專利名稱：基于原子力顯微鏡的超薄切片厚度的測(cè)量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超薄切片厚度的測(cè)量方法，特別涉及的是利用原子力顯微鏡來(lái)掃描切片邊緣并用軟件處理圖像，然后測(cè)量切片厚度的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
對(duì)電子顯微鏡照片的正確解釋，必須精確地了解切片的厚度。自從超薄切片技術(shù)發(fā)明以來(lái)，已有不少方法來(lái)測(cè)量切片的厚度。當(dāng)切片漂浮在刀槽內(nèi)的液面上時(shí)，可以從切片上反射光的干涉色來(lái)估計(jì)它的厚度，即用切片的干涉色作為切片厚度的近似指標(biāo)。Peachy(J.Biophys.Biochem.Cytol.1958，4233)最早給出了連續(xù)的干涉色的顏色和對(duì)應(yīng)切片厚度的關(guān)系。但由于用白熾燈觀察到的干涉色和用日光燈觀察的稍有不同，并且判斷顏色的主觀性因素也必須予以考慮，因此需要強(qiáng)調(diào)，按照干涉色估計(jì)切片厚度是不夠準(zhǔn)確的，特別是需要定量時(shí)。
Silverman等(J.Cell Biol.1969，40768)介紹了一種利用定量電鏡(quantitativeelectron microscopy)來(lái)測(cè)量切片厚度的方法。他們使用一種松散的陰離子交換樹(shù)脂，磷鎢酸染色后作為切片厚度測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)。這種方法的優(yōu)勢(shì)就是保證了厚度的測(cè)量與材料的自身結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。
Gillis和Wibo(J.Cell Biol.1971，49947)發(fā)明了另一種干涉法來(lái)測(cè)切片厚度，宣稱精確度可以達(dá)到1nm。在暴露于電子射線前，這種方法顯示出了比較高的精確性和可靠性。
Edie和Karlsson(J.Microscopie 1972，1313)提供了一種在電鏡觀察時(shí)計(jì)算切片厚度的方法。切片厚度由電子束穿過(guò)包埋介質(zhì)之后的衰減程度決定。
上述提到的多種方法都是基于電子顯微鏡或者為電鏡觀察做準(zhǔn)備的。近年來(lái)，隨著原子力顯微鏡(AFM)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多，其中也有一些是將超薄切片作為研究對(duì)象的，利用AFM來(lái)研究組織或細(xì)胞超薄切片的精細(xì)結(jié)構(gòu)，在這種情況下，切片的厚度也是一個(gè)很關(guān)鍵的條件，它直接影響切片表面凹凸起伏的程度。但是，從切片上反射光的干涉色來(lái)估計(jì)切片的厚度是不夠準(zhǔn)確的，若利用定量電鏡的方法又不適合AFM制樣的要求。因此，基于AFM的切片厚度測(cè)量是一項(xiàng)全新研究，很有必要也十分關(guān)鍵，但目前尚未見(jiàn)有關(guān)基于AFM的超薄切片厚度的測(cè)量方法的報(bào)導(dǎo)。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為，制備包埋塊和進(jìn)行超薄切片選定所需要的片子后，用潔凈的鉑金環(huán)撈取并輕輕浸在清潔云母表面的水滴中，移走鉑金環(huán)或?qū)K金環(huán)倒扣，使切片飄浮在水面上，再將云母片緩慢烘干，使切片平整地貼附在云母表面，利用原子力顯微鏡采用接觸模式掃描包含切片邊緣和云母的區(qū)域，實(shí)時(shí)平面調(diào)整參數(shù)設(shè)為“補(bǔ)償”，控制溫度和濕度，對(duì)獲得的圖像進(jìn)行平整化處理時(shí)將包含切片的區(qū)域排除在外，作截面測(cè)量切片和云母表面之間的平均相對(duì)高度，即為切片厚度。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟采用現(xiàn)有成熟的超薄切片技術(shù)，先制備包埋塊和進(jìn)行超薄切片選擇所需要的片子，用潔凈的鉑金環(huán)撈取。
滴15μl超純水在清潔的云母表面，將鉑金環(huán)輕輕浸在水滴中，從側(cè)面移走鉑金環(huán)，使切片飄浮在水面上，或?qū)K金環(huán)倒扣在水面上，切片也會(huì)漂浮在水面上。
將云母片置于烘片機(jī)上緩慢烘干，使切片平整地貼附在云母表面。烘片機(jī)溫度控制在40-65℃之間。
利用AFM掃描包含切片邊緣和云母的區(qū)域，掃描模式為空氣中的接觸模式，實(shí)時(shí)平面調(diào)整(realtime planefit)參數(shù)必須設(shè)為“補(bǔ)償”(offset)，溫度控制在25±1℃，濕度控制在40％以下。
對(duì)獲得的圖像進(jìn)行平整化處理，平整化時(shí)將包含切片的區(qū)域排除在外，作截面測(cè)量切片和云母表面之間的平均相對(duì)高度，即為切片厚度。
本發(fā)明在現(xiàn)有超薄切片技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，增加了將切片轉(zhuǎn)移到云母表面的步驟，并獨(dú)創(chuàng)了利用水的張力使薄切片平整地貼附在云母表面的技術(shù)。在AFM成像操作過(guò)程中，調(diào)整參數(shù)使其適合掃描臺(tái)階式的包含云母和切片邊緣的區(qū)域，并在平整化處理中采用了特殊辦法，即將包含切片的區(qū)域排除在外，大大提高了高度測(cè)量的可行性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明的方法步驟簡(jiǎn)單，根據(jù)AFM的特點(diǎn)設(shè)計(jì)，測(cè)量厚度和表面掃描可以同時(shí)進(jìn)行，不會(huì)破壞樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)，適用于各種厚度的超薄切片，所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，誤差小。


圖1、圖2為本發(fā)明實(shí)施例中制備的樣品在AFM(Nanoscope IIIa from DigitalInstrument，Santa Babara，CA)空氣中接觸模式下觀察的圖像。圖像中亮的部分為切片，暗的部分為云母。所用DI公司提供的離線處理軟件(版本號(hào)4.42r4)僅對(duì)圖像作平整化處理。
圖1樣品為人舌鱗狀細(xì)胞癌組織切片，切片干涉色為藍(lán)紫色。
圖2樣品為人舌鱗癌培養(yǎng)細(xì)胞Tca8113，切片干涉色為藍(lán)色。
掃描范圍30μm×30μm。
掃描范圍30μm×30μm。
權(quán)利要求
1.一種基于原子力顯微鏡的超薄切片厚度的測(cè)量方法，其特征在于制備包埋塊和進(jìn)行超薄切片選定所需要的片子后，用潔凈的鉑金環(huán)撈取，滴15μl超純水在清潔的云母表面，將鉑金環(huán)輕輕浸在水滴中，從側(cè)面移走鉑金環(huán)或?qū)K金環(huán)倒扣，使切片飄浮在水面上，再將云母片置于烘片機(jī)上緩慢烘干，使切片平整地貼附在云母表面，烘片機(jī)溫度控制在40-65℃，利用原子力顯微鏡掃描包含切片邊緣和云母的區(qū)域，掃描模式為空氣中的接觸模式，實(shí)時(shí)平面調(diào)整參數(shù)設(shè)為“補(bǔ)償”，溫度控制在25±1℃，濕度控制在40％以下，對(duì)獲得的圖像進(jìn)行平整化處理時(shí)將包含切片的區(qū)域排除在外，作截面測(cè)量切片和云母表面之間的平均相對(duì)高度，即為切片厚度。
全文摘要
一種基于原子力顯微鏡的超薄切片厚度的測(cè)量方法，制備包埋塊和進(jìn)行超薄切片選定所需要的片子后，用潔凈的鉑金環(huán)撈取并輕輕浸在清潔云母表面的水滴中，移走鉑金環(huán)或?qū)K金環(huán)倒扣，使切片飄浮在水面上，再將云母片緩慢烘干，使切片平整地貼附在云母表面，利用原子力顯微鏡采用接觸模式掃描包含切片邊緣和云母的區(qū)域，實(shí)時(shí)平面調(diào)整參數(shù)設(shè)為“補(bǔ)償”，控制溫度和濕度，對(duì)獲得的圖像進(jìn)行平整化處理時(shí)將包含切片的區(qū)域排除在外，作截面測(cè)量切片和云母表面之間的平均相對(duì)高度，即為切片厚度。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，表面掃描和厚度測(cè)量可以同時(shí)進(jìn)行，不會(huì)破壞樣品的超微結(jié)構(gòu)，所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)G01B21/08GK1445524SQ0311668
公開(kāi)日2003年10月1日 申請(qǐng)日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月29日
發(fā)明者李鑫輝, 季彤, 李剛, 胡曉芳, 張曉東, 張陳平, 胡鈞 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)