專利名稱：多參數(shù)全面分析核酸以及同樣樣品上的形態(tài)學(xué)特征的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及用于腫瘤領(lǐng)域和診斷測(cè)試的胞質(zhì)生物分子的基因特異性擴(kuò)增、分析和圖譜。本發(fā)明特別適用于這些領(lǐng)域，如癌癥普查、化療選擇和監(jiān)測(cè)、或者癌癥復(fù)發(fā)。更特別地，本發(fā)明提供了有助于來自生物樣品的腫瘤細(xì)胞或其它稀有細(xì)胞的mRNA和DNA的全面分析的方法、裝置和試劑盒，同時(shí)保持細(xì)胞的完整用于計(jì)數(shù)和形態(tài)圖像分析。為實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，本發(fā)明也提供了方法以允許分析從細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞釋放的可溶性胞質(zhì)生物分子，其用滲透試劑來確定釋放的核酸分子的表達(dá)譜，同時(shí)仍然保持細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和抗原性特征以用于隨后的或者并行的多參數(shù)流體細(xì)胞計(jì)數(shù)、成像、以及免疫細(xì)胞化學(xué)分析(參見US6,365,362)。本發(fā)明也提供了方法以允許使用由基于醛和醛-脲衍生物的固定劑穩(wěn)定的樣品進(jìn)行同樣的全面分析。
相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的說明任何特定的細(xì)胞僅僅表達(dá)其基因組中存在的總基因的一部分。被表達(dá)的總基因的部分決定了細(xì)胞的功能，諸如發(fā)育和分化、自體調(diào)節(jié)、細(xì)胞循環(huán)的調(diào)節(jié)、老化、凋亡，等等?；虮磉_(dá)的改變決定了正常細(xì)胞發(fā)育的進(jìn)程以及疾病狀態(tài)例如癌癥的出現(xiàn)。特異性基因的表達(dá)對(duì)于任何特定細(xì)胞的本質(zhì)將具有深遠(yuǎn)的影響。因此，分析基因表達(dá)的方法，例如本發(fā)明提供的那些方法，在基本分子生物學(xué)研究和腫瘤生物學(xué)中是重要的。特異性基因特別是稀有基因的鑒定能夠?yàn)樵\斷、預(yù)后和治療各種反映這些基因表達(dá)水平的疾病提供關(guān)鍵信息(Levsky，et al.，Single-Cell Gene Expression Profiling，Science，297836-840，(2002))。
差異基因表達(dá)是一種通用的評(píng)估細(xì)胞中基因表達(dá)的方法。特別是，用cDNA微陣列分析比較獲自健康個(gè)體和患病個(gè)體的細(xì)胞或器官的cDNA靶序列水平。然后將這些靶序列與一系列固定在膜上的探針片段雜交。然后檢測(cè)所得的雜交圖案的區(qū)別并關(guān)聯(lián)到兩種來源基因表達(dá)的差別(US6,383,749)。這種方法要求緩慢的并且耗時(shí)的分析成百上千的基因特異性探針。而且競(jìng)爭(zhēng)作用可能干擾雜交而導(dǎo)致信噪比的降低，例如非互補(bǔ)的靶序列之間的相互作用、靶與探針之間的非特異性結(jié)合以及靶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
基因特異性引物組已經(jīng)在分析差異性表達(dá)中公開(US5,994,076和US6,352,829)。這里，基因特異性引物組用于特異性擴(kuò)增復(fù)合文庫(kù)中的mRNA分庫(kù)組以獲得與全庫(kù)標(biāo)記擴(kuò)增相比的cDNA陣列信號(hào)的改善。這種類型的分析法的關(guān)鍵是比較樣品陣列表達(dá)譜作為基因發(fā)現(xiàn)研究的一部分，而不是開發(fā)在診斷中具有實(shí)用性的用于實(shí)踐的細(xì)胞RNA分析的方法。
因此，盡管基因特異性引物組已經(jīng)用于從mRNA庫(kù)選擇性擴(kuò)增特定的mRNA亞組，仍然存在降低擴(kuò)增過程中的信噪比的明確需求，特別是應(yīng)用于診斷治療的稀有細(xì)胞檢測(cè)以包括定量和定性分析兩者。
現(xiàn)在普遍接受的是，患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的存在提供了評(píng)估治療介入需求的早期檢測(cè)體系?？梢跃_計(jì)數(shù)循環(huán)癌細(xì)胞的高敏感性分析法已經(jīng)表明，外周血腫瘤細(xì)胞的量與疾病狀態(tài)相關(guān)(Terstappen等人，外周血腫瘤細(xì)胞的量反映了乳腺癌患者的疾病的臨床活性，International J.of Oncology，17573-578，2000)。
此外，細(xì)胞類型和來源的分類將提供更全面的治療平臺(tái)。對(duì)幾例癌癥例如擴(kuò)散性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)的治療基于兩種不同的與臨床預(yù)后相關(guān)的疾病類型(Rosenwald等人，使用分子圖譜預(yù)測(cè)擴(kuò)散性大B細(xì)胞淋巴瘤的化療后的存活率，New England Journal of Medicine，3461937-1947，(2002))。在DLBCL中，源自生發(fā)中心B細(xì)胞的腫瘤對(duì)化療是敏感的，具有更高的存活機(jī)會(huì)，而來自活性B細(xì)胞的那些可能更難治療。因而這些細(xì)胞亞型依賴于腫瘤細(xì)胞的來源。
這些亞型的分層依賴于腫瘤的細(xì)胞來源。盡管在幾個(gè)例子中亞型的差別可以通過分析單一基因而確定，基因組合的完整陣列還是更加具有決定性。通過微陣列分析基因表達(dá)水平而制作的基因表達(dá)譜將是其它疾病的腫瘤性質(zhì)的期望指標(biāo)，例如淋巴瘤、急性白血病、乳腺癌、肺癌以及肝癌。然而，要適應(yīng)這一點(diǎn)，診斷用遺傳信息需要解決現(xiàn)有技術(shù)狀況下固有的明顯信噪問題。
因此，具有很大的興趣來開發(fā)分析基因表達(dá)的新方法，特別是這樣的方法提供了快速雜交、高特異性結(jié)合靶與互補(bǔ)探針、以及極大改善信噪比。此外，當(dāng)分析與癌和相關(guān)狀態(tài)疾病有關(guān)的基因表達(dá)時(shí)，這些方法具有額外的重要性(參見美國(guó)申請(qǐng)10/079,939和美國(guó)申請(qǐng)09/904,472，二者均在此全文引入作為參考)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了對(duì)分離自循環(huán)稀有細(xì)胞的擴(kuò)增mRNA的基因表達(dá)進(jìn)行分析的方法、裝置以及試劑盒(參見

圖1)，其克服了上文描述的現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。本發(fā)明提供了從單一靶細(xì)胞或者細(xì)胞群分離可溶性或者可釋放的胞質(zhì)生物分子的方法，它同時(shí)保持結(jié)構(gòu)上的細(xì)胞完整性或者表型特征。因此，細(xì)胞是新鮮的，或者是穩(wěn)定的并用交聯(lián)劑固定，與形成孔道的可滲透成分接觸，并回收核酸。來自固定化細(xì)胞的RNA(PCT/US02/26867)通過蛋白酶與親核逆轉(zhuǎn)試劑的結(jié)合進(jìn)行回收，用于擴(kuò)增以及隨后的定性和定量PCR分析，或者通過融合逆轉(zhuǎn)錄(RT)引物的基因特異性亞組并隨后進(jìn)行通用引物的PCR擴(kuò)增而用于定量分析。因此，本發(fā)明的一個(gè)焦點(diǎn)是制備用于胞質(zhì)生物分子分析以及表型細(xì)胞分析的細(xì)胞，其通過在滲透之前穩(wěn)定和固定化細(xì)胞，然后從同一穩(wěn)定化細(xì)胞釋放核酸來制備。
本發(fā)明也涉及分離靶細(xì)胞中的細(xì)胞核和/或線粒體DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及其它可溶性組分，其通過將細(xì)胞或細(xì)胞群與滲透性組分接觸并分別分析一個(gè)或多個(gè)成分的釋放和/或未釋放部分，諸如細(xì)胞核和/或線粒體DNA、總RNA、mRNA、可溶性蛋白、以及其它靶物質(zhì)(美國(guó)申請(qǐng)60/330,669)。
本發(fā)明包括對(duì)來自同一細(xì)胞或細(xì)胞群的胞質(zhì)生物分子以及膜或表面生物分子都進(jìn)行分析，其通過將細(xì)胞與滲透試劑接觸并分別分析胞質(zhì)生物分子和表面生物分子以形成包括源自基因型和表型細(xì)胞特征的特征在內(nèi)的功能性細(xì)胞圖譜，用于區(qū)分正常的和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
本發(fā)明的分離方法和稀有細(xì)胞分析方法相結(jié)合，提供了能夠從稀有細(xì)胞獲得全面分析mRNA的方法和試劑。例如，那些定義為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的細(xì)胞群將是在癌癥患者外周血和骨髓中發(fā)現(xiàn)的稀有細(xì)胞類型。mRNA通過本發(fā)明描述的細(xì)胞制備方法而獲得，但是也將包括現(xiàn)有技術(shù)中通用的任何方案。
從包含相關(guān)細(xì)胞的樣品分離并純化mRNA后，檢測(cè)帶有低mRNA拷貝數(shù)的非常稀有的細(xì)胞，這通過帶有或不帶有基于T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的預(yù)擴(kuò)增步驟的基因特異性RT-PCR儀而完成(美國(guó)專利60/369,945)。預(yù)擴(kuò)增通過使用修正的Eberwine aRNA方法進(jìn)行完整mRNA庫(kù)的線性擴(kuò)增而完成(Van Gelder等人，1990)。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，反義mRNA庫(kù)(aRNA)預(yù)擴(kuò)增的形成導(dǎo)致了分離自鐵磁流體富集的循環(huán)細(xì)胞的初始mRNA中存在的所有信息增加了至少一千倍。然后基因特異性引物僅僅用于擴(kuò)增相關(guān)的基因。這些引物設(shè)計(jì)來擴(kuò)增標(biāo)志著已知稀有事件例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。靶序列的數(shù)量可以小至兩個(gè)或者大至必須能夠與稀有事件的一些標(biāo)志特征相關(guān)聯(lián)。這可以作為分開的各自反應(yīng)或者在單獨(dú)的反應(yīng)瓶中進(jìn)行。隨后的分析產(chǎn)生靶序列的至少定性評(píng)估，其由諸如這些方法獲得，但不限于，我們?cè)谶@里提供的基因特異性引物(GSP)陣列和/或GSP系列-RT(通用PCR)的兩種類型多基因分析方法之一。
通用PCR在帶有或不帶有mRNA庫(kù)預(yù)擴(kuò)增的單獨(dú)反應(yīng)管中從樣品回收的mRNA中獲得多基因分析。不帶預(yù)擴(kuò)增只能允許同時(shí)分析一個(gè)基因。預(yù)擴(kuò)增增加了在最多1000個(gè)不同的反應(yīng)中分析一個(gè)樣品的優(yōu)點(diǎn)，這樣就可以在不同的時(shí)間來檢查許多不同的基因。盡管注意到其它方法也可以使用，但是通用PCR分析儀的分析是由陣列或者毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)完成的。因此，當(dāng)以cDNA微陣列方式進(jìn)行測(cè)定時(shí)，該系統(tǒng)可同時(shí)用于1到上千個(gè)單獨(dú)的mRNA類型的定量以及定性鑒定。
因此，本發(fā)明包括上述分離方法和圖譜分析涉及的方案和試劑盒的結(jié)合，包括一些或所有必須的試劑，包括滲透性組分，在交聯(lián)后RNA回收劑，表面共價(jià)結(jié)合寡聚(dT)探針的磁微球，以及用于捕獲并進(jìn)行全面性分析的RNA分析的其它基因特異性結(jié)合磁微球的探針，其使用小的或者大的微陣列、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、HPLC、電泳以及其它分析平臺(tái)。
附圖的簡(jiǎn)要說明圖1顯示了一個(gè)流程圖，描述了由本申請(qǐng)公開的發(fā)明所允許的用于單一樣品多參數(shù)分析的各種可能性以及可選擇性。表型和基因型分析在固定的或者不固定的細(xì)胞上獲得。
圖2顯示了變性總RNA的反相圖像(負(fù)染)，其通過SYBR金染大約1600個(gè)SKBR3乳腺癌細(xì)胞后以2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，所述細(xì)胞在以Trizol加小球狀顏料共沉淀從所得的上清液中分離出總RNA之前，用Immuniperm進(jìn)行處理。
圖3顯示了以溴乙碇染色的1％變性總RNA瓊脂糖凝膠，包括全細(xì)胞、來自細(xì)胞沉淀丸粒部分的Immuniperm(皂角苷)-滲透的細(xì)胞、以及來自Immuniperm-滲透的SKBR3乳腺癌細(xì)胞的上清液部分的細(xì)胞。
圖4顯示了圖3所示的凝膠被多核苷酸激酶處理過的32P-標(biāo)記寡聚(dT)(25mer)探針雜交的Northern印跡熒光圖譜。放射性信號(hào)相應(yīng)于來自全細(xì)胞的總RNA的所有多聚(A)+mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及圖3所示凝膠中兩種Immuniperm-處理的細(xì)胞部分。
圖5顯示了圖4的條帶經(jīng)常規(guī)洗脫和去除標(biāo)記的寡聚(dT)探針并用細(xì)胞核特異的前體rRNA探針再雜交的Northern印跡。
圖6顯示了圖5的Northern印跡經(jīng)剝脫并用線粒體特異性的12srRNA探針再雜交。
圖7顯示了cDNA陣列點(diǎn)印跡雜交模式的比較，用于產(chǎn)生圖3凝膠圖譜的相應(yīng)mRNA是在第一鏈寡聚(dT)引物cDNA合成中進(jìn)行過α-32P核苷酸標(biāo)記的。然后將標(biāo)記的第一鏈cDNA用作雜交探針。圖譜比較顯示出同樣相對(duì)豐度的mRNA存在于所有三種RNA細(xì)胞部分中。
圖8顯示了相關(guān)胞質(zhì)總RNA的凝膠圖譜，既定量也定性，所述RNA是分別處理均被Immuniperm處理的多個(gè)包含大約770個(gè)PC-3細(xì)胞的試樣后而獲得。
圖9顯示了使用CytoChexTM和其它醛基固定劑對(duì)90-100％的總RNA庫(kù)進(jìn)行保存、回收和RNA完整性分析，然后酶消化。在該實(shí)驗(yàn)中，300,000個(gè)SKBR3細(xì)胞系細(xì)胞的大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化部分首先摻入到新鮮提取的7.5ml外周血(EDTA Vacutainer管)中，包括無(wú)固定劑的對(duì)照道以及具有三種不同固定劑Cyto-ChexTM、StabilcyteTM和TransfixTM的道。它們混合后在室溫(20-25℃)孵育24小時(shí)。隨后使用VU-1 D9(EpCAM)-鐵磁流體免疫磁學(xué)選擇將這些SKBR3細(xì)胞富集。每份處理的富集細(xì)胞分成3等份，用蛋白酶K處理(標(biāo)記為“Post”的道)或者不用蛋白酶K處理(標(biāo)記為“Pre”的道立即進(jìn)行RNA分離，標(biāo)記為“No”的道表示其與Post的唯一區(qū)別就是不加入蛋白酶K成分，所有的其它處理與Post相同)。所得的標(biāo)準(zhǔn)化RNA分離物用1％變性瓊脂糖分離，用SYBR金染色，α圖像密度儀照相，然后進(jìn)行Northern印跡，最后以寡聚(dT)探針顯示回收的總RNA和mRNA庫(kù)各自的相對(duì)質(zhì)量和數(shù)量。
圖10A和B顯示了Cyto-ChexTM、StabilcyteTM、TransfixTM、多聚甲醛、甲醛、戊二醛和乙二醛在1、2和4小時(shí)期間固定的相對(duì)速度。在該實(shí)驗(yàn)中，Cyto-ChexTM、StabilcyteTM、TransfixTM、多聚甲醛、甲醛、戊二醛和乙二醛固定的時(shí)間過程相對(duì)速度在第1、2和4小時(shí)進(jìn)行分析。用如圖9中所述的同樣方法從單個(gè)供體制備7.5ml的血液樣品。唯一的區(qū)別是它們?cè)诘?、2和4小時(shí)的時(shí)間端點(diǎn)對(duì)RNA分離物進(jìn)行選擇和加工。所得的標(biāo)準(zhǔn)化RNA分離物用1％變性瓊脂糖分離，用SYBR金染色，α圖像密度儀照相，然后進(jìn)行Northern印跡，最后以寡聚(dT)探針顯示回收的總RNA和mRNA庫(kù)各自的相對(duì)質(zhì)量和數(shù)量。
圖10C顯示了Cyto-ChexTM和多聚甲醛在15、30和45分鐘時(shí)間過程的相對(duì)固定速度。在該實(shí)驗(yàn)中，Cyto-ChexTM和多聚甲醛固定的時(shí)間過程相對(duì)速度在第15、30和45分鐘進(jìn)行分析。用如圖9中所述的同樣方法從單個(gè)供體制備7.5ml的血液樣品。唯一的區(qū)別是它們?cè)诘?5、30和45分鐘的時(shí)間端點(diǎn)進(jìn)行選擇。顯示相對(duì)mRNA庫(kù)質(zhì)量和數(shù)量的寡聚(dT)探針印跡的熒光圖像定量表明相對(duì)速度為甲醛＝多聚甲醛(～4倍)＞TransfixTM(～2倍)＞StabilcyteTM(～1.5倍)＞Cyto-ChexTM(～1倍)＝戊二醛和乙二醛，過慢就不能排序了。所得的標(biāo)準(zhǔn)化RNA分離物用1％變性瓊脂糖分離，用SYBR金染色，α圖像密度儀照相，然后進(jìn)行Northern印跡，最后以寡聚(dT)探針顯示回收的總RNA和mRNA庫(kù)各自的相對(duì)質(zhì)量和數(shù)量。
圖11顯示了親核試劑和酶的改變對(duì)由Cyto-ChexTM保存回收的RNA質(zhì)量和數(shù)量的影響，證明當(dāng)用于復(fù)合處理以改善序列分析質(zhì)量是可能的。所得的標(biāo)準(zhǔn)化RNA分離物用1％變性瓊脂糖分離，用SYBR金染色，α圖像密度儀照相，然后進(jìn)行Northern印跡，最后以寡聚(dT)探針顯示回收的總RNA和mRNA庫(kù)各自的相對(duì)質(zhì)量和數(shù)量。
圖12A顯示了診斷應(yīng)用的可行性，這是通過檢測(cè)來自10個(gè)SKBR3細(xì)胞/7.5ml血液的特異性mRNA而證實(shí)，所述的血液是經(jīng)Cyto-ChexTM穩(wěn)定24小時(shí)用蛋白酶回收以及aRNA預(yù)擴(kuò)增。診斷應(yīng)用的可行性在此通過敏感和可再現(xiàn)地檢測(cè)特異性mRNA三次，其來自10或20個(gè)SKBR3細(xì)胞摻入的7.5ml外周血來證實(shí)。摻入后的血液立即用Cyto-ChexTM處理進(jìn)行穩(wěn)定以穩(wěn)定化細(xì)胞RNA。在室溫(20-25℃)孵育一天后，穩(wěn)定化的細(xì)胞使用VU-1 D9(EpCam)-鐵磁流體免疫磁學(xué)選擇進(jìn)行選擇性富集。富集后用蛋白酶K消化以釋放RNA，以便在二氧化硅結(jié)合RNA分離之后進(jìn)行aRNA預(yù)擴(kuò)增以及能夠?qū)K19和EpCAM進(jìn)行基因特異性定量RT-PCR。
圖12B和12C分別顯示了CK19和EpCAM的Q-PCR，其來自SKBR細(xì)胞摻入，鐵磁流體選擇，以及CytoChexTM處理，接著用蛋白酶逆轉(zhuǎn)。該實(shí)驗(yàn)顯示了定量RT-PCR分析的結(jié)果，其在作圖前對(duì)初始總RNA量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。這樣，顯示的數(shù)值相當(dāng)于在aRNA擴(kuò)增前包含在初始RNA分離物中的起始mRNA量。
圖12D和12E分別顯示了CD19和EpCAM在aRNA上的Q-PCR，其來自用細(xì)胞穩(wěn)定劑處理的SKBR細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)顯示來自三種不同固定劑的RNA，在圖9中顯示為Cyto-ChexTM、StabilcyteTM和TransfixTM。這些蛋白酶K回收的RNA樣品也對(duì)CK19和EpCAM進(jìn)行了aRNA預(yù)擴(kuò)增和基因特異性定量RT-PCR的同樣mRNA模板分析，如分別示于圖12B和12C。這里顯示的這些數(shù)據(jù)都對(duì)總RNA量進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，其等于該實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的aRNA量。這樣該固定劑導(dǎo)致的相對(duì)RNA數(shù)量和質(zhì)量對(duì)照是aRNA(圖12A)和此處顯示的其后定量RT-PCR的測(cè)量。這些對(duì)照都是在僅使用蛋白酶K方法回收RNA后各自的固定劑依賴RT模板質(zhì)量。
圖13A顯示了包含CK19 mRNA轉(zhuǎn)錄本的3′-最多800個(gè)堿基序列的aCK19-cRNA標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR擴(kuò)增效率。包含200、100、50、12、5個(gè)拷貝的CK19-cRNA標(biāo)準(zhǔn)物的連續(xù)兩倍稀釋物摻入到來自白細(xì)胞的2ng CK19負(fù)總RNA中，重復(fù)三次，得到最大27％的變化系數(shù)。顯示了標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)值條。cRNA稀釋到少于一個(gè)拷貝以及沒有模板的對(duì)照沒有產(chǎn)生可檢測(cè)到的信號(hào)。
圖13B顯示了瓊脂糖凝膠電泳后的相對(duì)RT-PCR基因表達(dá)水平。CK19 cRNA摻入到來自白細(xì)胞的總RNA中，在第1格、第2格、第3格和第4格中分別具有25拷貝、250拷貝、2500拷貝和25000拷貝的水平。
圖13C比較了同一mRNA庫(kù)中未擴(kuò)增的和基于T7啟動(dòng)子擴(kuò)增的mRNA轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表現(xiàn)。通過使用RT-PCR動(dòng)力學(xué)曲線方法檢測(cè)8個(gè)不同mRNA轉(zhuǎn)錄本(PSA，PSM，MGB1，MGB2，CK8，CK19，PIP，EpCam)估計(jì)了相對(duì)豐度。
圖14A顯示了標(biāo)志循環(huán)上皮細(xì)胞存在的基因測(cè)定的散點(diǎn)條形圖。免疫磁學(xué)富集有在其細(xì)胞表面表達(dá)EpCAM抗原的細(xì)胞的人類血作為樣品首先進(jìn)行aRNA預(yù)擴(kuò)增，然后逆轉(zhuǎn)錄25ng。然后通過在選擇的基因組上進(jìn)行RT-PCR后以瓊脂糖凝膠電泳對(duì)各份進(jìn)行分析。13個(gè)健康供體(7個(gè)男性，6個(gè)女性)每個(gè)檢測(cè)的基因標(biāo)記為N柱，9個(gè)連續(xù)取樣的含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的HRPC患者經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)確定，每個(gè)測(cè)定的基因標(biāo)記為P柱。每個(gè)柱的水平線表示開始值，在其上面的計(jì)為實(shí)際的正值。
圖14B描述了表示原始狀態(tài)的前列腺瘤器官的基因一覽，其通過如14A中所述的同樣方法得到。
圖14C描述了表示存在治療目標(biāo)狀態(tài)的基因一覽，其通過如14A中所述的同樣方法得到。
圖15A、15B、以及15C顯示了在新的化療之前、其間以及之后對(duì)單獨(dú)的HRPC患者的CTC和RT-PCR多基因分析進(jìn)行的縱向監(jiān)視。X軸顯示以周為單位的取樣時(shí)間，左邊的y軸以實(shí)心圓符號(hào)顯示CTC水平。右邊的y軸以相應(yīng)的符號(hào)顯示相對(duì)mRNA表達(dá)水平，雄性激素受體(AR)為空心方塊，Hepsin(HPN)為空心圓，多藥抗藥性(MDR1)為空心三角。在治療期間僅用利普安的相對(duì)mRNA水平示于圖15A，用利普安結(jié)合服用Taxotere和雌氮芥(由x軸上的豎向箭頭表示)化療的2個(gè)患者示于圖15B和圖15C。頂部的條表示長(zhǎng)期激素消除治療在進(jìn)行中。
優(yōu)選
具體實(shí)施例方式
的詳述如前述探討中指出的，更全面和實(shí)用形式的癌癥診斷還必須包括胞內(nèi)和胞外膜抗原分析以及在相同細(xì)胞或細(xì)胞群體中細(xì)胞RNA含量和DNA含量的分析，這些到現(xiàn)在為止還是互相排斥的方法(US6,365,362)。這種排他性是由于分析結(jié)構(gòu)性胞內(nèi)抗原的分析前細(xì)胞制備方法，其主要目標(biāo)是保持細(xì)胞完整，與分離胞質(zhì)生物分子的方法之間的基本不相容性?？蛇x擇地，分析前的細(xì)胞制備也可以限定為可溶性胞質(zhì)RNA、總細(xì)胞RNA、總細(xì)胞DNA和/或蛋白質(zhì)，其主要目標(biāo)是均質(zhì)化細(xì)胞以釋放可溶性胞內(nèi)成分(US6,329,179)。特別是，傳統(tǒng)的表型表征需要細(xì)胞結(jié)構(gòu)的固定，其通過將細(xì)胞暴露于交聯(lián)劑而實(shí)現(xiàn)，例如多聚甲醛、甲醛、戊二醛等。這些苛刻的細(xì)胞固定條件同時(shí)引起了不期望的共價(jià)交聯(lián)和/或所有可分離RNA種類的破碎。類似的胞內(nèi)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)最近已經(jīng)報(bào)道(Quievryn和Zhitkovick，通過自發(fā)水解和與蛋白體功能相關(guān)的活性修復(fù)過程使暴露于甲醛的細(xì)胞的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)生喪失，Carcinogenesis，211573-1580(2000))。所謂的非甲醛或非多聚甲醛固定劑(例如Cyto-ChexTM，Streck Labs，Omaha，NE)是包含甲醛-脲衍生的供體化合物的細(xì)胞穩(wěn)定化添加劑。它用作循環(huán)腫瘤細(xì)胞在運(yùn)輸或貯藏期間的防腐劑，如在一份共同未決的申請(qǐng)中所公開的(PCT/US02/26867，在此引入作為參考)。不過，本發(fā)明人進(jìn)行的研究已經(jīng)表明，僅僅包含微量水平游離甲醛的Cyto-ChexTM也明顯減慢了釋放可交聯(lián)胞內(nèi)RNA的甲醛到胞內(nèi)蛋白質(zhì)。這種交聯(lián)通過本發(fā)明的方法完全逆轉(zhuǎn)以能夠進(jìn)行全面的RNA分析。因此細(xì)胞RNA和DNA分析可按常規(guī)方法在不固定的新鮮細(xì)胞上或者在由不交聯(lián)的試劑保存的細(xì)胞上進(jìn)行，或者在mRNA從細(xì)胞釋放期間逆轉(zhuǎn)交聯(lián)。RNAlaterTM(Ambion)是一種可商業(yè)獲得的RNA穩(wěn)定溶液，它穩(wěn)定了RNA但是不能在同樣的樣品上進(jìn)行免疫磁法、免疫化學(xué)或者圖像分析，對(duì)血液來說是無(wú)效的。PreAnalytiX提供了一種血液RNA穩(wěn)定劑，但是它只不過是在VacutainerTM管中的離液劑異硫氰酸胍溶液(GITC)，僅僅能夠進(jìn)行基于單獨(dú)的總RNA分離的常規(guī)勻漿。
總的來說，由固定細(xì)胞回收的mRNA是不定量的、嚴(yán)重降解的或者破碎的、降低了完整RNA的大小，是大約1750個(gè)堿基的平均大小，這是高可變度的大約200堿基的平均大小的十倍，而且包含了許多無(wú)法很好理解的復(fù)雜化學(xué)修飾。然而，由固定劑得到的RNA的有效效果被RNA分析嚴(yán)重抵消了(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，(2002))。結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析的單調(diào)非定量mRNA獲取技術(shù)顯示出了有限的價(jià)值，盡管是以定性的而不是定量的方式，其計(jì)劃用作長(zhǎng)度小于100堿基對(duì)的擴(kuò)增子(US5,346,994)。進(jìn)一步地，這種固定細(xì)胞上的限制性RNA分析必須接著進(jìn)行表型分析。這樣，這兩個(gè)過程不能在同一細(xì)胞樣品上連續(xù)進(jìn)行，因?yàn)槌Ｒ?guī)RNA分離技術(shù)需要完全的細(xì)胞溶胞或者勻漿，破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步由于混合了細(xì)胞DNA和RNA群而使分析復(fù)雜化(Maniatis等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborPress(1989))。以前的報(bào)道已經(jīng)顯示需要在組織中的RNA回收的改進(jìn)方法(Godfrey等，使用5′核酸酶的定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量分析由甲醛固定獲得的、石蠟包埋的組織的mRNA表達(dá)，J.of MolecularDiagnostics，284-91(2000))。基于甲醛和脲的固定劑的應(yīng)用是本發(fā)明一個(gè)方面的基礎(chǔ)，所述固定劑穩(wěn)定了來自血液的可回收的定量的、高質(zhì)量的全長(zhǎng)完整總mRNA和mRNA庫(kù)，并因此能夠進(jìn)行全面分析。
相當(dāng)出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)用作滲透劑的皂角苷是一種胞質(zhì)RNA和其它生物分子的高度選擇性的以及有效的釋放劑，因而避免了細(xì)胞溶胞或勻漿的需求。皂角苷作為RNA釋放劑的這種新用途是本發(fā)明的特別有益的部分。諸如皂角苷的表面活性劑傳統(tǒng)上用于檢查胞內(nèi)抗原的表達(dá)，其通過滲透細(xì)胞膜而允許在保持細(xì)胞完整性的同時(shí)摻入染色劑。例如，通過熒光原位雜交(FISH)分析染色體或基因，或者用細(xì)胞核染色劑DAPI染色胞內(nèi)組分例如細(xì)胞核DNA，或者用特殊標(biāo)記的抗體免疫染色細(xì)胞角蛋白，在這些方面起著關(guān)鍵作用。胞內(nèi)蛋白質(zhì)、RNA或DNA的釋放一般通過增溶或者以更強(qiáng)的表面活性劑例如TritonX-100完全細(xì)胞溶胞。不過，皂角苷迄今為止尚未用于研究可溶性胞內(nèi)抗原包括RNA的表達(dá)，也未用于研究同樣樣品的個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞群的表型分析。因此，允許連續(xù)的表型分析以及同一細(xì)胞樣品的胞質(zhì)完整RNA和可溶性蛋白質(zhì)分析的方法是非常值得期望的，這是本發(fā)明的主題。
因此，本發(fā)明提供了用于所有細(xì)胞特別是生物樣品中發(fā)現(xiàn)的靶細(xì)胞的快速并有效的RNA分析的優(yōu)越方法、裝置和試劑盒。本發(fā)明提供了用于允許分別進(jìn)行表型和基因型分析的方法。表型通過抗體抗原蛋白質(zhì)和質(zhì)譜圖方法以及全面分析來自同一細(xì)胞或細(xì)胞群的完整胞質(zhì)RNA而提供并分析。樣品基因組和線粒體DNA的基因型可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何手段進(jìn)行單獨(dú)分析。類似于mRNA庫(kù)的擴(kuò)增，基因組和線粒體庫(kù)可分別預(yù)擴(kuò)增，使能夠進(jìn)行許多分析而不喪失臨床敏感性，多重移位擴(kuò)增(MDA)技術(shù)使第一個(gè)有效的全基因組擴(kuò)增方法成為可能。MDA是一種快速、可靠的從幾個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)限D(zhuǎn)NA的方法。
此處所述的發(fā)明可用于有效分離和表征細(xì)胞表型，例如表面抗原、胞質(zhì)內(nèi)抗原和任何類型的RNA，以及基因型。表型和基因型分析都可在完全相同的樣品上連續(xù)進(jìn)行。例如在細(xì)胞表面分析和RNA提取后，剩下的完整細(xì)胞核和線粒體可以用所有基于RNA(mt RNA，hRNA)、DNA和蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)進(jìn)行下游分析，例如S1核酸酶、核糖核酸酶保護(hù)、RT-PCR、SAGE、DD-RT-PCR、微陣列cDNA雜交、ISH、FISH、SNP、所有基于RNA和所有基于基因組的PCR技術(shù)以及任何蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)。
這種類型的細(xì)胞分析的許多應(yīng)用之一是在癌癥診斷中。許多臨床醫(yī)生相信癌癥在限于其早期時(shí)是器官特異性的疾病。這種疾病在它首次可用現(xiàn)有的方法檢測(cè)到的時(shí)候就變成全身性的了。因此，提示循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞存在的證據(jù)將提供第一線的檢測(cè)機(jī)制，它可以或者替代其它檢驗(yàn)，或者與其它檢驗(yàn)共同起作用，例如乳房X射線照射術(shù)或者前列腺特異性抗原的測(cè)定。經(jīng)由這些細(xì)胞特異性標(biāo)記而分析細(xì)胞表型(蛋白質(zhì)和RNA)和基因型，這種細(xì)胞的組織來源就可以容易確定，例如乳腺、前列腺、結(jié)腸、肺、卵巢或者其它非造血細(xì)胞癌癥。這樣在蛋白質(zhì)、RNA和基因組可被分析的位置，特別是未獲得腫瘤臨床信號(hào)的地方，確定特異性腫瘤的存在以及來源器官是可能的。因?yàn)檫@些圖譜說明了細(xì)胞功能，它們還預(yù)示了用于癌細(xì)胞檢測(cè)的最合適的治療類型和方法應(yīng)該是什么。進(jìn)一步地，在那些外科手術(shù)或者其它成功的治療之后沒有檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞的證據(jù)的監(jiān)視病例中，從進(jìn)一步的臨床研究來確定是否需要進(jìn)一步治療也是可能的。
為了準(zhǔn)備更全面和早期的診斷，本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
包括以下方法從細(xì)胞或細(xì)胞群分離胞質(zhì)生物分子，用滲透劑化合物接觸細(xì)胞，在保持細(xì)胞完整性用于隨后的表型和形態(tài)分析的同時(shí)，從細(xì)胞分離相關(guān)的胞質(zhì)生物分子。
本發(fā)明的目標(biāo)性稀有事件涉及任何預(yù)示至少部分已知稀有事件的生物材料的表達(dá)。因此，激素、蛋白質(zhì)、肽、凝集素、寡核苷酸、藥物、化學(xué)物質(zhì)、核酸分子(例如RNA和/或DNA)以及生物微粒例如細(xì)胞、凋亡小體、細(xì)胞碎片、核、線粒體、病毒、細(xì)菌、以及它們的類似物都將包括在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中。
流體樣品包括而不限于含有細(xì)胞的體液、外周血、骨髓、尿、唾液、痰、精液、組織勻漿、乳頭吸出物、以及從人患者獲取的稀有細(xì)胞的任何其它來源。
“胞質(zhì)生物分子”包括相關(guān)的細(xì)胞靶分子，例如但不限于蛋白質(zhì)、多肽、糖蛋白、寡糖、脂質(zhì)、基質(zhì)、RNA、DNA及其類似物，它們位于細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)。一旦用滲透劑化合物接觸細(xì)胞以及隨后的細(xì)胞分離，胞質(zhì)生物分子存在于上清中用于下游分析。所有的可溶性胞質(zhì)生物分子都可以被分離和分析，例如完整的胞質(zhì)RNA庫(kù)或者能夠穿越膜孔的目標(biāo)組分。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，焦點(diǎn)集中在轉(zhuǎn)錄的mRNA和翻譯的蛋白質(zhì)的分析上，例如在CTC中作為癌癥診斷和治療管理中相關(guān)的癌基因轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。
“膜生物分子”包括相關(guān)的任何胞外的、膜內(nèi)的、或者胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域分子，它們與細(xì)胞膜結(jié)合或者包埋在細(xì)胞膜中，包括但不限于細(xì)胞外膜、核膜、線粒體和其它細(xì)胞器的膜。一旦用本發(fā)明的滲透劑化合物滲透，目標(biāo)膜生物分子通常不被溶解或者從膜上離開，也就是說膜生物分子仍然與被滲透的細(xì)胞結(jié)合。膜生物分子包括但不限于蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸以及它們的復(fù)合物，它們與細(xì)胞膜結(jié)合，包括那些暴露在外膜外部的或胞外表面的和那些存在于外膜內(nèi)表面的，以及那些與細(xì)胞核、線粒體和所有其它胞內(nèi)細(xì)胞器膜結(jié)合的蛋白質(zhì)。膜生物分子也包括細(xì)胞骨架蛋白。
“基因型”或者“基因型分析”是指鑒別胞內(nèi)遺傳物質(zhì)如DNA的過程，DNA存儲(chǔ)內(nèi)部編碼的可遺傳指令來構(gòu)建和控制細(xì)胞生活和死亡的所有方面?！氨硇汀被颉氨硇头治觥倍x為在可觀察到的外部結(jié)構(gòu)要素及其產(chǎn)物(即包括中間RNA)的基礎(chǔ)上對(duì)細(xì)胞的分類。它們包括拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、形態(tài)結(jié)構(gòu)和其它表面特征，所有這些都是由結(jié)合到本發(fā)明方法中的內(nèi)部編碼的基因型信息產(chǎn)生的。相反，在常規(guī)RNA分離技術(shù)中不能保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和完整性，其涉及在NP-40的存在下至少是除了細(xì)胞核和線粒體之外的所有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完全溶解，通常是通過離液鹽處理和/或機(jī)械性細(xì)胞勻漿來分解所有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
關(guān)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)結(jié)構(gòu)或形態(tài)學(xué)根據(jù)通常定義使用，與細(xì)胞和細(xì)胞核拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及表面特征相關(guān)，包括胞內(nèi)或表面標(biāo)記或抗原決定簇，它們?cè)试S用組織化學(xué)試劑染色或者與可檢測(cè)的標(biāo)記性結(jié)合配基例如抗體相互作用。此外形態(tài)結(jié)構(gòu)包括“形態(tài)測(cè)量學(xué)”的全部領(lǐng)域，其定義為在細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)分布的定量測(cè)定。
術(shù)語(yǔ)基因組和蛋白質(zhì)組按照通常定義的使用?！肮δ苄浴痹谶@里用作憑經(jīng)驗(yàn)可檢測(cè)的細(xì)胞生物特征或性質(zhì)的一個(gè)形容詞，例如“功能性細(xì)胞組”更廣泛地包括基因組和蛋白質(zhì)組兩者以及其它目標(biāo)類別，包括但不限于用于碳水化合物的“糖組”以及用于脂質(zhì)的“脂組”。所得的細(xì)胞特征提供了可以區(qū)別正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的圖譜。
“接觸”意指直接或間接地將化合物或試劑一起達(dá)到細(xì)胞的物理接近。細(xì)胞和/或化合物可存在于任何數(shù)量的緩沖液、鹽、溶液等之中。接觸包括例如將試劑溶液放進(jìn)含有細(xì)胞的管、微量滴定板、微陣列、細(xì)胞培養(yǎng)瓶或者類似物中。微量滴定板和微陣列的形式可進(jìn)一步允許同時(shí)分析細(xì)胞目標(biāo)化合物或組分的多樣性的多元分析，包括但不限于核酸和蛋白質(zhì)。
“滲透劑化合物、試劑或組分”意指在細(xì)胞膜中形成小孔的任何試劑，包括脂-膽固醇雙層，它同時(shí)要保持足夠的膜、胞質(zhì)和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)以便可以在滲透后的細(xì)胞上進(jìn)行隨后的表型分析。例如，皂角苷是一種已知的“孔形成”化合物，它與細(xì)胞膜組分結(jié)合從而在細(xì)胞壁或膜中形成許多跨膜的大約8nm大小的孔，這樣就允許小的可溶性胞質(zhì)成分向外擴(kuò)散，例如酶、蛋白質(zhì)、糖蛋白、球蛋白、電解質(zhì)和類似物，以及與胞外試劑成分例如電解質(zhì)的內(nèi)部平衡。
“免疫磁珠”是磁標(biāo)記的納米微粒或微米微粒，它也具有共價(jià)附著的結(jié)合試劑(如抗體)，對(duì)細(xì)胞上的表面標(biāo)記或抗原決定簇具有相當(dāng)選擇性的親和力，由此，當(dāng)暴露于諸如在高梯度磁分離系統(tǒng)(HGMS)中產(chǎn)生的磁場(chǎng)時(shí)，就可以實(shí)現(xiàn)磁標(biāo)記細(xì)胞的選擇性捕獲。這里使用的其它方法學(xué)、試劑和儀器的術(shù)語(yǔ)都是常規(guī)定義的，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
優(yōu)選的用于鑒別來源組織、診斷、預(yù)后、治療目標(biāo)特征和監(jiān)視的基因表達(dá)目標(biāo)(mRNA和蛋白質(zhì))包括但不限于源自這些癌癥的細(xì)胞乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、腎癌、膀胱癌，以及用于檢測(cè)和監(jiān)視敏感性或者抗性基因表達(dá)標(biāo)記的類似物，例如乳球蛋白1(MGB1)、乳球蛋白2(MGB2)、促乳素誘導(dǎo)蛋白(PIP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、腺激素2(hK2)、雄性激素受體(AR)、前列腺素、Hespin(HPN)、DD3、Her-2/Neu、BCL2、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、酪氨酸激酶型受體(HER2)、胸苷酸合成酶(TS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF、胰粘液素(Muc1)、鳥苷酸環(huán)化酶(GC-C)、磷脂酰肌醇3激酶(PIK3CG)、蛋白激酶Bγ(AKT)、切補(bǔ)修復(fù)蛋白(ERCC1)、α-1球蛋白(F6)、巨噬細(xì)胞抑制性細(xì)胞因子-1(G6)、二氫嘧啶脫氫酶(DPYD)、胰島素生長(zhǎng)因子受體(IGF2)、雌激素受體α和β(ER)、孕酮受體(PR)、芳香酶(cyp19)、末端酶(TERT)、通用上皮組織特異性基因、細(xì)胞角蛋白19(CK19)、細(xì)胞角蛋白5(CK5)、細(xì)胞角蛋白8(CK8)、細(xì)胞角蛋白10(CK10)、細(xì)胞角蛋白20(CK20)、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、粘液素包括粘液素1(MUC1)、拓?fù)洚悩?gòu)酶、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化因子受體(uPAR)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、通用白細(xì)胞特異性mRNA、α-1球蛋白、CD16、CD45、和CD31，以及類似物。這些列舉打算舉例說明mRNA特異性基因陣列的一般差異性，其能夠組合來區(qū)分不同來源、類型和疾病的細(xì)胞，但并不打算是全面性的。
穩(wěn)定、釋放和回收使用此前公開的美國(guó)專利No.6,365,362和美國(guó)申請(qǐng)No.10/079,939(均在此引入作為參考)的方法，循環(huán)上皮細(xì)胞可富集到相對(duì)于白細(xì)胞為至少2,500倍到大約10,000倍的程度。血液中的循環(huán)上皮細(xì)胞經(jīng)免疫磁學(xué)選擇后進(jìn)行本發(fā)明包括的核苷酸分析。富集僅僅是本領(lǐng)域已知的選擇用于本發(fā)明具體實(shí)施方式
的特定細(xì)胞群的許多方法的例子之一。
在染色和免疫染色之前用皂角苷進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞滲透的過程中，出乎意料地、令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了從這些細(xì)胞釋放完整的胞質(zhì)總RNA和mRNA從而分離并純化它們的方法，這樣就可能在完全同樣的細(xì)胞、細(xì)胞群或樣品上連續(xù)地或者平行地進(jìn)行胞質(zhì)RNA和胞內(nèi)抗原表型分析以及DNA基因型分析。
滲透的進(jìn)行可以在這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)下使用3類普通表面活性劑或去污劑之一孔形成試劑，如皂角苷，或者皂角苷成分如QS-21、七葉皂苷、毛地黃皂苷，卡烯內(nèi)酯等。所有這些試劑都增加膜的孔隙度并釋放小的可溶性胞內(nèi)組分。另一組試劑是表面活性劑。這些試劑不必溶胞就具有相當(dāng)高的親水-親脂性平衡以滲透膜。其它具有更低親水-親脂平衡的更溶胞的表面活性劑可能釋放RNA，但是其傾向于將膜溶解。這些試劑包括但不限于聚氧乙烯脫水山梨糖醇(商業(yè)上公知為吐溫20、40或者80)、壬基苯氧基-聚乙氧基乙醇(NP-40)、以及類似物、t-辛基-苯氧基乙氧基乙醇、或者SDS。
隨后可以通過所有的基于RNA、DNA和蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)進(jìn)行下游的胞質(zhì)RNA(以及其它RNA如mtRNA和hnRNA)、細(xì)胞表面和可溶性胞內(nèi)抗原、細(xì)胞器如線粒體以及殘余細(xì)胞核的分析。這些技術(shù)包括所有類型的cDNA、RNA和蛋白質(zhì)微陣列的圖譜分析、質(zhì)譜、熒光原位雜交(FISH)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)，所有基于基因組的擴(kuò)增技術(shù)如PCR和類似技術(shù)、微衛(wèi)星分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP，ALFP)、SAGE、DD-RT-PCR、以及類似技術(shù)。
這樣的分析可以在少至每次1-10個(gè)RNA分子以及任何RNA序列類型上進(jìn)行，但是優(yōu)選在幾萬(wàn)直到上百萬(wàn)拷貝的靶上進(jìn)行，以能夠檢測(cè)到作為臨床上疾病狀態(tài)標(biāo)志的細(xì)胞翻譯或轉(zhuǎn)錄圖譜的微小改變。其它可釋放的和不可釋放的細(xì)胞組分如蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、寡糖及類似物的功能性細(xì)胞圖譜可以類似地通過分析這兩種組分而產(chǎn)生，其通過常規(guī)的微陣列、HPLC、電泳方法包括高分辨率2D電泳方法、或者抗體陣列圖譜進(jìn)行。
本發(fā)明的滲透劑化合物包括但不限于皂角苷，它是一類由類膽固醇糖苷配基或配質(zhì)(不含任何碳水化合物部分的三萜或甾體類)連接到脂肪酸和一個(gè)或多個(gè)糖基而構(gòu)成的天然產(chǎn)物，其易分散到水中形成球狀膠束，這是孔形成的活性物質(zhì)。這些物質(zhì)以及上述列舉的其它合適的孔形成物，聚氧乙烯脫水山梨糖醇(商業(yè)上公知為吐溫20、40或80)、壬基苯氧基-聚乙氧基乙醇(NP-40)、以及t-辛基-苯氧基乙氧基乙醇，具有高HLB(親水-親脂平衡)值，必須使用足夠低的濃度以最小化不期望的細(xì)胞組分溶解和膜溶解。當(dāng)使用包含約10％皂角苷配基的皂角苷時(shí)，滲透劑化合物的濃度范圍是大約0.01-0.5％(w/v)。優(yōu)選的滲透劑化合物是皂角苷(Sigma目錄號(hào)S-7900)。其它來源和更高純度的皂角苷也可以使用，例如大約20-25％皂角苷配基純度的皂角苷(SigmaS-4521)以及高度純化的大約99％純度的皂角苷QS-21，其購(gòu)自Aquila Biopharmaceuticals，F(xiàn)ramingham，MA。其它可使用的化合物是α-七葉皂角苷和β-七葉皂角苷(Sigma E-1378)，二者均來自七葉樹。滲透劑化合物可存在于組合物中，例如磷酸緩沖液，還包含抗菌劑如疊氮化鈉、Proclin 300(Rohm & Haas，Philadelphia，PA)、以及類似物。另一種優(yōu)選的滲透劑是ImmunipermTM，它單獨(dú)釋放大約50％的胞質(zhì)RNA(細(xì)胞中所有RNA的85％)而對(duì)細(xì)胞核或線粒體核苷酸池沒有影響。剩余50％的細(xì)胞總RNA和固定細(xì)胞中的所有DNA可用包含SDS、蛋白酶以及甲醛清除劑的釋放性混合物進(jìn)行釋放，該混合物構(gòu)成本發(fā)明的具體實(shí)施方式
之一。盡管單獨(dú)的混合物組分的確切作用模式是未知的，不過可以推測(cè)SDS用來溶解交聯(lián)于結(jié)構(gòu)性胞內(nèi)蛋白的胞內(nèi)RNA和DNA，這樣就使得甲醛交聯(lián)的核酸更有效的進(jìn)行蛋白質(zhì)水解并釋放。新的甲醛清除劑例示但不限于羥胺、羧甲氧基胺、肼、乙酰肼和其它酰肼、或者肼衍生物、以及胺如tris，發(fā)現(xiàn)它們?cè)黾恿酸尫诺暮怂岬臄?shù)量和“質(zhì)量”，這里的質(zhì)量是通過增加的擴(kuò)增率和產(chǎn)量而測(cè)定的。由Immuniperm和釋放性混合物釋放的兩個(gè)部分可以各自分析或者在分析前合并。
因此，加入或不加入甲醛清除劑的任何表面活性劑或蛋白酶(或者它們的結(jié)合)都將包括在本發(fā)明的范圍之中，所述的甲醛清除劑能夠釋放胞內(nèi)核苷酸并維持合適的形態(tài)用于共同的分析。
不象可能嚴(yán)重破碎細(xì)胞RNA的現(xiàn)有細(xì)胞固定和RNA回收方法，本發(fā)明能夠用滲透細(xì)胞膜同時(shí)保持細(xì)胞完整性的滲透劑如皂角苷處理細(xì)胞，并從中提取和分離超過90％的完整胞質(zhì)總RNA和mRNA。mRNA分離物還兼容于免疫磁學(xué)細(xì)胞富集和免疫熒光細(xì)胞標(biāo)記方法。細(xì)胞的全面RNA表達(dá)譜分析能夠用于直接證實(shí)、補(bǔ)充和擴(kuò)展表達(dá)譜并增加由此獲得的信息，所述的分析是通過細(xì)胞分析平臺(tái)進(jìn)行鑒別和表征的，例如采用T7、SP6、或T3啟動(dòng)子的基于RNA聚合酶啟動(dòng)子的線性擴(kuò)增方法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、微陣列以及在Cell Spotter或CellTracks系統(tǒng)中(二者均由Immunicon Corp，PA制造)進(jìn)行。
盡管不限于特定的固定劑，被滲透的細(xì)胞用交聯(lián)劑處理以維持如上所述的形態(tài)、抗原和核苷酸完整性。Cyto-ChexTM、StabilCyteTM和TRANSfixTM是商業(yè)上提供的三種穩(wěn)定劑的例子，它們用于在延長(zhǎng)時(shí)間期限的血樣中穩(wěn)定血細(xì)胞。這些穩(wěn)定劑被優(yōu)化以維持細(xì)胞大小(主要是通過最低化皺縮)并保護(hù)細(xì)胞表面抗原，主要根據(jù)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行確定。打算的應(yīng)用一般涉及直接分析，不需要延長(zhǎng)樣品操作或者對(duì)特定細(xì)胞群的富集。相反，本發(fā)明中分離和檢測(cè)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞或其它稀有靶細(xì)胞，包括并且定義為極低頻率存在的病理異?；蛘呦∮屑?xì)胞，則需要在檢測(cè)前大量富集。
Cyto-ChexTTM穩(wěn)定劑可用作細(xì)胞穩(wěn)定劑以及，如本發(fā)明的應(yīng)用中所證明的，胞內(nèi)RNA的醛釋放固定劑，其導(dǎo)致與胞內(nèi)蛋白質(zhì)的大分子復(fù)合物的形成。我們意外地發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選用甲醛供體如CytochexTM進(jìn)行的固定對(duì)于在隨后的樣品加工中保持和保護(hù)RNA是必要的，完整的功能性RNA的全部或最佳釋放需要皂角苷與上述的釋放性混合物聯(lián)合使用。
理想的“穩(wěn)定劑”或“保護(hù)劑”(這里可交換使用)定義為這樣的成分，它能夠快速保護(hù)生物樣品中存在的相關(guān)靶細(xì)胞，同時(shí)在生物樣品中使形成干擾性聚集體和/或細(xì)胞碎片最小化，這些聚集體或碎片在任何情況下都可能阻礙靶細(xì)胞的分離、檢測(cè)和計(jì)數(shù)以及它們與非靶細(xì)胞的區(qū)別。換句話說，當(dāng)與抗凝劑組合時(shí)，穩(wěn)定劑不應(yīng)該阻礙抗凝劑的性能。反過來，抗凝劑也不應(yīng)該干擾穩(wěn)定劑的性能。此外，公開的穩(wěn)定劑還起固定從而穩(wěn)定滲透細(xì)胞的第三功能，其中表達(dá)方式“被滲透的”或“滲透”以及“固定”、“被固定的”或“固定化”按照細(xì)胞生物學(xué)中通常定義的使用。這里穩(wěn)定劑的描述意味著以適當(dāng)?shù)臐舛然驍?shù)量使用這些試劑，這對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)人員來說將是非常顯而易見的，這里的濃度或數(shù)量對(duì)穩(wěn)定靶細(xì)胞是有效的而不引起損傷。為保護(hù)稀有細(xì)胞的目的而使用本發(fā)明的組合物、方法以及裝置的人顯然不會(huì)以損傷或破壞這些稀有細(xì)胞的方式使用它們，并因此將自然選擇適當(dāng)?shù)臐舛然驍?shù)量。例如，甲醛供體咪唑烷基脲被發(fā)現(xiàn)有效的優(yōu)選濃度是0.1-10％，更優(yōu)選0.5-5％以及最優(yōu)選大約1-3％的所述樣品體積。另外的試劑例如聚乙二醇也發(fā)現(xiàn)能有效穩(wěn)定細(xì)胞，加入的優(yōu)選濃度是大約0.1％-5％。使用這樣的試劑公開于PCT/US02/26867，在此引入作為參考。
本發(fā)明令人驚奇的方面是，作為大分子復(fù)合物一部分的胞內(nèi)RNA能夠回收擴(kuò)增，并與以前用細(xì)胞穩(wěn)定劑和固定劑處理的細(xì)胞有幾乎等量的產(chǎn)量。交聯(lián)RNA的完全釋放需要在溶胞去污劑和甲醛清除劑存在時(shí)皂角苷與酶消化的結(jié)合。例如，經(jīng)Cyto-ChexTM處理的細(xì)胞通過蛋白酶K、V8蛋白酶、鏈霉蛋白酶消化可得到完全回收或者包括全長(zhǎng)可分析的RNA。本發(fā)明公開的甲醛清除劑的存在被發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步改善了RNA回收。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，靶細(xì)胞如循環(huán)癌細(xì)胞或胎兒細(xì)胞可如此分析，通過將它們與非靶細(xì)胞有效分離、純化它們的核酸、然后擴(kuò)增相關(guān)的靶用于微陣列分析。
因此，胞質(zhì)生物分子的分離可以首先通過離心或免疫磁珠富集將被滲透的細(xì)胞與滲透劑化合物分開而進(jìn)行。然后胞質(zhì)生物分子混合物就存在于上清中了。胞質(zhì)生物分子的分離可以通過用磁珠捕獲而實(shí)現(xiàn)。例如，如果胞質(zhì)生物分子是mRNA，寡聚(dT)附著的磁珠或非磁性載體可用來捕獲從而從細(xì)胞分離mRNA，進(jìn)行離心或者不進(jìn)行離心。如果胞質(zhì)生物分子是蛋白質(zhì)，就可以使用能夠結(jié)合特定蛋白質(zhì)的抗體，其中抗體可被附著到磁珠或非磁性載體上。其它分離技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，諸如標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)和RNA化學(xué)提取、電泳、層析、免疫分離以及親和技術(shù)。用于分離細(xì)胞和生物分子的免疫磁學(xué)富集試劑和裝置由幾家制造商提供，包括但不限于Immunicon Corp.(Huntingdon Valley，PA)、Dynal(New Hyde Park，NY)以及MiltenyiBiotec Inc.(Auburn，CA)。細(xì)胞可以是原核細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞，或者是真核細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選的是人源細(xì)胞。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞是癌或腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選相關(guān)的癌包括但不限于那些源自乳腺、前列腺、肺、結(jié)腸、以及卵巢組織的癌，以及類似物，如在組織切片或體液中發(fā)現(xiàn)的，例如在血液和骨髓中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
公開了用于制備在完全同樣的樣品上連續(xù)進(jìn)行胞質(zhì)和/或完整細(xì)胞生物分子分析以及膜生物分子分析的細(xì)胞的方法，共同定義為分別分析核酸或蛋白質(zhì)的功能性基因組或者功能性蛋白質(zhì)組。如上所述，這樣的分析在本發(fā)明的方法之前還不可能在同一細(xì)胞上進(jìn)行。如上所述，將細(xì)胞與滲透劑化合物接觸以釋放胞質(zhì)生物分子而不改變結(jié)構(gòu)生物分子和膜生物分子。
正如本發(fā)明中所公開的，分析細(xì)胞樣品的胞質(zhì)生物分子和分析同一細(xì)胞樣品的膜生物分子的方法是如上所述提供的，在細(xì)胞與滲透劑化合物接觸、穩(wěn)定并回收胞質(zhì)生物分子之后進(jìn)行。胞質(zhì)生物分子可以與相關(guān)生物分子同時(shí)或依次進(jìn)行分離和分析。
本發(fā)明還提供了用于分離胞液或全部細(xì)胞RNA特別是mRNA的試劑和試劑盒。該試劑盒包含滲透劑化合物和RNA提取試劑或者用于RNA分離和檢測(cè)的雜交探針，例如寡聚(dT)或者基因特異性序列或者不同長(zhǎng)度的隨機(jī)(變性)寡核苷酸。該試劑盒還可包含與細(xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合的抗體，例如結(jié)合膜生物分子的抗體?？贵w和探針可被酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、或者放射性標(biāo)記以能夠檢測(cè)?？贵w和探針還可附著到例如磁珠或類似物上以方便分離。
分析胞質(zhì)生物分子分析包括涉及細(xì)胞胞質(zhì)分離的生物分子的任何類型的分析。胞質(zhì)生物分子分析進(jìn)一步包括但不限于功能性基因組表達(dá)譜、其包括但不限于mRNA譜、蛋白質(zhì)表達(dá)譜、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、Northern印跡、Western印跡、核苷酸或氨基酸序列分析、基因表達(dá)連續(xù)分析SAGE、競(jìng)爭(zhēng)性基因組雜交(CGH)、電泳、2-D電泳、MALDI或SELDI質(zhì)譜、氣相色譜、液相色譜、核磁共振、紅外光譜、原子吸收、以及類似方法。在核苷酸或氨基酸水平的序列分析能夠顯示和鑒別蛋白質(zhì)、DNA/cDNA或者mRNA序列的突變。例如，初始基因或蛋白質(zhì)譜分析可以顯示轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中癌基因的存在。適當(dāng)癌癥治療后的再次分析可以顯示出緩解期間更低的腫瘤癥狀，或者顯示為惡化，后者是癌基因進(jìn)一步突變以及藥物抗性或者更厲害的腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生導(dǎo)致的結(jié)果。
膜生物分子分析包括涉及結(jié)合到細(xì)胞中細(xì)胞膜上的生物分子的任何類型的分析，所述生物分子就是胞外和胞內(nèi)生物分子或標(biāo)記物。合適的分析方法包括但不限于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、形態(tài)染色、細(xì)胞分類、以及類似方法。被滲透的細(xì)胞可以通過例如基于特定可檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的熒光活化細(xì)胞分類(FACS)技術(shù)進(jìn)行分類。細(xì)胞分類技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并已經(jīng)用于簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)可檢測(cè)的標(biāo)記細(xì)胞，例如在癌癥診斷中。被滲透的細(xì)胞也可以在特殊蛋白質(zhì)表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)行分類，例如CD4或CD8細(xì)胞。膜生物分子分析也可在下游膜組分上進(jìn)行，然后進(jìn)行下述的分析，包括但不限于蛋白質(zhì)表達(dá)譜、Western印跡、氨基酸序列分析、質(zhì)譜、氣相色譜、液相色譜、核磁共振、紅外光譜、原子吸收、表面血漿共振(SPR)以及適于分析膜組分的任何其它技術(shù)。
功能性基因組分析或測(cè)定可以在保留于滲透細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)上進(jìn)行。例如基因組DNA、細(xì)胞核RNA(hnRNA)、線粒體RNA(mtRNA)和任何其它RNA、或者細(xì)胞器含有的DNA可以進(jìn)行分析，它們?cè)诩?xì)胞滲透時(shí)仍然結(jié)合或固定在細(xì)胞中。這樣，上述用于胞質(zhì)生物分子的分析類型可以用于進(jìn)行基因組DNA、hnRNA和mtRNA的分析，使用的方法或分析法包括但不限于原位雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、差別顯示PCR、任意引物PCR、微衛(wèi)星分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、競(jìng)爭(zhēng)性基因組雜交(CGH)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、細(xì)胞核和線粒體連綴轉(zhuǎn)錄分析、以及體外蛋白質(zhì)翻譯分析。然而，為獲得基因組DNA、細(xì)胞核hnRNA和線粒體mtRNA，滲透細(xì)胞必須或者暴露于本發(fā)明的釋放性混合物進(jìn)行完全溶胞、或者進(jìn)一步通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)手段進(jìn)行分級(jí)分離。對(duì)于穩(wěn)定性細(xì)胞，蛋白酶和親核試劑的組合可用于逆轉(zhuǎn)并去除包含了感興趣核酸的大分子復(fù)合物，從而釋放RNA和DNA核酸組分。此外，滲透時(shí)保留的細(xì)胞器可隨后進(jìn)一步分級(jí)分離，用于例如線粒體和類似物的代謝功能性分析。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
提供了從胞液RNA分離細(xì)胞核或線粒體遺傳物質(zhì)的方法。包含細(xì)胞核或線粒體遺傳物質(zhì)以及胞液RNA的細(xì)胞與滲透劑化合物如上所述進(jìn)行接觸。細(xì)胞核或線粒體遺傳物質(zhì)可通過例如隨后的合適亞細(xì)胞分級(jí)分離以及分級(jí)分離的細(xì)胞物質(zhì)的完全細(xì)胞/細(xì)胞器溶解而進(jìn)行分離。所得的細(xì)胞器特異性組分(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物等)可以從勻漿中提取或分離，并進(jìn)行分析。也可以使用細(xì)胞器特異的免疫磁珠，如上所述進(jìn)行分離。
本發(fā)明還產(chǎn)生了幾個(gè)重要的實(shí)用的自動(dòng)化優(yōu)點(diǎn)。例如，在滲透溶液從細(xì)胞中去除后，mRNA可用寡聚(dT)-磁珠進(jìn)行捕獲，這理想地適于類似于微陣列的下游自動(dòng)化操作和全面分析。此外，僅僅需要稍微改變通用的mRNA分析程序就可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)和mRNA圖譜，因而減少了時(shí)間和試劑需求。而且，細(xì)胞核和線粒體中的相應(yīng)完整的細(xì)胞基因組DNA仍然包含在滲透細(xì)胞中并且容易取得，能夠通過常規(guī)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)方法進(jìn)行下游分析，例如FISH、NP、SAGE、DD-PCR、PCR、RFLP、RT-PCR、CGH、cDNA微陣列、質(zhì)譜以及蛋白質(zhì)陣列等。對(duì)DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物以及(它們的前體、代謝物和輔助因子)的多組分同時(shí)分析策略，例如在大型微陣列上，可以廣泛應(yīng)用于任何真核細(xì)胞、組織樣品或體液。通過多細(xì)胞組分或者與多元(例如微陣列)分析結(jié)合而得的這種類型的細(xì)胞表達(dá)譜在從藥物候選物的高通量篩選到疾病診斷和管理的技術(shù)中是極其重要的目標(biāo)。
本發(fā)明還提供了用于分離胞液或全部細(xì)胞RNA特別是mRNA的試劑和試劑盒。該試劑盒可以包含滲透劑化合物和RNA提取試劑或者用于RNA分離和檢測(cè)的雜交探針，例如寡聚(dT)或者基因特異性序列或者不同長(zhǎng)度的隨機(jī)(變性)寡核苷酸。該試劑盒還可包含與細(xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合的抗體，例如結(jié)合膜生物分子的抗體。抗體和探針可被酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、或者放射性標(biāo)記以能夠檢測(cè)?？贵w和探針還可附著到例如磁珠或類似物上以方便分離。
然后對(duì)完整文庫(kù)探查任何涉及識(shí)別上皮細(xì)胞存在和/或確定這些上皮細(xì)胞來源組織存在的信息。為此，樣品中存在的所有mRNA都必須對(duì)相關(guān)的每個(gè)特殊基因進(jìn)行分析，每個(gè)都具有彼此相同的敏感性/選擇性并具有能夠在同一時(shí)間觀察所有mRNA的能力。
在上述標(biāo)準(zhǔn)下，采用微陣列的所有基因表達(dá)分析將對(duì)稀有事件不敏感。特別是，樣品的信噪比將很低，因?yàn)樵谌魏翁囟ǖ母患瘶悠分写嬖谂c白細(xì)胞免疫磁學(xué)攜帶的污染同樣的問題。例如在通過免疫磁學(xué)選擇富集了一種特定靶細(xì)胞群的流體樣品中，潛在地可能大約10,000個(gè)白細(xì)胞帶有1到10個(gè)靶細(xì)胞群。靶細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)稀有事件將被白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核苷酸所掩蓋。過量白細(xì)胞來源的背景RNA干擾與靶mRNA的相當(dāng)稀有的拷貝水平相結(jié)合，導(dǎo)致了可能檢測(cè)不到的潛在信號(hào)。
為避免這個(gè)問題，總RNA(或者純化的mRNA)采用基于SP6、T3、或T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的體外線性預(yù)擴(kuò)增方法進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。一個(gè)典型的例子是T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)、啟動(dòng)子(T7 RNAPP)以及酶擴(kuò)增體系，但是任何等價(jià)體系都可被本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的體系代替。對(duì)所有信息的線性預(yù)擴(kuò)增將初始mRNA庫(kù)展示增加至少1000倍，而RNA群體中各個(gè)mRNA序列的相對(duì)豐度是最小限度失真的。同樣的預(yù)擴(kuò)增方法也已知為轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增、線性擴(kuò)增或者體外擴(kuò)增。因此，完整mRNA庫(kù)的1000倍線性預(yù)擴(kuò)增正是本發(fā)明具體實(shí)施方式
的特別特征之一。單鏈mRNA在包含寡核苷酸的T7啟動(dòng)子的寡聚(dT)部分進(jìn)行多聚A尾巴的退火。RNA聚合酶產(chǎn)生了完整mRNA庫(kù)(aRNA)的反義拷貝。這樣總體來說，在完整庫(kù)中具有多聚A尾巴的mRNA拷貝的數(shù)量至少有1000倍的增加，以及與之相關(guān)聯(lián)的任何特定mRNA序列類型的敏感性增加1000倍。
例如，T7啟動(dòng)子寡核苷酸引物，其用作第一鏈RT引物和隨后的T7 RNAP擴(kuò)增引物，由具有3′-寡聚(dT)部分的67個(gè)堿基組成，包含5′-T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，具有如下的堿基對(duì)順序(5′-TCTAGTCGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCG(T)21-3′)。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)是這樣完成的，首先通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后通過隨機(jī)引物DNA聚合酶依賴的第二鏈合成，最后用T7RNAP進(jìn)行過夜保溫。隨后，該全部反應(yīng)混合物的一部分用在PCR反應(yīng)分析中，其產(chǎn)生特定的單一條帶擴(kuò)增子，具有合適設(shè)計(jì)的相關(guān)基因特異性引物(GSP′s)，或者可以選擇任何其它合適的RNA分析方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員所公認(rèn)的是，基因特異性引物的設(shè)計(jì)和合成將依賴于特定的待擴(kuò)增靶序列，并能夠通過本領(lǐng)域已知和接受的任何方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。例如，基因特異性引物使用NCBI(國(guó)家生物技術(shù)信息中心)BLASTS(基本局部排序檢索工具)軟件和GenBank人類cDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物優(yōu)化退火溫度為大約55℃到65℃，顯示出僅從復(fù)合mRNA庫(kù)產(chǎn)生無(wú)DNA的RT-PCR依賴性單一條帶，這公知為對(duì)特定mRNA是陽(yáng)性的。復(fù)合mRNA庫(kù)經(jīng)常提取自正常的和患癌癥的人類組織以及體外細(xì)胞系。設(shè)計(jì)的引物產(chǎn)生期望的靶序列特異性PCR條帶，它們都經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以同已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)比較。使用凝膠分析軟件上確定的Rf值完成計(jì)算。擴(kuò)增子序列可進(jìn)一步通過直接測(cè)序、印跡探測(cè)、限制性酶切圖譜等進(jìn)行序列驗(yàn)證。
為避免如上所述的cDNA陣列分析所固有的信噪比(S/N)局限，發(fā)展了一種新修正的RNA聚合酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的線性擴(kuò)增策略。可選擇地，單管即在單個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行的基于cDNA多基因特異性逆轉(zhuǎn)錄的通用PCR擴(kuò)增的多基因RT-PCR分析體系可充分減少背景干擾。這兩種信噪比改進(jìn)是本發(fā)明包括的特定組成。
預(yù)擴(kuò)增庫(kù)的第二鏈合成僅僅在被選擇的區(qū)域進(jìn)行，可以在單個(gè)樣品中包括1到1000個(gè)相關(guān)獨(dú)立區(qū)域，而仍然保持初始庫(kù)的100％敏感性。第二鏈合成通過僅僅選擇性擴(kuò)增那些相關(guān)基因而完成。因此，用于第二鏈合成的基因特異性引物(GSP)設(shè)計(jì)為僅僅包括相關(guān)區(qū)域。所述區(qū)域包括但不限于例如前列腺特異性抗原(PSA)、PSM、CK19、EpCam、AR、HPN、F6、乳球蛋白、和/或所有的細(xì)胞角蛋白。GSP設(shè)計(jì)為在它們的末端添加通用引物。
與現(xiàn)有技術(shù)中第一鏈合成使用基因特異性引物組進(jìn)行相比，本發(fā)明的新方面的一部分是將基因特異性引物僅僅用于第二鏈合成，而不使用CAPswitchTM寡核苷酸(美國(guó)專利No.6,352,829)?，F(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)，基因特異性引物設(shè)計(jì)為在它們的5′端添加任意的錨定序列，包括CAPswitch寡核苷酸。所以會(huì)驚訝于本發(fā)明披露于此的是，引物通用部分并不包括CAPswitch部分。
基因特異性引物的長(zhǎng)度典型地在大約15到30個(gè)核苷酸的范圍，而通用引物部分典型地長(zhǎng)為大約15個(gè)。
小部分T7擴(kuò)增的反義RNA(aRNA)庫(kù)的逆轉(zhuǎn)錄通過使用本領(lǐng)域已知的循環(huán)條件進(jìn)行。所有的RTPCR結(jié)果首先在包含溴乙啶的2％瓊脂糖凝膠上根據(jù)本領(lǐng)域已知的程序進(jìn)行初步分析。
在擴(kuò)增的aRNA庫(kù)所選擇部分進(jìn)行擴(kuò)增后，以陣列方式或者通過本領(lǐng)域已知的任何電泳方式對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。
除了如上所述的預(yù)擴(kuò)增后的第二鏈擴(kuò)增，通用PCR多基因擴(kuò)增可以在單一管中完成，加入基因特異性引物組(P1)用于同時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，同時(shí)結(jié)合適當(dāng)?shù)姆聪蛞锝M(P2)進(jìn)行同時(shí)的第二鏈合成。它們共同定義了兩個(gè)(α和β)末端并形成了完整的等同于相關(guān)GSP多基因的基因特異性擴(kuò)增子組。用于兩種基因特異性第一鏈和第二鏈合成的GSP1和GSP2引發(fā)是使用適當(dāng)?shù)拿冈诟叨纫?靶退火特性條件下進(jìn)行的，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。獲得合適引物特異性的其它標(biāo)準(zhǔn)和方法可以通過使用來自天然重組細(xì)胞修復(fù)機(jī)制例如recA的蛋白質(zhì)而實(shí)現(xiàn)。這些修復(fù)體系的合適體外應(yīng)用能夠形成更好的、甚至絕對(duì)的引物模板特異性。模板標(biāo)準(zhǔn)是mRNA、或mRNAcDNA異源雙鏈核酸、或者雙鏈的雙股cDNA。此外，利用細(xì)胞的天然修復(fù)機(jī)制這一創(chuàng)新性思想，正如本申請(qǐng)中所述的，可以應(yīng)用到其它基因特異性引物方法，例如下面所述的一種，用于改變信噪比的GSP-RT亞組使得能夠在稀有細(xì)胞事件上進(jìn)行cDNA陣列分析。任何一種GSP多基因PCR引物組的每種P1和P2引物都包含5′末端的通用引物序列，它們是所有基因特異性P1和P2共有的(或者僅是P1的，而所有P2共有不同的通用序列)。為了在第二鏈合成后控制不期望的副反應(yīng)和競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，所有的GSP1和2都要從欲得到的雙鏈cDNA擴(kuò)增子組中去除，以消除它們對(duì)下游程序的非特異性影響。許多策略對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是可能的，例如由Sephadex和Centricon等提供的基于分子大小的排阻，層析，固相載體選擇性附著，單鏈特異性DNase(Mung Bean，S1等)引物序列特異性策略，例如尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)與由脫氧尿苷(U)代替胸苷(T)而合成的DNA寡核苷酸引物的結(jié)合?？蛇x擇地，RNA-DNA寡聚引物雜合體可用于代替DNA-尿嘧啶，類似地可在第一和/或第二鏈合成后通過不含DNase的RNase處理而去除。包含尿嘧啶的DNA-引物與UNG降解的PCR整合的結(jié)合提供了一種去除不期望的復(fù)雜引物交互作用的有效方法。該UNG降解策略將產(chǎn)生短得多的寡聚物，它們不能夠在所選擇的PCR退火溫度下進(jìn)行退火。經(jīng)UNG處理后，cDNA模板混合物也可能受益于不含DNase的RNase處理以去除所有不期望的可能由高復(fù)雜性RNA引起的副反應(yīng)。在UNG處理后(可選擇使用RNase處理以去除所有RNA)，唯一剩下的核酸是雜交的第1鏈與互補(bǔ)的第2鏈形成的dsDNA雙鏈，其構(gòu)成了現(xiàn)在的樣品可取得的PCR模板。下一步，加入不含UMP的通用引物(至多1或2)重復(fù)PCR。凈效果就是用一種或2種PCR兼容的高效率引物捕獲任何期望的mRNA(或不含RT的DNA)序列組，使得能夠在單一管中進(jìn)行定量RT-PCR多基因同時(shí)擴(kuò)增和隨后的分析。由于引物是通用的，它們以完全同樣的效率引發(fā)每種GSP擴(kuò)增子，排除了混雜多元GSP引物的性能問題。具有一板或一組擴(kuò)增子的每種GSP定義的擴(kuò)增子可具有不同的預(yù)定片段大小，使得每種GSP序列都能夠在基于大小的分析體系中通過其獨(dú)特Rf值進(jìn)行分離和鑒別，所述體系是例如垂直和水平PAGE以及瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、SELDI、MALDI、cDNA陣列等。這樣，快速的多基因RNA/DNA板可應(yīng)用于快速探查用于不同系列的診斷治療和監(jiān)視的大量樣品。該方法可以在進(jìn)行或不進(jìn)行mRNA庫(kù)預(yù)擴(kuò)增的情況下，在單一反應(yīng)管中獲得單獨(dú)的mRNA樣品的多基因分析。不進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增就只能允許對(duì)一個(gè)樣品的一板基因進(jìn)行一次測(cè)定分析。預(yù)擴(kuò)增增加了可以對(duì)單個(gè)樣品進(jìn)行多達(dá)1000次不同測(cè)定的分析的優(yōu)點(diǎn)，這樣許多不同的基因板就能夠在不同的時(shí)間在一個(gè)樣品上進(jìn)行探查。盡管不限于任何特定方法，通過cDNA陣列或毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)進(jìn)行的通用PCR板分析是優(yōu)選的方法。
因此，區(qū)分本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵特征就是通過選擇性預(yù)擴(kuò)增稀有靶mRNA樣本而改善了信噪比，使得該方法在現(xiàn)有的多元mRNA分析上有了新的進(jìn)展。已知的多元分析體系例如多元RT-PCR可充分改變信噪比，然而設(shè)計(jì)和優(yōu)化有意義的多元體系的困難使得它們一般是不實(shí)用的，特別是用在一個(gè)反應(yīng)器中有兩個(gè)以上的目標(biāo)亞組時(shí)。
本發(fā)明還利用高信噪比改善來選擇代表性的轉(zhuǎn)錄本，在一個(gè)反應(yīng)管中擴(kuò)增待檢測(cè)的完整靶序列組。
因此，盡管本發(fā)明不限于下面的特定用途，代表性的基因特異性引物組可用來產(chǎn)生已知疾病狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的靶基因亞組。代表性的組將包括至少兩種不同的標(biāo)志感興趣疾病狀態(tài)的靶基因。對(duì)每個(gè)反應(yīng)瓶來說，基因特異性引物組的數(shù)目將由疾病狀態(tài)和已知的可定義疾病狀態(tài)的特征來確定。
下面的實(shí)施例用來例證性說明所公開的發(fā)明的實(shí)用性并證明本發(fā)明對(duì)診斷技術(shù)的影響。這些實(shí)施例不打算限定發(fā)明的范圍。此外，本文引用或描述的每份專利、專利申請(qǐng)和出版物的公開都是全文引入作為參考。在全部的這些實(shí)施例中，分子克隆反應(yīng)、以及其它標(biāo)準(zhǔn)重組分子生物學(xué)技術(shù)都是根據(jù)下面出版物描述的方法進(jìn)行的Maniatis等，《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第2版，冷泉港出版社(1989)(下文中稱為“Maniatis等”)，以及《現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊(cè)》，Wiley，2002，使用商品化可購(gòu)買的試劑，除非另外指出。
實(shí)施例1胞質(zhì)RNA的分離發(fā)現(xiàn)獲自鐵磁流體選擇的未固定細(xì)胞的上清中包含超過80％的細(xì)胞總RNA留在細(xì)胞胞質(zhì)中，所述的未固定細(xì)胞用Immuniperm、包含0.05％皂角苷和0.1％疊氮化鈉的磷酸緩沖液滲透。從該上清分離的RNA沒有顯示出如天然和變性瓊脂糖凝膠電泳以及溴乙碇染色判定的降解證據(jù)。意外地發(fā)現(xiàn)該上清包含完整的或未降解的全長(zhǎng)形式RNA，從而提供了還可用于形態(tài)分析的同樣細(xì)胞的mRNA圖譜，而這些上清液通常在鐵磁流體選擇細(xì)胞的胞內(nèi)染色后是被丟棄的。圖2圖解說明了這些發(fā)現(xiàn)，表明總RNA釋放的發(fā)生少于一分鐘，而大約95％的胞質(zhì)總RNA可以容易地可重復(fù)地分離。
對(duì)比之下，使用常規(guī)方法即使用商業(yè)可獲得的基于苯酚的RNA溶胞緩沖液TrizolReagent(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，目錄號(hào)10296)從乳腺癌細(xì)胞系SKBR3分離的RNA將完全溶解和勻漿全部細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而也導(dǎo)致了基因組和線粒體DNA、以及胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核RNA的釋放。來自用EpCAM鐵磁流體選擇的SKBR3細(xì)胞進(jìn)行Immuniperm(皂角苷)處理(詳細(xì)步驟見實(shí)施例2)的細(xì)胞沉淀進(jìn)行的檢測(cè)表明存在幾乎100％的基因組和線粒體DNA，以及細(xì)胞核和線粒體RNA，后者總計(jì)占可望來自同樣數(shù)量非滲透完整細(xì)胞的總細(xì)胞RNA的大約15-20％。大約95％的期望胞質(zhì)RNA從Immuniperm上清層中被回收。
如圖3所示，包含大約250,000個(gè)乳腺癌細(xì)胞系SKBR3細(xì)胞的兩支相同的管首先經(jīng)免疫磁學(xué)富集，然后在不存在(僅有PBS)和存在Immuniperm(+IP)的情況下室溫孵育15分鐘。經(jīng)Immuniperm處理的滲透細(xì)胞隨后通過在800×g RCF的速度離心5分鐘而作為可見的滲透細(xì)胞沉淀被分離。包含所有胞質(zhì)可溶性組分的Immuniperm上清部分被轉(zhuǎn)移到第二管中。分離自全部未處理細(xì)胞的RNA、Immuniperm處理的滲透細(xì)胞沉淀以及Immuniperm處理的細(xì)胞上清部分使用RNeasy(QiagenInc.，Valencia，CA)二氧化硅結(jié)合方法進(jìn)行分離。這些總RNA部分隨后用DNase處理以去除微量DNA。DNase處理的RNA部分的分光光度定量產(chǎn)生平均20皮克的總RNA/細(xì)胞(全部細(xì)胞)(＝100％)，4皮克總RNA/來自沉淀部分的滲透細(xì)胞(20％)，以及16皮克總RNA/來自上清部分的細(xì)胞(80％)。來自這三種DNase處理的總RNA部分的相當(dāng)2.5×104個(gè)細(xì)胞的群體被隨后進(jìn)行甲酰胺變性和通過1％瓊脂糖凝膠然后以溴乙碇染色的電泳，如圖3所示。通過瓊脂糖凝膠光密度分析的定量與分光光度法分析的回收值一致。圖3的凝膠圖還顯示rRNA是全長(zhǎng)的并具有高度完整性，這是由4.4kb ssRNA同28SrRNA條帶共遷移與2kb ssRNA標(biāo)準(zhǔn)同18S rRNA條帶共遷移的相對(duì)比率證明?？傮w來說，所觀察到的28S rRNA與18S rRNA為2的相對(duì)比率是mRNA完整性的一個(gè)極好的標(biāo)志，這一點(diǎn)也通過如圖4所示的Northern印跡該凝膠并用寡聚(dT)探查而證明?？俁NA來自細(xì)胞核的百分比的文獻(xiàn)值范圍在15到25％。Immuniperm處理的細(xì)胞部分包含20％的RNA，因而是與公開的細(xì)胞核分布一致的。
總之，基于Immuniperm的滲透意外地顯示出細(xì)胞核和胞質(zhì)總RNA的完全分離，將近100％的胞液總RNA可容易地從Immuniperm處理的未固定細(xì)胞的上清中回收。而且，驚奇地發(fā)現(xiàn)總RNA的細(xì)胞核部分在經(jīng)Immuniperm處理后所得的滲透細(xì)胞結(jié)構(gòu)中保持完整。
使用多聚A尾巴雜交，將來自兩種Immuniperm細(xì)胞組分的RNA的mRNA部分對(duì)全細(xì)胞進(jìn)行分析，通過將示于圖3的變性RNA的Northern印跡轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍濾紙上。寡聚(dT)25-mer探針用35P進(jìn)行標(biāo)記，然后將多聚核苷酸激酶雜交到Northern印跡上。包含多聚A尾巴的單鏈RNA分子量梯度用作標(biāo)準(zhǔn)，使得能夠形成mRNA相對(duì)定性大小的分子量條帶梯度。圖4的寡聚(dT)雜交結(jié)果顯示，沒有觀察到三種樣品的mRNA庫(kù)之間大小范圍的明顯差別。
來自全細(xì)胞mRNA庫(kù)的完整mRNA印跡區(qū)(即完整的dT雜交信號(hào)區(qū))的比較定量磷光圖譜分析幾乎等于Immuniperm處理的滲透細(xì)胞沉淀(細(xì)胞核部分)加上源自Immuniperm的胞液部分的總和。進(jìn)一步地，由磷光圖譜確定的來自dT-探針信號(hào)的mRNA的細(xì)胞部分百分比等于由瓊脂糖凝膠圖譜光密度分析確定的28S/18S rRNA的百分比。這些數(shù)據(jù)證明源自Immuniperm的胞液總RNA及其mRNA組分二者都是定量分離的，呈現(xiàn)出高度完整性，并且是全長(zhǎng)的。源自Immuniperm的mRNA的釋放不受轉(zhuǎn)錄本大小的限制，因?yàn)閹缀?00％的胞液mRNA都能夠從Immuniperm上清中獲取，rRNA 28S/18S的完整性是mRNA完整性完全保持的標(biāo)志。
將示于圖4的Northern印跡切下，用細(xì)胞核特異性前體rRNA探針再次探測(cè)。圖5顯示Immuniperm處理的細(xì)胞獲得了細(xì)胞核和胞液總RNA群的完全分離。這樣，核膜結(jié)構(gòu)在Immuniperm處理期間保持完整，細(xì)胞核保留了它所有的可溶性組分。
將示于圖5的Northern印跡切下，用線粒體特異性12S rRNA探針再次探測(cè)。示于圖6的結(jié)果證明Immuniperm處理的細(xì)胞獲得了線粒體和胞液總RNA群的完全分離。這樣，線粒體膜結(jié)構(gòu)在Immuniperm處理期間保持完整。
用于產(chǎn)生圖3-6圖譜的相同總RNA儲(chǔ)備液進(jìn)一步用來產(chǎn)生相等的量和特異性活性的32P-標(biāo)記的第一鏈cDNA庫(kù)。這三種標(biāo)記的第一鏈庫(kù)探針用于雜交以獲得分離的但同樣也是制備好的cDNA陣列點(diǎn)印跡圖，如圖7所示。此處的目的在于通過比較每張成像濾紙的每種cDNA雜交信號(hào)圖案的相對(duì)比例來估計(jì)每種Immuniperm來源的細(xì)胞組分的mRNA相對(duì)豐度。隨機(jī)選擇的模板上的cDNA基因陣列成分示于圖7。最上面一排的點(diǎn)是一系列持家基因，用縮寫命名為23kd＝23千道爾頓蛋白，a-tub＝α微管蛋白，b-act＝β肌動(dòng)蛋白，b2mic＝β-2-微球蛋白，phos＝磷脂酶A2。第二排命名為f6＝α-1-球蛋白，CD16＝簇決定子16，CD12，CD38，CD45，和CD31。底排包括普通上皮特異性基因，命名為g6-巨噬細(xì)胞抑制性細(xì)胞因子，CK8＝細(xì)胞角蛋白8，CK18＝細(xì)胞角蛋白18，CK19＝細(xì)胞角蛋白19，EpCam＝上皮細(xì)胞粘附分子，uPA＝尿激酶纖維蛋白溶酶原活化因子。每個(gè)部分的定性和定量熒光圖譜比較沒有顯示出陣列上基因的相對(duì)豐度有明顯差別。有趣的是，這些數(shù)據(jù)顯示完整細(xì)胞的相對(duì)mRNA豐度大概相當(dāng)于其胞液所占分?jǐn)?shù)，反過來胞液所占分?jǐn)?shù)相當(dāng)于其細(xì)胞核所占分?jǐn)?shù)，總RNA量可在大約細(xì)胞核的20％到胞液的80％之間變化。該cDNA陣列中的轉(zhuǎn)錄本的各自長(zhǎng)度在1到5kb之間變化，再次加強(qiáng)了Northern印跡的發(fā)現(xiàn)，即Immuniperm處理細(xì)胞的釋放中看不到大小偏差。圖7中同樣的相對(duì)表現(xiàn)模式也意外地證明了Immuniperm來源的mRNA是與傳統(tǒng)方法來源的完整細(xì)胞mRNA同樣有效的第一鏈合成的逆轉(zhuǎn)錄酶模板。
全部的這些數(shù)據(jù)顯示了意外的發(fā)現(xiàn)，Immuniperm來源的胞液RNA產(chǎn)生了大約80％量的完整勻漿細(xì)胞的全部細(xì)胞總RNA，基本上是所有胞液總RNA的＞95％，它們是全長(zhǎng)的，并且具有與由傳統(tǒng)的苯酚和二氧化硅提取方法分離的總RNA相同效率的逆轉(zhuǎn)錄。因此，與傳統(tǒng)的全細(xì)胞高質(zhì)量RNA分離方法相比，Immuniperm來源的胞液總RNA及其伴隨的異核RNA組分在所有常規(guī)下游RNA分析方法中是同樣有效的模板。
圖8顯示了通過用Immuniperm處理大約770個(gè)PC-3細(xì)胞而獲得的胞液RNA的凝膠圖譜。數(shù)據(jù)顯示來自低細(xì)胞數(shù)量的Immuniperm來源的胞液mRNA具有如圖3、4、5、6和7所證明的同樣比例的RNA。因此，Immuniperm介導(dǎo)的細(xì)胞釋放胞液RNA不是細(xì)胞數(shù)量依賴性的。
實(shí)施例2從外周血分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞從外周血分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和基因表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞分析，這可以如下進(jìn)行EDTA抗凝的血液(7.5ml)轉(zhuǎn)移到15ml的圓錐管中，加入6.5ml系統(tǒng)緩沖液(PBS，還包含0.05％的疊氮化鈉，目錄號(hào)#7001，Immunicon Corp.，Huntingdon Valley，PA)。將管子牢固蓋好，顛倒混合幾次。血液-緩沖液混合物在800×g的速度于室溫離心10分鐘。經(jīng)抽吸小心去除上清，注意不要攪動(dòng)淡黃色膜層?？梢粤粝乱恍┥锨逶诠苤?。吸出的上清抗原丟棄。向管中加入AB緩沖液(系統(tǒng)緩沖液，含作為可逆聚集試劑的抗生物素蛋白鏈菌素，Immunicon Corp.，Huntingdon Valley，PA)到終體積10ml。將管子蓋好，顛倒混合幾次。通過輕輕顛倒管子幾次懸浮VU/脫硫生物素EpCAM鐵磁流體微粒(結(jié)合到抗EpCAM單克隆抗體上的免疫磁學(xué)納米微粒，還綴合到脫硫生物素上用于抗生物素蛋白鏈菌素的生物素逆轉(zhuǎn)聚集，Immunicon Corp.，Huntingdon Valley，PA)。向AB緩沖液中的樣品加入100μl的VU/脫硫生物素EpCAM鐵磁流體，顛倒混合管子幾次。避免搖動(dòng)，以免產(chǎn)生泡沫。立即將管子插入到QMS17(目錄號(hào)#AS017，Immunicon Corp.，Huntingdon Valley，PA)磁力分離器，保持10分鐘。從分離器中取出管子，顛倒管子幾次重新懸浮管內(nèi)容物。再次將管子插入到QMS17磁力分離器中，保持10分鐘。從分離器中取出管子，顛倒管子幾次重新懸浮管內(nèi)容物。取下蓋子，將管子置于QMS17分離器中額外的20分鐘。將管子放在QMS17中，用巴斯德吸管小心吸取細(xì)胞-緩沖液混合物，將吸出的上清丟棄。然后立即將管子從分離器中取出，加入3ml系統(tǒng)緩沖液。短暫渦旋將磁選擇的細(xì)胞重懸浮。在渦旋過程中應(yīng)該升高液體以便頂部附近的細(xì)胞被沖洗下去。不蓋蓋子的管子再次置于QMS17分離器中10分鐘，用巴斯德吸管吸出上清。丟棄吸出的上清。在200μl還包含RNase抑制劑(RNase OUT，目錄號(hào)#10777019，Invitrogen，Rockville，MD)的Immuniperm/RNase抑制劑(滲透劑，Immunicon Corp.，Huntingdon Valley，PA)中渦旋重新懸浮磁選擇的細(xì)胞。在渦旋過程中應(yīng)該升高液體以便頂部附近的細(xì)胞被沖洗下去。可以加入抗體并渦旋混合，所述抗體為例如25μl體積的抗細(xì)胞角蛋白的單克隆抗體(C11-PE，0.25ug)(綴合到R-藻紅蛋白上的識(shí)別細(xì)胞角蛋白4、5、6、8、10、13、18的抗體混合物；ImmuniconCorp.，Huntingdon Valley，PA)和10μl的CD45 PerCP(Pan抗白細(xì)胞標(biāo)記，目錄號(hào)#347464，Becton Dickinson，San Jose，CA)或者任何其它合適的抗體。孵育15分鐘后，輕敲管底而輕輕攪動(dòng)樣品。將管子放回QMS17等待5分鐘。輕輕吸出上清，將Immuniperm-RNA部分轉(zhuǎn)移到適當(dāng)標(biāo)記的管子中。
實(shí)施例3對(duì)來自外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分析將來自實(shí)施例2的細(xì)胞重新懸浮在200μl的CellFix(PBS基緩沖液，包含作為解聚試劑和細(xì)胞防腐組分的生物素，Immunicon Corp.，Huntingdon Valley，PA)中，孵育5分鐘。將樣品轉(zhuǎn)移到12×75mm的流管中，混合300μl的PBS，然后加入核酸染料硫核黃素T(Sigma#T3516，10ul)和大約10ul的熒光珠(10,000個(gè)珠；Flow-SetFluorospheres，目錄號(hào)#6607007 Coulter，Miami，F(xiàn)L)。渦旋混合樣品。優(yōu)選地，熒光珠管在吸取珠之前渦旋混合。然后在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上分析樣品。
實(shí)施例4來自外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)分析使用寡聚(dT)標(biāo)記的磁珠(DynabeadsmRNADirectMicroKit，Dynal，產(chǎn)品號(hào)#610.21，New Hyde Park，NY)分離多聚(A)+的mRNA?？蛇x的，總RNA分離可以通過使用適于本領(lǐng)域技術(shù)人員的任何其它方法進(jìn)行，例如二氧化硅結(jié)合、聚合物結(jié)合、以及更常規(guī)的苯酚提取如Trizol試劑(GibcoBRL，目錄號(hào)#10296)。使用諸如DNase I(GibcoBRL)的DNase處理去除基因組DNA。制備由2∶1的10×DNase(1U/∶1)、1∶1的RNase抑制劑(cloned)、5∶1的dH2O和10∶1的RNA或?qū)φ?250ng基因組DNA)的酶混合物。該酶混合物在37℃保溫20分鐘。DNase處理的RNA經(jīng)寡聚(dT)標(biāo)記的磁珠或Trizol重新純化，重新懸浮于10∶1的不含RNase的水中。DNase酶的活性確定通過在2％瓊脂糖凝膠上電泳跑膠對(duì)照基因組DNA(+/-DNase處理)、用溴乙碇染色。
特定的mRNA序列的擴(kuò)增可以使用rTth(產(chǎn)熱性嗜熱菌)RT-PCR?？芍苽溆?0∶1的5x EZ緩沖液、1.5∶1的dATP、1.5∶1的dCTP、1.5∶1的dGTP、1.25∶1的dUTP、5∶1的Mn++(25mM)、2∶1的rTth(2.5U/∶1)、0.5∶1的UNG(1U/∶1)、12.25∶1的dH2O、2.25∶1的反義引物、以及2.25∶1的逆反義引物組成的主混合物來逆轉(zhuǎn)錄特定的mRNA種類。40∶1體積的主混合物加入到包含10∶1 DNase處理的RNA樣品以及相應(yīng)的含10∶1H2O的陰性對(duì)照管中。PCR熱循環(huán)如下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)50℃下2分鐘(PCR前)，62/65℃下30分鐘(PCR前)，95℃下1分鐘(PCR前)，94℃下15秒(PCR)，62/65℃下30秒(PCR)，以及62/65℃下7分鐘(PCR后)。熱循環(huán)完成后，立即將樣品管置于-20℃中2分鐘。完成后，將樣品管置于4℃中直到進(jìn)行凝膠分析為止。以20∶1的體積在2％瓊脂糖凝膠上跑膠，用溴乙碇染色。特定mRNA轉(zhuǎn)錄本的定性和定量基因表達(dá)測(cè)定通過使用UV透射儀和α-成像儀檢查凝膠圖譜進(jìn)行，來確定期望分子量的擴(kuò)增子的存在。
除了此處描述的那些，本發(fā)明的各種修正對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是在上述描述中顯而易見的。這樣的修正也打算落入所附的權(quán)利要求的范圍中。
實(shí)施例5來自外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)分離和分析從大約一百萬(wàn)個(gè)鐵磁流體選擇的SKBR3細(xì)胞獲得的上清除了包括實(shí)施例1到4中分析的核酸組分外，還包含被釋放的存在于細(xì)胞胞質(zhì)中的胞液蛋白質(zhì)，所述SKBR3細(xì)胞是用Immuniperm、含0.05％皂角苷和0.1％疊氮化鈉的磷酸緩沖液滲透過的。該上清溶液中的可溶性蛋白質(zhì)和留在細(xì)胞內(nèi)或者表面上的不溶性蛋白質(zhì)就因而提供了一種用來確定總蛋白質(zhì)表達(dá)譜或細(xì)胞的蛋白質(zhì)組圖譜以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的方法。
首先，確定由于用Immuniperm處理而從胞質(zhì)釋放的總胞液可溶性蛋白質(zhì)部分相對(duì)于從用NP-40處理的同樣細(xì)胞制品中釋放的蛋白質(zhì)總量的比例，所述的NP-40是一種表面活性劑，是從細(xì)胞釋放總胞液蛋白質(zhì)的優(yōu)選試劑。兩種處理過的細(xì)胞制品在以常規(guī)方法確定總可溶性蛋白質(zhì)之前經(jīng)離心或磁分離去除膜碎片，所述的常規(guī)方法是例如分光光度分析的Lowry和Bradford方法。
第二，兩份樣品制劑在4到20％的梯度SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，以便(a)確定源于Immuniperm的胞液蛋白質(zhì)的分子量截止點(diǎn)以及(b)比較兩種制品的蛋白質(zhì)條帶圖案和每條帶的蛋白質(zhì)相對(duì)量。
第三，試樣進(jìn)一步經(jīng)2D電泳和常規(guī)染色或者可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行分析，以提供兩種組分的蛋白質(zhì)大小和等電點(diǎn)的“指紋”信息，其基于可識(shí)別和未經(jīng)識(shí)別組分的定量和定性點(diǎn)圖案。得到的信息就產(chǎn)生了正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體的胞液和總蛋白質(zhì)部分中的相對(duì)和絕對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)圖案的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜。
實(shí)施例6基于基因特異性引物(GSP)RNA聚合酶的mRNA庫(kù)亞組擴(kuò)增使得能夠進(jìn)行具有固有信噪比(S/N)限制的診斷形式，例如稀有細(xì)胞事件和稀有轉(zhuǎn)錄本的cDNA陣列分析在RNA分離后，可以應(yīng)用幾種RNA分析方法。傳統(tǒng)的RT-PCR或者更合意的定量方案是可以應(yīng)用的，不過一般認(rèn)為它們是在個(gè)別樣品中少量使用的，因?yàn)檫@些樣品產(chǎn)生了很少量的起始材料。作為結(jié)果，折衷了臨床敏感性來進(jìn)行多基因分析。這樣，未擴(kuò)增的mRNA/cDNA庫(kù)只能對(duì)一個(gè)基因分析一次，而不能折衷臨床的(以及最大的技術(shù)性)敏感性。由于個(gè)別樣品的稀少，發(fā)展了幾種更高通量的方法。
這里，我們表明了極大的期望能夠通過高通量形式同時(shí)測(cè)定多基因(2到1000個(gè))的表達(dá)水平，例如只在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行全部的微陣列形式。這是通過不明顯降低工作量和喪失敏感性而完成的。在單一管中對(duì)稀有細(xì)胞事件及其稀有mRNA樣品進(jìn)行cDNA微陣列分析的一個(gè)重要障礙就是它們?cè)谄鹗糾RNA樣品中固有的不利S/N比。
對(duì)放射標(biāo)記的cDNA陣列來說，這些限制源于(a)當(dāng)一個(gè)特定的已知靶摻入時(shí)液相中可檢測(cè)到的靶拷貝數(shù)下限(大約5×105)，(b)最大量標(biāo)記的非特異性(背景干擾)靶(20ng＝2×1011隨機(jī)標(biāo)記的靶分子庫(kù))，這些靶可以同時(shí)雜交到尼龍濾紙陣列體系上而不會(huì)增加S/N比的背景濾紙(載體)干擾成分。
對(duì)免疫磁學(xué)富集的樣品來說，明顯的背景干擾mRNA是由于在富集過程中不可避免地遺留下來的WBC的存在。為了從稀有細(xì)胞中得到期望的稀有mRNA，溶液要改變S/N比1000倍，這可以通過只選擇預(yù)定基因的一個(gè)亞組進(jìn)行第二輪RNA聚合酶擴(kuò)增(RNAPA)。
該GSP亞組RNAPA選擇過程在本實(shí)施例中簡(jiǎn)化進(jìn)行，使用一個(gè)反映臨床樣品中發(fā)現(xiàn)的典型WBC mRNA拷貝數(shù)比值的模型體系進(jìn)行(在大約5000 WBC中為10ng總RNA)/CTC(在大約50 CTC中為0.5ng總RNA)。在由50個(gè)CTC組成的該起始樣品原料的等量試樣中，通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR確定所有可檢測(cè)mRNA的數(shù)目，前列腺特異性抗原(PSA＝2650)、前列腺特異膜抗原(PSM＝1750)、雄性激素受體(AR＝100)以及上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM＝1163)示于表1。與非特異性背景干擾成比例的起始WBC mRNA總拷貝數(shù)是大約108到109。對(duì)該特殊實(shí)施例來說，起始總RNA/mRNA首先進(jìn)行一輪擴(kuò)增，成比例增加所有mRNA種類，大約等于如實(shí)時(shí)定量RT-PCR所確定的(表1)。隨后，25ng首輪擴(kuò)增的aRNA試樣進(jìn)行第二輪GSP亞組的RNAPA，如下所述改變4個(gè)GSP靶的信噪比(表1)。
在第二輪GSP RNAPA中，關(guān)鍵的選擇步驟發(fā)生在單一RT反應(yīng)的過程中，只對(duì)包括基因特異性RT引物的預(yù)定mRNA庫(kù)亞組同時(shí)形成第一鏈。在該實(shí)施例中，GSP RT引物亞組是上述4種mRNA(PSA、PSM、AR、EpCAM)。GSP-RT選擇性第一鏈合成后，使用合適的DNA聚合酶和具有T7RNAP啟動(dòng)子的寡聚(dT)引物合成互補(bǔ)的第二鏈，這樣就產(chǎn)生了T7RNAP適用的選擇性雙鏈DNA模板組。
這樣，期望的RNAPA適用的模板亞組已經(jīng)通過GSP第一和第二鏈的合成進(jìn)行了選擇。在此，所有剩下的RNA通過將第二鏈反應(yīng)混合物暴露于不含DNase的RNase而進(jìn)行降解?？蛇x擇地，任何剩下的單鏈RNA和在dT依賴的第二鏈合成期間形成的任何無(wú)關(guān)的(非多聚U/非多聚A依賴的)單鏈cDNA都可以通過單鏈特異性核酸酶例如綠豆核酸酶而除去。然后，雙鏈cDNA模板組經(jīng)苯酚提取和/或二氧化硅結(jié)合而純化。選中的RNAPA適用的模板經(jīng)RNAP過夜擴(kuò)增以便僅僅產(chǎn)生4種相關(guān)基因的大約1000倍增加，它們的S/N對(duì)于其它可能的模板發(fā)生了改變，這些模板例如F6(α1球蛋白序列)代表了源自WBCmRNA的干擾。表1顯示了這4種相關(guān)基因在全部過程中包括隨后的GSP-第二輪S/N改變的實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果，這里F6定義為α1球蛋白序列，發(fā)現(xiàn)它在該體系中是WBC高度豐富的而在上皮細(xì)胞中是檢測(cè)不到的。這些結(jié)果清楚顯示，選中的四種GSP靶平均增加了844倍而非靶的F6 WBC干擾僅僅增加5.9倍。這樣當(dāng)區(qū)分增加的GSP靶信號(hào)與F6 WBC干擾時(shí)，就形成了最終每種GSP靶信噪比的改善。有必要指出的是，進(jìn)一步的改善可以期望通過進(jìn)行修飾，例如上述綠豆核酸酶和GSP-RT引物序列的選擇進(jìn)行優(yōu)化。

實(shí)施例7基于蛋白酶和親核試劑的從固定化樣品回收細(xì)胞RNA產(chǎn)生用于下游RT依賴分析的高質(zhì)量RNA模板令人驚奇的是，與相應(yīng)的未固定對(duì)照相比，對(duì)暴露于醛和脲為基礎(chǔ)的穩(wěn)定劑或固定劑的樣品來說，Cyto-ChexTM和其它以甲醛和甲醛-脲衍生物為基礎(chǔ)的固定劑能夠穩(wěn)定幾乎100％的全長(zhǎng)總RNA、mRNA以及其它在全血中發(fā)現(xiàn)的所有細(xì)胞的核酸。固定為大分子復(fù)合物的完整RNA改變了它的RNA化學(xué)性質(zhì)，不受目前常用的細(xì)胞溶胞和離液鹽為基礎(chǔ)的RNA分離方法的影響，例如苯酚提取、二氧化硅結(jié)合以及寡聚(dT)雜交。
這些大分子復(fù)合物(共價(jià)和非共價(jià)的)通過酶消化和/或化學(xué)親核試劑孵育相結(jié)合而解離和逆轉(zhuǎn)。從而核酸被釋放，使得能夠充分完整地分離近乎100％的起始DNA和RNA庫(kù)。這些固定劑來源的RNA庫(kù)提供了用于逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)依賴的形成第一鏈cDNA的高質(zhì)量模板。
這些固定劑回收的RNA與本申請(qǐng)中描述的aRNA預(yù)擴(kuò)增或通用PCR方法相結(jié)合，用于下游全面分析或者允許總體的和mRNA庫(kù)的普通功能性分析。
圖9證實(shí)Cyto-ChexTM象其它醛基固定劑那樣起作用。經(jīng)24小時(shí)固定化暴露，少于1％的mRNA和不成比例的量的18S-rRNA是可回收的(大約10％)。即使在應(yīng)用極端離液鹽變性化學(xué)(即GITC和苯酚、二氧化硅或(dT)雜交、BRL′s Trizol Reagent、Qiagen′s RNA微型二氧化硅結(jié)合以及Dynal′s Dynabeads mRNA直接寡聚(dT)多聚(A)+試劑盒)的時(shí)候，回收也是極低的。
令人驚訝的是，用諸如蛋白酶K的蛋白酶和諸如Tris基的親核試劑進(jìn)行處理，就恢復(fù)了足夠的核酸化學(xué)性質(zhì)使得能夠以充分完整的狀態(tài)回收超過90％的起始總RNA和mRNA，所述試劑去除了大多數(shù)共價(jià)結(jié)合到其它大分子包括核酸上的蛋白質(zhì)和多肽。來自圖9中發(fā)現(xiàn)的總RNA的大規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)化試樣的25ng aRNA試樣(圖12A)進(jìn)行CK19和EpCAM兩者的定量RT-PCR比較分析。這個(gè)比較顯示固定劑來源的RNA相對(duì)于非固定RNA有3.8和3.9倍的更低拷貝數(shù)。這是可以理解的，因?yàn)槌Ｓ玫牡鞍酌窴處理恢復(fù)了至少25％的最大RT-模板活性用于RT-PCR分析。
當(dāng)不同的操作人員通過RT-PCR進(jìn)行同樣的程序并且分析Percoll來源白細(xì)胞相對(duì)于非固定的相應(yīng)樣品的特定mRNA(α球蛋白)時(shí)，通過固定-回收體系恢復(fù)最大RT-模板活性的25％是可再現(xiàn)的。
此外，在這里使用TransfixTM配方獲得了每單位體積血液0.1％的多聚甲醛固定劑最終濃度，這是已知的。
因?yàn)镃yto-ChexTM暴露的RNA的損失和回收狀態(tài)與TransfixTM和其它醛是同樣的，如下所述，極為可能的是，在Cyto-ChexTM和StabilcyteTM配方中發(fā)現(xiàn)的甲醛脲衍生物組分的甲醛供體成分是造成核酸共價(jià)連接到蛋白質(zhì)的原因。
在生物體系(即蛋白質(zhì)和核酸)中發(fā)現(xiàn)在大量大分子親核試劑的存在下，甲醛-脲衍生物導(dǎo)致了這些衍生物解離速度的增加。
解離發(fā)生在接近生物親核試劑復(fù)合物的地方，可能特異性結(jié)合RNA的調(diào)節(jié)蛋白造成了共價(jià)連接。這些連接和結(jié)合隨后被蛋白酶和更強(qiáng)的親核試劑處理而去除和逆轉(zhuǎn)。已知交聯(lián)試劑TransfixTM從24小時(shí)穩(wěn)定的全血細(xì)胞產(chǎn)生全長(zhǎng)的高度完整性mRNA庫(kù)證明，所有的醛基穩(wěn)定劑都將產(chǎn)生類似高質(zhì)量的核酸。這樣就可在保存和回收后產(chǎn)生可再現(xiàn)產(chǎn)量的核酸。
使用這些以及大多數(shù)其它醛和/或脲衍生物固定劑分析90-100％的總RNA及其相應(yīng)的mRNA庫(kù)是可能的，正如下面圖10A、10B和10C所進(jìn)一步顯示的。此外，大多數(shù)這些類型的固定核酸可通過蛋白酶和親核試劑混合物的結(jié)合加熱到諸如60℃的高溫而去除，如圖11所示。
這些結(jié)果顯示，在緩沖液中單獨(dú)高溫加熱固定RNA一個(gè)小時(shí)就產(chǎn)生mRNA庫(kù)的一部分。這種高溫回收效果以前已經(jīng)顯示在福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織RNA獲取中，不過這個(gè)結(jié)果從未在全血中報(bào)道過。而且，在本申請(qǐng)中回收的mRNA庫(kù)的質(zhì)量和數(shù)量即使在那些使用福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織RNA獲取的報(bào)道中也沒有獲得。
該mRNA庫(kù)與那些使用其它親核試劑(Tris、乙酰肼以及羥胺)回收的相比，每種親核試劑的mRNA轉(zhuǎn)錄本大小分布比例是不同的，即使這些樣品沒有顯示RNA降解。這暗示不同類型的mRNA序列都可通過特定親核試劑和孵育條件而獲取(即不同類型的甲醛修飾被逆轉(zhuǎn))。使用的各種酶也顯示了不同的回收比例(圖11，凝膠底部)。
蛋白酶K消化僅僅恢復(fù)25％最大RT-模板活性的事實(shí)，結(jié)合觀察到的不同固定化逆轉(zhuǎn)試劑產(chǎn)生不同比例的mRNA庫(kù)，強(qiáng)有力的支持一種想法，即通過采用親核試劑和酶的組合明顯改善回收是可行的。
為證實(shí)mRNA應(yīng)用于診斷癌癥，特別是使用相對(duì)地為非侵入性外周血模型的可行性，圖12A顯示了從單一T7 RNAP預(yù)擴(kuò)增總RNA/mRNA得到的aRNA的相對(duì)質(zhì)量和數(shù)量，所述RNA/mRNA是通過在室溫用Cyto-ChexTM穩(wěn)定24小時(shí)后將10和20個(gè)SKBR3細(xì)胞摻入7.5ml外周血而分離的，重復(fù)三次。然后這些平行測(cè)定的每個(gè)樣品經(jīng)免疫磁學(xué)富集，來自它們的細(xì)胞溶解產(chǎn)物用蛋白酶逆轉(zhuǎn)條件處理，隨后通過二氧化硅結(jié)合分離總RNA。標(biāo)準(zhǔn)化等量aRNA用于兩個(gè)特定基因CK19和EpCAM的定量RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果示于圖12B和12C?？蓮膱D12B和圖12C看到的是，正如由CK19所測(cè)定的，所有的摻入樣品相對(duì)于供體的相應(yīng)重復(fù)樣品(未摻入的對(duì)照)都是陽(yáng)性。類似地，EpCAM在所有的摻入樣品中都具有同樣的100％陽(yáng)性，盡管在該供體的未摻入對(duì)照重復(fù)樣品中發(fā)現(xiàn)了異常的(內(nèi)源的)和極低水平的表達(dá)。實(shí)際上，由RT-PCR檢測(cè)到的這種低水平EpCAM mRNA對(duì)這種序列來說是常見的，并不是因?yàn)镻CR污染的假陽(yáng)性。
圖12D和12E顯示了源自三種不同的醛基固定劑Cyto-ChexTM、StabilcyteTM和TransfixTM的各種mRNA RT-模板的質(zhì)量。如圖示，TransfixTM產(chǎn)生的mRNA模板可能具有比Cyto-ChexTM或StabilcyteTM稍微低的RT質(zhì)量。而且，當(dāng)這些數(shù)據(jù)對(duì)摻入細(xì)胞數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并與未修飾細(xì)胞在時(shí)間＝0的時(shí)候在完全同樣的SKBR3細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行對(duì)比，固定與未固定的CK19和EpCAM mRNA之間的差別只有4倍(來自圖9的RNA數(shù)據(jù)未顯示)。這被認(rèn)為是意味著以蛋白酶K單獨(dú)回收和aRNA擴(kuò)增相結(jié)合的24小時(shí)穩(wěn)定化過程產(chǎn)生了25％的可能RT模板質(zhì)量。進(jìn)一步地，低于100％RT質(zhì)量的原因可能是由于醛修飾，這不是蛋白酶K單獨(dú)能夠去除的。因此，正如這些實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，蛋白酶和親核試劑混合物的結(jié)合將明顯地改善這些模板的質(zhì)量超過25％。為了在類似的條件下與相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比較，對(duì)來自福爾馬林固定多聚甲醛包埋組織的RT RNA模板質(zhì)量的相同參數(shù)進(jìn)行分析的研究表明，與未固定組織相比，RT模板質(zhì)量降低了13到60倍(Godfrey等，使用5′核酸酶定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)來自福爾馬林固定石蠟包埋的組織進(jìn)行定量mRNA表達(dá)分析。J.of Molecular Diagnostics，284-91(2000))。因此，4倍降低相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)是明顯的改善。
圖12A、12B、12C、12D和12E確定了用于血液RNA樣品保存和循環(huán)上皮細(xì)胞全面分析的一套可再現(xiàn)的、具有產(chǎn)物活性的程序，所述循環(huán)上皮細(xì)胞最可能是癌細(xì)胞。高水平的mRNA保存經(jīng)得起這樣的質(zhì)量分析，其能夠檢測(cè)到摻入7.5ml血液中的單個(gè)細(xì)胞的存在，只要所述細(xì)胞中存在的任何mRNA有至少50mRNA分子/細(xì)胞(即僅僅50拷貝/樣品)。
總起來說，全血中的共價(jià)固定速度和類型隨固定劑類型而不同。同樣地，共價(jià)固定的逆轉(zhuǎn)或恢復(fù)速度和類型將隨使用的蛋白酶和親核試劑類型或組合而不同。對(duì)用于相關(guān)mRNA的半壽期比固定速度快的應(yīng)用來說，固定速度將是關(guān)鍵點(diǎn)。迅速固定和逆轉(zhuǎn)恢復(fù)反應(yīng)(過程)兩者都可以進(jìn)一步優(yōu)化以產(chǎn)生更高的RNA質(zhì)量和數(shù)量。不過，目前穩(wěn)定和回收的RNA質(zhì)量和數(shù)量在此被證實(shí)在血液中是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過任何以前出現(xiàn)的那些。
實(shí)施例8從新鮮的未固定血液CTC中富集和分析mRNA人類血液是從9個(gè)患有晚期激素頑固性前列腺癌(HRPC)的患者和13個(gè)健康志愿者中分離的，對(duì)循環(huán)上皮細(xì)胞特異性mRNA的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。
患者血液抽吸進(jìn)10ml的EDTA VacutainerTM管(Becton-Dickinson，NJ)中，9個(gè)患有晚期激素頑固性前列腺癌(HRPC)的患者和13個(gè)健康志愿者，后者有7個(gè)男性(年齡在24到73歲之間，平均45歲)和6個(gè)女性(年齡在27到61歲之間，平均39歲)。在9個(gè)HRPC患者中，2個(gè)患者具有5個(gè)連續(xù)采樣，1個(gè)具有4個(gè)，3個(gè)具有2個(gè)，以及3個(gè)具有1個(gè)的采樣時(shí)間點(diǎn)?；颊吣挲g在60-81歲之間(平均74歲)，他們的初步診斷是在本研究2-10年之前。經(jīng)過紫杉醇/雌氮芥和/或利普安治療的患者的連續(xù)樣品作為連續(xù)系列進(jìn)行制備和分析?；颊吆椭驹刚吆炇鹆苏J(rèn)可進(jìn)行研究的贊同意見。
靶細(xì)胞分離血樣保存于室溫，在采集后2-3小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行處理，除非另外指出。15ml血分成7.5ml的等份，轉(zhuǎn)移到內(nèi)徑17mm的一次性管(FisherScientific)中，800g不制動(dòng)離心10分鐘。加入含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖鹽(PBS)，使體積達(dá)到10ml，顛倒混合樣品。識(shí)別上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的Mab VU-1D9與上皮細(xì)胞來源的組織具有廣泛的反應(yīng)性，將其連接到磁性納米微粒(鐵磁流體，Immunicon，Huntingdon Valley，PA)。
為增加EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞的磁負(fù)載并減少由于細(xì)胞表面EpCAM密度差異而產(chǎn)生的捕獲效率的可變性，將脫硫生物素連接到EpCAM-標(biāo)記的磁性納米微粒上形成CA-EpCAM，如在申請(qǐng)?zhí)?9/351,515和09/702,188中描述的，這兩份申請(qǐng)?jiān)诖艘胱鳛閰⒖?。然后將CA-EpCAM鐵磁流體和含有抗生物素蛋白鏈菌素的緩沖液加入到樣品中以獲得磁標(biāo)記細(xì)胞的增加。在CA-EpCAM鐵磁流體上的脫硫生物素隨后被生物素取代，所述生物素包含在下述的滲透緩沖液中。從而逆轉(zhuǎn)了CA-EpCAM鐵磁流體微粒之間的交聯(lián)。立即將樣品置于四重磁力分離器中10分鐘(QMS17，Immunicon)。10分鐘后，從分離器中取出管子，倒轉(zhuǎn)5次，放回磁力分離器再10分鐘。重復(fù)該步驟一次，將管子放回分離器20分鐘。分離后，將上清吸出并丟棄。從磁力分離器中取出管子，用包含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖鹽(PBS)3ml重新懸浮，從器壁上收集組分。
每個(gè)樣品的兩個(gè)7.5ml等份分別處理。一份通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行制備和分析(實(shí)施例12)，如下所述分析另一份的RNA。
核苷酸純化和擴(kuò)增在優(yōu)選
具體實(shí)施例方式
中利用本發(fā)明的一種方式是首先純化核苷酸樣品。這里，總RNA或mRNA是從富集的細(xì)胞群體中分離的。分離可以通過本領(lǐng)域中能夠保持mRNA完整性并防止降解的任何方法完成。例如，來自兩份血樣的富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞在100μl的Trizol試劑(BRL)或100μl的RNA提取緩沖液(ZYMO Research)中進(jìn)行胞溶，渦旋勻漿的樣品，儲(chǔ)存在-80℃直到RNA的使用。按照制造商的說明使用勻漿來分離總RNA?？俁NA用DNaseI進(jìn)行簡(jiǎn)單處理。在DNase處理后檢驗(yàn)DNase活性，使得不會(huì)產(chǎn)生溴乙碇凝膠可檢測(cè)到的基因組DNA。DNase處理的RNA再次用Trizol分離程序進(jìn)行清洗。十分之一所得的總RNA在1％瓊脂糖凝膠上沿總RNA群和分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行Northern印跡，與等摩爾的核糖體18S和28S寡聚體混合物進(jìn)行雜交。所得的雜交印跡用32P標(biāo)記，熒光成像(PackardCyclone)并分析確定RNA完整性和大小。然后將每個(gè)樣品的剩余總RNA量的值(90％)認(rèn)為是樣品的7.5ml血液供體的總RNA等價(jià)物，其中的1.5％計(jì)為mRNA。
實(shí)施例9免疫磁學(xué)選擇后在患者中進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析取自人血液的白細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析用于估計(jì)循環(huán)上皮細(xì)胞中的基因表達(dá)。然后將所述制備的分離細(xì)胞重懸浮在含有生物素(Immunicon Corporation)的200μl滲透緩沖液中，在飽和條件下加入單克隆抗體(Mab)-熒光染料復(fù)合物。單克隆抗體由藻紅蛋白(PE)綴合的識(shí)別細(xì)胞角蛋白4、6、8、10、13和18的抗細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(Mab C11)以及多甲藻素葉綠素蛋白(PerCP)-標(biāo)記的抗-CD45(Hle-1，BDIS，San Jose，CA)組成。在細(xì)胞與Mab孵育15分鐘后，加入2ml細(xì)胞緩沖液(PBS，1％BSA，50mM EDTA)，細(xì)胞懸浮液磁分離10分鐘。丟棄掉無(wú)法分離的懸浮液后，將收集的細(xì)胞重懸浮在0.5ml的PBS中，向其中加入Procount SystemTM使用的核酸染料(Procount，BDIS)。此外，向懸浮液中加入10,000個(gè)熒光計(jì)數(shù)珠以檢驗(yàn)分析樣品的體積(Flow-Set Fluorospheres，Coulter，Miami，F(xiàn)L)。
樣品在配備488nm氬離子激光器(BDIS)的FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行分析。使用核酸染料的熒光閾值以CeIlQuestTTM(BDIS)進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取。在800個(gè)珠或者80％的樣品被分析后停止獲取。在listmode數(shù)據(jù)(Paint-A-Gate，BDIS)上進(jìn)行多參數(shù)數(shù)據(jù)分析。分析標(biāo)準(zhǔn)包括由前端光散射定義的大小、由直角光散射定義的粒度。用核酸染料和PE-標(biāo)記的Pan抗角蛋白MabC11(CK4、5、6、8、10、13和18)進(jìn)行的陽(yáng)性染色，結(jié)合用PerCP-標(biāo)記的抗-CD45 Mab進(jìn)行的染色用于差異性CTC/WBC熒光染色和分析。通過核酸染料和細(xì)胞角蛋白抗原的存在以及CD45染色的缺少來識(shí)別CTC。對(duì)每個(gè)樣品來說，區(qū)域中存在的事件數(shù)目要乘以1.25來計(jì)算未被流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的樣品體積，這是上皮細(xì)胞典型的。
在健康的、沒有癌癥的供體樣品中，免疫磁學(xué)選擇留下來的白細(xì)胞在655到5,560之間(中值為4350；平均值1759)。在HRPC患者樣品中，留下來的白細(xì)胞在813到92,000之間(中值為4350；平均值12,300)。來自健康的、沒有癌癥的對(duì)照組的7個(gè)男性和6個(gè)女性的血液顯示沒有CTC，而來自HRPC的血液則顯示出7.5ml血液有4-283個(gè)CTC的范圍。
實(shí)施例10來自擴(kuò)增庫(kù)的mRNA轉(zhuǎn)錄本的定量mRNA/aRNA量的標(biāo)準(zhǔn)化通過首先定量從每個(gè)免疫磁學(xué)富集的7.5ml血樣體積分離的總RNA量而確定。它的完成通過對(duì)每個(gè)樣品總RNA的10％進(jìn)行Northern印跡，然后進(jìn)行28S和18S放射標(biāo)記的寡聚探針雜交，并與已知的總RNA量細(xì)胞系標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。接著進(jìn)行熒光成像定量(Cyclone，Packard Instruments)。所得的總RNA量定義為1個(gè)供體樣品mRNA當(dāng)量＝1個(gè)供體樣品aRNA當(dāng)量[(總RNA量)×(1.5％mRNA)]/3*＝1個(gè)供體樣品aRNA當(dāng)量*(發(fā)現(xiàn)aRNA庫(kù)平均分子量低于未擴(kuò)增的mRNA分子量3倍)0、1、2、3和4的相對(duì)基因表達(dá)水平確定為未知的擴(kuò)增產(chǎn)品的瓊脂糖凝膠動(dòng)力學(xué)曲線密度，包括已知拷貝數(shù)的CK19體外轉(zhuǎn)錄RNA構(gòu)建體(CK19-cRNA)標(biāo)準(zhǔn)。該CK19-cRNA標(biāo)準(zhǔn)包含CK19野生型mRNA序列的3’-末端800個(gè)堿基。覆蓋1000倍動(dòng)力學(xué)范圍的標(biāo)準(zhǔn)CK19-cRNA曲線進(jìn)行三次重復(fù)，每一種是以20,000；2,000；200；100；50；25和12.5個(gè)拷貝摻入到2ng分離自Percoll-來源的WBC的總RNA中。進(jìn)行40輪循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)曲線顯示出對(duì)13-200個(gè)拷貝的CK19-cRNA轉(zhuǎn)錄本的RNA拷貝數(shù)的線性信號(hào)響應(yīng)的圖形條帶密度(見圖13A和13B)。對(duì)任何三次重復(fù)分析的標(biāo)準(zhǔn)，外部標(biāo)準(zhǔn)曲線具有27％的最大CV。對(duì)多元基因分析來說，比較了CK19的外部標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)基因表達(dá)水平0-4確定為0-檢測(cè)不到的1-大約25-50拷貝的CK19，2-大約250-500拷貝的CK19，3-大約2,500-5,000拷貝的CK19，以及4-超過25,000拷貝的CK19。
圖13B顯示了相應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線上CK19 cRNA的近似拷貝數(shù)的典型帶密度，用于確定相對(duì)基因表達(dá)水平1-4。
CTC計(jì)數(shù)和基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜是使用23個(gè)不同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確定的，所述擴(kuò)增產(chǎn)物來自13個(gè)健康供體和9個(gè)HPRC患者的Ep-CAM免疫磁學(xué)富集血樣。微陣列在分析這些類型的樣品時(shí)是無(wú)效的，這是因?yàn)樵诿庖叽艑W(xué)富集過程中非特異性留下的WBC來源的信噪比不相容。在這些樣品中CTC特異性信號(hào)與WBC留下的干擾的比值在1到1000CTC/103到104WBC的范圍。這些微陣列限制的克服可通過結(jié)合使用來自每個(gè)免疫磁學(xué)富集血樣的90％完整mRNA庫(kù)進(jìn)行10,000倍預(yù)擴(kuò)增步驟，然后進(jìn)行多基因RT-PCR分析代替陣列。這項(xiàng)創(chuàng)新提供了足夠的起始材料用于每份7.5ml血樣進(jìn)行幾百個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)。這樣，人們就能夠進(jìn)行單個(gè)患者的CTC多元RT-PCR譜分析，而不會(huì)影響每個(gè)CTC mRNA庫(kù)的每種mRNA成員的分析敏感性或臨床敏感性。
在進(jìn)行上述的體積標(biāo)準(zhǔn)化程序后，剩下的來自每種樣品的90％總RNA使用SMART PCR cDNA合成儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)，但是使用的是上述67個(gè)堿基的寡聚(dT)引物。反應(yīng)在42℃孵育90分鐘。全部10μl RT轉(zhuǎn)移到使用Advantage cDNA PCR儀(Clontech)的50μl PCR反應(yīng)中，用P1-SMART引物和P2-T7的18個(gè)堿基引物進(jìn)行PCR(5′-TCTAGTCGACGGCCAGTGAATT-3′)使用的是PE-9600，熱循環(huán)程序?yàn)?5℃1分鐘，10個(gè)循環(huán)的95℃15秒，65℃1秒，68℃6分鐘，然后在72℃20分鐘。全部PCR反應(yīng)物加載到Sephadex G-50 Quick Spin(TE)柱(Roche Diagnostics)上，根據(jù)制造商的說明產(chǎn)生洗脫液。
洗脫液在Vacufuge(Eppendorf)上于60℃真空濃縮大約30分鐘到3μl。根據(jù)制造商的說明使用AmpliScribe試劑盒(EpicenterTechnologies)組裝可生產(chǎn)典型aRNA庫(kù)的T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)，在20μl體積中于37℃孵育6-12小時(shí)。進(jìn)一步重復(fù)Trizol分離程序清理RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
RNA大小標(biāo)準(zhǔn)、RNA量標(biāo)準(zhǔn)和每個(gè)樣品的十分之一轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物在60℃甲酰胺變性15分鐘，上樣到2％瓊脂糖凝膠上，在5伏/厘米跑膠15分鐘，在使用AlmagerTM(A Innotech Corp.)進(jìn)行凝膠成像密度計(jì)量之前用SYBR GoldTM(Molecular Probes)后染色一小時(shí)。確定每個(gè)轉(zhuǎn)錄庫(kù)的量。
基因特異性引物如上述設(shè)計(jì)。所有引物組設(shè)計(jì)為擴(kuò)增每個(gè)特異性基因靶的3’-末端的500個(gè)堿基(平均344bp，226-513bp長(zhǎng)度范圍)中的特異性基因靶cDNA。為避免擴(kuò)增基因組DNA，所有RNA樣品如上述用DNase進(jìn)行處理。表1顯示了用于相對(duì)RT-PCR分析的每個(gè)擴(kuò)增子的引物對(duì)。前導(dǎo)引物P1顯示為各自引物對(duì)的上面的序列。反向引物是下面的序列。所有序列寫為5’→3’。
表1引物對(duì)距3′GenBank末端的 擴(kuò)增于登錄號(hào)基因 P1距離選擇的引物對(duì)的序列 長(zhǎng)度α 1-V00491 580 AAGACCTACTTCCCGCACTT 451球蛋白 TATTTGGAGGTCAGCACGGTAR NM_000044 513 ATCTCTGTGCAAGTGCCCAAGAT207CAGGAACATGTTCATGACAGACTGTBCL2XM_008738 440 GCAAGAGTGACAGTGGATTGCAT330CTAATGGTGGCCAACTGGAGACTCK05NM_000424 353 AGTCACTGCCTTCCAAGTGCAGCAA 212GGAAACCTGAAGGCTGATTTGAAGCAGCK08M34225 429 GTGGTTTGAGCTCGGCCTATGG 275CCAGTGCTACCCTGCATAGCGCK10NM_000421 305 GACGGTAGAGTTCTTTCATCTACGGTTG 196GGAAACCACAAAACACCTTGTAGACACCCK18NM_000224 331 ACCTTGAGTCAGAGCTGGCACAGA 275
GCTTCTGCTGGCTTAATGCCTCAGCK19 NM_002276320CATATCCAGGCGCTGATCAGCG228CAAAGGACAGCAGAAGCCCCAGDD3 AF103908 2160 GTAAGCCTGGGATGTGAAGCAAAGG 260GAACCCTAAAGTGGCTCACAAGAGTGEGFR NM_005228265CCTGTAACCTGACTGGTTAACAGCAG200GGCTCTGACTGATCTGGGAGTCAEpCamM33011 432GAGATGCATAGGGAACTCAATGC 275ACGATGGAGTCCAAGTTCTGGATER-a NM_000125382AGCAGGTGCCTGAGACACAGA 328TCGAGCATCCCGCTGGATTCTTER-b NM_001437323GGAAGCTGGCTCACTTGCTGAA232GAAGCACGTGGGCATTCAGCATHer2Neu M11730 426TCGTTGGAAGAGGAACAGCACTG 266AGCCTGGATACTGACACCATTGCHK2 XM_008996334CACACCATGCAGGATGACAT 190GCATTCCACAAGGTTCTCAGMDR1 AF016535 263AGTGTCCAGGCTGGAACAAAG 215CTCCACTTGATGATGTCTCTCACMGB1 XM_006409408CTCCCAGCACTGCTACGCAGGC340GACATAAGAAAGAGAAGGTGTGGTMGB2 NM_002407420CTCCTCCTGCACTGCTATGCAGAT 264ACACCAAATGCTGTCGTACACTGTATGCAMic1 AF019770 352CTACAATCCCATGGTGCTCA 289ACACAGTTCCATCAGACCAGMMP2 NM_004530332ACTGCTGGCTGCCTTAGAACCTT 216GAGAAGAGACTCGGTAGGGACATMMP9 NM_004994327CGTCTTCCAGTACCGAGAGAAAG 215TGTATCCGGCAAACTGGCTCCTTMRP L05628 328GGTGATCGTCTTGGACAAAGGAG 300TCTTCACAGCCAGTTCCAGGCAGMUC1 J05582 361AACGGTGGCAGCAGCCTCTCTTA 238GCTTCCACACACTGAGAAGTGTCCGNKX3ANM_006167284GGAAGTTCAGCCATCAGAAGTAC 246GGTATGGGTAGTAAGGATAGp53 AF307851 334CTGCCTCAGCCTCCGGAGTAGCT 243GTGGGGTGAAAATGCAGATGTGCPIP J03460 226CAGAACTGTGCAAATTGCAGCCGTC 201AGACCACAGCAGAAATTCCAGCCAAGPSA M26663 236TGAAGCACTGAGCAGAAGCTGGA 236GAGGGTTGTCTGGAGGACTTCAA
PSGR AF311306 425ACACCGCTTTGGAAACAGCCTTCATC 281GTACTGATGTGCTTATGGGCAACTGGPSM M99487 459AGTTCAGTGAGAGACTCCAGGAC286CTGCACTGTGAAGGCTGCAACATTERT NM_003219 347AGCACACCTGCCGTCTTCACTT 234GGCACACCTTTGGTCACTCCAATimp1NM_003254 302CCAAGACCTACACTGTTGGCTGT240ACTGTGCAGGCTTCAGTTCCACTTimp2NM_003255 325TGGGCTGCGAGTGCAAGATCAC 219CTGCTTATGGGTCCTCGATGTCTopo2a NM_001067 356GCCATCCACTTCTGATGATTCTG244ACCAGTCTTGGGCTTGGTAAGATopo2b NM_001068 366AAGCCCAAGAGAGCCCCAAAAC 279TGGCAGAGAAGGTGGCTCAGTATROP2X77753 334TGTTGCTACTCTGGTGTGTCCCAAG 245CTGGGATTCAAAGGAGGTACAGCTCuPA NM_002658 387TGGGCTGTGAGTGTAAGTGTGAG285CACCCAGTGAGGATTGGATGAAC逆轉(zhuǎn)錄(RT)在25納克T7預(yù)擴(kuò)增aRNA庫(kù)上用隨機(jī)9堿基50ng、1μl的SuperscriptTM(BRL)根據(jù)制造商的說明進(jìn)行。RT孵育于25℃10分鐘、37℃10分鐘、42℃20分鐘、50℃60分鐘。每個(gè)樣品aRNA(50-1300pg的范圍)的十個(gè)供體當(dāng)量用于包含1單位platinum taq酶(BRL)的隨后每個(gè)50μl PCR反應(yīng)。通過在熱循環(huán)程序的第31、35和40輪時(shí)取樣15μl由每個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)管產(chǎn)生各自的PCR曲線，所述熱循環(huán)程序是使用PE-9600熱循環(huán)儀進(jìn)行95℃1分鐘，31、35和40個(gè)循環(huán)的95℃1秒、65℃1秒、72℃1分鐘；然后在72℃20分鐘。每個(gè)PCR批次的每個(gè)擴(kuò)增子包括一個(gè)細(xì)胞系cDNA擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照，以及主要混合的PCR試劑擴(kuò)增陰性對(duì)照，它包括除了cDNA樣品外的所有組分。所有RT-PCR結(jié)果在含有溴乙啶的2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析，同時(shí)用AlphaEaseTM軟件的5.04版進(jìn)行BRL低分子量和點(diǎn)密度分析。
基因鑒定的目的是用最高臨床特異性和敏感性檢測(cè)上皮細(xì)胞來識(shí)別CTC中的mRNA表達(dá)譜。首先，在WBC中發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)水平是從健康供體的富集進(jìn)行估測(cè)的。候選基因的選擇是根據(jù)已知文獻(xiàn)數(shù)據(jù)所顯示的顯著上皮特異性表達(dá)水平進(jìn)行的。WBC陰性候選者的識(shí)別可使得CTC圖譜能夠用于三種基本組織水平的分類/表征，就是上皮來源的(圖14A)，腫瘤/器官來源的(圖14B)，以及腫瘤治療的靶特征(圖14C)。
RT-PCR作圖是在所有樣品上根據(jù)圖14A、14B和14C中的擴(kuò)增子組進(jìn)行的。圖14A顯示上皮標(biāo)記CK19在本發(fā)明HRPC樣品體系中100％特異的，而0/13個(gè)健康供體是CK19陽(yáng)性的，與此相比，18/23(78％)個(gè)HPRC患者樣品得到CK19陽(yáng)性結(jié)果。CD5和TROP2也是100％特異性的。然而，它們的敏感性分別為1/23(4％)和2/23(9)，不能增加足夠的圖像價(jià)值以證明其用途。在沒有100％特異性的基因(EpCAM、Muc-1和MIC-1)中，WBC背景閾值可用在水平1和2之間，超過后，所有患者來源的信號(hào)都比可認(rèn)為真正陽(yáng)性的值大。在用這組基因進(jìn)行最大上皮敏感性分析時(shí)，CK19、EpCAM和Muc-1敏感性的結(jié)合在23/23(100％)的患者樣品中得到上皮陽(yáng)性的結(jié)果。由于所有血樣因鐵磁流體富集過程中的低特異性結(jié)合而產(chǎn)生WBC的遺留，WBC特異性基因(F6＝α1-球蛋白基因)用作全體系RNA處理和擴(kuò)增的陽(yáng)性對(duì)照。所有36個(gè)樣品都得到大于水平4的結(jié)果(見圖14A)。
實(shí)施例11分析在預(yù)擴(kuò)增的敏感性下限的可再現(xiàn)性為評(píng)估修正的T7轉(zhuǎn)錄預(yù)處理擴(kuò)增程序的可再現(xiàn)的下限敏感性性能，構(gòu)建了一個(gè)模型體系，其中包括臨床RNA樣品上進(jìn)行的所有操作。來自乳腺和前列腺癌細(xì)胞系SKBR3和LNCaP(America Type CultureCollection，Manassas，VA)的總RNA是使用Trizol試劑(LifeTechnologies Inc.)按照制造商的說明進(jìn)行分離的。在第一鏈合成前，進(jìn)行相應(yīng)的2、0.2、0.02的SKBR-3細(xì)胞當(dāng)量的連續(xù)稀釋，每份稀釋液摻入到2ng的Percoll來源的WBC總RNA中。RT-PCR外部CK19標(biāo)準(zhǔn)曲線確定與SKBR-3稀釋曲線同時(shí)進(jìn)行，得到存在于每份SKBR-3細(xì)胞當(dāng)量中的大約1,000個(gè)野生型CK19 mRNA拷貝。CK19表征的SKBR3稀釋曲線用作兩類特異性轉(zhuǎn)錄本之一來模擬這種基于T7的mRNA庫(kù)擴(kuò)增體系的全過程下限敏感性和可再現(xiàn)性。第二種轉(zhuǎn)錄本是基于外源Lambda DNA的構(gòu)建體(Walker Biotech Publication)，其產(chǎn)生1.2kb的多聚A(30)轉(zhuǎn)錄本。摻入SKBR-3細(xì)胞的WBC曲線的分析是在2000、200和20個(gè)CK19 mRNA拷貝水平進(jìn)行，每份三次重復(fù)。Lambda曲線的分析是在500、50和5個(gè)拷貝水平摻入到2ng的Percoll來源的WBC總RNA中，重復(fù)三次。在最后的分析中，從50個(gè)拷貝或更高水平(N＝12)獲得了可再現(xiàn)的RT-PCR擴(kuò)增，其中各個(gè)樣品通過完整T7-轉(zhuǎn)錄預(yù)擴(kuò)增進(jìn)行，每個(gè)都產(chǎn)生了可測(cè)量的信號(hào)。而且，僅僅以任一序列的50個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本起始，這種檢測(cè)下限在隨后的細(xì)胞系摻入模型中是可重復(fù)的，其中在aRNA和定量RT-PCR分析(實(shí)施例6)之前將所有六個(gè)序列類型(PSA，PSM，AR，HPN CK19和EpCam)連續(xù)稀釋到已知拷貝水平。
在RT-PCR后，用AlphaImager在31、35和40循環(huán)的動(dòng)力學(xué)曲線試樣上進(jìn)行分子量和點(diǎn)密度凝膠分析。從12個(gè)摻入水平的11個(gè)(92％)中計(jì)算得到19.25％的CV。200個(gè)拷貝樣品中只有一個(gè)(8％)具有低于預(yù)期14倍的密度，但是這個(gè)樣品仍然是可檢測(cè)的，確定為水平1。
在分開的研究中，本發(fā)明的T7預(yù)擴(kuò)增方法對(duì)相對(duì)mRNA豐度的影響通過與同樣制備的未擴(kuò)增庫(kù)比較進(jìn)行了模擬。沒有檢測(cè)到N＝8的基因(PSA，PSM，MGB1，MGB2，PIP，CK8，CK19，和EpCAM)在帶密度比值上的明顯差別，其中使用15個(gè)細(xì)胞當(dāng)量的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和15個(gè)細(xì)胞當(dāng)量的乳腺癌細(xì)胞系SKBR-3摻入到1000個(gè)細(xì)胞當(dāng)量的WBC總RNA(2ng)中起始，然后進(jìn)行T7預(yù)擴(kuò)增方法和隨后的多基因RT-PCR動(dòng)力學(xué)曲線分析，如圖13C所示。在這些研究中與每個(gè)批次同時(shí)進(jìn)行的cDNA模板陰性擴(kuò)增對(duì)照沒有顯示出可檢測(cè)的信號(hào)。
使用本發(fā)明的修正T7方法進(jìn)行一輪總RNA庫(kù)的成比例擴(kuò)增，產(chǎn)生的aRNA庫(kù)比初始mRNA量平均增加了10,000倍以上。這是基于初始mRNA水平估計(jì)為確定的總RNA量的1.5％。轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增過程產(chǎn)生了中等轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度為600堿基的庫(kù)，長(zhǎng)度范圍在550-800堿基之間。每個(gè)庫(kù)中的各個(gè)轉(zhuǎn)錄本的大小在300-3000堿基的范圍。各個(gè)aRNA庫(kù)隨機(jī)引發(fā)RT，由此使用10個(gè)aRNA/cDNA供體當(dāng)量進(jìn)行各個(gè)PCR反應(yīng)的多基因分析。
健康、沒有癌癥的樣品中來自遺留的WBC的總RNA量在0.8-11.12ng之間(平均3.5ng)。來自HRPC患者樣品的總RNA量在0.8-35.12ng之間(平均7.2ng)。所有總RNA樣品隨后產(chǎn)生的aRNA庫(kù)的量與起始總RNA值直接成比例。
每個(gè)樣品10％總RNA的Northern印跡與28S和18S放射性標(biāo)記寡聚探針、并同時(shí)與來自細(xì)胞系標(biāo)準(zhǔn)的已知量總RNA進(jìn)行雜交，然后通過熒光成像確定數(shù)量和質(zhì)量。質(zhì)量估計(jì)通過28S與18S的比例進(jìn)行，其中SKBR-3細(xì)胞系標(biāo)準(zhǔn)平均為1.55(在1.50-1.64的范圍)，對(duì)富集樣品來說，13個(gè)健康供體平均為1.36(在1.16-1.60的范圍)，HRPC平均為1.10(在0.57-1.80的范圍)。
此外，我們觀察到來自HRPC患者的80％鐵磁流體富集的CTC/WBC樣品具有比期望值少6倍的總RNA量(在1.5到15倍的范圍)。這些期望值基于WBC平均總RNA量＝2pg/個(gè)細(xì)胞，以及平均的上皮細(xì)胞總RNA量＝20pg/個(gè)細(xì)胞。這在估測(cè)診斷和治療狀態(tài)的個(gè)體中可能是有意義的，特別是在治療過程中。
實(shí)施例12使用組織特異性基因進(jìn)行CTC腫瘤組織來源和患者特異性治療表征的確認(rèn)36個(gè)樣品進(jìn)一步用N＝8個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行分析以確定最佳特異性和敏感性表達(dá)譜來識(shí)別循環(huán)上皮腫瘤細(xì)胞的器官來源。對(duì)前列腺特異性識(shí)別，我們估測(cè)了PSA，PSM，HK2，HPN，PSGR，DD3，MGB1和MGB2(見圖14B)。這些擴(kuò)增子沒有顯示出任何來自WBC組的信號(hào)，除了一個(gè)有Hepsin(HPN)的#3女性的例外。如圖14B所示，PSA是該前列腺組最敏感的，有20/23(89％)的樣品是陽(yáng)性結(jié)果，其后是PSM為17/23(74％)，HPM為13/23(57％)，hK2為7/23(30％)，PSGR為2/23(9％)，以及DD3為1/23(4％)。出乎意料的是，兩種“乳腺特異的”基因乳球蛋白1和2在前列腺中有強(qiáng)信號(hào)水平的陽(yáng)性結(jié)果，MBG1為1/23(4％)和MBG2為2/23(9％)，不過在健康供體群中沒有。結(jié)合這兩種以及最高敏感性的標(biāo)記PSA和PSM產(chǎn)生了20/23(87％)的敏感性。加入HPN后，敏感性增加到21/23(91％)。Hepsin和PSM是兩種標(biāo)記，它們對(duì)治療策略也是重要的，因?yàn)樗鼈儍煞N都是組織特異性的和跨膜的，使得特異性細(xì)胞靶向輸送策略成為可能。
基于CTC RNA圖譜對(duì)潛在治療分析進(jìn)行了各個(gè)患者的表征，結(jié)果示于圖14C。在該樣品組的個(gè)體特異性得分顯示AR、NKX3A、EGFR和ER都是100％。MDR1、MRP和Topo2a都受到了WBC組背景信號(hào)的明顯影響。AR檢測(cè)HRPC CTC的敏感性是16/23(70％)，其后是NKX3A為4/23(17％)，Topo2a為5/23(22％)，MDR1為5/23(22％)，EGFR為4/23(17％)，以及ER為1/23(4％)。出乎意料的是，MDR和MRP在分辨這兩組方面看起來是無(wú)用的。
在18-26周期間從三個(gè)患者連續(xù)提取樣品。一個(gè)患者只用利普安治療，而兩個(gè)用利普安結(jié)合紫杉烷/雌氮芥治療。連續(xù)樣品顯示出基因相關(guān)的治療敏感性/抗性表達(dá)的改變，而其他仍然沒有改變。這些改變與CTC和白細(xì)胞數(shù)目無(wú)關(guān)，如圖15A、15B和15C所示。對(duì)只用利普安治療的患者，在0、5、10和18周時(shí)提取4個(gè)連續(xù)樣品，沒有檢測(cè)到MDR1(圖15A)，AR保持相對(duì)恒定，而Hepsin有波動(dòng)。圖15B和15C進(jìn)一步顯示出在TX/ES治療過程中MDR1 mRNA水平相對(duì)于健康供體的一致降低。在HRPC發(fā)展中起重要作用的AR表達(dá)水平在TX/ES治療過程中完全消失，如圖15B所示。相比之下，圖15C顯示AR在類似治療過程中相對(duì)不受影響。檢測(cè)到了Hepsin mRNA的驚人變化，在圖15B和15C中，兩個(gè)患者在未治療時(shí)的高表達(dá)水平在TX/ES治療過程中都完全消失了。
實(shí)施例13用來自同樣樣品的血漿來源(非CTC)的RNA作圖分析疾病狀態(tài)以提供CTC補(bǔ)充數(shù)據(jù)迄今為止，已經(jīng)描述了用于分析來自血樣富集的CTC的mRNA的方法。該方法重要的步驟是T7預(yù)擴(kuò)增步驟，它可以允許分析只有幾個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄本，能夠進(jìn)行多達(dá)1000個(gè)不同的單獨(dú)基因特異性RT-PCR反應(yīng)。典型mRNA庫(kù)的T7預(yù)擴(kuò)增有效去除了有限樣品mRNA量的主要限制。這種同樣的預(yù)擴(kuò)增可以應(yīng)用到非CTC RNA。其實(shí)，特定血樣中有眾多RNA來源，這些非CTC RNA中的一些將提供有價(jià)值的信息。
CTC存在的證實(shí)和腫瘤來源組織的確定以及疾病機(jī)制的全面表征都可以使用來自血漿組分的RNA而實(shí)現(xiàn)，所述組分是在鐵磁流體富集過程中獲得的。優(yōu)選地，這可以與上述富集CTC的實(shí)施例中描述的T7預(yù)擴(kuò)增方法結(jié)合。鐵磁流體富集方法首先分離出每個(gè)樣品的血漿組分。典型地，這種組分在CTC富集時(shí)是被丟棄的。
不過血漿和血清來源的mRNA和DNA最近已經(jīng)出現(xiàn)在文獻(xiàn)中，提供了有價(jià)值的癌癥表達(dá)(表型)和基因型(DNA分析)數(shù)據(jù)。血漿來源的mRNA和DNA是通過用于下游分析的常規(guī)分子生物學(xué)方法分離的。因?yàn)閙RNA容易從血漿得到，而且已經(jīng)證明提供了有價(jià)值的RT-PCR數(shù)據(jù)，因此這些同樣的RNA轉(zhuǎn)錄本可以使用這里表述的修正T7擴(kuò)增程序進(jìn)行更全面的分析。因此不依賴CTC和/或CTC補(bǔ)充的mRNA表達(dá)譜可以用與CTC相同的程序產(chǎn)生，通過使用來自每個(gè)樣品的血漿來源部分的RNA。
進(jìn)一步地，基于T7的表達(dá)譜方法可應(yīng)用于上述富集方法，使得CTC廢棄組分的分析能夠用于區(qū)分WBC表達(dá)譜和CTC特異性圖譜，其中前者是富集過程中非特異性遺留的。這可以通過差異模式比較和隨后的扣除而完成，從而提供了額外機(jī)制在分析過程中正確識(shí)別CTC。此外，CTC廢棄的圖譜本身可提供有價(jià)值的關(guān)于特定治療應(yīng)答和敏感性患者的特異性信息。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解本發(fā)明所涉及的，本發(fā)明不限于此處公開的說明書和優(yōu)選具體實(shí)施方式
的探討，而是此處特定描述的程序可以進(jìn)行許多修正和改變，只要不脫離由下面權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種診斷受試患者的疾病嚴(yán)重性的方法，該方法包括a.從疑有癌癥的受試患者的血液中獲得樣品，樣品包括懷疑包含上皮來源的癌細(xì)胞的混合細(xì)胞群體；b.將所述樣品與特異性結(jié)合所述癌細(xì)胞的免疫磁學(xué)微粒混合，基本排除其它樣品組分；c.將樣品-免疫磁學(xué)微?；旌衔锝?jīng)高梯度磁場(chǎng)處理以產(chǎn)生富集有磁微粒結(jié)合癌細(xì)胞的分離細(xì)胞部分；以及d.分析所述富集部分中所述癌細(xì)胞的存在，所述樣品中所述癌細(xì)胞的存在預(yù)示著癌癥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試患者是用于評(píng)估循環(huán)癌細(xì)胞的存在的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試患者對(duì)癌癥根除方法的響應(yīng)通過所述循環(huán)癌細(xì)胞的存在進(jìn)行評(píng)估。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試患者已經(jīng)診斷為患有選自下面的組的癌癥，包括前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌apud瘤、迷芽瘤、支氣管瘤、惡性類癌瘤綜合征、良性腫瘤性心臟病、惡性腫瘤例如Walker氏瘤、基細(xì)胞瘤、基底鱗狀瘤、Brown-Pearce氏瘤、導(dǎo)管瘤、埃利希瘤、原位瘤、Krebs 2瘤、merkel氏細(xì)胞瘤、粘蛋白狀瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞瘤、乳頭瘤、硬癌瘤、支氣管瘤、支氣管源磷狀上皮細(xì)胞瘤、以及轉(zhuǎn)變性細(xì)胞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖瘤、黑素瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、巨細(xì)胞瘤、組織細(xì)胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、間皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、Ewing氏肉瘤、關(guān)節(jié)骨液瘤、腺纖維瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、間質(zhì)瘤、中腎瘤、肌肉瘤、成釉細(xì)胞瘤、牙骨質(zhì)瘤、牙瘤、畸胎瘤、throphoblastic瘤、腺癌、腺瘤、膽管瘤、珠光瘤、圓柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、淀粉粒質(zhì)細(xì)胞瘤、兩性體胚細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞瘤、汗腺腺瘤、島細(xì)胞瘤、leydig細(xì)胞瘤、乳突淋瘤、滋養(yǎng)細(xì)胞瘤、卵泡膜細(xì)胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌細(xì)胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、室鼓膜瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)上皮瘤、纖維神經(jīng)瘤、神經(jīng)瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、非嗜鉻細(xì)胞、非角質(zhì)瘤、硬化性血管瘤、多發(fā)性血管瘤、血管球瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果體瘤、癌肉瘤、軟骨肉瘤、葉狀囊性肉瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白色肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤(Kaposi氏肉瘤和肥大細(xì)胞肉瘤)、腫瘤(例如骨癌、消化系統(tǒng)癌、肝癌、胰腺癌、垂體癌、睪丸癌、眼窩瘤、頭頸瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤、聲覺瘤、骨盆瘤、呼吸道瘤、以及泌尿生殖道瘤)、neurobromatosis、以及子宮頸非典型增生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的分析所述的富集部分中所述癌細(xì)胞的存在包括a.從所述癌細(xì)胞中釋放胞質(zhì)生物分子；b.分離所述的胞質(zhì)生物分子；以及c.分析所述的胞質(zhì)生物分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的獲得所述流體樣品是通過細(xì)胞分級(jí)分離。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的釋放是通過加入滲透劑實(shí)現(xiàn)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的滲透劑選自由去污劑、表面活性劑及它們的結(jié)合組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的滲透劑選自由皂角苷、Immuniperm及它們的結(jié)合組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的滲透劑是Immuniperm。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的獲得所述流體樣品是通過用細(xì)胞穩(wěn)定劑處理。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的穩(wěn)定劑選自由醛、脲及它們的結(jié)合組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的醛選自由甲醛、多聚甲醛及它們的結(jié)合組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的穩(wěn)定劑是二醛。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的二醛選自由戊二醛、乙二醛及它們的結(jié)合組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的穩(wěn)定劑選自由Cyto-chexTM、StabilocyteTM以及TransfixTM組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述胞質(zhì)生物分子的所述釋放涉及通過所述穩(wěn)定劑處理形成大分子復(fù)合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述胞質(zhì)生物分子從所述細(xì)胞的所述釋放是由酶消化產(chǎn)生的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述的酶消化是通過包括蛋白酶、親核試劑及它們的結(jié)合而發(fā)生的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的蛋白酶選自由蛋白酶K消化、V8蛋白酶消化、鏈霉蛋白酶消化及它們的結(jié)合組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的親核試劑選自由磷酸基緩沖液、tris基緩沖液、乙酰肼、羥胺及它們的結(jié)合組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的胞質(zhì)生物分子是蛋白質(zhì)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述蛋白質(zhì)的所述分離選自由化學(xué)提取、電泳、層析、免疫分離以及親和技術(shù)組成的組。
24.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的胞質(zhì)生物分子是核酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的核酸選自由胞質(zhì)RNA、細(xì)胞核和線粒體RNA、細(xì)胞核和線粒體DNA及它們的結(jié)合組成的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的核酸是胞質(zhì)mRNA。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述核酸的所述分離選自由RNA或DNA化學(xué)提取、電泳、層析、免疫分離以及親和技術(shù)組成的組。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述核酸的所述分離是通過用粘附到寡聚(dT)上的磁珠捕獲進(jìn)行的。
29.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述靶細(xì)胞的分析是用于表型表達(dá)，而不是在獲得所述流體樣品后以所述胞質(zhì)生物分子進(jìn)行的。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的表型表達(dá)選自由形態(tài)檢查、細(xì)胞成分染色、免疫分析及它們的結(jié)合組成的組。
31.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的分析是通過選自下面組的方法進(jìn)行的，包括多參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、免疫熒光顯微鏡方法、激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)、明視場(chǎng)基本圖像分析法、毛細(xì)管容量分析法、光譜圖像分析法、手工細(xì)胞分析法以及自動(dòng)細(xì)胞分析法。
32.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述胞質(zhì)生物分子的所述分析是通過功能蛋白質(zhì)學(xué)方法進(jìn)行的。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述的功能蛋白質(zhì)學(xué)方法選自下面的組，包括蛋白質(zhì)表達(dá)譜、Western印跡、氨基酸序列分析、電泳、2-D電泳、質(zhì)譜、氣相色譜、液相色譜、核磁共振、紅外光譜、原子吸收及它們的結(jié)合。
34.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述胞質(zhì)生物分子的所述分析是通過功能基因組學(xué)方法進(jìn)行的。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的功能基因組學(xué)方法選自下面的組，包括mRNA譜分析、蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、Northern印跡、Western印跡、核苷酸或氨基酸序列分析、微陣列上的基因表達(dá)、電泳、2-D電泳、質(zhì)譜、氣相色譜、液相色譜、核磁共振、紅外光譜以及原子吸收。
36.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中分析所述胞質(zhì)RNA中至少兩個(gè)遺傳標(biāo)記的存在是通過多基因RT-PCR進(jìn)行的。
37.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述遺傳標(biāo)記確定了所述癌細(xì)胞的組織來源。
38.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述遺傳標(biāo)記診斷已知的癌癥。
39.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述遺傳標(biāo)記確定了選自由乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎癌以及膀胱癌組成的組的癌癥。
40.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述遺傳標(biāo)記確定了癌癥，所述遺傳標(biāo)記選自MGB1、MGB2、PIP、CEA、PSA、PSMA、hK2、AR、DD3、Her-/Neu、BCL2、EGFR、TS、DPYD、IGF2、ER、PR、cyp19、TERT、常規(guī)上皮組織特異的基因、CK19、CK8、CK20、EpCAM、MUC1、拓?fù)洚悩?gòu)酶、uPA、uPAR、MMP、常規(guī)白細(xì)胞特異的mRNA、α-1-球蛋白、CD16、CD45、以及CD31。
41.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中分析所述胞質(zhì)RNA中的所述遺傳標(biāo)記包括a.用至少一組都在5′端具有通用引物延伸的基因特異性引物逆轉(zhuǎn)錄所述遺傳標(biāo)記；b.除去所述基因特異性引物；c.用所述的通用引物延伸在PCR擴(kuò)增中擴(kuò)增基因特異性擴(kuò)增子；以及d.鑒別所述的基因特異性擴(kuò)增子。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中所述基因特異性引物的所述去除是使用下面組的方法完成的，包括分子大小排阻、固體支持物選擇性附著、單鏈特異性DNase、以及結(jié)合尿嘧啶-N-糖基化酶與由脫氧尿苷合成的DNA寡核苷酸引物。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中所述基因特異性引物的所述去除是用尿嘧啶-N-糖基化酶處理由脫氧尿苷合成的DNA寡核苷酸引物而完成的。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的尿嘧啶-N-糖基化酶處理之后加入不含DNase的RNase。
45.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中所述的基因特異性引物是在高的引物-靶退火特異性條件下使用的。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述的高的引物-靶退火特異性是使用來自細(xì)胞修復(fù)機(jī)制的天然重組的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。
46.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述的高的引物-靶退火特異性是用recA實(shí)現(xiàn)的。
48.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中所述基因特異性擴(kuò)增子的所述鑒別是通過其在基于大小的分析系統(tǒng)中的獨(dú)特Rf值進(jìn)行的。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述的基于大小的分析系統(tǒng)選自由PAGE、瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、SELDI、MALDI、以及cDNA陣列組成的組。
50.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的分析包括a.通過線性擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增所述提取的核酸，其中所述的預(yù)擴(kuò)增造成所有庫(kù)轉(zhuǎn)錄本以aRNA的形式增加至少1000倍；b.從所述aRNA合成最多僅1000個(gè)獨(dú)立選擇的相關(guān)基因的第二鏈；以及c.使用下面組的方法識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物，包括陣列分析、電泳以及它們的結(jié)合。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述的預(yù)擴(kuò)增是通過由SP6 RNA聚合酶啟動(dòng)子、T3 RNA聚合酶啟動(dòng)子、以及T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子組成的組進(jìn)行的。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述預(yù)擴(kuò)增是由使用隨機(jī)引物的RNA聚合酶進(jìn)行的。
53.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述的第二鏈的所述合成是在高的引物-靶退火特異性條件下進(jìn)行的。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中所述的高的引物-靶退火特異性是使用來自細(xì)胞修復(fù)機(jī)制的天然重組的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中所述的高的引物-靶退火特異性是用recA實(shí)現(xiàn)的。
56.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述的識(shí)別是通過使用不含DNase的RNase預(yù)處理進(jìn)行的。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述的預(yù)處理選自由酚萃取、二氧化硅結(jié)合以及它們的結(jié)合組成的組。
58.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述的識(shí)別是通過所有的雙鏈產(chǎn)物的擴(kuò)增進(jìn)行的。
59.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述的識(shí)別選自由陣列分析、電泳以及它們的結(jié)合組成的組。
60.一種用于篩選患者樣品中循環(huán)癌細(xì)胞存在的測(cè)試試劑盒，包括a.免疫磁學(xué)微粒，其中所述微粒特異性結(jié)合癌細(xì)胞；b.細(xì)胞滲透劑；c.細(xì)胞穩(wěn)定劑；d.核酸釋放試劑；e.核酸擴(kuò)增試劑；f.純化試劑，其中選擇所述的純化試劑用于雙鏈產(chǎn)物；g.核苷酸特異性檢測(cè)試劑，其中所述的檢測(cè)試劑能夠確定雙鏈產(chǎn)物；以及h.使用權(quán)利要求1的方法的說明書。
61.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的試劑盒進(jìn)一步包括具有對(duì)所述癌細(xì)胞的結(jié)合特異性的免疫磁學(xué)微粒。
62.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的細(xì)胞滲透劑選自由皂角苷、去污劑、表面活性劑以及它們的結(jié)合組成的組。
63.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的滲透劑是Immuniperm。
64.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的穩(wěn)定劑選自由醛、二醛、脲以及它們的結(jié)合組成的組。
65.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的穩(wěn)定劑選自由Cyto-chexTM、StabilocyteTM以及TransfixTM組成的組。
66.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的釋放試劑選自由蛋白酶、親核試劑以及它們的結(jié)合組成的組。
67.如權(quán)利要求66所述的試劑盒，其中所述的蛋白酶選自由蛋白酶K、V8蛋白酶、鏈霉蛋白酶以及它們的結(jié)合組成的組。
68.如權(quán)利要求66所述的試劑盒，其中所述的親核試劑選自由磷酸基緩沖液、tris基緩沖液、乙酰肼、羥胺以及它們的結(jié)合組成的組。
69.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的純化試劑是對(duì)所述核酸具有結(jié)合特異性的免疫磁學(xué)微粒。
70.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的純化試劑選自由RNA或DNA化學(xué)提取劑、電泳劑、層析劑、免疫分離劑以及核苷酸親和劑組成的組。
71.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的擴(kuò)增試劑選自由SP6RNA聚合酶/啟動(dòng)子、T3 RNA聚合酶/啟動(dòng)子、以及T7 RNA聚合酶/啟動(dòng)子組成的組，所述的擴(kuò)增試劑將核酸量增加1000倍。
72.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的擴(kuò)增試劑是RNA聚合酶/隨機(jī)引物，所述的擴(kuò)增試劑將核酸量增加1000倍。
73.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的擴(kuò)增試劑是聚合酶/具有高的引物-靶退火特異性的引物。
74.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的純化試劑是不含DNase的RNase。
75.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的純化試劑選自由酚萃取試劑和二氧化硅結(jié)合試劑組成的組。
76.如權(quán)利要求60所述的試劑盒，其中所述的核苷酸特異性檢測(cè)試劑選自由雙鏈核苷酸擴(kuò)增試劑、陣列分析試劑、和電泳試劑組成的組。
全文摘要
公開了一種高敏感性的分析法，其利用了一種方法來從血液中發(fā)現(xiàn)的稀有細(xì)胞和稀有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行基因特異性的mRNA庫(kù)的引物擴(kuò)增。該分析法通過免疫磁法富集的方式可以檢測(cè)到1到10個(gè)細(xì)胞分離的稀有的mRNA(10個(gè)拷貝/細(xì)胞)。該分析法是多重PCR的改進(jìn)，可以有效檢測(cè)血液中的循環(huán)癌細(xì)胞的稀有編碼序列。該方法適用于分離自組織或體液的的細(xì)胞的分析，以及作為臨床檢測(cè)各種癌的輔助手段，包括循環(huán)癌細(xì)胞的早期檢測(cè)和分類。以傳統(tǒng)的或者微陣列方式進(jìn)行的細(xì)胞核酸和蛋白質(zhì)圖譜的監(jiān)視，有助于治療介入的管理，包括病情分期、治療響應(yīng)的監(jiān)測(cè)、癥狀緩解的確認(rèn)以及恢復(fù)的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1610752SQ02826131
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2002年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月26日
發(fā)明者S·M·奧哈拉, D·茲維茨, B·福爾克 申請(qǐng)人:免疫公司