專利名稱：甘蔗花葉病毒云南分離物tas－elisa檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)產(chǎn)品，具體涉及一種甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaicvirus，SCMV)云南分離物三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(TAS-ELISA)檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
植物病毒是農(nóng)作物病毒病害的重要病原，隨著植物脫病毒種苗產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展和現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)的興起，植物病毒的檢測與防控技術(shù)日益受到重視。目前植物病毒的檢測技術(shù)有血清學(xué)技術(shù)、指示植物測定、電子顯微鏡檢測、分子檢測(包括對病毒核酸及蛋白的檢測)4個方面的方法。各種方法相互印證，同時又存在檢測的靈敏度、?；浴⒃O(shè)備設(shè)施條件及成本等因素的局限。各國都在探索簡便、快速、準(zhǔn)確而又經(jīng)濟的檢測辦法，其中以血清學(xué)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-Linked immunosorbent assay，ELISA)是被廣泛改進和應(yīng)用的方法。
1969年，Avrameas將酶聯(lián)抗體應(yīng)用于血清學(xué)技術(shù)中，1971年Engvall和Perlmann將該方法進一步完善發(fā)明了ELISA方法。1974年Voller等將ELISA技術(shù)應(yīng)用于人和動物的抗體檢測，Voller等和Clark、Adams分別于1976年和1977年將ELISA方法應(yīng)用于植物病毒的檢測。之后，ELISA方法得到進一步發(fā)展，并廣泛應(yīng)用人和動植物病毒的檢測中。與其它檢測方法相比，ELISA方法具有成本顯著降低，檢測的設(shè)備設(shè)施簡單，快速高效的特點，并始終在不斷被改進中，有直接ELISA、間接ELISA(I-ELISA)、單抗體ELISA(SPA-ELISA)。微波ELISA、雙抗體夾心ELISA(Double-antibody sandwich-ELISA，DAS-ELISA)等。目前市售的ELISA檢測試劑盒主要有I-ELISA和DAS-ELISA。如美國的Agdia公司，英國的PD公司、意大利的Agritest公司、德國的Loewe生物技術(shù)公司、瑞士的BIOREBA公司是植物病毒檢測試劑盒的主要營銷公司。我國的植物病毒檢測試劑盒銷售公司大多為這些公司的代理或進口試劑盒分裝銷售，也有自行研制的報道，但涉及植物病毒種類較少。
目前市售的ELISA檢測試劑盒可用于脫毒種苗和植物病毒樣品的批量化檢測，但同時也存在非特異性反應(yīng)(即假陽性或假陰性反應(yīng))、檢測靈敏度不夠高(一般為1ng/ml-10ng/ml病毒濃度)。尤其在我國，許多種類的植物病毒抗體依賴于進口，一方面受到進口血液制品的限制，難以穩(wěn)定供應(yīng)，另一方面國外的抗體生產(chǎn)成本高而導(dǎo)致價格昂貴，未能滿足生產(chǎn)的需求。近年來國外的相關(guān)公司對植物病毒檢測試劑盒進行了改進，進一步簡化了操作程序，如英國PD公司的試紙條檢測方法已實現(xiàn)商品化生產(chǎn)，但價格高昂，每樣次的檢測需100多元人民幣。國內(nèi)外生產(chǎn)中規(guī)?；瘧?yīng)用的仍然是I-ELISA和DAS-ELISA檢測試劑盒，根據(jù)病毒種類的不同，每樣次的試劑成本約10-30元人民幣不等。
Roggero和Ogliara等1996年在DAS-ELISA基礎(chǔ)上，加入單克隆抗體，開展了番茄班萎病毒(TSWV)的三抗體夾心ELISA(Triple-antibody sandwich ELISA，TAS-ELISA)檢測，繼承了DAS-ELISA簡便快速的優(yōu)勢，同時結(jié)合了單克隆抗體?；詮?、靈敏度高的特點，可高效、快速和靈敏地檢測待測樣中的病毒抗原。本發(fā)明的技術(shù)人員近年來用TAS-ELISA檢測了雙生病毒云南分離物(已發(fā)表多篇相關(guān)論文)，郭興啟等(2003)應(yīng)用TAS-ELISA檢測了馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)、美國和我國臺灣分別報道了TAS-ELISA檢測康乃馨蝕環(huán)病毒(CarERV)和壞死病毒(LNV)，F(xiàn)ranconi(2002)報道了TAS-ELISA檢測PVX，Bowman等(2002)應(yīng)用該辦法檢測黃瓜花葉病毒(CMV)，Tavert等(2002)應(yīng)用TAS-ELISA檢測煙草花葉病毒(TMV)運動蛋白。目前從現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道來看，有關(guān)TAS-ELISA方法研究植物病毒的報道近年雖然有所增加，但專門研制TAS-ELISA檢測試劑盒應(yīng)用于植物病毒的規(guī)?；瘷z測尚未發(fā)現(xiàn)，同時市場中尚無TAS-ELISA檢測試劑盒的出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確性強、高效的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒的制備方法，該方法簡便易行、易于規(guī)?；a(chǎn)。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的甘蔗花葉病毒云南分離物三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(TAS-ELISA)檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的用液，盒體內(nèi)的用液包括陽性對照、陰性對照、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物，其特征在于，盒體內(nèi)的用液還包括煙草花葉病毒多克隆抗體、甘蔗花葉病毒單克隆抗體，所述的甘蔗花葉病毒多克隆抗體和所述的甘蔗花葉病毒單克隆抗體由35-45mg/ml病毒濃度的甘蔗花葉病毒提取液作為免疫抗原，分別采用免疫家兔和免疫小鼠法制備而成。
所述的甘蔗花葉病毒提取液的制備方法為先將含有甘蔗花葉病毒(SCMV)的病葉剪碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1～3(克/毫升)，勻漿，過濾，濾液中加入濾液體積的20～30％氯仿，攪拌，收集上清液，然后在上清液中加入聚乙二醇(PEG)至濃度為4～10％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后靜置取沉淀，沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液懸浮離心處理，沉淀用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮，離心，重復(fù)三次，合并上清，取上清液加入離心管離心，沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，離心，上清液即為病毒提純液。
具體地說，所述的甘蔗花葉病毒提取液的制備方法為1)病葉剪碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1(克/毫升)，攪拌充分勻漿，紗布過濾；2)濾液中加入濾液體積20～30％氯仿，攪拌20～40min，4℃下離心力為3000g下離心10～30min，收集上清；3)上清液中加入聚乙二醇(PEG)至濃度為4～10％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后4℃下放置4h～24h；4℃下離心力為10000g下離心10～30min；4)沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液在pH7.4～7.5下懸??；4℃下離心力為10000g下離心10～20min；5)沉淀用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)在pH7.4～7.5下懸浮，4℃下離心力為10000g下離心10～20min。重復(fù)三次，合并上清，取上清液；6)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下10000g，離心2～3h，沉淀用pH7.4～7.5，含0.01M MgCl2的0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，低速離心，，取上清液即為病毒提純液。
經(jīng)檢測，本發(fā)明所述的病毒提純液為乳白色液體，病毒濃度為35～45mg/ml。本發(fā)明所述的病毒提純液純度及含量采用電鏡負(fù)染法及紫外分光光度儀進行檢測，具體方法為1.電鏡負(fù)染法檢測病毒的純度病毒提純液上置電鏡銅網(wǎng)吸附3min，2％鉬酸銨染色3min，放置5min，置于JEM100CX-II型透射電子顯微鏡下觀察。在電鏡下觀察，可見其含大量的SCMV病毒粒子，未見雜質(zhì)。
2.檢測病毒的純度及含量病毒提純液用PBS緩沖液稀釋10倍于BECKMAN DU640型紫外分光光度儀上測定190nm-450nm全波長掃描圖、260nm和280nm吸收值。
病毒提純液經(jīng)紫外分光光度儀檢測，190nm～450nm全波長掃描圖顯示為典型病毒掃描圖，所得病毒濃度為35～45mg/ml。其中優(yōu)選的提純樣品稀釋100倍液中A260＝1.140，A280＝1.382，A260/A280＝0.825，病毒濃度＝A260/A0.1％260＝1.140/2.7×10＝42.22mg/ml。每100克病葉得病毒45mg。
所述的抽提緩沖液為0.02M磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH為7.4～7.5，含0.1％巰基乙醇，0.01M EDTA。
本發(fā)明所述的勻漿、過濾、離心和懸浮，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù)。
其中，所述的甘蔗花葉病毒(SCMV)云南分離物多克隆抗體由35～45mg/ml病毒濃度的甘蔗花葉病毒提取液作為免疫抗原，采用免疫注射法制備而成。其制備方法為選用2公斤以上健康雄性家兔作為免疫動物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
然后進行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點注射，每點0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分離物多克隆抗體。
對所采集的SCMV云南分離物多克隆抗體進行檢測分析，將病毒提純液稀釋至0.01mg/ml，備用。將多克隆抗體倍比稀釋為1/10、1/20、1/40......1/20480，以間接ELISA法測定抗體效價。結(jié)果，經(jīng)四次免疫家兔后采血，分離得到40ml抗血清，間接ELISA法測的效價為1∶5000-6000。
將多克隆抗體稀釋至1mg/ml，備用。將病毒提純液稀釋為1mg/ml、0.1mg/ml0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml、0.000001mg/ml，以間接ELISA法測定抗體靈敏度。結(jié)果，經(jīng)四次免疫家兔后采血，分離得到40ml抗血清，最低檢出濃度(檢測靈敏度)達(dá)0.01-0.001 ng/ml。
在組裝本發(fā)明所述的試劑盒時，所述的多克隆抗體可將所得的多克隆抗血清中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封、冷貯(-70℃)、備用。在使用時可保存于4℃中，不宜反復(fù)凍融，有效期2年。每個試劑盒中100ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋。
所述的甘蔗花葉病毒單克隆抗體由35-45mg/ml病毒濃度的甘蔗花葉病毒提取液作為免疫抗原，采用克隆抗體法制備而成。其制備方法選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體。
對所得單克隆抗體進行分析，篩選出一個SCMV廣譜單克隆抗體細(xì)胞株，間接ELISA測定抗體效價為1∶5000～10000。
在組裝本發(fā)明所述的試劑盒時，所述的單克隆抗體可將制備的抗體中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封，4℃保存，備用。每個試劑盒中100ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋。
本發(fā)明所述的甘蔗花葉病毒云南分離物三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(TAS-ELISA)檢測試劑盒中，所述的陽性對照采用含甘蔗花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，離心力2000g下離心10min，取上清在冷凍干燥機制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
所述的陰性對照采用無病毒煙葉，同制備陽性對照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
本發(fā)明所述的試劑盒中所述的酶標(biāo)抗體為羊抗鼠AP-IgG，分裝，4℃保存，備用。每個試劑盒中5ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋，可由Sigma公司購買。
其他主要材料及藥品可按溶液體積稱量分裝，常溫下保存。
所述的緩沖液包括包被緩沖液、病毒抽提緩沖液、封閉緩沖液、底物緩沖液，具體用量如下①包被緩沖液每個試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6；
②PBST每個試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g溶解于1000ml雙蒸水中，加入0.5％tween20(吐溫-20)充分混合；③病毒抽提緩沖液每個試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；④封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；⑤底物緩沖液每個試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽(p-NPP)。
本發(fā)明所述的試劑盒可根據(jù)應(yīng)用單位的實際需求，可組裝成每個試劑盒檢測500個樣次的抗體及藥品試劑量，可備用適量的滴管，比如20個一次性滴管。
本發(fā)明所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟先將甘蔗花葉病毒進行分離提純得病毒提取液，然后采用病毒提取液進行甘蔗花葉病毒多克隆抗體及單克隆抗體的制備，再對陽性對照、陰性對照、多克隆抗體、單克隆抗體、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物進行制備組裝而成。
具體地說，所述的試劑盒的制備方法，包括如下步驟1.所述的甘蔗花葉病毒的分離提純先將含有甘蔗花葉病毒(SCMV)的病葉剪碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1-3(克/毫升)，勻漿，過濾，濾液中加入濾液體積的20-30％氯仿，攪拌，收集上清液，然后在上清液中加入聚乙二醇(PEG)至濃度為4-10％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后靜置取沉淀，沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液懸浮離心處理，沉淀用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮，離心，重復(fù)三次，合并上清，取上清液加入離心管離心，沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，離心，上清液即為病毒提純液，所得病毒濃度為35～45mg/ml；2.SCMV多克隆抗體的制備選用2公斤以上健康雄性家兔作為免疫動物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
然后進行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點注射，每點0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；
7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分離物多克隆抗體。
3.SCMV單克隆抗體的制備選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體。
4.試劑盒的組裝(1)陽性對照采用含甘蔗花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，2000g離心10min，取上清在冷凍干燥機制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
(2)陰性對照采用無病毒甘蔗葉，同制備陽性對照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
(3)多克隆抗體將所得的多克隆抗血清中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封、冷貯(-70℃)、備用。在使用時可保存于4℃中，不宜反復(fù)凍融，有效期2年。每個試劑盒中100ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋。
(4)單克隆抗體將制備的抗體中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封，4℃保存，備用。每個試劑盒中100ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋。
(5)酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體為羊抗鼠AP-IgG，分裝，4℃保存，備用。每個試劑盒中5ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶1000稀釋。
(6)其他主要材料及藥品①包被緩沖液每個試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6；②PBST每個試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g溶解于1000ml雙蒸水中，加入0.5％tween20(吐溫-20)充分混合；③病毒抽提緩沖液每個試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3g
NaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；④封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；⑤底物緩沖液每個試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽(p-NPP)。
其中，所述的甘蔗花葉病毒分離提純的方法為1)病葉剪碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1(克/毫升)，攪拌充分勻漿，紗布過濾；2)濾液中加入20-30％氯仿，攪拌20-40min，4℃下離心力為3000g下離心10-30min，收集上清；3)上清液中加入聚乙二醇(PEG)至濃度為4-10％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后4℃下放置4h-24h；4℃下離心力為10000g下離心10-30min；4)沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液在pH7.4-7.5下懸??；4℃下離心力為10000g下離心10-20min；5)沉淀用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)在pH7.4-7.5下懸浮，4℃下離心力為10000g下離心10-20min。重復(fù)三次，合并上清，取上清液；6)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下10000g，離心2-3h，沉淀用pH7.4-7.5，含0.01M MgCl2的0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，低速離心，取上清液即為病毒提純液。
本發(fā)明的研究人員在已有ELISA檢測試劑盒的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多年的研究，研制出TAS-ELISA檢測試劑盒，采用本發(fā)明所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒，檢測靈敏度高，檢測靈敏度可達(dá)到0.005～0.01ng/ml，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測靈敏度提高100～1000倍。而且采用本發(fā)明所述的方法制備的TAS-ELISA檢測試劑盒，試劑成本便宜，易于實現(xiàn)批量化生產(chǎn)，僅2元人民幣/樣次，在性價比上具有明顯的市場競爭力，對于研究、免疫和防治甘蔗病毒有很大幫助，可應(yīng)用于脫病毒種苗(薯)、種球、工廠化育苗檢測及種質(zhì)材料進出口檢疫。


圖1多克隆抗體免疫注射程序圖2單抗體克隆制備流程具體實施方式
下面實施例進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
實驗例1本實驗例的目的在于研究SCMV云南分離物的TAS-ELISA檢測試劑盒的檢測方法。
本發(fā)明的研究人員對試劑盒的檢測方法進行研究，總結(jié)出本發(fā)明所述的TAS-ELISA檢測試劑盒進行甘蔗病毒檢測時的檢測方法，具體如下1.SCMV多克隆抗體以1∶500倍用包被緩沖液稀釋，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，37℃下放置3h。
2.PBST洗板6次，快速3次，慢速3次，3min/次，拍干。
3.樣品加入5-10倍病毒抽提緩沖液研磨樣品，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，每個樣品加兩個孔，4℃下放置過夜。同時如法設(shè)置陽性、陰性、空白對照。
4.同上洗板。
5.每孔加入150ul封閉緩沖液，37℃下放置30min。
6.拋棄孔中液體，拍干。
7.SCMV單抗以1∶500倍用PBST稀釋，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，37℃下放置3h。
8.同上洗板。
9.酶標(biāo)抗體羊抗鼠AP-IgG以1∶10000倍用PBST稀釋，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，37℃下放置3h。
10.同上洗板。
11.用底物緩沖液溶解底物至1mg/ml，加入酶標(biāo)板，每孔100ul，室溫25℃下至充分顯色，每孔加入50ul 1N NaOH終止顯色。肉眼或酶標(biāo)儀405nm讀數(shù)判別檢測結(jié)果。
實驗例2本實驗例驗證陰陽性判別、檢測靈敏度與準(zhǔn)確率比較。
應(yīng)用酶標(biāo)儀進行檢測結(jié)果判別時，記錄酶標(biāo)儀在405nm波長下酶標(biāo)板每孔的OD數(shù)值，首先進行空白孔系統(tǒng)調(diào)零，若空白孔出現(xiàn)明顯的顏色反應(yīng)，或經(jīng)空白孔調(diào)零后，系統(tǒng)檢測出現(xiàn)大量的負(fù)值時，整個系統(tǒng)測定無效；每一樣品測定雙孔的OD值應(yīng)基本一致，若兩孔測定值差別較大(一般指同一樣品相同稀釋度兩孔的OD值超過其均值的0.5-1.5倍范圍)，該酶標(biāo)板測定無效。若陽性對照OD值低于或接近陰性對照OD值時，測定也無效。待測樣品OD值與陰性對照OD值檢測之比大于等于2.1時，待測樣品為陽性，否則為陰性。
肉眼判別檢測結(jié)果時，首先也是觀察空白孔、陰性孔、陽性孔的顏色，若空白孔、陰性孔顏色較深或陽性孔無顏色或顏色較淺時，則本塊酶標(biāo)板測定無效。目測待測樣品顏色反應(yīng)與陰性對照顏色反應(yīng)深淺對比，較深則為陽性，較淺則為陰性。
本發(fā)明所述的TAS-ELISA檢測試劑盒檢測靈敏度達(dá)到0.005-0.01ng/ml，與電鏡檢測結(jié)果比較準(zhǔn)確率相符，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測靈敏度提高100-100倍。
實施例1本實施例所述的甘蔗花葉病毒云南分離物三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(TAS-ELISA)檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的用液，盒體內(nèi)的用液包括陽性對照、陰性對照、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物，及甘蔗花葉病毒多克隆抗體和甘蔗花葉病毒單克隆抗體，所述的甘蔗花葉病毒多克隆抗體和所述的甘蔗花葉病毒單克隆抗體由42.2mg/ml病毒濃度的甘蔗花葉病毒提取液作為免疫抗原，分別采用免疫家兔和免疫小鼠法制備而成。
本實施例所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟1.甘蔗花葉病毒的分離提純在田間采集病株樣品，經(jīng)電子顯微鏡和標(biāo)準(zhǔn)抗體檢測含有大量SCMV，樣品采集后放入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩３樘峋彌_液為0.2M的磷酸鹽緩沖液PBS(pH7.4，含0.5％巰基乙醇，0.01M EDTA)提純方法1)病葉剪碎。
2)加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1(克/毫升)，電動攪拌機充分勻漿，雙層紗布過濾。
3)濾液中加入30％氯仿，4℃下，離心力為3000g離心30min，收集上清。
4)上清中加入PEG至濃度為8％(克/毫升)，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置4h。
5)4℃下，離心力為10000g離心20min。
6)沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液在pH7.4下懸浮。
7)4℃下，離心力為10000g離心10min。
8)沉淀用0.01M PBS在pH7.4下懸浮，4℃下，離心力為10000g離心10min。重復(fù)三次，合并上清。
9)上清液即為粗提純液。
10)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下，離心力為10000g離心2h，沉淀用pH7.4，含0.01M MgCl2的0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，低速離心，上清液即為病毒提純液。
對所述的病毒提純液純度及含量采用電鏡負(fù)染法及紫外分光光度儀進行檢測，在電鏡下觀察，可見其含大量的SCMV病毒粒子，未見雜質(zhì)；提純樣品稀釋100倍液中A260＝1.140，A280＝1.382，A260/A280＝0.825，病毒濃度＝A260/A0.1％260＝1.140/2.7×10＝42.22mg/ml。每100克病葉得病毒45mg。
2.SCMV多克隆抗體的制備選用2公斤以上健康雄性家兔作為免疫動物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
然后進行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點注射，每點0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；
一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分離物多克隆抗體。
對所采集的SCMV云南分離物多克隆抗體進行檢測分析，將病毒提純液稀釋至0.01mg/ml，備用。將多克隆抗體倍比稀釋為1/10、1/20、1/40......1/20480，以間接ELISA法測定抗體效價。
結(jié)果，經(jīng)四次免疫家兔后采血，分離得到50ml抗血清，間接ELISA法測的效價為1∶5120。
將多克隆抗體稀釋至1mg/ml，備用。將病毒提純液稀釋為1mg/ml、0.1mg/ml0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml、0.000001mg/ml，以間接ELISA法測定抗體靈敏度。
結(jié)果，經(jīng)四次免疫家兔后采血，分離得到40ml抗血清，最低檢出濃度(檢測靈敏度)達(dá)0.01ng/ml。
3.SCMV單克隆抗體的制備選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。
單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體。
對所得單克隆抗體進行分析，篩選出一個SCMV廣譜單克隆抗體細(xì)胞株，間接ELISA測定抗體效價為1∶5000。
4.試劑盒的組裝(1)陽性對照采用含甘蔗花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，2000g離心10min，取上清在冷凍干燥機制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
(2)陰性對照采用無病毒甘蔗葉，同制備陽性對照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
(3)多克隆抗體將所得的多克隆抗血清中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封、冷貯(-70℃)、備用。在使用時可保存于4℃中，不宜反復(fù)凍融，有效期2年。每個試劑盒中100ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋。
(4)單克隆抗體將制備的抗體中加防腐劑0.1％疊氮化鈉(NaN3)，無菌分裝后，密封，4℃保存，備用。每個試劑盒中100ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋。
(5)酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體為羊抗鼠AP-IgG，分裝，4℃保存，備用。每個試劑盒中5ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶1000稀釋。
(6)其他主要材料及藥品
①包被緩沖液每個試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6。
②洗滌液PBST每個試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g加水至1000ml，加入0.5％tween20(吐溫-20)充分混合；③病毒抽提緩沖液每個試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；④封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；⑤底物緩沖液每個試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽(p-NPP)。
本實施例所述的試劑盒可根據(jù)應(yīng)用單位的實際需求，可組裝成每個試劑盒檢測500個樣次的抗體及藥品試劑量，可備用適量的滴管，比如20個一次性滴管。
本實施例所述的檢測試劑盒可用于常規(guī)規(guī)程檢測，檢測靈敏度可達(dá)到0.01ng/ml，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測靈敏度提高100倍。
實施例2其他同實施例1，不同的是，甘蔗花葉病毒的分離提純在田間采集病株樣品，經(jīng)電子顯微鏡和標(biāo)準(zhǔn)抗體檢測含有大量SCMV，樣品采集后放入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。抽提緩沖液為0.2M的磷酸鹽緩沖液PBS(pH7.5含0.5％巰基乙醇，0.01M EDTA)提純方法1)病葉剪碎。
2)加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶3(克/毫升)，電動攪拌機充分勻漿，雙層紗布過濾。
3)濾液中加入25％氯仿，4℃下，離心力為3000g離心20min，收集上清。
4)上清中加入PEG至濃度為9％(克/毫升)，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置24h。
5)4℃下，離心力為10000g離心25min。
6)沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液在pH7.5下懸浮。
7)4℃下，離心力為10000g離心20min。
8)沉淀用0.01M PBS在pH7.4下懸浮，4℃下，離心力為10000g離心15min。重復(fù)三次，合并上清。
9)上清液即為粗提純液。
10)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下，離心力為10000g離心2.5h，沉淀用pH7.4，含0.01M MgCl2的0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，低速離心，上清液即為病毒提純液。
對所述的病毒提純液純度及含量采用電鏡負(fù)染法及紫外分光光度儀進行檢測，病毒濃度為36.8mg/ml。
由此病毒提純液所得多克隆抗體進行檢測分析，間接ELISA法測的效價為1∶5550，最低檢出濃度(檢測靈敏度)達(dá)0.006ng/ml。
所得單克隆抗體進行分析，篩選出一個TMV廣譜單克隆抗體細(xì)胞株，間接ELISA測定抗體效價為1∶8000。
該試劑盒的檢測靈敏度可達(dá)到0.006ng/ml，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測靈敏度提高500倍。
實施例3其他同實施例1，不同的是，甘蔗花葉病毒的分離提純在田間采集病株樣品，經(jīng)電子顯微鏡和標(biāo)準(zhǔn)抗體檢測含有大量SCMV，樣品采集后放入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。抽提緩沖液為0.2M的磷酸鹽緩沖液PBS(pH7.5含0.5％巰基乙醇，0.01M EDTA)提純方法1)病葉剪碎。
2)加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶2(克/毫升)，電動攪拌機充分勻漿，雙層紗布過濾。
3)濾液中加入20％氯仿，4℃下，離心力為3000g離心40min，收集上清。
4)上清中加入PEG至濃度為6％(克/毫升)，NaCl終濃度為0.1M，溶解后4℃放置4h。
5)4℃下，離心力為10000g離心30min。
6)沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液在pH7.4下懸浮。
7)4℃下，離心力為10000g離心15min。
8)沉淀用0.01M PBS在pH7.4下懸浮，4℃下，離心力為10000g離心20min。重復(fù)三次，合并上清。
9)上清液即為粗提純液。
10)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下，離心力為10000g離心3h，沉淀用pH7.4，含0.01M MgCl2的0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，低速離心，上清液即為病毒提純液。
對所述的病毒提純液純度及含量采用電鏡負(fù)染法及紫外分光光度儀進行檢測，病毒濃度為40.2mg/ml。
由此病毒提純液所得多克隆抗體進行檢測分析，間接ELISA法測的效價為1∶6000，最低檢出濃度(檢測靈敏度)達(dá)0.001ng/ml。
所得單克隆抗體進行分析，篩選出一個TMV廣譜單克隆抗體細(xì)胞株，間接ELISA測定抗體效價為1∶10000。
該試劑盒的檢測靈敏度可達(dá)到0.008ng/ml，比間接ELISA和DAS-ELISA檢測靈敏度提高1000倍。
權(quán)利要求
1.甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的用液，盒體內(nèi)的用液包括陽性對照、陰性對照、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物，其特征在于，盒體內(nèi)的用液還包括煙草花葉病毒多克隆抗體、甘蔗花葉病毒單克隆抗體，所述的甘蔗花葉病毒多克隆抗體和所述的甘蔗花葉病毒單克隆抗體由35～45mg/ml病毒濃度的甘蔗花葉病毒提取液作為免疫抗原，分別采用免疫家兔和免疫小鼠法制備而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述的甘蔗花葉病毒提取液的制備方法為先將含有甘蔗花葉病毒的病葉破碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1～3(克/毫升)，勻漿，過濾，濾液中加入濾液體積的20～30％氯仿，攪拌，收集上清液，然后在上清液中加入聚乙二醇至濃度為4～10％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后靜置取沉淀，沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液懸浮離心處理，沉淀用0.01M PBS懸浮，離心，重復(fù)三次，合并上清，取上清液加入離心管離心，沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，離心，上清液即為病毒提純液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述的甘蔗花葉病毒提取液的制備方法為1)病葉剪碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1(克/毫升)，攪拌充分勻漿，紗布過濾；2)濾液中加入濾液體積20～30％氯仿，攪拌20～40min，4℃下離心力為3000g下離心10～30min，收集上清；3)上清液中加入聚乙二醇至濃度為4～10％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后4℃下放置4h～24h；4℃下離心力為10000g下離心10～30min；4)沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液在pH7.4～7.5下懸??；4℃下離心力為10000g下離心10～20min；5)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下懸浮，4℃下離心力為10000g下離心10～20min。重復(fù)三次，合并上清，取上清液；6)加入鋪有10ml25％蔗糖墊的離心管，于4℃下10000g，離心2～3h，沉淀用pH7.4～7.5，含0.01M MgCl2的0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，低速離心，取上清液即為病毒提純液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述的抽提緩沖液為0.02M磷酸鹽緩沖液，pH為7.4～7.5，含0.1％巰基乙醇，0.01M EDTA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述的甘蔗花葉病毒云南分離物多克隆抗體由35～45mg/ml病毒濃度的甘蔗花葉病毒提取液作為免疫抗原，采用免疫家兔制備而成，其制備方法為選用健康雄性家兔作為免疫動物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存；然后進行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點注射，每點0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分離物多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述的甘蔗花葉病毒單克隆抗體由35-45mg/ml病毒濃度的甘蔗花葉病毒提取液作為免疫抗原，采用克隆抗體法制備而成，其制備方法選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存；單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照采用含甘蔗花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，離心力2000g下離心10min，取上清在冷凍干燥機制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用；所述的陰性對照采用無病毒煙葉，同制備陽性對照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2mlPBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述的緩沖液包括包被緩沖液、病毒抽提緩沖液、PBST、封閉緩沖液、底物緩沖液，具體用量如下①包被緩沖液每個試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6；②PBST∶每個試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O7.2gKCl0.2g溶解于1000ml雙蒸水中，加入0.5％ tween20充分混合；③病毒抽提緩沖液每個試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；④封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；⑤底物緩沖液每個試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽。
9.制備權(quán)利要求1所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒的方法，其特征在于，包括如下步驟先將甘蔗花葉病毒進行分離提純得病毒提取液，然后采用病毒提取液進行甘蔗花葉病毒多克隆抗體及單克隆抗體的制備，再對陽性對照、陰性對照、多克隆抗體、單克隆抗體、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物進行制備組裝而成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的甘蔗花葉病毒云南分離物TAS-ELISA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)所述的甘蔗花葉病毒的分離提純先將含有甘蔗花葉病毒的病葉破碎，加抽提緩沖液，病葉與抽提緩沖液的重量體積比為1∶1～3(克/毫升)，勻漿，過濾，濾液中加入濾液體積的20～30％氯仿，攪拌，收集上清液，然后在上清液中加入聚乙二醇至濃度為4～10％(克/毫升)，氯化鈉終濃度為0.1M，溶解后靜置取沉淀，沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液懸浮離心處理，沉淀用0.01M PBS懸浮，離心，重復(fù)三次，合并上清，取上清液加入離心管離心，沉淀用0.05M檸檬酸緩沖液懸浮，離心，上清液即為病毒提純液，所得病毒濃度為35～45mg/ml；2)SCMV多克隆抗體的制備選用健康雄性家兔作為免疫動物，將提純病毒稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存。然后進行免疫注射程序，將1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔背部皮下多點注射，每點0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐劑，充分混合，在家兔雙后足足墊注射，每點1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳靜脈注射；一周后，用2ml免疫抗原耳靜脈注射；7-10天后，心臟全采血，分離血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分離物多克隆抗體；3)SCMV單克隆抗體的制備選用Bal b/c小白鼠STU系3月齡雌鼠用作病毒免疫，并取它們的脾細(xì)胞作細(xì)胞融合，將所述的病毒提純液稀釋至1mg/ml，作為免疫抗原，4℃保存；單克隆抗體制備流程為將提純病毒液免疫抗原細(xì)胞融合，ELISA篩選，克隆，然后進行單克隆抗體亞類鑒定，純化，真空冷凍干燥得單克隆抗體；4)試劑盒的組裝(1)陽性對照采用含甘蔗花葉病毒的病葉，加入病毒抽提緩沖液研磨，離心力2000g下離心10min，取上清在冷凍干燥機制成粉末狀而成，可分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用；(2)陰性對照采用無病毒甘蔗葉，同制備陽性對照方法制備而成；分裝成1000mg/每管，-20℃保存，使用時加入2ml PBST或蒸餾水溶解、稀釋即可用；(3)多克隆抗體將所得的多克隆抗血清中加防腐劑0.1％疊氮化鈉，無菌分裝后，密封、-70℃冷貯，每個試劑盒中100ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋；(4)單克隆抗體將制備的抗體中加防腐劑0.1％疊氮化鈉，無菌分裝后，密封，4℃保存，備用；每個試劑盒中100ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋；(5)酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體為羊抗鼠AP-IgG，分裝，4℃保存，備用。每個試劑盒中5ul，使用時可用PBST或蒸餾水按1∶500稀釋；(6)其他主要材料及藥品①包被緩沖液每個試劑盒中4.52g，加1000ml雙蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml雙蒸水中，調(diào)pH值為9.6；②PBST每個試劑盒中90.4g或124.8g，加8000ml雙蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O7.2gKCl0.2g溶解于1000ml雙蒸水中，加入0.5％ tween20充分混合；③病毒抽提緩沖液每個試劑盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，調(diào)pH值為7.4；④封閉緩沖液PBST中加入5％的脫脂奶粉，溶解；⑤底物緩沖液每個試劑盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘蔗花葉病毒云南分離物TAS－ELISA檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的用液，盒體內(nèi)的用液包括陽性對照、陰性對照、酶標(biāo)抗體、緩沖液和底物，盒體內(nèi)的用液還包括甘蔗花葉病毒云南分離物多克隆抗體、甘蔗花葉病毒云南分離物單克隆抗體，所述的甘蔗花葉病毒多克隆抗體和所述的甘蔗花葉病毒單克隆抗體由35～45mg/ml病毒濃度的甘蔗花葉病毒提取液作為免疫抗原，分別采用免疫注射法、單克隆抗體法制備而成；本發(fā)明所述的檢測試劑盒檢測靈敏度高，檢測靈敏度可達(dá)到0.005～0.01ng/ml，比間接ELISA和DAS－ELISA檢測靈敏度提高100～1000倍。
文檔編號G01N1/28GK1611944SQ200410033668
公開日2005年5月4日 申請日期2004年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日
發(fā)明者張仲凱, 周雪平, 丁銘, 方琦, 張麗珍, 彭潞波, 李婷婷, 蘇曉霞, 李展 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所