專利名稱：一種通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌內(nèi)毒素的測定方法，特別提供了一種通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的標(biāo)準(zhǔn)。
細(xì)菌內(nèi)毒素(Bacterial Endotoxin)是革蘭氏陰性細(xì)菌所產(chǎn)生的具有各種生物活性的大分子物質(zhì)，其主要化學(xué)成分為脂多糖(LPS)。內(nèi)毒素是注射劑藥品(原料等)中的主要污染物質(zhì)。
細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法有家兔試驗(yàn)法、鱟試驗(yàn)法。鱟試驗(yàn)法(LimulusAmebocyte Lysate，LAL)是利用鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的原理，定性或定量檢測藥品或機(jī)體血液中細(xì)菌內(nèi)毒素感染程度的一種體外檢測方法。具體作法又分為凝膠法和定量法。
凝膠法就是一種定性、限量測定內(nèi)毒素的方法。其原理是在專用的試管中將內(nèi)毒素樣品與鱟試劑等量混合，保溫反應(yīng)，當(dāng)內(nèi)毒素與鱟試劑中的C因子發(fā)生反應(yīng)后，激活凝固酶原，切斷凝固蛋白原特定位置的精氨酸肽鍵，形成凝固蛋白從而產(chǎn)生凝膠。中國藥典2000年附錄中對于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的規(guī)定，就是依據(jù)此方法，用來判定供試品中內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定，需要實(shí)驗(yàn)者目測是否出現(xiàn)凝膠來判定陰、陽性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)本身工作量較大，且易出現(xiàn)人為誤差。
定量法是利用動態(tài)比濁法的原理，即在內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)過程中，采用專用儀器檢測記錄其濁度變化，預(yù)設(shè)一個濁度值，當(dāng)濁度值變化到該預(yù)設(shè)值時(shí)所需的時(shí)間作為特征反應(yīng)時(shí)間，該特征反應(yīng)時(shí)間的對數(shù)與內(nèi)毒素濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系。此方法要求標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性好。
目前凝膠法和定量法兩種方法之間還沒有比較明確的對應(yīng)關(guān)系，藥檢機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)商在實(shí)際工作中主要采用凝膠法，依靠人工進(jìn)行檢查，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、人為干擾因素較多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法操作簡便、檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
本發(fā)明提供了一種通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法，其特征在于——將供試品與鱟試劑等比混合(體積)，反應(yīng)溫度為37.0±1℃，反應(yīng)時(shí)間為60±1分鐘；——檢測濁度值，濁度值定義為A0’＝-lg(It/I0’)，其中I’0為初始透射光強(qiáng)度，It為檢測時(shí)透射光強(qiáng)度；——濁度值大于等于0.055時(shí)，為陽性結(jié)果；濁度值小于0.055時(shí)，為陰性結(jié)果。
本發(fā)明通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法中，對所用的檢測儀器要求不是非常嚴(yán)格，所述供試品與鱟試劑的反應(yīng)在試管中進(jìn)行，反應(yīng)液的總體積為0.2毫升至0.7毫升。所采用的試管，其內(nèi)徑可以在5.4毫米至10.2毫米之間。檢測濁度值的檢測波長范圍在400至700nm之間。最好為660nm。
另外本發(fā)明通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法中，對試劑的要求也不是很高，所采用的鱟試劑，其靈敏度可為0.015-0.5EU/ml。
本發(fā)明的需要檢測的關(guān)鍵參數(shù)濁度值定義為A0’＝-lg(It/I0’)，其中I’0為初始透射光強(qiáng)度，It為檢測時(shí)透射光強(qiáng)度，濁度值與入射光強(qiáng)度無關(guān)，因此消除了測定管尺寸、反應(yīng)體系初始狀態(tài)的影響。另外，該參數(shù)可以容易地通過很多現(xiàn)有的技術(shù)手段測量實(shí)現(xiàn)，還可以通過專門的儀器來測量實(shí)現(xiàn)，減少了人工目測判斷凝膠與否的誤差，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；可望替代常規(guī)凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，用于藥品質(zhì)量控制和制劑的生產(chǎn)過程監(jiān)控等。


圖1為反應(yīng)體系濁度值變化示意。
具體實(shí)施例方式常規(guī)的細(xì)菌內(nèi)毒素限量的測定方法是首先需要進(jìn)行供試品干擾試驗(yàn)，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ濃度，每一稀釋液做4管(10mm內(nèi)徑試管)，輕輕振動上述試管混勻內(nèi)容物，封閉管口，置37±1℃水浴中。保溫60±2分鐘待觀察結(jié)果，另取內(nèi)毒素檢查用水和供試品稀釋液，各做2支陰性對照管。其最高濃度2.0λ的4管應(yīng)均為陽性，最低濃度0.25λ的4管應(yīng)均為陰性，且陰性對照管均為陰性時(shí)，則無干擾?？筛鶕?jù)供試品內(nèi)毒素限量選擇合適靈敏度的鱟試劑，依照上述方法做試驗(yàn)來檢查供試品內(nèi)毒素是否超出限量。
本發(fā)明通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法是，在內(nèi)毒素測定儀上，測定含內(nèi)毒素樣品與鱟試劑反應(yīng)體系的濁度值，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為60分鐘，濁度值大于等于0.055時(shí)，為陽性結(jié)果；濁度值小于0.055時(shí)，為陰性結(jié)果。
實(shí)施例1.
常規(guī)凝膠法的操作步驟是將供試品與鱟試劑等比混合于專用試管中，體積為0.2ml，混勻，封閉管口，置37±1℃水浴中，保溫60±2分鐘，取出試管緩緩倒轉(zhuǎn)180度，觀察結(jié)果。當(dāng)試管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性結(jié)果；凝膠不能保持完整，并從管壁滑脫者為陰性結(jié)果。
在內(nèi)毒素測定儀上，將供試品與鱟試劑等比混合于7mm內(nèi)徑平底試管，反應(yīng)溫度為37.1℃，反應(yīng)總體積為0.3ml，鱟試劑靈敏度為0.06EU/ml，供試品為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，濃度為0、0.03、0.06、0.12EU/ml，檢測時(shí)間達(dá)60分鐘時(shí)，其對應(yīng)的濁度值分別為0.005、0.024、0.055和0.090；該供試品與鱟試劑同時(shí)依照凝膠法做平行對照檢測，結(jié)果表明濁度值為0.005和0.024時(shí)，凝膠法的結(jié)果為陰性；濁度值為0.055和0.090時(shí)，凝膠法的結(jié)果為陽性。
實(shí)施例2.
在內(nèi)毒素測定儀上將供試品與鱟試劑等比混合于5.4mm內(nèi)徑平底試管，反應(yīng)溫度為37.2℃，反應(yīng)總體積為0.3ml，鱟試劑靈敏度為0.5EU/ml，供試品為含有內(nèi)毒素的去離子水，反應(yīng)時(shí)間達(dá)15分鐘時(shí)，檢測其對應(yīng)的濁度值為0.063；該供試品與鱟試劑同時(shí)依照凝膠法做平行對照檢測，結(jié)果表明濁度值為0.063，凝膠法的結(jié)果為陽性。
實(shí)施例3.
在內(nèi)毒素測定儀上將供試品與鱟試劑等比混合于采用5.4mm內(nèi)徑平底試管，反應(yīng)溫度為37.1℃，反應(yīng)總體積為0.3ml，鱟試劑靈敏度為0.03EU/ml，供試品為濃度為0.24EU/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素水溶液，檢測時(shí)間達(dá)60分鐘時(shí)，其對應(yīng)的濁度值為0.07；該供試品與鱟試劑同時(shí)依照凝膠法做平行對照檢測，結(jié)果表明濁度值為0.07，凝膠法的結(jié)果為陽性。
實(shí)施例4.
在內(nèi)毒素測定儀上將供試品與鱟試劑等比混合于采用7mm內(nèi)徑平底試管，反應(yīng)溫度為37.1℃，反應(yīng)總體積為0.5ml，鱟試劑靈敏度為0.03EU/ml，供試品為含有內(nèi)毒素的去離子水，當(dāng)檢測時(shí)間達(dá)25分鐘時(shí)，其濁度值為0.063時(shí)，采用分光光度計(jì)對其在400、600和700mm三個檢測波長下進(jìn)行測定，結(jié)果吸光度值分別為0.444、0.166和0.151。該供試品與鱟試劑同時(shí)依照凝膠法做平行對照檢測，結(jié)果表明濁度值為0.063時(shí)，凝膠法的結(jié)果為陽性。
實(shí)施例5.
采用分光光度計(jì)，在22.℃的室溫下，采用10.2mm內(nèi)徑的試管作為反應(yīng)測定管，供試品為含有內(nèi)毒素的去離子水樣品，鱟試劑靈敏度為0.5EU/ml，測定體系體積為0.7ml，供試品與鱟試劑的比例為1∶1，檢測波長設(shè)定為660mm，測定其吸光度值，85分鐘時(shí)，吸光度值為0.124。
在內(nèi)毒素測定儀上將供試品與鱟試劑等比混合于采用7mm內(nèi)徑平底試管，反應(yīng)溫度為37.1℃，反應(yīng)總體積為0.7ml，鱟試劑靈敏度為0.5EU/ml，檢測時(shí)間達(dá)85分鐘時(shí)，其對應(yīng)的濁度值為0.10。該供試品與鱟試劑同時(shí)依照凝膠法做平行對照檢測，結(jié)果表明濁度值為0.10時(shí)，凝膠法的結(jié)果為陽性。
實(shí)施例6.
在內(nèi)毒素測定儀上，將1.5mg/ml的克林霉素磷酸酯氯化鈉注射液與鱟試劑等比混合于7mm內(nèi)徑平底試管，反應(yīng)溫度為37.0℃，鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml，反應(yīng)體積0.3ml，60分鐘時(shí)，測定濁度值為0.004。同時(shí)該供試品與鱟試劑依照凝膠法做平行對照檢測，結(jié)果表明濁度值為0.004時(shí)，凝膠法的結(jié)果為陰性。
實(shí)施例7.
在內(nèi)毒素測定儀上將供試品與鱟試劑等比混合于5.4mm內(nèi)徑平底試管，反應(yīng)溫度為37.0℃，反應(yīng)總體積為0.2ml，鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，供試品為含有內(nèi)毒素的去離子水，檢測時(shí)間達(dá)60分鐘時(shí)，其對應(yīng)的濁度值為0.14；該供試品與鱟試劑同時(shí)依照凝膠法做平行對照檢測，結(jié)果表明濁度值為0.14時(shí)，凝膠法的結(jié)果為陽性。
實(shí)施例7在內(nèi)毒素測定儀上將供試品與鱟試劑等比混合于7mm內(nèi)徑平底試管，反應(yīng)溫度為37.0℃，反應(yīng)總體積為0.3ml，鱟試劑靈敏度為0.06EU/ml，供試品為氯化鈉水溶液，濃度為140mM，檢測時(shí)間達(dá)60分鐘時(shí)，其對應(yīng)的濁度值為0.004；該供試品與鱟試劑同時(shí)依照凝膠法做平行對照檢測，結(jié)果表明濁度值為0.004時(shí)，凝膠法的結(jié)果為陰性。
實(shí)施例8在內(nèi)毒素測定儀上將供試品與鱟試劑等比混合于7mm內(nèi)徑平底試管，反應(yīng)溫度為37.5℃，反應(yīng)總體積為0.3ml，鱟試劑靈敏度為0.015EU/ml，供試品為無熱源水，檢測時(shí)間達(dá)60分鐘時(shí)，其對應(yīng)的濁度值為0.003；該供試品與鱟試劑同時(shí)依照凝膠法做平行對照檢測，結(jié)果表明濁度值為0.003時(shí)，凝膠法的結(jié)果為陰性。
權(quán)利要求
1.一種通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法，其特征在于——將供試品與鱟試劑等比混合，反應(yīng)溫度為37.0±1℃，反應(yīng)時(shí)間為60±1分鐘；——檢測濁度值，濁度值定義為A0’＝-lg(Ig/I0’)，其中I0’為初始透射光強(qiáng)度，It為檢測時(shí)透射光強(qiáng)度；——濁度值大于等于0.055時(shí)，為陽性結(jié)果；濁度值小于0.055時(shí)，為陰性結(jié)果。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法，其特征在于所述供試品與鱟試劑的反應(yīng)在試管中進(jìn)行，反應(yīng)液的總體積為0.2毫升至0.7毫升。
3.按照權(quán)利要求2所述的一種通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法，其特征在于所采用的鱟試劑，其靈敏度可為0.015-0.5EU/ml。
4.按照權(quán)利要求2所述的一種通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法，其特征在于所采用的試管，其內(nèi)徑為5.4毫米至10.2毫米。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種通過測定濁度值來確定內(nèi)毒素限量的方法，其特征在于檢測濁度值的檢測波長范圍在400至700nm之間。
6.按照權(quán)利要求1所述的一種通過測定濁度值來確定內(nèi)毒素限量的方法，其特征在于檢測濁度值的檢測波長為660nm。
全文摘要
一種通過測定濁度值來進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法，其特征在于將供試品與鱟試劑等比混合，反應(yīng)溫度為37.0±1℃，反應(yīng)時(shí)間為60±1分鐘；檢測濁度值，濁度值定義為A
文檔編號G01N33/52GK1715925SQ20041002088
公開日2006年1月4日 申請日期2004年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月2日
發(fā)明者李京華, 岳麗娜, 邵英光, 王俊德 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所