專利名稱：用于生物芯片的芯片讀出器及其相關(guān)方法
一般情況一般地，本發(fā)明涉及芯片的閱讀和解釋，更具體的是涉及由信號產(chǎn)生分子，例如熒光團(tuán)，所標(biāo)記的，并且形成于構(gòu)建這些芯片的分子與來源于生物或化學(xué)樣本的分子或細(xì)胞之間的雜交的檢測。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及閱讀和分析芯片(或芯片讀出器)的裝置，其包括·用于接收打算鑒別至少一種樣本的芯片的工作臺，·在與其它分子反應(yīng)之后激發(fā)芯片的分子或細(xì)胞的裝置，·閱讀和分析受到激發(fā)的分子的裝置。
更具體地，本發(fā)明還提供了一種控制芯片溫度的裝置，這樣就使其能夠發(fā)展出涉及芯片溫度變化的應(yīng)用。
在具體應(yīng)用中，芯片是DNA或寡核苷酸芯片，而溫度的控制使其能精確限定在所述芯片上寡核苷酸探針的雜交溫度。
本發(fā)明還涉及使用這樣的讀出器的方法，特別是用于檢測基因突變。
定義在介紹本發(fā)明的目的和特征之前，先定義一些將在本文中用到的術(shù)語。
術(shù)語“陣列，微陣列，芯片”，在本發(fā)明中是通用的，其指的是排列在固體支持物上特異位點(diǎn)中的細(xì)胞陣列或生物或化學(xué)分子的陣列(形成，例如，矩陣)。
分子或細(xì)胞通常結(jié)合至由聚合物所涂覆的固體支持物上的各個位點(diǎn)，并且排列從而使這些位點(diǎn)的每個都是與相應(yīng)于其它位點(diǎn)的分子/細(xì)胞展示分子/細(xì)胞特異性相關(guān)的類型。
當(dāng)陣列包含生物分子，例如核酸或肽時(shí)，其定義為生物芯片。
更精確地，當(dāng)陣列包含脫氧核糖核苷酸時(shí)，其定義為DNA芯片或寡核苷酸芯片。
固體支持物選自由以下物質(zhì)制成的固體支持物玻璃、塑料、Nylon、Kevlar、硅樹脂、硅，或其它多糖或雜多糖，例如纖維素。
優(yōu)選的是玻璃。這種支持物可以是任何形式(扁平載波片、微珠，等等)，但是，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，支持物是平板，并且其包括扁平玻璃載波片。
當(dāng)芯片在合適條件下與樣本接觸時(shí)，樣本的特定組分有選擇地與(并且特異地結(jié)合至)芯片的一個或更多分子/細(xì)胞反應(yīng)。
此外，這些組分包含特定的標(biāo)記(通稱為熒光染料或分子——一般稱為“熒光團(tuán)”)而使其能夠在樣本與芯片接觸之后檢測組分的存在。這種檢測要求，在熒光團(tuán)的情況下，用控制了波長的光激發(fā)芯片。
術(shù)語“分子”在這里包括化學(xué)分子和生物分子。
對于生物應(yīng)用，“生物分子”優(yōu)選的是核酸，更優(yōu)選的是單鏈寡核苷酸。
對于化學(xué)應(yīng)用，可以是針對生物分子的化學(xué)配體。
術(shù)語“核酸，核酸探針，核酸序列，多核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸序列，核苷酸序列，寡核苷酸序列”，在本說明書中是通用的，指的是修飾或未修飾的核苷酸精義鏈，使其能限定核酸片段或區(qū)域，包含或不包含變性核苷酸，并且可以對應(yīng)于雙鏈DNA，單鏈DNA，PNA(“肽核酸”)或LNA(對應(yīng)于“鎖定的核酸”)以及所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，例如RNA。
術(shù)語“探針，寡核苷酸探針或寡核苷酸”在這里指的是功能性或非功能性寡核苷酸，其將被沉積(或“點(diǎn)樣”)并且通過共價(jià)鍵直接或間接經(jīng)過位點(diǎn)水平上的間隔化合物結(jié)合到固體支持物。
這樣點(diǎn)樣的寡核苷酸能通過一個或更多化學(xué)鍵類型的方式結(jié)合到樣本中存在的互補(bǔ)序列的靶核酸(即，互補(bǔ)的寡核苷酸或多核苷酸)，通常是通過互補(bǔ)堿基配對形成氫鍵。
優(yōu)選地，所述探針是單鏈DNA和RNA，優(yōu)選為DNA，其大小為10至7000堿基(b)之間，優(yōu)選為10至1000b之間，10至500b之間，10至250b之間，10至100b之間，10至50b之間或10至35b之間。
所點(diǎn)樣的寡核苷酸探針可以是化學(xué)合成的，從生物樣本純化的，或者，更常見的，通過重組DNA技術(shù)從天然和/或純化的多核苷酸中產(chǎn)生的。
例如，探針可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或RT-PCR(伴隨聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反轉(zhuǎn)錄)而產(chǎn)生。
術(shù)語“位點(diǎn)”對應(yīng)于芯片上分子被結(jié)合的點(diǎn)。
相同分子的幾個復(fù)制本優(yōu)選位于一個位點(diǎn)。
位點(diǎn)通過它們相對于芯片上的參考點(diǎn)的X-和Y-坐標(biāo)來限定。
一個位點(diǎn)可以，例如，對應(yīng)于具有一直徑的圓環(huán)，或?qū)?yīng)于一個孔，或平行六面型凝膠墊(被稱為凝膠墊)，其中該圓環(huán)直徑取決于平板限定的區(qū)域內(nèi)的所點(diǎn)樣溶液液滴的體積。
術(shù)語“樣本”對應(yīng)于生物的溶液，生化或化學(xué)分子或?qū)?yīng)于細(xì)胞組，其被預(yù)想為具有一定的特性。
在本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用中，樣本是包含至少一種從生物來源獲得的寡核苷酸的溶液。
樣本可以來源于從各種組織或細(xì)胞的活的或死的來源。
生物樣本的例子包括體液，例如血液(特別是白血球)，尿液，唾液，精液，或者陰道分泌物，皮膚，以及細(xì)胞例如發(fā)根囊泡細(xì)胞，從正?；虿±韮?nèi)部組織來的細(xì)胞，特別是來自腫瘤的，來自絨毛膜組織的細(xì)胞，羊膜細(xì)胞，胎盤細(xì)胞，胎兒細(xì)胞以及臍帶細(xì)胞。
術(shù)語“標(biāo)記”或“信號產(chǎn)生標(biāo)記”指的是能夠直接或間接與樣本中的生物，生化或化學(xué)分子相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，為了隨后檢測的目的，它采用例如那些根據(jù)本發(fā)明的讀出器的閱讀方式。
信號產(chǎn)生標(biāo)記優(yōu)選地選自酶，染料，半抗原，例如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或異羥洋地黃毒甙元(digoxygenin)的配體，或發(fā)光劑。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的信號產(chǎn)生標(biāo)記是一種熒光劑，根據(jù)激發(fā)能的來源其能分為放射發(fā)光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光以及光照發(fā)光(包括熒光和磷光)。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的信號產(chǎn)生標(biāo)記是一種熒光劑。
術(shù)語“熒光”一般是指一種例如熒光素的基質(zhì)的特性，基質(zhì)在受到光源以稱為激發(fā)波長的給定波長激發(fā)時(shí)會產(chǎn)生光，并且所發(fā)出的光具有更高的波長，被稱為發(fā)射波長，其能采用光子傳感器檢測，提供信號，當(dāng)將信號結(jié)合起來時(shí)能夠構(gòu)建芯片的雜交信號的圖像。
在本發(fā)明所采用的熒光團(tuán)中包括但不盡于·異硫氰酸酯熒光素(FITC)[最大吸收波長494nm/最大發(fā)射波長517nm]；·得克薩斯紅(TR)[最大吸收波長593nm/最大發(fā)射波長613nm]；·花青素3(Cy3)[最大吸收波長554nm/最大發(fā)射波長568nm]；·花青素5(Cy5)[最大吸收波長652nm/最大發(fā)射波長670nm]；·花青素5.5(Cy5.5)[最大吸收波長675nm/最大發(fā)射波長694nm]；·花青素7(Cy7)[最大吸收波長743nm/最大發(fā)射波長767nm]；·Bopidy 630/650[最大吸收波長632nm/最大發(fā)射波長658nm]；·Alexa 488(495/519)；·Alexa 350(347/422)；·梅紅(rhodamine red)染料(570/590)。
術(shù)語“反應(yīng)”指的是發(fā)生在與芯片上位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的分子和樣本的分子之間的化學(xué)或生物反應(yīng)(例如，雜交)。
術(shù)語“雜交”指的是涉及沉積的(或點(diǎn)樣的)寡核苷酸和來源于生物樣本的靶序列之間通過互補(bǔ)堿基對結(jié)合的反應(yīng)。
從雜交形成的雜交體或二倍體被稱為雜交復(fù)合物或雜交二倍體。
雜交復(fù)合物可以是互補(bǔ)復(fù)合物也可以是錯配復(fù)合物。
就是說，互補(bǔ)復(fù)合物是一種在點(diǎn)樣的寡核苷酸和樣本的靶序列之間沒有錯配的雜交復(fù)合物。
具有錯配的復(fù)合物是在點(diǎn)樣的寡核苷酸和樣本的靶序列之間至少存在一個錯配的雜交復(fù)合物。
術(shù)語“特異性雜交”指的是在嚴(yán)格條件下，并且當(dāng)序列存在于復(fù)雜DNA或RNA環(huán)境時(shí)僅在特異核苷酸序列上結(jié)合到形成的二倍體或雜交的核酸分子。
一種“互補(bǔ)寡核苷酸”是一種探針，其序列與特異靶序列完全互補(bǔ)(在本文中，術(shù)語“匹配”將被用來指代這種類型的完美配對)。
展示“錯配”的探針指的是一種或多種其序列與特異靶序列不完全互補(bǔ)的探針。
雖然錯配可以出現(xiàn)在展示錯配探針的任何地方，但是末端錯配是更加不理想的，因?yàn)樗鼈儗Π行蛄猩系碾s交具有更低的影響。
就是說，探針通常具有的錯配位于探針中心或中心的邊緣，從而錯配具有在雜交條件下使與靶序列形成的二倍體不穩(wěn)定的更大的變化。
術(shù)語“二倍體”或“雜交”對應(yīng)于雙鏈DNA片段。要看到的是這樣的二倍體是通過寡核苷酸(排列在芯片上位點(diǎn)內(nèi)的分子)與要鑒別的樣本的單鏈片段雜交獲得的。
術(shù)語“閱讀”通常指的是包括通過一種或更多合適的傳感器借助檢測標(biāo)記而收集反應(yīng)后分子的應(yīng)答的過程。
這種閱讀具體可以是光閱讀，但是，作為替代，也可以是通過收集例如放射輻射的信號的閱讀。
要注意的是，在本文中，芯片“讀出器”的定義不僅指這種簡單閱讀過程，因?yàn)樗€包括對“閱讀”信號的分析。

發(fā)明內(nèi)容
“光源”方面上述芯片讀出器的類型是已知的。
這樣的讀出器使其能在芯片分子與樣本分子反應(yīng)之后收集所述分子對給定激發(fā)的應(yīng)答。
這種應(yīng)答的收集使其能識別對所述激發(fā)反應(yīng)特異的標(biāo)記，其可以特別是集中在給定波長的照明(光激發(fā))。
芯片，優(yōu)選為平板的形式，位于工作臺上，可以沿著三個縱、橫和垂直軸x、y和z移動，因而連續(xù)地在芯片的各個位點(diǎn)上接受激發(fā)輻射，并且具有觀測這些位點(diǎn)的設(shè)備。
芯片可以直接放置在工作臺上或者放置在連接到工作臺的處理腔室中(例如，雜交小室)。
這些讀出器包括激發(fā)設(shè)備，其一般以光源形式存在(大約從幾百平方微米至幾平方毫米)，使其能夠以控制波長的光譜照明芯片的分子或細(xì)胞，因而使與分子結(jié)合的信號產(chǎn)生標(biāo)記(優(yōu)選為熒光標(biāo)記)激發(fā)。
這些照明設(shè)備一般以燈(典型的是氙燈或汞燈)或一個或更多激光二極管的形式存在。
氙燈提供了一種連續(xù)和相等的光譜，覆蓋大多數(shù)常用標(biāo)記的激發(fā)波長。
然而，這些燈的局限是與針對各種標(biāo)記的激發(fā)線相關(guān)的能量水平可能太低以至于不能產(chǎn)生充足的理想激發(fā)線。
至于汞燈，它們提供一定波長的光譜展示線(最大能量)。
因此，這樣的燈能夠充分激發(fā)在對應(yīng)于這些線的波長為可激發(fā)的熒光標(biāo)記。
然而，汞燈的激發(fā)線不包括通常用于激發(fā)這些讀出器應(yīng)用中所使用的激發(fā)熒光團(tuán)(可以是Cy5或Cy7類型或者另一不能被廣譜燈有效激發(fā)的熒光團(tuán))的特定波長。這對汞燈構(gòu)成了相當(dāng)大的局限。
作為燈的替代，已知實(shí)現(xiàn)讀出器照明的設(shè)備是一種或多種給定波長的激光器。
“紅”激光器，非常普通并且不是很貴，這樣構(gòu)成了實(shí)用和可獲得的解決方案用于激發(fā)標(biāo)記，例如花青素5或花青素7。然而，當(dāng)要激發(fā)的標(biāo)記在位于藍(lán)光或接近藍(lán)光范圍的紫外光的波長具有反應(yīng)活性(例如，激發(fā)FITC類型的標(biāo)記)時(shí)，必需要利用不太常見類型的激光器，其導(dǎo)致成本上相當(dāng)大的缺點(diǎn)。
這樣就顯現(xiàn)出用于為讀出器產(chǎn)生照明的設(shè)備的已知方案的局限性。
本發(fā)明的目的之一是使其能避免照明設(shè)備的相關(guān)局限。
“溫度控制”方面此外，對于許多應(yīng)用，例如，芯片上的寡核苷酸雜交反應(yīng)或酶反應(yīng)，有利的是采用讀出器監(jiān)控這些反應(yīng)的參數(shù)，這些參數(shù)是芯片溫度函數(shù)。
提供溫度控制的讀出器工作臺的操作是已知的。這樣讀出器的例子見于文件US6329661。
因此結(jié)合溫度控制的工作臺與芯片讀出器的方式能夠通過輸送給定的信息部分而控制工作臺的溫度。
本發(fā)明的另一目的是改進(jìn)這種裝置。
具體地，本發(fā)明的目的是能夠在用于觀測預(yù)想?yún)?shù)的最佳溫度條件下自動閱讀芯片。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種用于閱讀和分析芯片的裝置，其包括·用于接收打算鑒別至少一種樣本的芯片的工作臺，·在其與其它分子反應(yīng)之后激發(fā)芯片的分子或細(xì)胞的設(shè)備，·閱讀和分析受激發(fā)的分子的設(shè)備，其特征在于該裝置還包括·控制所述工作臺溫度的單元，所述控制單元被連接至由多個帕爾帖類型加熱/冷卻元件以相對于工作臺表面上各個位點(diǎn)排列所組成的模塊(111)，·并且至少一個工作臺傳感器(112)也被連接至所述控制單元。
優(yōu)選，但不限于，該裝置的各部件如下·燈是汞燈，·激光器是輻射集中在大約635nm波長的激光器，·讀出器包括幾個激光器，·激光器集中在相同的波長，·激發(fā)設(shè)備包括至少一個激光器，與掃描其光束的模塊相關(guān)聯(lián)從而激發(fā)待分析的分子，·讀出器包括兩個激光器和模塊，模塊用于掃描兩個激光器并在兩個垂直方向上控制兩個獨(dú)立的分子掃描，·激發(fā)設(shè)備包括至少一個激光器組件，其包括輻射受光纖導(dǎo)向的激光器，·激發(fā)設(shè)備包括兩個同樣的激光器組件，·激發(fā)設(shè)備包括一個固定的激光器，其發(fā)射光束朝向兩個順序安裝的連續(xù)的，并且其移動受控沿著兩個不同的方向進(jìn)行的鏡組件，·兩個鏡組件的移動是受控的，因而產(chǎn)生能跟隨芯片上的任何預(yù)定序列的光束，·激發(fā)設(shè)備包括燈和激光器，它們的輻射采用相同的光學(xué)通道，因?yàn)閾u擺鏡能夠圍繞兩個位置之間的軸旋轉(zhuǎn)因而使這兩個輻射的其中之一直射入芯片，·光學(xué)系統(tǒng)被插入燈和待激發(fā)的分子之間，而激光器激發(fā)則發(fā)生對分子的直接照明，·所述光學(xué)系統(tǒng)包括窄帶激發(fā)光濾光器和窄帶發(fā)射光濾光器，以及光束分離器，·讀出器還包括激發(fā)控制單元，與每個激發(fā)設(shè)備相連從而控制其功能，·所述激發(fā)控制單元能夠選擇性地控制采用燈和至少一個激光器同時(shí)或連續(xù)照明分子，或者是采用燈和至少一個激光器對分子的獨(dú)立激發(fā)。
本發(fā)明還提供了用于閱讀和分析芯片的裝置，其包括·用于接收要鑒別至少一種樣本的芯片的工作臺，·在與其它分子或細(xì)胞反應(yīng)之后，激發(fā)芯片的細(xì)胞或分子的設(shè)備，·閱讀受到激發(fā)的分子或細(xì)胞的設(shè)備，其特征在于該讀出器還包括溫度控制單元。
優(yōu)選，但不限于，該裝置的各部件如下·工作臺包括與所述溫度控制單元相連接的溫度傳感器。
·讀出器包括與工作臺相關(guān)聯(lián)并且要控制工作臺溫度的加熱/冷卻模塊，所述加熱/冷卻模塊與溫度控制單元相連接。
·讀出器還包括包含微處理器并且與溫度控制單元和閱讀設(shè)備相連接的處理設(shè)備。
·讀出器包括存儲分子對于作為溫度的函數(shù)的激發(fā)設(shè)備的匹配和錯配應(yīng)答的參考曲線的設(shè)備。
·存儲設(shè)備與根據(jù)所述參考曲線確定分子的匹配和錯配融合溫度的設(shè)備相連接。
·溫度控制單元能夠按照“靜態(tài)”模式控制讀出器的功能，即預(yù)先建立的作為溫度函數(shù)的分子匹配和錯配應(yīng)答的參考曲線被所述溫度控制單元用來建立能被傳送的設(shè)定溫度，從而控制所述工作臺的溫度。
·溫度控制單元能夠按照“動態(tài)”模式控制讀出器的功能，即溫度控制單元控制工作臺上給定的溫度變化，并且，在溫度的這一變化期間
≯閱讀設(shè)備實(shí)時(shí)收集與芯片上各種位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的分子對激發(fā)設(shè)備的激發(fā)做出的應(yīng)答，并將所述應(yīng)答傳送給處理設(shè)備，≯存儲設(shè)備存儲，針對芯片上每個點(diǎn)的，作為溫度函數(shù)的分子應(yīng)答的變化。
·讀出器包括處理設(shè)備，其能在所述應(yīng)答變化的存儲末端建立針對每個分子的分子診斷狀態(tài)。
·所述診斷狀態(tài)是匹配/錯配診斷。
此外，本發(fā)明還涉及使用這樣的裝置閱讀芯片的方法。
這樣的方法可以具體為芯片的寡核苷酸雜交的方法，其可以采用根據(jù)上述一個方面的讀出器來實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟≯使對應(yīng)于靶核酸的核酸探針與包含單鏈DNA片段的樣本接觸，從而通過形成二倍體實(shí)現(xiàn)特定探針與樣本的所述單鏈DNA片段的選擇性雜交。
≯閱讀這樣形成的二倍體，該方法的特征在于，該方法包括由自動確定下面溫度所組成的步驟≯針對每個處于“匹配”構(gòu)象的靶核酸的融合溫度，以及≯針對每個處于“錯配”構(gòu)象的靶核酸的融合溫度。
優(yōu)選，但不限于，這樣方法的各步驟如下·所述確定在“靜態(tài)”模式中采用說明通過閱讀分別對應(yīng)于匹配和錯配的二倍體所接收的信號中作為溫度函數(shù)的變化的參考曲線來實(shí)現(xiàn)，·該方法包括控制溫度從而在對應(yīng)于匹配和錯配之間最大差別的溫度進(jìn)行雜交，·該方法包括在先于閱讀步驟之前的步驟期間產(chǎn)生所述參考曲線，·該方法包括存儲所述參考曲線，·所述確定在“動態(tài)”模式中采用控制樣本溫度中給定的變化而實(shí)現(xiàn)，并且，在溫度的這個變化中，執(zhí)行以下步驟≯實(shí)時(shí)收集與通過激發(fā)設(shè)備激發(fā)的芯片上各種位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的二倍體的應(yīng)答，≯對于每個二倍體，存儲應(yīng)答中作為溫度函數(shù)的變化，
·該方法包括，對于每個二倍體，在應(yīng)答中每個變化的存儲末端建立二倍體的匹配/錯配的診斷。


本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將通過以下結(jié)合實(shí)施例和附圖的說明書顯現(xiàn)出來，圖例的含義如下·圖1是根據(jù)本發(fā)明的讀出器的原理圖。
·圖2包括≯在其上半部分，根據(jù)本發(fā)明讀出器的工作臺的原理圖，詳細(xì)展示了溫度控制設(shè)備，≯在其下半部分，代表的是溫度可能的變化(以及具體顯示溫度的快速變化——大約為2.3℃/s——在根據(jù)本發(fā)明的裝置中是可能的)，·圖3a至3b是示例完成這樣的讀出器的全部或部分激發(fā)光設(shè)備的四種變體的圖，圖3a還包括通過激發(fā)設(shè)備光源掃描芯片的示例，·圖4a和4b是與本發(fā)明分子雜交應(yīng)用相關(guān)的圖≯4a是由閱讀設(shè)備接收的針對相同DNA序列的匹配構(gòu)象和錯配構(gòu)象的作為溫度函數(shù)的芯片所有點(diǎn)信號變化的示例，≯圖4b是完成本發(fā)明的“動態(tài)”模式的示例，在其中那些圖4a類型的曲線是為幾種DNA序列構(gòu)建的，·圖5是將探針固定在具有醛基官能團(tuán)的載波片上的反應(yīng)圖(來自TéléChem的超級醛基載波片)。醛基基團(tuán)被共價(jià)結(jié)合到生物芯片的玻璃支持物上(長方形)。DNA分子的NH2官能團(tuán)攻擊醛基基團(tuán)從而形成共價(jià)鍵(中心圖)。該鍵通過脫水反應(yīng)而穩(wěn)定(在略微潮濕的空氣中干燥)，其結(jié)果導(dǎo)致形成希夫式(Schifff’s)堿基，·圖6示例了野生型寡核苷酸Q493X-Cy3和突變的寡核苷酸Q493X-Cy5混合物在包含各種以各種濃度(50，100和200μm)點(diǎn)樣的并且隨后以各種條件(低和高濕度)固定的相應(yīng)探針的生物芯片上雜交的Cy3熒光。雜交在6×SSC，0.2％SDS，0.2mg/ml BSA中，在室溫中進(jìn)行12小時(shí)。寡核苷酸的濃度是0.5μm。雜交后的生物芯片在6×SSC，0.2％SDS中室溫洗滌5分鐘，隨后是在2×SSC中室溫洗滌2分鐘，
·圖7顯示的是熒光信號的強(qiáng)度和信噪比，其對應(yīng)于針對包含各種以各種濃度(50，100和200μm)點(diǎn)樣的并且隨后以各種條件(低和高濕度)固定的相應(yīng)探針的芯片的寡核苷酸wtQ493X-Cy3和mutQ493X-Cy5的雜交溶液，·圖8代表了對應(yīng)于Cy3標(biāo)記的野生型寡核苷酸ΔF-508和Cy5標(biāo)記的突變型寡核苷酸Q493X。
具體實(shí)施例方式
參考附圖1，根據(jù)本發(fā)明的讀出器10如圖所表示。
讀出器10包括·接收芯片12的工作臺11，·激發(fā)設(shè)備13，·閱讀設(shè)備14(即觀察芯片分子的設(shè)備，特別是對設(shè)備13發(fā)出的激發(fā)進(jìn)行應(yīng)答)，·命令和控制設(shè)備。
工作臺11工作臺11詳細(xì)見于圖2的上半部分。
這個工作臺通常包括用于容納芯片12的設(shè)備110。
這些設(shè)備可以包括腔室——例如，雜交小室。
工作臺11與能夠控制工作臺溫度的加熱/冷卻模塊111相關(guān)聯(lián)。
更加具體的，模塊111包括多個帕爾帖效應(yīng)加熱/冷卻元件。這些帕爾帖元件與工作臺11的厚度融為一體。
這些帕爾帖元件的每一個相對位于工作臺11表面上的點(diǎn)中——并且因而位于工作臺所攜帶的芯片12上。
所述的點(diǎn)彼此相鄰，并且結(jié)合起來覆蓋了芯片的整個表面。
有利的是預(yù)先使這些點(diǎn)對應(yīng)于芯片上將要接受探針的位點(diǎn)(見下文)。
而且，模塊111與溫度控制單元15相連，該單元產(chǎn)生設(shè)定溫度并將其傳送至模塊111，因而后者根據(jù)取決于觀察到的物理化學(xué)現(xiàn)象的溫度變化率而調(diào)節(jié)工作臺的溫度。
更為具體的，控制單元針對模塊111的每個帕爾帖元件產(chǎn)生單個設(shè)定溫度。
這些帕爾帖元件非常精確——它們通常為設(shè)定溫度提供大約為0.01℃的精確度。
由這些帕爾帖元件組合形成的模塊111與熱交換模塊相關(guān)聯(lián)，因而實(shí)現(xiàn)工作臺11的加熱/冷卻。
這個熱交換模塊可以是空氣或液體循環(huán)功能的。
這樣就能夠精細(xì)地控制工作臺上任何位點(diǎn)的溫度。
尤其是它能夠通過這種方式確保在工作臺11上的所有位點(diǎn)的溫度嚴(yán)格相同。
基于帕爾帖元件對于設(shè)定溫度的變化(升高或降低)非常敏感，這一點(diǎn)進(jìn)一步得到提高。
這些元件因而能夠精確地提供快速溫度變化(典型地，精確度約為0.01℃，變化速率為每秒幾度)。
這樣就可以提供“快速”溫度變化——每秒大約幾度的變化，例如用于PCR類型的反應(yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮合)。
它也可以提供“慢”變化(每分鐘大約幾度的變化——用于，例如，以解離為目的的DNA鏈融合類型的反應(yīng))。
為了能夠提供這些各種類型的變化，至少一個相應(yīng)的工作表被存儲在單元15能夠存取的該裝置的存儲器中(例如，將要描述的計(jì)算機(jī)17的存儲器)。
要注意的是速率不僅取決于預(yù)定的反應(yīng)類型，而且也取決于所采用的探針的類型，以及預(yù)定要鑒別的樣本的類型。
基于此，相應(yīng)的工作表也要考慮這些參數(shù)。
此外，裝置的使用者能夠進(jìn)入與單元15和/或計(jì)算機(jī)17相連的合適的接口(鍵盤或其類似物)，作為與相應(yīng)工作表相關(guān)聯(lián)的程序的函數(shù)的參數(shù)(特別是，反應(yīng)類型，探針，樣本)將自動地選擇要傳送給模塊111的設(shè)定溫度變化。
而且，溫度傳感器112整合入工作臺中，記錄其有效溫度并且將它傳送至也與該傳感器相連的溫度控制單元15。
以這樣的方式，芯片上位點(diǎn)的溫度由溫度控制單元15控制，并且芯片上位點(diǎn)的這一溫度也被溫度控制單元實(shí)時(shí)獲知。
而且，可以相對于位點(diǎn)的組或者甚至相對于芯片上各個位點(diǎn)的每一個預(yù)設(shè)幾個溫度傳感器112。
傳感器112整合入工作臺11中。
此外，如以后將要更詳細(xì)表述的(特別是關(guān)于動態(tài)模式)，這(這些)溫度傳感器使得它能記錄與裝置的功能相關(guān)聯(lián)的溫度參數(shù)，并且能調(diào)節(jié)這種功能。
激發(fā)設(shè)備13激發(fā)設(shè)備13包括兩種類型的光源·廣譜燈131——優(yōu)選為汞燈，·至少一個激光器132。
這個激光器按照能激發(fā)常用標(biāo)記的波長發(fā)射，并且其激發(fā)光譜與燈131的發(fā)射光譜不一致。
在優(yōu)選實(shí)施例中，燈是汞燈——其不能激發(fā)Cy5標(biāo)記——激光器是常用的紅激光器，其發(fā)出的射線集中在635nm，或者是其它能激發(fā)Cy5分子的激光器。
以這樣的方式，所有常用的發(fā)光標(biāo)記都能通過激發(fā)設(shè)備13而激發(fā)。
而且，激光器的利用不會顯著增加讀出器的成本價(jià)格，因?yàn)檫@種類型的激光器非常普通而且便宜。
激發(fā)設(shè)備13還包括針對每個類型光源的獨(dú)立的電源1310，1320。
設(shè)備13還包括插入燈131和工作臺之間的光學(xué)系統(tǒng)1311(因而在芯片的分子和燈之間)。
如圖3a所示，這個光學(xué)系統(tǒng)包括激發(fā)濾光器13111，和光束分離器13112，使其能夠·使來自燈和來自濾光器13111的輻射直射向芯片，·使來自芯片的對應(yīng)于來自燈的(或來自激發(fā)設(shè)備的激光器的)激發(fā)的信號直射向閱讀設(shè)備14。
特別的是，所述光學(xué)系統(tǒng)還可以包括窄帶激發(fā)光濾光器和窄帶發(fā)射光濾光器(至少2個直至8個)以及光束分離器。
直射向芯片以及來自該芯片的輻射還可以通過物鏡134。
激發(fā)設(shè)備13還可以包括干涉濾光器變化設(shè)備1312(見于圖1)，其與濾光器13111和濾光器控制設(shè)備16相連。
因而可以理解，芯片的分子被來自燈的經(jīng)過了光學(xué)系統(tǒng)的輻射激發(fā)。
至于由來自激光器的輻射引起的芯片分子的激發(fā)，它是直接發(fā)生的，在激光器和芯片之間沒有插入任何元件。
在圖3a所示的更為特別的變體中，激發(fā)設(shè)備包括兩個激光器1321和1322。這兩個激光器是相同的。
每個激光器與用于掃描生物芯片的模塊(未示出)相關(guān)聯(lián)。
當(dāng)讀出器僅僅包含一個激光器時(shí)，這個激光器本身還與在可參量排列的光束中實(shí)現(xiàn)這個功能的模塊相關(guān)聯(lián)。
為了有效覆蓋對應(yīng)于要鑒別的芯片上位點(diǎn)的視野，并且通過激光器均勻照明該視野，兩個掃描模塊在兩個垂直方向上施加兩個獨(dú)立的分子掃描。
這種掃描類型在圖3a的下半部分示例。
兩個帶13210和13220代表了兩個激光器1321和1322的各自的光束。
這兩個光束具有延長的交叉部分，兩個光束的延長方向是垂直的。
這些方向中的每個可以在芯片上位點(diǎn)校準(zhǔn)的兩個方向之一上被調(diào)準(zhǔn)，這些位點(diǎn)一般形成矩形矩陣。
每個光束通過與其相關(guān)聯(lián)激光器的掃描模塊而在視野120中移動，其方向?yàn)榇怪庇诠馐娱L的方向。
圖3b代表了完成激發(fā)設(shè)備13的激光器的第二種變體。這些激光器預(yù)定要用于激光器1321和1322的位置。
在這個變體中，激光器激發(fā)通過兩個產(chǎn)生兩個獨(dú)立光束13210’和13220’的相同組件1321’和1322’而直射向芯片12。
這些組件之一，1321’所指示的，如圖3b的上半部分所示例。
這種組件包括激光器13211’，其與輸出透鏡13212’相關(guān)聯(lián)，該透鏡使來自激光器的光流朝向光纖13213’。
這個光纖本身將輻射傳送至另一個透鏡，標(biāo)號為13214’，其相對于芯片固定安裝并且使光束13210’朝向它。
圖3a的下半部分代表了兩個光束13210’和13220’在芯片上的影響以及在這樣被限定的照明范圍1320上的影響。
因此激光器可以是偏中心的。
圖3c代表了激光系統(tǒng)的第三種變體，在其中至少一個固定激光器132″使其光束朝向順序安裝的兩個連續(xù)鏡組件，標(biāo)號為1321″和1322″。
這些鏡組件中的每個包括一個鏡，其方向是由獨(dú)立的壓電調(diào)節(jié)器13210″，13220″來控制的。
更具體的，這樣一來，每個鏡沿著各自的軸移動，這些軸對應(yīng)于芯片12的橫向軸X，Y其中之一。
這樣，來自兩個鏡的光束1320″在芯片上采用的通路13201″可以沿著軸X、Y跟隨任意預(yù)定的序列。
此外，這種激光器系統(tǒng)可以替代圖3a中的激光器1321、1322。
最后，圖3d示例了完成另一種激發(fā)設(shè)備13的變體，其對應(yīng)于圖3a所代表的設(shè)備的替代方式。
這個圖3d代表汞燈131和激光器132。
激光器和燈每個都與各自的輸出透鏡相關(guān)聯(lián)。
在這個變體中，來自激光器和來自燈的獨(dú)立輻射采用相同的光學(xué)通路，由于能圍繞位于兩個位置之間的軸1300旋轉(zhuǎn)的搖擺鏡130因而使這兩個輻射之一朝向系列透鏡1301以及回轉(zhuǎn)鏡1302以便使輻射朝向光學(xué)組件134和芯片12。
鏡130的搖擺控制設(shè)備可以控制任意序列，使其能夠用兩種類型輻射(激光器和燈)照明芯片，例如通過預(yù)定的頻率在它的兩個位置之間旋轉(zhuǎn)。
特別的是，在上述所有變體中，激發(fā)設(shè)備可以包括一個激光器，或幾個相同的激光器。
閱讀設(shè)備14閱讀設(shè)備14包括光學(xué)系統(tǒng)141，其用于獲取芯片12的圖像范圍120，而且，能夠用于該芯片通過工作臺11的受控制的移動而相對于讀出器的其余部分移動。
為了這種效果，閱讀設(shè)備還包括記錄設(shè)備，用于協(xié)調(diào)工作臺11的移動。
因此光學(xué)系統(tǒng)141包括第一探測光學(xué)組件1411，以及插入這第一光學(xué)組件和CCD攝像機(jī)142之間的濾光器1412。
光學(xué)系統(tǒng)141還包括濾光變化設(shè)備14120(見圖1)，其與濾光器1412和濾光器控制設(shè)備16相連。
控制和命令設(shè)備除了溫度控制單元15和濾光器控制設(shè)備16已經(jīng)介紹過之外，用于控制和命令讀出器的設(shè)備包括，管理讀出器所有元件功能的計(jì)算機(jī)17。
計(jì)算機(jī)與如下元件以這樣一種方式相連以便將功能指令傳送給它們并且/或者接收來自它們的信息≯電源1310和1320——在這方面，計(jì)算機(jī)執(zhí)行激發(fā)控制單元的功能。特別是計(jì)算機(jī)可以選擇控制采用燈和至少一個激光器同時(shí)照明芯片分子，或者采用燈和至少一個激光器分別激發(fā)分子≯溫度控制單元15，≯濾光器控制設(shè)備16，≯以及伴隨的其它控制和命令元件。
控制和命令讀出器的設(shè)備還可包含·用于控制工作臺11移動的單元18，其與該工作臺和計(jì)算機(jī)17相連，·控制攝像機(jī)142以及獲取由該攝像機(jī)獲得的圖像的單元19，其能按照各種模式，其中包括用于跟隨動態(tài)現(xiàn)象的實(shí)時(shí)模式，或者采用終止時(shí)間用于提高非常低強(qiáng)度的位點(diǎn)(雜交信號)的圖像信噪比。
讀出器的功能根據(jù)本發(fā)明的讀出器的結(jié)構(gòu)在以上已經(jīng)詳細(xì)描述了。特定的方面，尤其是芯片分子的激發(fā)也已經(jīng)說明?，F(xiàn)在，將從溫度控制的角度詳細(xì)說明該讀出器的功能。
更具體的，將在預(yù)定的本發(fā)明應(yīng)用的基礎(chǔ)上描述該功能，即芯片的寡核苷酸與來自生物樣本的單鏈DNA片段的雜交。
然而，特異化的根據(jù)本發(fā)明的讀出器也能被用于其它應(yīng)用——例如，用于實(shí)現(xiàn)酶反應(yīng)(特別是連接酶，PCR，簡單寡核苷酸延伸，等類型)，用于篩選配體。
回到雜交應(yīng)用，例如來自患者的生物樣本，被研究以便檢測其中特定的遺傳特征。所尋找的特征可以是，例如，特異核酸序列，例如，CFTR基因中，可能存在的突變。
該方法開始是常規(guī)的，通過將對應(yīng)于靶核酸的核苷酸所構(gòu)成的核酸探針構(gòu)建在芯片的各個位點(diǎn)上而制備芯片。
這些探針預(yù)定要與包含單鏈DNA片段的樣本雜交。
而且，單鏈DNA片段是以已知方式獲得的，特別是通過PCR擴(kuò)增。它們與標(biāo)記相結(jié)合從而在這些片段與芯片探針雜交之后，使其能被讀出器的閱讀設(shè)備檢測。
所述探針隨后與樣本接觸因而實(shí)現(xiàn)特定探針與樣本單鏈DNA片段的選擇性雜交，從而構(gòu)建二倍體。
特別的是，不是所有的探針都與樣本的DNA鏈雜交。
事實(shí)上，每個核酸探針將優(yōu)先與其靶核酸雜交。
此外，一些探針對應(yīng)于沒有突變的核酸，而另一些則對應(yīng)于包含給定突變的核酸。
在這個雜交步驟期間，為有效雜交的探針形成二倍體。
探針正確雜交意味著包含單鏈DNA片段的樣本與所述探針的靶核酸相對應(yīng)。
以這種方式雜交的探針因而在雜交步驟之后對應(yīng)于“匹配”型二倍體。
而且，在雜交步驟之后，與樣本的單鏈DNA片段沒有雜交或雜交很差的探針對應(yīng)于“錯配”型二倍體或者甚至是非雜交的單鏈。
溫度是這個雜交步驟的重要參數(shù)。
這是因?yàn)?，對于每個靶核酸，存在著·針對處于“錯配”構(gòu)象中的二倍體的融合溫度Tm1，以及·針對處于“匹配”構(gòu)象中的二倍體的融合溫度Tm2。
融合溫度對應(yīng)于二倍體的一半的兩條鏈彼此分離時(shí)的溫度。
Tm1小于Tm2，如圖4a所示。
此外，理想的是，對于給定的靶核酸，在對應(yīng)于匹配和錯配之間差別最大的溫度進(jìn)行雜交步驟。
這樣，“匹配”和“錯配”二倍體可采用芯片讀出器的閱讀設(shè)備有選擇的鑒別。
這個理想溫度介于Tm1和Tm2之間。
在已知雜交方法的情況中，通常需要重復(fù)幾次雜交從而獲得接近于這個理想溫度的溫度。
在本發(fā)明的情況中，溫度的控制是通過溫度控制單元15而進(jìn)行的，從而避免了這一缺點(diǎn)。
更具體的，本發(fā)明的這一應(yīng)用可按照兩種模式實(shí)現(xiàn)“靜態(tài)”模式和“動態(tài)”模式。
在這兩種模式中，以下溫度可以自動被確定·處于“匹配”構(gòu)象中的每個靶核酸的融合溫度，以及·處于“錯配”構(gòu)象中的每個靶核酸的融合溫度。
靜態(tài)模式這種模式非常適合于探針對應(yīng)于同樣的靶核酸或靶核酸具有相似融合溫度的芯片的情況。
在這種模式中，所述融合溫度的確定是預(yù)先完成的，因此這些溫度在完成鑒別之前就已知了。
這些溫度可以讓操作者知曉，他實(shí)現(xiàn)這一鑒別并且因而將設(shè)定溫度輸入裝置(采用與計(jì)算機(jī)相連的接口，或者直接與單元15相連的接口)。
這些溫度還可以被存儲在讀出器的存儲器中，該存儲器與所述單元15相連。
這樣，芯片的溫度被控制，因而可在匹配與錯配之間差別最大的溫度進(jìn)行雜交。
特別的是，融合溫度還可以通過讀出器(見隨后的動態(tài)模式)而確定，并且被存儲用于完成靜態(tài)模式。
在這樣的融合溫度的優(yōu)先確定期間，參考曲線等價(jià)于圖4a產(chǎn)生的那些。
因而能在閱讀步驟之前形成參考曲線。
在這種情況下，讀出器被用來記錄在單元15控制的影響下溫度連續(xù)變化時(shí)，探針對已知類型的單鏈片段(對應(yīng)于沒有突變，和有突變的靶核酸的片段)的應(yīng)答。
此外，這些曲線可以被存儲在，例如計(jì)算機(jī)17中。
動態(tài)模式這種模式特別適合于這種情況的芯片，即其中的探針對應(yīng)于具有非常不同融合溫度的“匹配”構(gòu)象的靶核酸。
在這種模式中，芯片的溫度變化(例如，連續(xù)升高或連續(xù)降低)被控制，以通過各種探針的各種靶核酸的融合溫度。
這種變化通過從單元15輸送合適的信息至與工作臺相關(guān)聯(lián)的模塊111的帕爾帖元件而獲得。
在溫度的這種變化期間·閱讀設(shè)備14實(shí)時(shí)收集與芯片上各個位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的二倍體在激發(fā)設(shè)備13激發(fā)下的應(yīng)答，并將所述應(yīng)答傳送給計(jì)算機(jī)18。
·對于芯片上的每個位點(diǎn)，二倍體的應(yīng)答作為溫度函數(shù)的發(fā)展情況被存儲在計(jì)算機(jī)18的存儲器中。
此外，至少一個溫度傳感器112存在于工作臺中使其能夠·記錄連續(xù)溫度值的變化(這發(fā)生在工作臺的各個位點(diǎn)——因此在芯片上——其中排列了各傳感器112)。這使其能鑒別二倍體應(yīng)答中作為溫度函數(shù)的變化，·控制工作臺表面上的溫度。在這方面，傳感器112允許在簡單的滿足傳送設(shè)定溫度至加熱元件的“盲”控制之外，進(jìn)行溫度的實(shí)際調(diào)節(jié)。
要強(qiáng)調(diào)的是，由于帕爾帖元件非常敏感并且可以進(jìn)行快速溫度變化，所以PCR類型的應(yīng)用也是可預(yù)見的。
此外，將離散的帕爾帖類型加熱/冷卻元件與至少一個溫度傳感器結(jié)合使其能夠·精細(xì)的控制溫度在工作臺所有位點(diǎn)的分布(以及在芯片上)，·確保在簡單控制之外進(jìn)行真實(shí)調(diào)節(jié)。
這樣，對于芯片上的每個位點(diǎn)，計(jì)算機(jī)構(gòu)建了探針的作為溫度函數(shù)的應(yīng)答中變化的曲線，如圖4b所示，其示例了四位點(diǎn)芯片的非常簡單的情況(曲線1，2，3和4)。
探針成對分布，其中之一與沒有突變的靶核酸相對應(yīng)，另一個則與具有突變的相同靶核酸相對應(yīng)。
因此每一對的兩個探針的應(yīng)答將對應(yīng)于兩條與圖4a的參考曲線相似的曲線。
此外，通過分析每一對探針的曲線，它將能夠確定“匹配”探針和“錯配”探針。
對于這個效果，計(jì)算機(jī)包括了一個程序，一旦所述應(yīng)答中的變化被存儲，該程序就能建立針對芯片上每個位點(diǎn)的與該位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的診斷狀態(tài)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明的芯片讀出器能夠閱讀DNA芯片。因而本發(fā)明的目的還包括提供一種DNA芯片，其包括許多對應(yīng)于或包含野生型或突變基因片段的寡核苷酸(或探針)，特別是人的CFTR基因(囊性纖維化貫通膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子)。這樣的芯片尤其適用于檢測人CFTR基因的突變并診斷囊性纖維化。
囊性纖維化是高加索人種中最常見的常染色體隱性疾病之一，在北美出生的每2000個人中就有一人受其影響(Boat等人，遺傳疾病的代謝基礎(chǔ)，6thEd.Pp 2649-1680，McGraw Hill，New York，1989)。
囊性纖維化與250kb長的并包含27個外顯子的CFTR基因的突變相關(guān)聯(lián)。由于該基因已經(jīng)在1989年被鑒別，所以已經(jīng)開展了很多基因分析以限定該基因的突變范圍。所述突變有很多變體，并且超過850種突變已被鑒別。然而，有一種突變被發(fā)現(xiàn)存在于50％的患者中；它是Delta F508突變。而大多數(shù)其它的突變在患者中發(fā)生率很低(1—5％)。
這一發(fā)現(xiàn)揭示了研發(fā)可能的診斷檢測的復(fù)雜性。因此一種診斷檢測允許檢測大約30種不同的突變，其采用試管配體反應(yīng)(OLA，PerkinElmer)。
還有其它的涉及DNA芯片技術(shù)的方法被研發(fā)用于鑒別人CFTR基因的突變。這些記載見于美國專利US6027880；5837832；5972618；和5981178。然而，到目前為止，還沒有一種檢測能夠在一樣本中快速、有效而可靠地檢測CFTR基因中最常見的突變。這是本發(fā)明提出的所要解決的問題，其通過研發(fā)用于檢測人CFTR基因中突變的DNA芯片，該芯片可用于根據(jù)本發(fā)明的讀出器。
CFTR芯片的特性本發(fā)明提供了寡核苷酸或DNA芯片(CFTR芯片)的陣列用于檢測人CFTR基因的突變。該陣列包括固相支持物，有多個不同的寡核苷酸(探針)以所述寡核苷酸與互補(bǔ)寡核苷酸或多核苷酸有效雜交的方式(即，與存在于要檢測的生物樣本或取自其中的靶寡核苷酸或多核苷酸)結(jié)合在該支持物上，并且在這樣的方式中所述寡核苷酸在各個位點(diǎn)具有不同的核苷酸序列結(jié)合至所述固相支持物，以便寡核苷酸具有與在所述固體支持物的特異位點(diǎn)的互補(bǔ)靶寡核苷酸或多核苷酸有效雜交的特異核酸序列。
所述陣列的特征在于它包括至少一對，至少兩對，至少三對，至少四對，至少五對寡核苷酸，至少6對，至少7對，至少8對，至少9對，至少10對，至少15對寡核苷酸，每對寡核苷酸由對應(yīng)于或包含野生型(wt)CFTR基因的寡核苷酸片段的寡核苷酸以及對應(yīng)于或包含突變(mut)CFTR基因寡核苷酸片段的寡核苷酸以及與突變和野生型CFTR基因形成“錯配”二倍體的陰性對照寡核苷酸(cont)所組成。
產(chǎn)生了兩組大約為20nt(取決于堿基組成)和15nt長度的探針。
優(yōu)選地，所述組(野生型/突變/對照)選自以下組中SET No.1(這組沒有對照探針)TAGGAAACACCAAAGATGATATTT(SEQ ID N°1)24merCATAGGAAACACCAATGATATTTT(SEQ ID N° 2)24merSET NO.2AGGAAAACTGAGAACAGAATG(SEQ ID N°3)21merAGGAAAACTAAGAACAGAATG(SEQ ID N°4)21merAGGAAAACTTAGAACAGAATG(SEQ ID N°5)21merSET No.3ACCTTCTCCAAGAACTATATTG(SEQ ID N°6)/22merACCTTCTCAAAGAACTATATTG(SEQ ID N°7)22merACCTTCTCTAAGAACTATATTG(SEQ ID N°8)22merSET No.4TTCTTGCTCGTTGACCT(SEQ ID N°9)/17merTTCTTGCTCATTGACCT(SEQ ID N°10)17merTTCTTGCTCCTTGACCT(SEQ ID N°11)17merSET No.5TCGTTGACCTCCACTCA(SEQ ID N°12)/17mer
TCGTTGATCTCCACTCA(SEQ ID N°13)17merTCGTTGAACTCCACTCA(SEQ ID N°14)17merSET No.6ACCTTCTCCAAGAAC(SEQ ID N°15)/15merACCTTCTCAAAGAAC(SEQ ID N°16)15merACCTTCTCTAAGAAC(SEQ ID N°17)15merSET No.7CTTGCTCGTTGACCT(SEQ ID N°18)/15merCTTGCTCATTGACCT(SEQ ID N°19)15merCTTGCTCCTTGACCT(SEQ ID N°20)15merSET No.8TCGTTGACCTCCACT(SEQ ID N°21)/15merTCGTTGATCTCCACT(SEQ ID N°22)15merTCGTTGAACTCCACT(SEQ ID N°23)15merNo.1的一對能檢測最普通的CFTR基因突變，即位于外顯子10中的delta F508突變。這個突變對應(yīng)于檢測3堿基對(AGA編碼)，其結(jié)果導(dǎo)致CFTR蛋白缺失氨基酸508。
SET No.2能檢測CFTR基因外顯子10中的突變Q493X。這個突變對應(yīng)于在位置493的G→A的替換，其結(jié)果導(dǎo)致出現(xiàn)無義突變。
SET No.3和6能檢測CFTR基因外顯子11中的突變G542X。這個突變對應(yīng)于在位置542的C→A的替換，其結(jié)果導(dǎo)致出現(xiàn)無義突變。
SET No.4和7能檢測CFTR基因外顯子11中的突變R553X。這個突變對應(yīng)于在位置553的G→A的替換，其結(jié)果導(dǎo)致出現(xiàn)無義突變。
SET No.5和8能檢測CFTR基因外顯子11中的突變G551D。這個突變對應(yīng)于在位置551的C→T的替換，其結(jié)果導(dǎo)致在位置551以天冬氨酸替代甘氨酸。
優(yōu)選地，本CFTR芯片至少包括上述五對寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的CFTR芯片特征在于組成它的寡核苷酸在處于雙鏈形式時(shí)具有相似的融合溫度，并且優(yōu)選介于大約55至85℃，大約65至75℃，優(yōu)選大約70℃范圍(在1MNaCl中)。這樣，序列的寡核苷酸任選地，根據(jù)本發(fā)明的CFTR芯片還包含陰性對照寡核苷酸，即與所有要研究的靶形成錯配雜交的探針。
要在帶有錯配和沒有錯配的雜交之間獲得好的區(qū)別，固定在固體表面上的寡核苷酸序列的選擇非常重要。這樣，探針的設(shè)計(jì)非常重要，以便避免通過固定的探針形成第二分子內(nèi)結(jié)構(gòu)和形成分子間復(fù)合物的可能性，因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)極大降低靶和探針雜交的效率，以及具有或沒有錯配雜交之間的區(qū)別。這樣，通過選擇寡核苷酸的核酸序列，尤其是其長度和堿基組成，和/或通過施加額外的核酸以便修飾Tm或形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)和分子間復(fù)合物的可能性，從而達(dá)到對寡核苷酸特性的要求。這些很難滿足的要求證明本發(fā)明步驟的優(yōu)勢。
根據(jù)本發(fā)明的CFTR芯片，由寡核苷酸探針涂覆，其特征在于所述寡核苷酸探針被沉積形成位點(diǎn)，其平均直徑介于20μm至500nm之間，優(yōu)選介于50μm至200μm之間。
每個寡核苷酸探針的位點(diǎn)中心之間的距離是可變的，并且取決于芯片，但是它們被限定以便不影響在兩個相鄰位點(diǎn)上的雜交反應(yīng)。然而，這個距離優(yōu)選介于50μm至80μm之間，1000μm至2500μm之間，或100μm至500μm之間。在每個位點(diǎn)，優(yōu)選沉積相同寡核苷酸的多份拷貝。這樣，每個位點(diǎn)優(yōu)選地包含至少1個，至少2個，或通常至少16個同樣的寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的芯片上的位點(diǎn)數(shù)量是可變的，并且取決于在固體表面上點(diǎn)樣的寡核苷酸對的數(shù)量。優(yōu)選地，它是中間密度陣列，即具有限定數(shù)量的位點(diǎn)。這樣，所述位點(diǎn)的數(shù)量為至少2個/cm2，至少4個/cm2，至少6個/cm2，至少8個/cm2，至少10個/cm2，至少50個/cm2，至少100個/cm2，至少500個/cm2，至少1000個/cm2，至少10000個/cm2，至少50000個/cm2，或至少100000個/cm2。
根據(jù)本發(fā)明的CFTR芯片的固體支持物選自由玻璃，塑料，Nylon，Kevlar，硅樹脂，硅或多聚糖制成的固體支持物。優(yōu)選地，固體支持物是玻璃載波片，更優(yōu)選的是玻璃顯微載波片。
優(yōu)選的是，載波片采用醛基功能化。對于商業(yè)可得到的例子是2D玻璃載波片。根據(jù)本發(fā)明的芯片優(yōu)選來自2D-微陣列或3D-微陣列類型。根據(jù)第一實(shí)施例，它是2D-芯片，其中根據(jù)本領(lǐng)域人員已知的方法，探針優(yōu)選地通過氨基和醛基化學(xué)功能團(tuán)結(jié)合。這樣，未修飾的DNA和氨基修飾的DNA可以分別通過共價(jià)鍵在這些基質(zhì)上雜交。
將介紹用于固定銨基修飾DNA的超醛基基質(zhì)型載波片或用于固定未修飾DNA的超胺基基質(zhì)類載波片(例如，注冊商標(biāo)為TeleChemArray IT的載波片)。
氨基修飾DNA在商業(yè)化的醛基功能化載波片上的固定原理見于圖5。
圖6和7示例了對該方案修飾的影響以便實(shí)現(xiàn)在高濕度下DNA與超醛基表面的耦合(濕度為在具有大約700cm3封閉塑料盤中，水半滿)。
這種修飾提高了固定效率和信噪比。
根據(jù)第二實(shí)施例，芯片是水凝膠基的3D—芯片，例如3端連接的活性載波片(MotorolaTM)，其具有以下優(yōu)點(diǎn)(i)更高的探針固定效率，以及更好的雜交信號強(qiáng)度；(ii)在帶有錯配和沒有錯配的雜交之間更好的差別(Livshits and Mirzabekov，1996，DNA與凝膠固定的寡核苷酸雜交的動力學(xué)理論分析.Biophys.J.Nov.；71(5)2795-2801)。
優(yōu)選地，上述的CFTR芯片的寡核苷酸以單鏈DNA形式通過寡核苷酸的末端之一被點(diǎn)樣和結(jié)合至固體表面。優(yōu)選地，它是3’-末端。
CFTR芯片的用途過程材料和方法雜交條件寡核苷酸和芯片的雜交樣本從包含以下的混合液中制備·采用Cy3熒光團(tuán)標(biāo)記的非突變(野生型或wt)寡核苷酸，以及·采用Cy5熒光團(tuán)標(biāo)記的突變(或mut)寡核苷酸其在芯片上被雜交AAATATCATCTTTGGTGTTTCCTA-Cy3(ΔF508-wt)AAAATATCATTGGTGTTTCCTATG-Cy5(ΔF508-mut)CATTCTGTTCTCAGTTTTCCT-Cy3(Q493X-wt)CATTCTGTTCTTAGTTTTCCT-Cy5(Q493X-mut)AATATACTTGGAGAAGGT-Cy3(G542X-wt)ACCTTCTCAAAGTATATT-Cy5(G542X-mut)
AGGTCAACGAGCAAGAA-Cy3(R552X-wt)AGGTCAATGAGCAAGAA-Cy5(R552X-mut)TGAGTGGAGGTCAACGA-Cy3(G551D-wt)TGAGTGGAGATCAACGA-Cy5(G551D-mut)圖8顯示了對應(yīng)于芯片上寡核苷酸ΔF508-wt，ΔF508-mut，Q493-wt和Q493-mut雜交的雜交圖像。
觀察到了所有突變的匹配/錯配差別。
材料和方法雜交條件采用的是來自Metabion公司的3’末端標(biāo)記的寡核苷酸。寡核苷酸的特質(zhì)經(jīng)過變性條件下20％聚丙烯酰胺凝膠被檢驗(yàn)。
芯片上熒光團(tuán)標(biāo)記的寡核苷酸的雜交在2×SSC，0.2％SDS，0.2mg/ml BSA類型的溶液中，在室溫下進(jìn)行12小時(shí)。雜交室的體積為180μl，每種寡核苷酸的濃度為0.1μm。
芯片的雜交后在2×SSC，0.2％SDS溶液中，室溫洗滌1分鐘。
隨后根據(jù)TeleChem方案通過在500×g離心1分鐘來干燥芯片，并且隨后被閱讀。
一般，本發(fā)明的這種應(yīng)用包括利用根據(jù)本發(fā)明的CFTR芯片，用于檢測患者CFTR基因序列中可能存在的突變，優(yōu)選采用根據(jù)本發(fā)明的讀出器。
本方法的必要步驟如下·靶多核苷酸或寡核苷酸的制備采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法從生物樣本中提取基因DNA，或信使RNA，或其片段。利用重組DNA技術(shù)，RNA任選的轉(zhuǎn)換成cDNA(互補(bǔ)DNA)。這樣，所分離的DNA隨后被分成片段和/或通過PCR擴(kuò)增，以便產(chǎn)生寡核苷酸片段。后者被標(biāo)記，在采用根據(jù)常規(guī)方法的信號產(chǎn)生標(biāo)記之前、期間或者之后。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，這樣被分離的DNA采用針對要檢測的CFTR基因范圍的特異性引物通過PCR被擴(kuò)增，利用標(biāo)記的或修飾的核苷酸。這樣標(biāo)記的DNA，cDNA或RNA隨后被變性以便獲得單鏈分子。
·ssPCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記外顯子10的ssPCR產(chǎn)物(長度大約400nt)采用Cy3或Cy5熒光標(biāo)記被3’末端標(biāo)記——將100pmol的ssPCR產(chǎn)物溶解在25μl溶液中(在水中1×TdT緩沖液，400pmol的Cy3—UTP(或Cy5-UTP))，——加入10單位的TdT。
反應(yīng)在37C下進(jìn)行1小時(shí)。未結(jié)合的標(biāo)記采用QiagenDyeExTMSpin Kit柱根據(jù)Qiagen方案消除。
·靶DNA與芯片的寡核苷酸的雜交這樣標(biāo)記和變性的DNA、cDNA或RNA隨后被點(diǎn)樣至芯片上，并且在限定的嚴(yán)格雜交條件下通過特異雜交與寡核苷酸探針適當(dāng)結(jié)合。在清洗以去除過量標(biāo)記的DNA、cDNA或RNA和/或那些非特異性雜交之后，所形成的二倍體采用根據(jù)本發(fā)明的讀出器檢測。
CFTR基因中突變的分析可以按照第一種方法實(shí)現(xiàn)，即比較CFTR生物芯片上野生型(wt)和/或突變靶寡核苷酸與采用熒光團(tuán)標(biāo)記的單一類型靶寡核苷酸的雜交信號的強(qiáng)度。第二種方法采用在CFTR芯片上至少兩種不同的，采用不同信號產(chǎn)生標(biāo)記所標(biāo)記的靶核苷酸的雜交，其中的寡核苷酸之一來自要檢測的樣本，另一個與參考寡核苷酸相對應(yīng)(一般，寡核苷酸對應(yīng)于野生型序列)。
雜交在室溫為大約20℃的情況下，在后文將限定的且不含甲酰胺的緩沖液中進(jìn)行在所述靶核苷酸上的探針雜交。如果所用的雜交媒介中包含甲酰胺，本領(lǐng)域技術(shù)人員將不得不調(diào)整雜交條件。
優(yōu)選地，用于根據(jù)本發(fā)明的所述CFTR芯片的雜交媒介包括至少6×SSC(1×SSC對應(yīng)于0.15M NaCl+0.015M檸檬酸鈉)，0.2％的十二烷基硫酸鈉以及，任選地，0.2mg/ml的牛血清白蛋白。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過在雜交緩沖液中具有相似功能的化合物任意修訂這些條件。例如可以想得到，用動物膠替代牛血清白蛋白，或用SSPE緩沖液替代SSC緩沖液(5×SSPE由750M NaCl，50mM磷酸鈉，5mMEDTA組成，pH7.4)。
表述“允許靶核酸與所述寡核苷酸探針特異雜交的條件”優(yōu)選指的是極為嚴(yán)格的條件，尤其是后文所定義的?！皣?yán)格”條件是指在這些條件下探針將雜交在其靶序列上，但是不雜交在其它序列上。嚴(yán)格條件取決于序列，并且根據(jù)環(huán)境而不同。因子的變化可影響雜交的嚴(yán)格性。在這些之中，應(yīng)該由基礎(chǔ)組分，互補(bǔ)鏈的大小，有機(jī)溶劑的存在和堿基錯配的長度來構(gòu)成提及的表述。針對影響雜交的一般因素的討論可見于WO 93/02216或者Ausubel等人(分子生物學(xué)常規(guī)操作，GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley and Sons，Inc.)。一般，所選擇的嚴(yán)格條件為，例如，針對在限定的離子強(qiáng)度和pH的特異序列，溫度比融合溫度(Tm)低5℃。Tm是指50％的互補(bǔ)于靶序列的探針雜交至靶序列的平衡點(diǎn)的溫度(在限定的離子強(qiáng)度，pH值以及核酸濃度的條件下)。通常，嚴(yán)格條件包括至少大約0.01M至1M的鈉或其它的鹽濃度，pH值為7.0至8.3，以及針對小探針(10至50核苷酸)的至少為大約30℃的溫度。嚴(yán)格條件還可以通過加入不穩(wěn)定試劑，例如甲酰胺或四烷基銨鹽而獲得。例如，5×SSPE(750M NaCl，50mM磷酸鈉，5mM EDTA，pH7.4)和25-30℃的溫度的嚴(yán)格條件是突變遺傳因子特異探針雜交常用的條件。
在極為嚴(yán)格條件下的雜交意味著選擇溫度和離子強(qiáng)度，以便維持兩個互補(bǔ)DNA/DNA或RNA/DNA片段的雜交。通過示例，以上所述用于雜交步驟的為了限定雜交條件的極為嚴(yán)格的條件具有以下優(yōu)點(diǎn)DNA-DNA或DNA-RNA雜交分兩步進(jìn)行(1)在包含5×SSC，50％甲酰胺，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，10×Denhardt’s，5％葡聚糖硫酸鹽和1％鮭精DNA的磷酸緩沖液(20mM，pH7.5)中42℃預(yù)雜交3小時(shí)；(2)每序列在取決于探針大小的溫度下(即，大于100核苷酸的探針，溫度為42℃)雜交20小時(shí)，隨后在2×SSC+2％SDS中20℃進(jìn)行兩次20分鐘的洗滌，在0.1×SSC+0.1％SDS中20℃進(jìn)行一次20分鐘的洗滌。對于大小大于100核苷酸的探針，最后在0.1×SSC+0.1％SDS中60℃進(jìn)行30分鐘的洗滌。上述用于限定大小的多核苷酸的極為嚴(yán)格的雜交條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在用于更長或更短的寡核苷酸時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)，可參考Sambrook等人的描述(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊。2ndEd.Cold Spring Harbor)。
最后，雜交可以在更潮濕或更不潮濕的空氣中進(jìn)行。低濕度或高濕度的雜交條件使其能充分發(fā)揮雜交特異性。
嚴(yán)格性可以通過逐步提高嚴(yán)格條件而經(jīng)驗(yàn)的確定，例如通過提高鹽濃度，或者通過提高溫度直至獲得理想的特異性程度。本發(fā)明通過精確控制溫度的提高而能夠提高嚴(yán)格條件。
本發(fā)明還提供了用于診斷囊性纖維化的試劑盒，包含根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸陣列或CFTR芯片。用于檢測樣本中人CFTR基因中的突變或基因型的試劑盒或包的特征在于其包括根據(jù)本發(fā)明的CFTR芯片和，任選地，標(biāo)記靶寡核苷酸或多核苷酸所需要的試劑。本發(fā)明的目的還包括利用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸陣列或CFTR芯片診斷個體中的囊性纖維化。
本發(fā)明的目的還包括用于檢測樣本的CFTR基因中突變的方法，特征在于其包括如下步驟a)在允許這些靶核苷酸或把多核苷酸與所述寡核苷酸探針特異雜交的條件下，將取自懷疑存在突變的人CFTR基因中的包含靶核苷酸或多核苷酸的樣本點(diǎn)樣至采用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸涂覆的芯片上；b)在合適條件下洗滌來自步驟a)的芯片，以便去除沒有被雜交捕獲的樣本核酸；并且c)任選地采用根據(jù)本發(fā)明的讀出器檢測芯片上被雜交捕獲的核酸。
本發(fā)明的目的之一還包括用于診斷個體中囊性纖維化的體外方法，其包括如下步驟(a)獲得至少一個取自個體的CFTR基因的DNA片段；(b)用信號產(chǎn)生標(biāo)記來標(biāo)記所述片段；任選地，使所述片段變性以便獲得單鏈片段；(c)使所述標(biāo)記的片段與根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸陣列雜交；(d)檢測與所述陣列的一個或更多寡核苷酸特異雜交的DNA片段；(e)任選地，確定在所述個體中CFTR基因突變的存在。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述片段在步驟(b)中直接或間接地用根據(jù)本發(fā)明的信號產(chǎn)生標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記；優(yōu)選地，其為選自以下組的熒光標(biāo)記Cy3，Cy5，F(xiàn)ITC，德克薩斯紅(梅紅)，Bodipy 630/650，Alexa 488，Alexa 350，等等。
根據(jù)第一實(shí)施例，由信號產(chǎn)生標(biāo)記所標(biāo)記的單一靶核苷酸在所述CFTR芯片上被雜交。
根據(jù)第二實(shí)施例，至少1個，至少2個，至少3個，至少4個，至少5個，至少6個，至少7個，至少8個，至少9個或至少10個由信號產(chǎn)生標(biāo)記所標(biāo)記的靶核酸在所述CFTR芯片上被雜交。
根據(jù)本發(fā)明的讀出器事實(shí)上能夠同時(shí)或在時(shí)間上分開的檢測帶有不同標(biāo)記的雜交或二倍體。
權(quán)利要求
1.一種用于閱讀和分析芯片的裝置，包括·用于接收要鑒別至少一個樣本的芯片的工作臺，·在與其它分子反應(yīng)之后激發(fā)芯片的分子或細(xì)胞的設(shè)備，·閱讀和分析受激發(fā)的分子的設(shè)備，特征在于該裝置還包括·用于控制所述工作臺溫度的控制單元，所述控制單元與由多個和工作臺表面上各種位點(diǎn)相對排列的帕爾帖加熱/冷卻元件所組成的模塊(111)相連，·并且至少一個工作臺溫度傳感器(112)也與所述控制單元相連。
2.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于激發(fā)設(shè)備包括廣譜燈和至少一個激光器。
3.如前述權(quán)利要求之一所述的裝置，其特征在于激光器是輻射集中在635nm等級波長的激光。
4.如前述權(quán)利要求之一所述的裝置，其特征在于讀出器包括幾個激光器。
5.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于激光器集中在相同的波長。
6.如前述權(quán)利要求之一所述的裝置，其特征在于激發(fā)設(shè)備包括至少一個與用于掃描其光束的模塊相關(guān)聯(lián)，以便激發(fā)待分析的分子。
7.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于讀出器包括兩個激光器以及用于在兩個垂直方向中掃描兩個激光器和控制兩個獨(dú)立的分子掃描的模塊。
8.如權(quán)利要求1至5之一所述的裝置，其特征在于激發(fā)設(shè)備包括至少一個激光器組件，激光器組件包括輻射受光纖引導(dǎo)的激光器。
9.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于激發(fā)設(shè)備包括兩個相同的激光器組件。
10.如權(quán)利要求1至5之一所述的裝置，其特征在于激發(fā)設(shè)備包括固定的激光器(132″)，其發(fā)射光束朝向兩個順序安裝的連續(xù)的鏡組件，鏡組件的移動被控制沿著兩個不同的方向進(jìn)行。
11.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于兩個鏡組件的移動是受控的，因而產(chǎn)生的光束能跟隨芯片上的任何預(yù)定序列。
12.如權(quán)利要求1至5所述的裝置，其特征在于激發(fā)設(shè)備包括燈和激光器，燈和激光器的輻射采用相同的光學(xué)通道，搖擺鏡(130)能夠圍繞兩個位置之間的軸(1300)旋轉(zhuǎn)因而使這兩個輻射的其中之一直射入芯片。
13.如前述權(quán)利要求之一所述的裝置，其特征在于一個光學(xué)系統(tǒng)被插入燈和待激發(fā)的分子之間，而激光器則發(fā)生對分子的直接照明。
14.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于所述光學(xué)系統(tǒng)包括窄帶激發(fā)光濾光器和窄帶發(fā)射光濾光器，以及光束分離器。
15.如前述權(quán)利要求之一所述的裝置，其特征在于讀出器還包括激發(fā)控制單元，激發(fā)控制單元與每個激發(fā)設(shè)備相連從而控制其功能。
16.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于所述激發(fā)控制單元能夠選擇性地控制采用燈和至少一個激光器同時(shí)或連續(xù)照明分子，或者是燈和至少一個激光器對分子的獨(dú)立激發(fā)。
17.一種用于閱讀和分析芯片的裝置，包括·用于接收要鑒別至少一種樣本的芯片的工作臺，·在與其它分子或細(xì)胞反應(yīng)之后，激發(fā)芯片的細(xì)胞或分子的設(shè)備，·閱讀受到激發(fā)的分子或細(xì)胞的設(shè)備，其特征在于該讀出器還包括溫度控制單元。
18.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于工作臺包括與所述溫度控制單元相連的溫度傳感器。
19.如前兩個權(quán)利要求之一所述的裝置，其特征在于讀出器包括與工作臺相關(guān)聯(lián)的并且要控制工作臺溫度的加熱/冷卻模塊，所述加熱/冷卻模塊與溫度控制單元相連接。
20.如前三個權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于讀出器還包括包含微處理器并且與溫度控制單元和閱讀設(shè)備相連接的處理設(shè)備。
21.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于讀出器包括存儲作為溫度的函數(shù)的分子對于激發(fā)設(shè)備的匹配和錯配應(yīng)答的參考曲線的設(shè)備。
22.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于存儲設(shè)備與用于根據(jù)所述參考曲線確定分子的匹配和錯配融合溫度的設(shè)備相連接。
23.如前六個權(quán)利要求之一所述的裝置，其特征在于溫度控制單元能夠按照“靜態(tài)”模式控制讀出器的功能，在“靜態(tài)”模式中預(yù)先建立的作為溫度函數(shù)的分子匹配和錯配應(yīng)答的參考曲線被用來建立能通過所述溫度控制單元而被傳送的設(shè)定溫度，從而控制所述工作臺的溫度。
24.如前七個權(quán)利要求之一所述的裝置，其特征在于溫度控制單元能夠按照“動態(tài)”模式控制讀出器的功能，在“動態(tài)”模式中溫度控制單元控制工作臺上給定的溫度變化，并且，在溫度的這一變化期間·閱讀設(shè)備實(shí)時(shí)收集與芯片上各種位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的分子對激發(fā)設(shè)備的激發(fā)做出的應(yīng)答，并將所述應(yīng)答傳送給處理設(shè)備(18)，·針對芯片上每個點(diǎn)，存儲設(shè)備存儲作為溫度函數(shù)的分子應(yīng)答的變化。
25.如前述權(quán)利要求所述的裝置，其特征在于讀出器包括處理設(shè)備，其能在所述應(yīng)答變化的存儲末端建立針對每個分子的分子診斷狀態(tài)。
26.如前述權(quán)利要求的裝置，其特征在于所述診斷狀態(tài)是匹配/錯配診斷。
27.一種芯片的寡核苷酸雜交的方法，其可以采用根據(jù)上述各權(quán)利要求之一所要求的讀出器來實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟·使對應(yīng)于靶核酸的核酸探針與包含單鏈DNA片段的生物樣本接觸，從而通過形成二倍體實(shí)現(xiàn)特定探針與樣本的所述單鏈DNA片段的選擇雜交?！ら喿x這樣形成的二倍體，該方法的特征在于該方法包括由自動確定以下溫度構(gòu)成的步驟·針對每個處于“匹配”構(gòu)象的靶核酸的融合溫度，以及·針對每個處于“錯配”構(gòu)象的靶核酸的融合溫度。
28.如前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述確定在“靜態(tài)”模式中采用說明通過閱讀分別對應(yīng)于匹配和錯配的二倍體所接受的信號中作為溫度函數(shù)的變化的參考曲線來實(shí)現(xiàn)。
29.如前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于該方法包括控制溫度，從而實(shí)現(xiàn)在對應(yīng)于匹配和錯配之間最大差別的溫度進(jìn)行雜交。
30.如前述權(quán)利要求的方法，其特征在于該方法包括在先于閱讀步驟之前的步驟期間產(chǎn)生所述參考曲線。
31.如前述權(quán)利要求的方法，其特征在于該方法包括存儲所述參考曲線。
32.如前述五個權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于所述確定在“動態(tài)”模式中通過控制樣本溫度中給定的變化而實(shí)現(xiàn)，并且，在溫度的這個變化中，執(zhí)行以下步驟·實(shí)時(shí)收集與通過激發(fā)設(shè)備激發(fā)的芯片上各種位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的二倍體的應(yīng)答，·對于每個二倍體，存儲應(yīng)答中作為溫度函數(shù)的變化。
33.如前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于該方法包括，對于每個二倍體，在應(yīng)答中每個變化的存儲末端建立二倍體匹配/錯配的診斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于閱讀和分析芯片的裝置。本發(fā)明的裝置包括工作臺(11)，其用于接收要鑒別至少一種樣本的芯片(12)；在芯片分子或細(xì)胞與其它分子反應(yīng)之后激發(fā)它們的設(shè)備；以及閱讀和分析受激發(fā)的分子的設(shè)備(14)。本發(fā)明的特征在于該裝置還包括用于控制前述工作臺溫度的單元(15)，所述控制單元與由多個沉積在工作臺表面不同相對位點(diǎn)的多個帕爾帖類型加熱/冷卻元件組成的模塊(111)相連；并且至少一個工作臺溫度傳感器(112)也與所述控制單元相連。本發(fā)明還涉及相關(guān)的方法。
文檔編號G01N21/64GK1754095SQ200380109881
公開日2006年3月29日 申請日期2003年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月23日
發(fā)明者F·蘇薩麗娜, E·霍米亞科娃 申請人:愛慕斯塔爾圖像與模擬:戰(zhàn)略、分析與實(shí)現(xiàn)公司