專利名稱：改良的噬菌粒表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和抗體工程等領(lǐng)域。更具體地，涉及一種改良的用于噬菌體展示法篩選單鏈抗體中的噬菌粒表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
抗體作為疾病預(yù)防、診斷和治療的制劑已有上百年的發(fā)展歷史。早期制備抗體的方法是將某種天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動(dòng)物，成熟的B細(xì)胞克隆受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。
實(shí)際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。多克隆抗體是人類有目的利用抗體第一步。多克隆抗體的不均一性，限制了對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。
雜交瘤技術(shù)的誕生被認(rèn)為是抗體工程發(fā)展的第一次質(zhì)的飛躍，也是現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑。利用這種技術(shù)制備的單克隆抗體在疾病診斷、治療和科學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。這種單克隆抗體多是由鼠B細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞分泌的，具有鼠源性，進(jìn)入人體會(huì)引起機(jī)體的排異反應(yīng)；完整抗體分子的分子量較大，在體內(nèi)穿透血管的能力較差；生產(chǎn)成本太高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在80年代初，抗體基因結(jié)構(gòu)和功能的研究成果與重組DNA技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了基因工程抗體技術(shù)。
抗體工程技術(shù)的發(fā)展，即將鼠源單克隆抗體改造為人源化抗體，或者直接產(chǎn)生人源抗體，大大減少鼠源抗體帶來(lái)的副作用如人抗鼠抗體反應(yīng)等，有利于臨床應(yīng)用。目前，人源化或人源抗體的產(chǎn)生主要采用三種方法(1)鼠源抗體改造用人類抗體的Fc段和部分Fab替換鼠源抗體片段，減少小鼠來(lái)源的片段，以減輕人類對(duì)抗體的不良反應(yīng)；(2)轉(zhuǎn)基因方法將人類抗體基因轉(zhuǎn)移至小鼠，免疫動(dòng)物后產(chǎn)生人類抗體；(3)噬菌體展示技術(shù)是近年發(fā)展的新方法，利用噬菌體的特性篩選抗體可以直接篩選人源抗體，該方法利用人抗體基因構(gòu)建含有VH和VL的組合文庫(kù)，以噬菌體表面顯示系統(tǒng)篩選抗原特異性人源抗體。它以細(xì)菌克隆取代了B細(xì)胞克隆，被譽(yù)為抗體技術(shù)的革命性進(jìn)展。
上述三種方法各有利弊。前二種方法能篩選高親和力抗體，但費(fèi)用大，不易操作，第三種方法操作簡(jiǎn)便、花費(fèi)少，但親和力有時(shí)較低。
采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選抗體不必進(jìn)行動(dòng)物免疫，易于制備稀有抗原的抗體、篩選全人源性抗體和高親和力抗體。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是生命科學(xué)研究的突破性進(jìn)展之一，同時(shí)也將抗體工程的研究推想了一個(gè)新的高潮。
噬菌體選擇方法對(duì)于抗體或短肽的分離都不受限制，而且適用于其它具有生物活性的分子的研究，如細(xì)胞因子、受體、酶底物、酶抑制劑、抗體酶、DNA結(jié)合蛋白、構(gòu)建具有特異性結(jié)合分子的受體域、以及纖維素結(jié)合域等。據(jù)報(bào)道，抗體的支架不同可形成用于各種類型分子的合適的結(jié)合配體，而且許多例子可說(shuō)明，宿主支架可容納許多有效的可調(diào)節(jié)一些合適的置換的區(qū)域，(可根據(jù)這點(diǎn)制備局部變化的庫(kù))，這些支架包括β-折疊蛋白、α-螺旋束蛋白、這兩個(gè)蛋白的組合、以及綠色熒光蛋白(GFP)和纖維素結(jié)合域等。
目前常用于構(gòu)建人源噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)所用的噬菌粒表達(dá)載體為pHEN-2。然而，該載體在使用過(guò)程中常常會(huì)有相當(dāng)比例的人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產(chǎn)物因?yàn)榉N種未知因素而無(wú)法有效地插入單鏈抗體庫(kù)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)能夠更有效地用于構(gòu)建人源噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)的新的噬菌粒表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種能夠更有效地用于構(gòu)建人源噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)的新的噬菌粒表達(dá)載體。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種噬菌粒表達(dá)載體，它是改良的pHEN2載體，其中pHEN2中多酶切位點(diǎn)中的ApaL1酶切位點(diǎn)被去除或被BssH II酶切位點(diǎn)置換。
在另一優(yōu)選例中，pHEN2中多酶切位點(diǎn)中的ApaL1酶切位點(diǎn)被BssH II酶切位點(diǎn)置換。其中，所述的ApaL1酶切位點(diǎn)是GTGCAC，所述的BssH II酶切位點(diǎn)是GCGCGC。
在另一優(yōu)選例中，所述表達(dá)載體的多酶切位點(diǎn)的序列如SEQ ID NO1所示。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種本發(fā)明上述改良的pHEN2的噬菌粒表達(dá)載體的用途，它被用于通過(guò)噬菌體展示法篩選單鏈抗體。


圖1顯示了噬菌粒表達(dá)載體pHEN2多酶切位點(diǎn)圖譜。
圖2顯示了將ApaL1酶切位點(diǎn)用BssH II酶切位點(diǎn)置換的示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，pHEN-2噬菌粒載體在使用過(guò)程中常常會(huì)有相當(dāng)比例的人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產(chǎn)物無(wú)法有效地插入單鏈抗體庫(kù)的一個(gè)主要原因是存在ApaL1酶切位點(diǎn)。通過(guò)消除ApaL1酶切位點(diǎn)，就可顯著提高人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產(chǎn)物插入單鏈抗體庫(kù)的效率。
根據(jù)對(duì)已知免疫球蛋白可變區(qū)基因序列的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)部分輕鏈可變區(qū)VL中存在限制性酶切位點(diǎn)ApaL I，該位點(diǎn)在群體中的出現(xiàn)頻率4/162＝6.45％(表1)。
表1 被切割的功能片段數(shù)目

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，而ApaL I又是有些人偏愛(ài)使用的一種酶。如果輕鏈文庫(kù)的克隆過(guò)程中使用ApaL I酶便會(huì)不可避免的破壞部分VL基因序列的完整性，從而導(dǎo)致部分RT-PCR人免疫球蛋白輕鏈基因編碼產(chǎn)物無(wú)法插入單鏈抗體庫(kù)，使終庫(kù)容有所下降。
一種對(duì)pHEN-2噬菌粒載體進(jìn)行改造的方法是消除ApaL I酶。
在另一優(yōu)選例中，對(duì)pHEN-2噬菌粒載體進(jìn)行改造的方法是用限制性酶切位點(diǎn)BssH II替換ApaL I酶的酶切位點(diǎn)。本發(fā)明人對(duì)現(xiàn)有的用于構(gòu)建噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)的噬菌粒表達(dá)載體pHEN-2進(jìn)行改造，利用第三位密碼子的擺動(dòng)性，在保證編碼氨基酸不發(fā)生改變的前提下，通過(guò)PCR引物引入兩個(gè)堿基的定點(diǎn)突變，從而將限制性酶切位點(diǎn)ApaL I更改為在免疫球蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)出現(xiàn)的限制性酶切位點(diǎn)BssH II(圖2)，從而進(jìn)一步優(yōu)化了輕鏈文庫(kù)的克隆及鑒定條件，從而盡可能保證了所構(gòu)建的單鏈抗體文庫(kù)的多樣性，提高了實(shí)際庫(kù)容量。
可用于本發(fā)明的定點(diǎn)突變技術(shù)是本領(lǐng)域中很常規(guī)的一種技術(shù)，有許多文獻(xiàn)對(duì)定點(diǎn)突變技術(shù)有描述。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于，能夠使更多的人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產(chǎn)物有效地插入單鏈抗體庫(kù)，從而盡可能保證了所構(gòu)建的單鏈抗體文庫(kù)的多樣性，提高了實(shí)際庫(kù)容量。本發(fā)明人成功地利用此改造質(zhì)粒構(gòu)建了滴度為109的非免疫人源單鏈抗體文庫(kù)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1對(duì)pHEN-2的酶切位點(diǎn)的改造噬菌粒表達(dá)載體pHEN2是本領(lǐng)域一種常用的噬菌粒表達(dá)載體(購(gòu)自英國(guó)劍橋大學(xué)MRC中心)，其多酶切位點(diǎn)圖譜如圖1和SEQ ID NO1所示。
試驗(yàn)方法合成以下引物ForwardGCTGCAGGTCGACCTCGAGTG(SEQ ID NO3)
ReverseATCGAGCTCCTGCAGTTGGACCTGCGCGCTACCGCCAGAGCCACCTC(SEQ ID NO4)以pHEN2為模板，用以下方法將pHEN-2酶切位點(diǎn)改造為BssH II酶切位點(diǎn)。
利用上述引物進(jìn)行PCR，將所獲得的PCR產(chǎn)物及pHEN2質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Sac I和Nco I進(jìn)行酶切，將兩者連接轉(zhuǎn)化后，抽提質(zhì)粒，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證原pHEN2質(zhì)粒中的Apa I位點(diǎn)已改造成為BssH II位點(diǎn)。
結(jié)果通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，獲得了pHEN-2的酶切位點(diǎn)(GTGCAC)改造為BssH II酶切位點(diǎn)(GCGCGC)的改良的噬菌粒表達(dá)載體，其中酶切位點(diǎn)的改造對(duì)編碼的氨基酸序列無(wú)影響。改造的多酶切位點(diǎn)的序列如SEQ ID NO2所示。
實(shí)施例2構(gòu)建人源單鏈抗體文庫(kù)用常規(guī)方法合成了五十多條可用于擴(kuò)增人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的PCR引物，提取了四個(gè)人胎肝和胎脾以及一份人骨髓細(xì)胞和15個(gè)健康成人的外周血淋巴細(xì)胞的mRNA；采用RT-PCR方法，分別以針對(duì)免疫球蛋白不同家族的引物，從中擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因；先后克隆入改造的噬菌粒表達(dá)載體中，經(jīng)數(shù)百次電轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了人源單鏈抗體文庫(kù)，其中分別采用pHEN-2(對(duì)照)和實(shí)施例1中制備的改良的pHEN-2。然后，梯度稀釋噬菌體抗體庫(kù)并感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli TG1菌液，涂LB氨芐平板，37℃過(guò)夜，利用菌落記數(shù)法測(cè)定文庫(kù)的滴度。
結(jié)果表明，用改造的pHEN-2質(zhì)粒構(gòu)建的非免疫人源單鏈抗體文庫(kù)的滴度為109，而對(duì)照(未改造的pHEN-2)是5×106。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>改良的噬菌粒表達(dá)載體<130>036339<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>369<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>pHEN-2的多酶切位點(diǎn)<400>1ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct tgcatgcaaa ttctatttca 60aggagacagt cataatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg ttattactcg120cggcccagcc ggccatggcc caggtgcagc tgcaggtcga cctcgagtgg tggaggcggt180tcaggcggag gtggctctgg cggtagtgca caggtccaac tgcaggagct cgatatcaaa240cgggcggccg cacatcatca tcaccatcac ggggccgcag aacaaaaact catctcagaa300gaggatctga atggggccgc atagactgtt gaaagttgtt tagcaaaacc tcatacagaa360aattcattt369<210>2<211>369<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>改造的pHEN-2的多酶切位點(diǎn)<400>2ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct tgcatgcaaa ttctatttca 60
aggagacagt cataatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg ttattactcg120cggcccagcc ggccatggcc caggtgcagc tgcaggtcga cctcgagtgg tggaggcggt180tcaggcggag gtggctctgg cggtagcgcg caggtccaac tgcaggagct cgatatcaaa240cgggcggccg cacatcatca tcaccatcac ggggccgcag aacaaaaact catctcagaa300gaggatctga atggggccgc atagactgtt gaaagttgtt tagcaaaacc tcatacagaa360aattcattt369<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3gctgcaggtc gacctcgagt g 21<210>4<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4atcgagctcc tgcagttgga cctgcgcgct accgccagag ccacctc 4權(quán)利要求
1.一種噬菌粒表達(dá)載體，其特征在于，它是改良的pHEN2載體，其中pHEN2中多酶切位點(diǎn)中的ApaL1酶切位點(diǎn)被去除或被BssH II酶切位點(diǎn)置換。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，pHEN2中多酶切位點(diǎn)中的ApaL1酶切位點(diǎn)被BssH II酶切位點(diǎn)置換，其中所述的ApaL1酶切位點(diǎn)是GTGCAC，所述的BssH II酶切位點(diǎn)是GCGCGC。
3.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的多酶切位點(diǎn)的序列如SEQ ID NO1所示。
4.如權(quán)利要求1所述的噬菌粒表達(dá)載體的用途，其特征在于，用于通過(guò)噬菌體展示法篩選單鏈抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改良的用于噬菌體展示法篩選單鏈抗體中的噬菌粒表達(dá)載體，它是改良的pHEN2載體，其中pHEN2中多酶切位點(diǎn)中的ApaL1酶切位點(diǎn)被去除或被BssH II酶切位點(diǎn)置換。改良的pHEN2噬菌粒表達(dá)能夠使更多的人免疫球蛋白的輕鏈基因編碼產(chǎn)物有效地插入單鏈抗體庫(kù)，從而盡可能保證了所構(gòu)建的單鏈抗體文庫(kù)的多樣性，提高了庫(kù)容量。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1618974SQ200310108759
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者張新, 韓澤廣 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心