專利名稱：含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血液樣品預處理方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血漿或血清生物樣品的預處理方法，更具體地說涉及含馬兜鈴酸(馬兜鈴酸I、II)及其內酰胺類成分(馬兜鈴內酰胺I、II)的血漿或血清樣品酸化后采用乙酸乙酯進行萃取處理的血漿或血清樣品預處理方法。
背景技術：
馬兜鈴酸類成分是馬兜鈴屬植物的主要活性成分，同時也是導致服用此類中草藥及其成方制劑造成腎功能損傷的直接原因。馬兜鈴內酰胺類成分為馬兜鈴酸類成分的衍生物，廣泛分布于臨床使用的中藥材中，文獻報道了馬兜鈴內酰胺I對腎小管上皮細胞具有損傷作用(李彪等，馬兜鈴內酰胺I對腎小管上皮細胞的損傷作用.中國中藥雜志，2004，29(1)78-83)。體內代謝產(chǎn)物研究結果表明馬兜鈴內酰胺I(Alt I)、II(Alt II)為馬兜鈴酸I(AAI)、II(AAII)的代謝產(chǎn)物(G Krumbiegel，et al，Studies on the metabolism of aristolochicacids I and II.Xenobiotica，1987，17(8)981)；基因致癌物馬兜鈴酸的DNA加合物結構式中馬兜鈴酸以其相應的內酰胺形式存在(Joelle L.Nortier et al，Urothelial carcinoma associated with the use of a Chinese herb(Aristolochia fangchi).The New England Journal ofMedicine.Boston，2000，342(23)1686)。
馬兜鈴酸類成分與其相應的內酰胺類成分結構相似，二者在生物體內的轉化關系與及基因致癌物馬兜鈴酸的DNA加合物的形成機制目前均還不清楚；另外，能夠導致馬兜鈴酸腎病的致病成分也還不清楚。因此患者體內馬兜鈴酸及其酰胺類成分的檢測，對于監(jiān)測服用含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分藥物造成的腎損傷情況具有重要意義。而目前此方面的分析報道甚少，適用于高效液相色譜法(HPLC)測定的含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分人血漿或血清樣品預處理方法尚未見報道。僅一篇文獻中報道了含馬兜鈴酸I的兔血漿生物樣品預處理方法(Tsai，Tung Hu.etal，Determination of aristolochic acid in rabbit plasma by high-performance liquid chromatography with photodiode-arrayultraviolet detection and its pharmacokinetics application.J.Liq Chromatogr.1993.16(5)，1173-82)，所采用的血漿預處理方法為乙腈沉淀法。目前血漿樣品預處理常用的方法為蛋白沉淀法和溶劑萃取法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血液(血漿或血清)樣品預處理方法。
本發(fā)明采用含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分的血漿樣品酸化后以乙酸乙酯進行萃取處理的預處理方法。針對影響馬兜鈴酸及其內酰胺類成分提取回收率的影響因素，如萃取溶劑用量、加入鹽酸濃度等進行了篩選；同時還設計了正交試驗和驗證實驗對其它操作條件進行了優(yōu)化，最終獲得了對含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分的血漿或血清樣品均有較高提取回收率(均大于95％)的預處理方法。本發(fā)明包括以下四方面內容1.色譜條件C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)流動相A∶B＝1％醋酸/30m mol/L三乙胺∶乙腈(35％B→100％B)柱溫15℃進樣體積20μL檢測波長260nm(Alt I、Alt II)；250nm(AA I、AA II)
人血漿分離色譜圖，見說明書附

圖1。
2.萃取溶劑用量的確定-20℃保存空白血漿，37℃水浴解凍，分別取1mL血漿，加入60μL混和對照品溶液(其中AltII、AAII、AltI、AAI的濃度分別為9.80、10.1、10.3、6.60μg/mL)，渦旋混勻1min，加入5mol·L-1鹽酸溶液10μL，渦旋混勻1min，40℃水浴30min，放冷至室溫，分別采用乙酸乙酯3mL萃取一次；5mL萃取一次；6mL分二次加入(3mL，3mL)萃取后合并上清液；7mL分三次加入(3mL，3mL，1mL)萃取后合并上清液。萃取后的上清液分別在40℃水浴下氮氣揮干(約40～60min)，殘渣加150μL甲醇溶解，過濾(0.45μm)至100μL進樣小瓶中。4℃保存。進樣體積20μL。實驗結果表明分別采用3mL、5mL萃取一次血漿中四種成分提取回收率均低于90％，6mL(3mL，3mL)分二次萃取后合并上清液得到的血漿中四種成分提取回收率均較高且接近100％。因此萃取溶劑用量確定為1mL血漿加入6mL乙酸乙酯，分二次加入(3mL，3mL)萃取后合并上清液。
3.鹽酸濃度的確定-20℃保存空白血漿，37℃水浴解凍，分別取1mL血漿加到7mL塑料離心管中，分別加入60μL混和對照品溶液(其中AltII、AAII、AltI、AAI的濃度分別為9.80、10.1、10.3、6.60μg/mL)，渦旋混勻1min后分別加入1mol·L-1、3mol·L-1、5mol·L-1、7mol·L-1、10mol·L-1鹽酸溶液10μL，渦旋混勻1min，40℃水浴30min，放冷至室溫，6mL乙酸乙酯分二次加入(3mL，3mL)萃取，分別渦旋混合1min，合并上清液。萃取后的上清液在40℃水浴下氮氣揮干溶劑(約40～60min)，殘渣加150μL甲醇溶解，過濾(0.45μm)至100μL進樣小瓶中。4℃保存。進樣體積20μL。實驗結果表明加入鹽酸濃度較低為1mol·L-1時，AAI、AAII的提取回收率均低于50％；加入鹽酸濃度較高為10mol·L-1時，AAI、AAII的提取回收率低于90％；加入5mol·L-1鹽酸酸化后，血漿中四種目標成分的提取回收率最高且接近100％。因此血漿或血清樣品酸化時加入鹽酸的濃度確定為1mL血漿或血清加入5mol·L-1鹽酸溶液10μL。
4.其它操作條件的優(yōu)化為了考察樣品處理過程中的水浴溫度、水浴時間、揮干溫度等其它操作條件對加入鹽酸酸化后的血漿樣品中四種目標成分提取回收率的影響，我們設計了L9(34)正交表(見表1)對血漿樣品處理條件進行了進一步的優(yōu)化。樣品預處理方法為取1mL血漿，分別加入60μL混和對照品溶液，萃取溶劑用量為6mL，分二次(3mL，3mL)萃取后合并上清液的樣品預處理方法，按正交表設計正交試驗方案(見表2)處理樣品并進行四種目標成分的HPLC峰面積測定。以血漿中四種目標成分的總平均提取回收率作為衡量指標。
表1 L9(34)正交表因素A B C D水平 鹽酸濃度水浴溫度水浴時間揮干溫度1 0mol·L-120℃ 15min 20℃2 5mol·L-140℃ 30min 40℃3 10mol·L-150℃ 45min 60℃
表2正交試驗方案及結果實驗號 ABCD 平均回收率11111 43.521222 43.731333 43.242123 86.152231 88.362312 80.473132 91.283213 79.293321 74.0k1 130.4220.8203.1205.8 629.5k2 254.7211.2203.8215.3 CTk3 244.5197.6222.7208.4 44034.44k1平均 43.5 73.6 67.7 68.6k2平均 84.9 70.4 67.9 71.8k3平均 81.5 65.9 74.2 69.5R 41.4 7.7 6.5 3.2k1^216995.22 48744.03 41233.55 42335.32k2^264878.44 44600.04 41521.78 46371.59k3^259757.46 39031.47 49596.25 43445.34Q 47210.37 44125.18 44117.20 44050.75Q-CT3175.93 90.7482.7516.30從極差分析結果(R值)可以直觀地看出，血漿中馬兜鈴酸及其內酰胺類成分提取回收率的影響因素A＞B＞C＞D；各因素的最優(yōu)水平組合為A2B1C3D2。對上述結果進行方差分析(見表3)表3正交試驗方差分析方差來源 離差平方和自由度 均方F值 P值因素A 3175.932 1587.97 194.84 ＜0.01因素B 90.74 2 45.37 5.57＞0.05因素C 82.75 2 41.38 5.08＞0.05因素D 16.30 2 8.15總和 3365.72從方差分析表結果可以看出，A(鹽酸濃度)為影響血漿中四種目標成分提取回收率的主要因素(P＜0.01)，其余因素為次要因素，從而進一步說明含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品處理過程中加入鹽酸酸化的必要性。隨后對正交試驗結果進行驗證實驗(見表4)，設計了A2B1C3D2、A3B1C3D2、A2B2C2D2并對其結果進行了比較(表5)。
表4正交驗證實驗設計樣品處理條件A B C D優(yōu)化條件15mol·L-1(A2) 20□(B1) 45min(C3) 40□(D2)優(yōu)化條件210mol·L-1(A3) 20℃(B1) 45min(C3) 40□(D2)組合條件35mol·L-1(A2) 40□(B2) 30min(C2) 40□(D2)
表5正交驗證實驗結果平均提取回收率(％)平均樣品處理條件 AltII AAII AltI AAI 回收率(％)優(yōu)化條件1 94.998.9 99.7 100.2 98.4優(yōu)化條件2 97.2±1.7 105.3±2.4 98.4±0.1 104.6±3.0101.4組合條件3 94.3±2.9 100.2±4.1 94.0±4.2 102.0±4.997.6注釋正交驗證實驗中制備兩份樣品；優(yōu)化條件1中的一份樣品操作時出現(xiàn)誤差，因此平均值僅為一份樣品的計算值。
在正交驗證的三種組合條件下，血漿中四種目標成分的提取回收率均大于95％，說明此三種方法均可用作血漿或血清樣品的預處理方法。同時，考慮到鹽酸濃度太大對樣品的穩(wěn)定性具有一定的影響，因此根據(jù)正交試驗及正交驗證實驗結果將血漿或血清樣品預處理方法中的其它操作條件優(yōu)化為取1mL血漿，加入5mol·L-1鹽酸溶液10μL，20℃水浴45min，40℃水浴氮氣揮干。
具體實施例方式
由于患者血漿或血清中馬兜鈴酸及其內酰胺類成分的情況未知，不能保證馬兜鈴酸及其內酰胺類成分同時存在于人血漿或血清樣品中，因此我們采用關木通水煎液(濃度分別為6g/mL、4g/mL)灌喂SD雄性大鼠獲得含藥血漿，再采用本發(fā)明方法對給藥血漿進行預處理和HPLC檢測，同時將本發(fā)明方法與常用的蛋白沉淀法進行比較。實施本發(fā)明的具體步驟包括1.色譜條件色譜柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)流動相A∶B＝1％醋酸/30m mol/L三乙胺∶乙腈(35％B→100％B)柱溫15℃進樣體積20μL檢測波長260nm(AltI、AltII)；250nm(AAI、AAII)。
2.樣品處理方法(1)本發(fā)明方法取灌喂關木通水煎液(濃度為6g/mL、4g/mL)的給藥大鼠血漿1mL至于7mL塑料離心管中，加入5mol·L-1鹽酸溶液10μL，渦旋混合，40℃水浴30min，放冷至室溫，6mL乙酸乙酯分兩次加入(3mL，3mL)萃取，分別渦旋混合，合并上清液；萃取后的上清液40℃水浴下氮氣揮干，殘渣加150μL甲醇溶解，過濾，取濾液20μL進行HPLC檢測。
(2)蛋白沉淀法 取灌喂關木通水煎液(濃度為6g/mL、4g/mL)取給藥大鼠血漿1mL至于7mL塑料離心管中，加入3mL乙腈/無水乙醇/二甲基甲酰胺(DMF)混合液(30∶10∶5)，渦旋混合1min，12000轉/分，離心5min，取上清液，60℃水浴下氮氣揮干溶劑，殘渣加150μL甲醇溶解，過濾，取濾液20μL進行HPLC檢測。
3.色譜峰峰面積的HPLC測定從說明書附圖2中可以看到本發(fā)明方法與蛋白沉淀法相比，色譜圖中極性較大的內源性色譜峰較少且強度較弱，說明本發(fā)明方法能夠減小血漿中極性較大的內源性物質對色譜柱造成的污染；另外，本發(fā)明方法制備得到的血漿色譜圖中四個目標成分的色譜峰均完全分離且峰形較好。從表6的HPLC色譜峰面積測定結果可以看出本發(fā)明方法制備得到的血漿中四種目標成分的峰面積值均高于蛋白沉淀法，尤其是藥材中所含比例較低的馬兜鈴內酰胺I和II的峰面積值有較大增加。
表6本發(fā)明方法與蛋白沉淀法制備的給藥大鼠血漿HPLC測定結果比較給藥劑量給藥后 處理方法色譜峰面積(mAU)SD大鼠(關木通水煎液) 取血 AltII AAII AltI AAI 體重時間 (雄性)6g/mL×3mL×3d 24h蛋白沉淀法9.720695.415.3 1482.8 197～208g6g/mL×3mL×3d 24h本發(fā)明方法21.7 22196.833.1 1573.34g/mL×3mL×3d 24h蛋白沉淀法4.810157.09.2201.6197～208g4g/mL×3mL×3d 24h本發(fā)明方法19.2 11586.918.5 218.權利要求
1.一種含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品預處理方法，其特征在于取1mL血漿或血清樣品，加入鹽酸(使每毫升血漿或血清中鹽酸濃度范圍在3.0×10-5～1.0×10-4mol.mL-1內)后渦旋混勻，室溫放置30～60min；采用乙酸乙酯萃取1～2次，每次3～5mL，渦旋混合萃取，收集上清液；萃取所得上清液在60℃以下水浴中氮氣揮干溶劑，殘渣加150μL甲醇溶解，過濾，取20μL濾液進行高效液相色譜法檢測。方法中所述的血漿或血清包括人、大鼠、小鼠、家兔等。
2.根據(jù)權利要求1所述含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品預處理方法，其特征在于血漿或血清為人血漿或人血清。
3.根據(jù)權利要求1所述含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品預處理方法，其特征在于加入5mol·L-1鹽酸，此時每毫升血漿或血清中鹽酸濃度為5×10-5mol.mL-1。
4.根據(jù)權利要求1所述含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品預處理方法，其特征在于室溫溫度為20℃時放置45min。
5.根據(jù)權利要求1所述含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品預處理方法，其特征在于采用乙酸乙酯萃取2次，每次3mL，合并上清液。
6.根據(jù)權利要求1所述含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品預處理方法，其特征在于40℃水浴下氮氣揮干溶劑。
7.根據(jù)權利要求1～6所述含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品預處理方法，其特征在于可從血漿或血清樣品中同時提取馬兜鈴酸及其內酰胺類成分，并進行高效液相色譜法檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分血漿或血清樣品預處理方法，其特點為含馬兜鈴酸及其內酰胺類成分的血漿或血清樣品用鹽酸酸化后采用乙酸乙酯進行萃取處理。血漿或血清樣品加入鹽酸(使每毫升血漿或血清中的鹽酸濃度范圍在3.0×10
文檔編號G01N1/28GK1690686SQ20041003384
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月19日 優(yōu)先權日2004年4月19日
發(fā)明者高小麗, 王璇, 蔡少青 申請人:北京大學