品16種微生物的檢測(cè)。同理，可采用1536(32×48)個(gè)反應(yīng)孔的反應(yīng)器對(duì)多樣品多種微生物病毒或生物大分子進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例二。蛋白質(zhì)的定性定量檢測(cè)。檢測(cè)蛋白質(zhì)或同時(shí)檢測(cè)核酸與蛋白質(zhì)或生物大分子，親和試劑是利用特異性的抗體分子吸附抗原，并與與DNA分子直接連接起來(lái)的抗體，形成復(fù)合體結(jié)構(gòu)，在親和富集的過(guò)程中與抗原蛋白相對(duì)應(yīng)的DNA分子被富集，并將提取的DNA分子作為靶分子擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行DNA的定性定量分析，反推出蛋白質(zhì)的性質(zhì)與數(shù)量，即通過(guò)對(duì)核酸的檢測(cè)進(jìn)行蛋白質(zhì)的間接檢測(cè)。
實(shí)施例三。本方法在實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增中的運(yùn)用，本方法在使用實(shí)時(shí)PCR可以簡(jiǎn)化程序，可用類(lèi)似96孔酶標(biāo)板的裝置作反應(yīng)器，實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行分子擴(kuò)增后可以直接讀出數(shù)據(jù)分析結(jié)論。
實(shí)施例四。通過(guò)核酸檢測(cè)食品安全性(微生物)。在本實(shí)施例中操作方法及程序基本上與實(shí)施例一相同，所不同的在于①本實(shí)施例需要檢測(cè)的微生物包括沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創(chuàng)傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、瘋牛病病原；大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌。②本實(shí)施例只對(duì)如下微生物進(jìn)行定性檢測(cè)沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創(chuàng)傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒，因只做定性檢測(cè)，無(wú)需做梯度稀釋?zhuān)?jié)省的反應(yīng)器空間可用于更多種類(lèi)的微生物進(jìn)行測(cè)定。③對(duì)大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌進(jìn)行定性定量檢測(cè)。④定性檢測(cè)與定性定量檢測(cè)在一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)一次完成。⑤是通用的可適用于任何食品，即能完成對(duì)致病菌的定性檢測(cè)，并同時(shí)檢測(cè)定性定量的菌群，完成定量菌群的數(shù)量確定。⑥將大多食品有關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)全部輸入到計(jì)算機(jī)制成軟件，當(dāng)食品樣品檢測(cè)完畢后再比照。
實(shí)施例五。醫(yī)學(xué)臨床微生物的檢測(cè)。主要是檢測(cè)危及人類(lèi)健康的致病菌及病毒，對(duì)其進(jìn)行定性定量分析，為疾病診斷提供根據(jù)。檢測(cè)樣品的采樣方法可按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，樣品來(lái)源于血液、骨髓液、漿膜腔液、尿液、膿液、胃液、膽汁、糞便、皮膚標(biāo)本、各種分泌物等。產(chǎn)品的主要部分及其檢測(cè)方法如同實(shí)施例一。主要檢測(cè)醫(yī)學(xué)臨床微生物(病毒)經(jīng)常檢測(cè)的種類(lèi)，計(jì)有葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腸球菌、嗜血桿菌、沙門(mén)菌、大腸埃希菌、結(jié)核菌、李斯特菌、銅綠甲單胞菌、厭氧菌、克雷伯菌、變形桿菌、淋球菌、鉤端螺旋體、放線菌、腦膜炎奈瑟菌、白喉菌、念珠菌、百日咳菌、腸道細(xì)菌、曲霉菌、彎曲菌、志賀菌、弧菌、副溶血弧菌、梅毒、棒狀桿菌、真菌、莫拉菌、幽門(mén)螺旋菌、軍團(tuán)菌；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、乳頭瘤病毒、人巨細(xì)胞病毒、EB病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒I型(II型)、柯薩奇病毒、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒、乙型腦炎病毒、骨髓灰質(zhì)炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、HIV、ECHO病毒、森林腦炎病毒、登革病毒、漢坦病毒、新疆出血熱病毒、狂犬病病毒。
實(shí)施例六。通過(guò)核酸對(duì)商品進(jìn)出品檢驗(yàn)的檢測(cè)。對(duì)于進(jìn)出口的食品、動(dòng)物、植物按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微物(病毒)檢測(cè)。進(jìn)出口的商品范圍廣泛，所檢的生物(病毒)種類(lèi)多，變化也較快。檢測(cè)方法與程序參照實(shí)施例一，對(duì)于進(jìn)出口的食品的商檢參照實(shí)施例二。進(jìn)出口商檢包括動(dòng)物、植物、物種鑒定、轉(zhuǎn)基因品種等，對(duì)動(dòng)、植物主要是進(jìn)行病毒的檢測(cè)，如雞瘟病毒、瘋牛病病原、口蹄疫病毒等等，1999年國(guó)際第七次病毒標(biāo)準(zhǔn)約有4000種，按照核酸分類(lèi)共八大類(lèi)，即DNA—單股DNA病毒，DNA—雙股DNA病毒，DNA與RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，RNA病毒—雙股RNA病毒，RNA病毒—負(fù)鏈、單股RNA病毒，RNA病毒—正鏈、單股RNA病毒，裸露RNA病毒及類(lèi)病毒。本產(chǎn)品根據(jù)國(guó)家、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)在產(chǎn)品設(shè)計(jì)上約有以上八大類(lèi)中百余種病毒，根據(jù)不同的商品，時(shí)期性、標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例七。通過(guò)核酸用于人員檢疫的檢測(cè)。主要是針對(duì)傳染病病毒設(shè)計(jì)的，主要用于進(jìn)出境人員檢疫等。檢測(cè)方法與程序參照實(shí)施例一、實(shí)施例四。該類(lèi)試劑盒所不同的是①主要是檢測(cè)引發(fā)傳染病的病毒；②檢測(cè)種類(lèi)較少；③主要是定性檢測(cè)。具體檢測(cè)的種類(lèi)依照國(guó)家最新標(biāo)準(zhǔn)。
本方法對(duì)樣品中病毒的檢測(cè)與對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)略有不同①使用與病毒有親和性的親和試劑(帶有抗體的順磁性微顆粒)，富集時(shí)也可在常溫下進(jìn)行，用生理鹽水取代增菌液；②逆轉(zhuǎn)錄，可用與RNA病毒有專(zhuān)一性的核酸引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，對(duì)DNA病毒無(wú)須進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
本方法所述的標(biāo)準(zhǔn)樣與固化引物可在產(chǎn)品出廠前已配制好，在使用時(shí)只加稀釋液；或者是標(biāo)準(zhǔn)樣、固化引物、稀釋液已配置好。
本方法所述的親和試劑為附有特異性的抗體蛋白的顆粒，或附有特異性的核酸探針?lè)肿拥念w粒。微顆粒的體積≤4mm3，具有順磁性。
本方法所述的固化引物是專(zhuān)一試劑(如核酸引物)和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99％；或者是專(zhuān)一試劑及通用試劑和添加劑的復(fù)合物，添加劑在最終反應(yīng)中的濃度不高于20％。
本方法所述的固化引物可以用機(jī)械的方法制成小顆粒狀或薄片狀，其每個(gè)體積≤8mm3。制成小顆粒狀或薄片狀的固化引物可以粘接固定在反應(yīng)器的孔內(nèi)。
本方法所述的親和試劑為磁性顆粒與核酸片段或抗體的復(fù)合體，靶物為微生物或其所具有的多糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸。
親和試劑與靶物(分子)的結(jié)合(識(shí)別)是通過(guò)免疫反應(yīng)或核酸分子雜交而實(shí)現(xiàn)。
本方法所述的靶分子擴(kuò)增是通過(guò)PCR反應(yīng)，所被擴(kuò)增的靶分子是被檢生物所專(zhuān)有的RNA或DNA、cDNA或是專(zhuān)一性地連接到抗體或抗原的核酸分子或片段。
本方法可用于動(dòng)、植物和微生物(病毒)及生物大分子的鑒定，包括物種鑒定、多態(tài)性鑒定、核酸分子數(shù)量鑒定、遺傳特征測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸或其它生物大分子的檢測(cè)。這些鑒定和檢測(cè)是通過(guò)對(duì)靶物核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本方法可制成①試劑盒，試劑盒包括相關(guān)的反應(yīng)引物和生物化學(xué)試劑；②生物芯片或反應(yīng)器；③相關(guān)的電腦軟件(數(shù)據(jù)分析以及使用說(shuō)明)；④相關(guān)的檢測(cè)儀器。
權(quán)利要求
1.一種廣譜的生物分子檢測(cè)方法，其特征是用親和試劑對(duì)檢驗(yàn)樣品中的靶物進(jìn)行特異性富集，提取靶分子，然后把靶分子放入反應(yīng)器內(nèi)置有固化引物的反應(yīng)孔中，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)各孔內(nèi)的固化引物融化并共同參與擴(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)做出結(jié)果分析。
2.實(shí)施一種廣譜的生物分子檢測(cè)方法所用的裝置，其特征是反應(yīng)器上設(shè)置有數(shù)個(gè)微型不透孔，微型不透孔內(nèi)置有固化引物。
3.一種廣譜的生物分子檢測(cè)方法，其特征是檢測(cè)方法是按照以下步驟進(jìn)行的①靶物的富集；②提取靶分子；③放入反應(yīng)器與固化引物結(jié)合；④DNA擴(kuò)增；⑤信號(hào)采集；⑥結(jié)果分析。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是與核酸靶分子直接連接起來(lái)的抗體或抗原形成復(fù)合體結(jié)構(gòu)，提取核酸靶分子將其擴(kuò)增，并對(duì)核酸靶分子進(jìn)行定性定量分析，并由此間接推出蛋白質(zhì)的性質(zhì)與數(shù)量。
5.如權(quán)利要求1、3所述，其特征是本發(fā)明在使用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增時(shí)，信號(hào)采集與結(jié)果分析是實(shí)時(shí)讀出結(jié)論，減少信號(hào)采集與結(jié)果分析步驟。
6.如權(quán)利要求1、3所述方法，其特征是標(biāo)準(zhǔn)樣做為靶分子的參照物從第①步靶物的富集一直到結(jié)果分析共同參與全過(guò)程，是進(jìn)行定量分析的重要參照指標(biāo)。
7.如權(quán)利要求1所述方法，其特征是親和試劑是附有特異性的抗體蛋白的顆粒，并具順磁性，特異性富集通過(guò)免疫反應(yīng)進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1所述，其特征是親和試劑是附有特異性的核酸探針?lè)肿拥念w粒，并具順磁性，特異性富集通過(guò)核酸分子雜交進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是固化引物是專(zhuān)一試劑和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99％。
10.如權(quán)利要求1、2所述，其特征是一種成小顆粒狀的固化引物，其體積≤8mm3。
全文摘要
一種廣譜的生物分子檢測(cè)方法，是利用了酶免吸附原理制作了親和試劑，用親和試劑純化了待檢的樣品，然后放入了平行多元的反應(yīng)器(生物芯片)中與固化引物結(jié)合，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是貫通了ELISA、生物芯片、PCR技術(shù)集合了其優(yōu)勢(shì)，能同時(shí)檢測(cè)多種核酸、蛋白質(zhì)或其它生物大分子，提高了檢測(cè)精度和效率，減少了檢測(cè)樣品和工序，對(duì)樣品的處理簡(jiǎn)化使操作和使用更加簡(jiǎn)便。本方法可對(duì)人體、動(dòng)植物、微生物、食品、環(huán)境等進(jìn)行檢測(cè)，用于疾病診斷、食品檢測(cè)、商檢、環(huán)保評(píng)估檢疫等。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1570631SQ20041003494
公開(kāi)日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日
發(fā)明者吳昌 申請(qǐng)人:吳昌