專利名稱：基于連續(xù)光的多光子激發(fā)毛細(xì)管電泳熒光檢測儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物化學(xué)微量檢測技術(shù)，具體涉及一種基于連續(xù)光的多光子激發(fā)毛細(xì)管電泳熒光檢測儀。它采用近紅外波長的半導(dǎo)體激光器，通過連續(xù)光多光子激發(fā)待測的微量物質(zhì)，并實(shí)現(xiàn)熒光檢測。
背景技術(shù)：
高效毛細(xì)管電泳(high-performance capillary electrophoresis，HPCE)是近十幾年來發(fā)現(xiàn)的一種新型分離分析技術(shù)，具有分離效率高、分析時間短和進(jìn)樣量小等優(yōu)點(diǎn)，且容易實(shí)現(xiàn)自動化，操作簡單，廣泛用于多肽和蛋白質(zhì)、環(huán)境食品、DNA序列分析和單細(xì)胞檢測。
HPCE，由于電泳的有效體積和進(jìn)樣量小，對檢測器有更高的要求，故檢測技術(shù)成為HPCE發(fā)展的關(guān)鍵。目前應(yīng)用較多的檢測方法有UV吸收、激光誘導(dǎo)熒光(Laser-induced fluorescence，LIF)、質(zhì)譜和電化學(xué)檢測等方法。
LIF是所有檢測方法中靈敏度最高的一種方法，已達(dá)到單分子檢測極限，LIF成為HPCE分析中的熱點(diǎn)之一。同時常用的LIF方法也面臨一些問題大多數(shù)生命物質(zhì)在可見光區(qū)激光激發(fā)下不產(chǎn)生熒光，需要熒光探針標(biāo)記；紫外光可以激發(fā)生命活性物質(zhì)產(chǎn)生熒光，但紫外光的光毒性、光降解和光漂白又不利于單細(xì)胞分析和在體分離檢測。
近年來，多光子激發(fā)熒光(Multi-photon Excitation，MPE)技術(shù)在細(xì)胞化學(xué)成像和氨基酸、蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)等生命活性物質(zhì)分析中的應(yīng)用倍受重視。多光子激發(fā)具有激發(fā)體積小，光損傷和光毒性小，背景噪聲低等特點(diǎn)。將多光子熒光激發(fā)技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)用，能發(fā)揮多光子激發(fā)熒光的優(yōu)點(diǎn)，在分析化學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域開展更多的應(yīng)用研究。1997年Song等人(見Song J M，Inoue T，et al.Highly sensitive detection using laser two-photon excitedfluorescence in capillary electrophoresis.Journal of chromatography A，1997，765351-319)最先將毛細(xì)管電泳和多光子激發(fā)熒光技術(shù)結(jié)合起來，在amol(10-18mol)檢測了Coumarine(7-anino-4-methyl coymarine)和DDCS(7-Diethy Aminocoumarine-3-acidsuccinimidyl ester)。Shear等人(Shear J，Brown E B Webb W.Mutiphoton-excitedfluorescence of fluoregen-labeled neurotransmitters.Analytical Chemistry，1996，68(10)1778--1783)曾用多光子系統(tǒng)研究熒光標(biāo)記的神經(jīng)遞質(zhì)，探究囊泡的分泌，探測極限在1000個分子以下。他們所用的光源是鎖模飛秒激光器。但是，昂貴的飛秒鎖模激光器限制了多光子激發(fā)熒光技術(shù)的推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的在于提供一種能克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，基于連續(xù)光的多光子激發(fā)毛細(xì)管電泳熒光檢測儀。它具有檢測靈敏度高、成本低和噪聲低的特點(diǎn)。
本實(shí)用新型提供的一種基于連續(xù)光的多光子激發(fā)毛細(xì)管電泳熒光檢測儀，它由激發(fā)光源、毛細(xì)管電泳部分、熒光檢測部分和數(shù)據(jù)處理四部分構(gòu)成，其中毛細(xì)管電泳部分由檢測池，毛細(xì)管和直流高壓電源組成。本系統(tǒng)基本工作過程是激光器采用半導(dǎo)體激光器，用于提供激發(fā)光源，實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)，發(fā)射的激光經(jīng)過二向色鏡和全反射鏡的兩次反射后進(jìn)入物鏡，物鏡將光束聚焦成一點(diǎn)，照射在毛細(xì)管的檢測出口使待測物質(zhì)實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)；激發(fā)所產(chǎn)生的熒光同時被物鏡所收集，在全反射鏡反射，透過二向色鏡，經(jīng)帶通濾光片組過濾后，熒光到達(dá)光電倍增管，光電倍增管將熒光信號放大后送給數(shù)據(jù)采集卡，再傳送給計算機(jī)加以處理完成。
本實(shí)用新型為生物、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等學(xué)科提供一種經(jīng)濟(jì)的檢測手段，適合微量物質(zhì)檢測，特別適合于生物體內(nèi)熒光基團(tuán)的檢測。它采用近紅外的連續(xù)光光源，實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā)；熒光信號檢測方法采用柱后檢測法。本實(shí)用新型具有檢測靈敏度高、成本低、噪聲低和操作簡單的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，柱后檢測方法更適合連續(xù)光的多光子激發(fā)毛細(xì)管電泳熒光檢測儀，并且檢測極限從10-6M提高到10-9M，具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)說明見具體實(shí)施方式
部分。


圖1為柱上和柱后檢測的比較示意圖，(a)柱上檢測圖(b)柱后檢測圖；圖2為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為不同的濃度由高到低依次檢測所得到熒光峰值結(jié)果；圖中，(a)10-2mol/l、(b)10-3mol/l、(c)10-4mol/l、(d)10-5mol/l、(e)10-6mol/l、(f)10-7mol/l、(g)10-8mol/l；圖4為丁基Rhodamine B和Rhodamine B的分離圖；a)10-3M丁基Rhodamine B的電泳譜圖；b)10-4M Rhodamine B的電泳譜圖；c)混合樣品的分離。
具體實(shí)施方式
如圖1所示，現(xiàn)有的激發(fā)熒光——毛細(xì)管電泳檢測儀采用的是柱上激發(fā)，柱上檢測法，見圖1(a)；本實(shí)用新型采用柱后激發(fā)，柱后檢測方法，見圖1(b)。
如圖2所示，本實(shí)用新型的連續(xù)光的多光子激發(fā)毛細(xì)管電泳熒光檢測儀由激發(fā)光源、毛細(xì)管電泳部分、熒光檢測部分和數(shù)據(jù)處理部分構(gòu)成。各部分分別介紹如下激光器采用半導(dǎo)體激光器5，提供激發(fā)光源，實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)。
毛細(xì)管電泳部分由緩沖池1、毛細(xì)管2、檢測池4和直流高壓電源10構(gòu)成，其作用是提供電場，驅(qū)動待測物質(zhì)泳動，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的高效分離，本系統(tǒng)檢測采用柱后檢測。
熒光檢測部分由物鏡3，光電倍增管7、二向色鏡12、全反射鏡11和帶通濾光組6構(gòu)成；二向色鏡12功能是對長波長的近紅外激光反射，而對于物鏡收集的短波長的熒光而言，則完全透射；帶通濾光組6則過濾掉反射的近紅外光，讓短波長的熒光通過；光電倍增管實(shí)現(xiàn)探測并放大熒光信號。
數(shù)據(jù)處理部分由數(shù)據(jù)采集卡8和計算機(jī)9構(gòu)成，負(fù)責(zé)采集和分析熒光信號，實(shí)現(xiàn)定性和定量分析。
本實(shí)用新型采用光源是價格低的半導(dǎo)體激光器，發(fā)射激光波長是近紅外光，經(jīng)過二向色鏡12和全反射鏡11的反射后進(jìn)入物鏡3，光束因物鏡3的會聚作用而聚焦成一點(diǎn)，照射在毛細(xì)管的檢測出口中心。待測的微量物質(zhì)經(jīng)過手動進(jìn)樣后，在電場力作用下由高電勢流向低電勢，由于不同的物質(zhì)的電荷特性不同，因而所受的電場力不同，故泳動的速度就不同，導(dǎo)致物質(zhì)到達(dá)檢測出口的時間不同，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)空間上的分離。當(dāng)待測物質(zhì)達(dá)到檢測出口時，在激光的照射下實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)。激發(fā)所產(chǎn)生的熒光同時被物鏡3所收集，在全反射鏡11反射，透過二向色鏡12，經(jīng)帶通濾光片組6過濾后，只讓熒光通過并到達(dá)光電倍增管7，光電倍增管將熒光放大后送給數(shù)據(jù)采集卡8，最后傳送給計算機(jī)加以處理完成。
利用本實(shí)用新型提供的檢測儀可以作定性和定量分析。
1定性分析因?yàn)椴煌镔|(zhì)，其激發(fā)熒光波長不同，和它們的電荷特性各異，受到電場力不等，在毛細(xì)管中流動速度大小不一，所以到達(dá)檢測窗口的時間順序有先有后。只要我們選用合適的帶通濾光片，結(jié)合對檢測時間的分析就可得出待測物質(zhì)的不同組分。
2定量分析同一種物質(zhì)，在毛細(xì)管中的運(yùn)動速度相同，但是它的濃度的不同，導(dǎo)致在檢測窗口照射時，濃度高的受激而產(chǎn)生熒光的幾率就大(對一定范圍內(nèi)的濃度而言)，最后我們檢測到的信號就要強(qiáng)。同一種物質(zhì)不同濃度我們可以通過比較檢測到的信號強(qiáng)度得出信號強(qiáng)度高的對應(yīng)濃度高，反之，濃度低的信號強(qiáng)度低。最后與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較就可以得出該樣品濃度的準(zhǔn)確值。
實(shí)例上述檢測儀的構(gòu)成部件中，物鏡3采用Olympus-CK40倒置熒光顯微鏡，半導(dǎo)體激光器5采用激光器HTYG-081，其波長為808nm，帶通濾光片組6由440DCLP，BP590和D605/90組成，光電倍增管7采用R5070光電倍增管探測器，數(shù)據(jù)采集卡8采用fNIRI數(shù)據(jù)采集卡，計算機(jī)9采用賽揚(yáng)800計算機(jī)，直流高壓電源10采用±30KV/0.3mA直流高壓電源。
采用上述實(shí)例中的熒光檢測儀進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)過程、結(jié)果及分析如下1 配制不同濃度的Rhodamine B溶液10-2mol/l；10-3mol/l；10-4mol/l；10-5mol/l；10-6mol/l；10-7mol/l；10-8mol/l。分別進(jìn)行測量，得出本系統(tǒng)的線性工作區(qū)間范圍7×10-7-8×10-4mol/L。具體結(jié)果如下圖3，對不同濃度樣品的檢測結(jié)果表明，濃度高的檢測結(jié)果值就大。
2 對10-6mol/l和10-9mol/l樣品進(jìn)行柱上檢測和柱后檢測，兩種檢測方式比較得出(如表1)柱后檢測方式的靈敏度較高，背景噪聲略低。
表1.對10-6mol/l和10-9mol/l兩種濃度樣品的柱上和柱后檢測比較柱上檢測 柱后檢測柱后檢測/柱后檢測峰值(10-6mol/l) 3.4 26.57.8峰值(10-9mol/l) -- 5.4 --備注--表示檢測不出來3 如圖4所示，對10M丁基Rhodamine B和10-4M Rhodamine B及其混合后的樣品測量結(jié)果分析相互比較，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可信。圖4的試驗(yàn)條件如下電泳條件硼砂緩沖溶液(10mM，PH9.0)；丁基Rhodamine B10-3M，Rhodamine B 10-4M；毛細(xì)管65cm×75I.D.；分離電壓18KV；虹吸進(jìn)樣，高度10cm，10s。其中圖a是10-3M丁基Rhodamine B的電泳譜圖；圖b是10-4M Rhodamine B的電泳譜圖；圖c是混合樣品的分離譜圖。
權(quán)利要求1.一種基于連續(xù)光的多光子激發(fā)毛細(xì)管電泳熒光檢測儀，由激光器、毛細(xì)管電泳部分、熒光檢測部分和數(shù)據(jù)處理部分構(gòu)成，所述毛細(xì)管電泳部分由檢測池，毛細(xì)管和直流高壓電源構(gòu)成，其特征在于所述激光器采用半導(dǎo)體激光器(5)，用于提供激發(fā)光源，實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)，發(fā)射的激光經(jīng)過二向色鏡(12)和全反射鏡(11)的反射后進(jìn)入物鏡(3)，物鏡(3)將光束聚焦成一點(diǎn)，照射在毛細(xì)管(2)的檢測出口使待測物質(zhì)實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)；激發(fā)所產(chǎn)生的熒光被物鏡(3)所收集，在全反射鏡(11)反射，透過二向色鏡(12)，經(jīng)帶通濾光片組(6)過濾后，熒光通過并到達(dá)光電倍增管(7)，將熒光放大后送給數(shù)據(jù)采集卡(8)，再傳送給計算機(jī)(9)加以處理完成。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種基于連續(xù)光的多光子激發(fā)毛細(xì)管電泳熒光檢測儀。激光器采用半導(dǎo)體激光器，用于提供激發(fā)光源，實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)，發(fā)射的激光經(jīng)過二向色鏡和全反射鏡的反射后進(jìn)入物鏡，物鏡將光束聚焦成一點(diǎn)，照射在毛細(xì)管的檢測出口使待測物質(zhì)實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)；激發(fā)所產(chǎn)生的熒光被物鏡所收集，在全反射鏡反射，透過二向色鏡，經(jīng)帶通濾光片組過濾后，熒光通過并到達(dá)光電倍增管，將熒光放大后送給數(shù)據(jù)采集卡，再傳送給計算機(jī)加以處理完成。本實(shí)用新型為柱后檢測法，特別適合于生物體內(nèi)熒光基團(tuán)的檢測。具有檢測靈敏度高、成本低、噪聲低和操作簡單的特點(diǎn)，其檢測極限從10
文檔編號G01N21/64GK2653501SQ20032011584
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者駱清銘, 曾紹群, 陳 勝 申請人:華中科技大學(xué)