專利名稱:克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及的是一種將免疫化學(xué)檢測技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留量的檢測,尤其是一種克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法。屬于農(nóng)藥殘留量檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù):
克百威(2、3-二氫-2、2-二甲基-7-苯丙呋喃基甲基氨基甲酸酯)又名克百威,是廣譜、高效、藥效殘留期長的內(nèi)吸性殺蟲、殺螨、殺線蟲劑,廣泛用于水稻、玉米、煙草、茶、大豆、膠白、韭菜等作物的害蟲防治。70年代以來通過對(duì)克百威的毒理研究發(fā)現(xiàn),克百威在機(jī)體內(nèi)與膽堿酯酶形成絡(luò)合物,抑制其活性,使乙酰膽堿不能分解而積蓄在體內(nèi),影響中樞神經(jīng)細(xì)胞間的沖動(dòng)傳導(dǎo),具有神經(jīng)毒性。該藥劑在土壤中殘留有效期長、藥效高,能通過根、莖、葉或種子吸收傳導(dǎo)并輸送到植物體各器官,也能通過徑流滲透污染地下水,對(duì)人體健康及環(huán)境造成極大的危害,因此,加強(qiáng)對(duì)克百威農(nóng)藥殘留的檢測十分必要。至今為止,對(duì)其殘留量的檢測方法主要采用液相色譜、氣相色譜及光譜等物理學(xué)辦法,但需昂貴儀器且耗時(shí),不適合一定規(guī)?;臋z測分析。經(jīng)文獻(xiàn)檢索,發(fā)現(xiàn)Development of Monoclonal Antibody-based Immunoassays to theN-Methylcarbamate Pesticide Carbofuran(甲基氨基甲酸酯農(nóng)藥克百威的單抗免疫測定的建立),詳見Journal of Agricultural andFood Chemistry(農(nóng)業(yè)和食物化學(xué)雜志)1999,47,2475-2485。所列文獻(xiàn)合成了克百威人工免疫抗原,并將人工合成的抗原免疫小鼠,采用雜交瘤技術(shù)制備了抗克百威單克隆抗體,在此基礎(chǔ)上建立了間接和直接的酶聯(lián)免疫吸附測定檢測克百威農(nóng)藥的技術(shù)。該技術(shù)在原農(nóng)藥殘留常規(guī)檢測(氣相色譜、液相色譜儀器分析方法)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了革新,采用酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(ELISA)進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測,使得檢測時(shí)間縮短、成本大大降低,靈敏度提高,有利于在食品、土壤和環(huán)境中克百威農(nóng)藥的快速檢測并便于廣泛地推廣使用,但是其方法尚存在操作相對(duì)繁煩、需要重復(fù)多次洗滌,需要借助于酶標(biāo)儀讀數(shù)進(jìn)行測定,不能實(shí)現(xiàn)真正的一步法快速檢測。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,使納米技術(shù)及免疫技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域,改變了傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留多步繁鎖檢測問題,實(shí)現(xiàn)一步法快速檢測克百威農(nóng)藥殘留的方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的,本發(fā)明以改良活性酯法將克百威免疫半抗原(BFNH)與BSA偶聯(lián),合成人工免疫抗原復(fù)合物,免疫動(dòng)物,制備特異性高效價(jià)抗BFNH抗體,抗體經(jīng)分離純化后,將納米級(jí)的膠體金標(biāo)記于抗克百威的特異性抗體,然后將此標(biāo)記結(jié)合物、偶聯(lián)卵清蛋白的克百威以及羊抗鼠IgG分別固化在一載體上,根據(jù)競爭抑制免疫層析原理,進(jìn)行克百威農(nóng)藥的半定量分析測定,所建立的檢測體系對(duì)克百威農(nóng)藥的最小檢測量為0.25mg/kg,且在10分鐘內(nèi)完成,方法穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確,適合于進(jìn)行一步法農(nóng)藥殘留的快速檢測。以下對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出進(jìn)一步說明,其具體的步驟為(1)人工免疫化合物的制備采用2、3-二氫-2、2-二甲基-7-苯并呋喃酚為原料,在通光氣的條件下合成2、3-二氫-2、2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯,在低溫條件下與6-氨基己酸反應(yīng)合成(BFNH)免疫半抗原,然后采用改良活性酯法分別合成免疫抗原和包被抗原,分別將0.026g半抗原溶于1ml無水DMF,再加入0.016g DCC和0.009g NHs,室溫下反應(yīng)過夜,離心取上清夜,分別逐滴加入15mg/ml的BSA和OVA碳酸緩沖掖中,磁力攪拌4小時(shí),蒸餾水透析2次,生理鹽水透析2次。分裝凍存于-20℃冰箱。
(2)抗克百威特異性抗體的制備用合成的BFNH-BSA免疫BALB/小白鼠或?qū)嶒?yàn)用新西蘭大白兔,初次免疫用等量的福氏完全佐劑乳化人工抗原,然后以福氏不完全佐劑乳化抗原,進(jìn)行六次基礎(chǔ)免疫,采用ELISA法檢測血清抗體效價(jià),待血清抗體達(dá)到一定效價(jià)后進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫,采取兔子心臟血清。或用雜交瘤技術(shù)制備單抗。分離純化,-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
(3)膠體金的制備在100ml超純水中加入1ml 1%濃度的氯金酸,加熱至沸騰,再加入1%檸檬酸三鈉溶液1ml,繼續(xù)煮沸10分鐘,冷卻后,4℃保存?zhèn)溆?,取樣掃描測定最大吸收峰并進(jìn)行透射電鏡觀察粒子大小。
(4)膠體金標(biāo)記抗克百威特異性抗體調(diào)節(jié)如上制備的膠體金溶液(100ml)的pH值為8.2,快速攪拌下加入抗克百威特異性抗體400μg,使其終濃度為4μg/ml,室溫反應(yīng)15分鐘后,加入聚乙二醇(PEG)至終濃度為1%,繼續(xù)攪拌15分鐘。用8000r/min離心30分鐘,吸去上清后所得沉淀即為純化的金標(biāo)記抗體,此金標(biāo)記抗體復(fù)懸于保存液中,4℃保存。
(5)硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜的處理用微定量噴頭噴涂兩條平行線于硝酸纖維素膜上,克百威偶聯(lián)卵清蛋白結(jié)合物作為測試線,羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線。用定量噴頭噴涂膠體金標(biāo)記抗克百威抗體于玻璃纖維素膜上,干燥硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜后備用。
(6)免疫層析試紙條的制備在60mm×300mm的單面膠PVC板上,依次粘貼上玻璃纖維素膜、已固定有金標(biāo)記抗克百威抗體的玻璃纖維素膜、已平行包被克百威-卵清蛋白結(jié)合物和抗小鼠IgG抗體的硝酸纖維素膜、吸水玻璃纖維素膜。用切條機(jī)將粘貼好的PVC板縱向切成5mm×60mm的試紙條(7)樣品測試和結(jié)果判斷方法將試紙條插入待測樣品中,停留5秒后取出平放,或用滴管在樣品墊上滴加3-4滴液體樣品,10分鐘后觀察結(jié)果。羊抗鼠IgG和克百威偶聯(lián)OVA結(jié)合物分別噴涂在NC膜的質(zhì)控線(C)和測試線(T),含克百威待測樣品經(jīng)S端根據(jù)層析原理向另一端移動(dòng),并先后越過測試線和質(zhì)控線,固化在玻璃纖維膜上的金標(biāo)記抗克百威特異性抗體與樣品中的克百威起特異性反應(yīng),并競爭性地抑制其與測試線上的克百威結(jié)合,因此當(dāng)樣品中的克百威含量不到一定量時(shí),金標(biāo)記抗克百威特異性抗體與測試線克百威結(jié)合后金顆粒凝集顯色,當(dāng)樣品中的克百威含量超過一定量時(shí),金標(biāo)記特異性抗體完全被抑制而不顯色,質(zhì)控線(C)是檢驗(yàn)方法本身有效與否而設(shè)定,顯色有效,不顯色表明方法本身無效。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步,主要表現(xiàn)為反應(yīng)操作簡便,不需要酶,不需復(fù)雜繁煩的洗滌環(huán)節(jié);靈敏度穩(wěn)定,能快速檢測樣品中的待測農(nóng)藥的超標(biāo)與否,且便于保存;檢測速度快,整個(gè)反應(yīng)時(shí)間在10分鐘之內(nèi)完成,能實(shí)現(xiàn)快速檢測的需要;將納米技術(shù)及免疫技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域,改變了傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留多步繁鎖檢測問題,實(shí)現(xiàn)一步法快速檢測克百威農(nóng)藥殘留的方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一采用熱法合成免疫半抗原,取呋喃酚100g加入250ml三口燒瓶,再加入19g催化劑三甲基芐基氯化銨,伴有電動(dòng)攪拌下加熱至95℃,以一定的流量通入光氣,2小時(shí)出現(xiàn)沉淀,取樣、氣譜、質(zhì)譜分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。然后稱取4.6g6-氨基己酸溶于6.4ml 4mol/L的NaOH溶液中,加入250ml燒瓶,冰浴冷卻至4℃,稱取7.18g苯并呋喃基氯甲酸酯溶于20ml二噁烷中,在攪拌情況下分5次間隔10分鐘加入三口燒瓶中反應(yīng)兩小時(shí),調(diào)節(jié)pH值至4.0、乙酸乙酯三次萃取,析出白色沉淀,水洗烘干。
然后以改良活性酯法分別合成免疫抗原和包被抗原,分別將0.026g半抗原溶于1ml無水DMF,再加入0.016g DCC和0.009g NHs,室溫下反應(yīng)過夜,離心取上清夜,分別逐滴加入15mg/ml的BSA和OVA碳酸緩沖掖中,磁力攪拌4小時(shí),蒸餾水透析2次,生理鹽水透析2次;用合成的BFNH-BSA免疫BALB/小白鼠動(dòng)物,初次免疫用等量的福氏完全佐劑乳化人工抗原,進(jìn)行腹部皮下注射,然后以福氏不完全佐劑乳化抗原,進(jìn)行六次基礎(chǔ)免疫,采用ELISA法檢測血清抗體效價(jià),待血清抗體達(dá)到一定效價(jià)后進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫,外科手術(shù)取免疫鼠脾細(xì)胞與骨隋瘤細(xì)胞雜交、HAT篩選并進(jìn)行克隆化,篩選出能穩(wěn)定分泌抗克百威單克隆抗體的細(xì)胞株,將細(xì)胞株注入小鼠腹腔,取腹水來制備單抗;然后將經(jīng)分離純化的400μg,單抗加入預(yù)先制備的40nm大小的pH為8.2的膠體金溶液中,室溫反應(yīng)15分鐘,加入聚7二醇(PEG)至終濃度為1%,繼續(xù)攪拌15分鐘。用8000r/min離心30分鐘,吸去上清后所得沉淀即為純化的金標(biāo)記抗體。將此金標(biāo)記抗體結(jié)合物噴涂于玻璃纖維素膜上,將克百威偶聯(lián)-OVA結(jié)合物噴涂于NC膜,作為測試線,將羊抗鼠IgG噴涂于NC膜,作為質(zhì)控線,然后將樣品吸收墊、噴涂有膠體金抗體的的玻璃纖維、噴有測試線和質(zhì)控線的NC膜以及吸水玻璃纖維依次粘貼于一塑料底板(5mm×6mm)。
測試樣品時(shí),將試紙條插入待測樣品中,停留5秒后取出平放,或用滴管在樣品墊上滴加3-4滴液體樣品,10分鐘后觀察結(jié)果,若只有質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色條帶,結(jié)果為陽性,若質(zhì)控線和測試線都出現(xiàn)紫紅色條帶,結(jié)果為陰性,若質(zhì)控線不出現(xiàn)紫紅色條帶,認(rèn)為測試結(jié)果無效。
實(shí)施例二
采用熱法合成免疫半抗原,取呋喃酚100g加入250ml三口燒瓶,再加入19g催化劑三甲基芐基氯化銨,伴有電動(dòng)攪拌下加熱至95℃,以一定的流量通入光氣,2小時(shí)出現(xiàn)沉淀,取樣、氣譜、質(zhì)譜分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。然后稱取4.6g6-氨基己酸溶于6.4ml 4mol/L的NaOH溶液中,加入250ml燒瓶,冰浴冷卻至4℃,稱取7.18g苯并呋喃基氯甲酸酯溶于20ml二噁烷中,在攪拌情況下分5次間隔10分鐘加入三口燒瓶中反應(yīng)兩小時(shí),調(diào)節(jié)pH值至4.0、乙酸乙酯三次萃取,析出白色沉淀,水洗烘干。
然后以改良活性酯法分別合成免疫抗原和包被抗原,分別將0.026g半抗原溶于1ml無水DMF,再加入0.016g DCC和0.009g NHs,室溫下反應(yīng)過夜,離心取上清夜,分別逐滴加入15mg/ml的BSA和OVA碳酸緩沖掖中,磁力攪拌4小時(shí),蒸餾水透析2次,生理鹽水透析2次;用合成的BFNH-BSA免疫體格健壯的成年新西蘭大白兔,初次免疫用2.5ml福氏完全佐劑乳化等量的人工抗原,進(jìn)行背部皮內(nèi)多點(diǎn)和大腿部肌肉注射,然后以福氏不完全佐劑乳化抗原,進(jìn)行六次基礎(chǔ)免疫,采用ELISA法檢測血清抗體效價(jià),待血清抗體達(dá)到一定效價(jià)后進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫,隔7天進(jìn)行心臟采血,25-30ml/兔,分離提純血清,-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
然后將經(jīng)分離純化的400μg,單抗加入預(yù)先制備的40nm大小的pH為8.2的膠體金溶液中,室溫反應(yīng)15分鐘,加入聚乙二醇(PEG)至終濃度為1%,繼續(xù)攪拌15分鐘。用8000r/min離心30分鐘,吸去上清后所得沉淀即為純化的金標(biāo)記抗體。將此金標(biāo)記抗體結(jié)合物噴涂于玻璃纖維素膜上,將克百威偶聯(lián)-OVA結(jié)合物噴涂于NC膜,作為測試線,將羊抗鼠IgG噴涂于NC膜,作為質(zhì)控線,然后將樣品吸收墊、噴涂有膠體金抗體的的玻璃纖維、噴有測試線和質(zhì)控線的NC膜以及吸水玻璃纖維依次粘貼于一塑料底板(5mm×6mm)。
測試樣品時(shí),將試紙條插入待測樣品中,停留5秒后取出平放,或用滴管在樣品墊上滴加3-4滴液體樣品,10分鐘后觀察結(jié)果,若只有質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色條帶,結(jié)果為陽性,若質(zhì)控線和測試線都出現(xiàn)紫紅色條帶,結(jié)果為陰性,若質(zhì)控線不出現(xiàn)紫紅色條帶,認(rèn)為測試結(jié)果無效。
權(quán)利要求
1.一種克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,其特征在于以改良活性酯法將克百威免疫半抗原BFNH與BSA偶聯(lián),合成人工免疫抗原復(fù)合物,免疫動(dòng)物,制備特異性高效價(jià)抗BFNH抗體,抗體經(jīng)分離純化后,將納米級(jí)的膠體金標(biāo)記于抗克百威的特異性抗體,然后將此標(biāo)記結(jié)合物、偶聯(lián)卵清蛋白的克百威以及羊抗鼠IgG分別固化在一載體上,根據(jù)競爭抑制免疫層析原理,進(jìn)行克百威農(nóng)藥的半定量分析測定,所建立的檢測體系對(duì)克百威農(nóng)藥的最小檢測量為0.25mg/kg,且在10分鐘內(nèi)完成快速檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,其特征是,以下對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出進(jìn)一步限定,其具體的步驟為(1)人工免疫化合物的制備,(2)抗克百威特異性抗體的制備,(3)膠體金的制備,(4)膠體金標(biāo)記抗克百威特異性抗體,(5)硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜的處理,(6)免疫層析試紙條的制備,(7)樣品測試和結(jié)果判斷方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,其特征是,所涉及的步驟(1)的具體含義為采用2、3-二氫-2、2-二甲基-7-苯并呋喃酚為原料,在通光氣的條件下合成2、3-二氫-2、2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯,在低溫條件下與6-氨基己酸反應(yīng)合成BFNH免疫半抗原,然后采用改良活性酯法分別合成免疫抗原和包被抗原,分別將0.026g半抗原溶于1ml無水DMF,再加入0.016g DCC和0.009g NHs,室溫下反應(yīng)過夜,離心取上清夜,分別逐滴加入15mg/ml的BSA和OVA碳酸緩沖掖中,磁力攪拌4小時(shí),蒸餾水透析2次,生理鹽水透析2次,分裝凍存于-20℃冰箱。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,其特征是,所涉及的步驟(2)的具體含義為用合成的BFNH-BSA免疫BALB/小白鼠或?qū)嶒?yàn)用新西蘭大白兔,初次免疫用等量的福氏完全佐劑乳化人工抗原,然后以福氏不完全佐劑乳化抗原,進(jìn)行六次基礎(chǔ)免疫,采用ELISA法檢測血清抗體效價(jià),待血清抗體達(dá)到一定效價(jià)后進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫,采取兔子心臟血清。或用雜交瘤技術(shù)制備單抗。分離純化,-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,其特征是,所涉及的步驟(3)的具體含義為在100ml超純水中加入1ml 1%濃度的氯金酸,加熱至沸騰,再加入1%檸檬酸三鈉溶液1ml,繼續(xù)煮沸10分鐘,冷卻后,4℃保存?zhèn)溆茫訏呙铚y定最大吸收峰并進(jìn)行透射電鏡觀察粒子大小。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,其特征是,所涉及的步驟(4)的具體含義為調(diào)節(jié)如上制備的膠體金溶液100ml的pH值為8.2,快速攪拌下加入抗克百威單抗400μg,使其終濃度為4μg/ml,室溫反應(yīng)15分鐘后,加入聚乙二醇PEG至終濃度為1%,繼續(xù)攪拌15分鐘,用8000r/min離心30分鐘,吸去上清后所得沉淀即為純化的金標(biāo)記抗體,此金標(biāo)記抗體復(fù)懸于保存液中,4℃保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,其特征是,所涉及的步驟(5)的具體含義為用微定量噴頭噴涂兩條平行線于硝酸纖維素膜上,克百威偶聯(lián)卵清蛋白結(jié)合物作為測試線,羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線。用定量噴頭噴涂金標(biāo)記抗克百威抗體于玻璃纖維素膜上,干燥硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜后備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,其特征是,所涉及的步驟(6)的具體含義為在60mm×300mm的單面膠PVC板上,依次粘貼上玻璃纖維素膜、已固定有金標(biāo)記抗克百威抗體的玻璃纖維素膜、已平行包被克百威-卵清蛋白和抗小鼠IgG抗體的硝酸纖維素膜、吸水玻璃纖維素膜,用切條機(jī)將粘貼好的PVC板縱向切成5mm×60mm的試紙條。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法,其特征是,所涉及的步驟(7)的具體含義為將試紙條插入待測樣品中,停留5秒后取出平放,或用滴管在樣品墊上滴加3-4滴液體樣品,10分鐘后觀察結(jié)果,羊抗鼠IgG和克百威偶聯(lián)OVA結(jié)合物分別噴涂在NC膜的質(zhì)控線(C)和測試線(T),含克百威待測樣品經(jīng)S端根據(jù)層析原理向另一端移動(dòng),并先后越過測試線和質(zhì)控線,固化在玻璃纖維膜上的金標(biāo)記抗克百威特異性抗體與樣品中的克百威起特異性反應(yīng),并競爭性地抑制其與測試線上的克百威結(jié)合,因此當(dāng)樣品中的克百威含量不到一定量時(shí),金標(biāo)記抗克百威特異性抗體與測試線克百威結(jié)合后金顆粒凝集顯色,當(dāng)樣品中的克百威含量超過一定量時(shí),金標(biāo)記抗體完全被抑制而不顯色,質(zhì)控線(C)是檢驗(yàn)方法本身有效與否而設(shè)定,顯色有效,不顯色表明方法本身無效。
全文摘要
一種克百威農(nóng)藥的納米膠體金標(biāo)記免疫測定方法。屬于農(nóng)藥殘留量檢測領(lǐng)域。以改良活性酯法將克百威免疫半抗原BFNH與BSA偶聯(lián),合成人工免疫抗原復(fù)合物,免疫動(dòng)物,制備特異性高效價(jià)抗BFNH抗體,抗體經(jīng)分離純化后,將納米級(jí)的膠體金標(biāo)記于抗克百威的特異性抗體,然后將此標(biāo)記結(jié)合物、偶聯(lián)卵清蛋白的克百威以及羊抗鼠IgG分別固化在一載體上,根據(jù)競爭抑制免疫層析原理,進(jìn)行克百威農(nóng)藥的半定量分析測定,所建立的檢測體系對(duì)克百威農(nóng)藥的最小檢測量為0.25mg/kg,且在10分鐘內(nèi)完成快速檢測。本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步,將納米技術(shù)及免疫技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域,改變了傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留多步繁瑣檢測問題,實(shí)現(xiàn)一步法快速檢測克百威農(nóng)藥殘留的方法。
文檔編號(hào)G01N33/532GK1445548SQ0311669
公開日2003年10月1日 申請日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月29日
發(fā)明者周培, 陸貽通, 李斌, 周軍 申請人:上海交通大學(xué)