專利名稱：通過活化血紅蛋白清除劑受體生產(chǎn)血細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及刺激干細胞生長、增殖、分化和/或動員以生產(chǎn)血細胞的方法和組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及刺激血細胞生成的方法，包括分別通過刺激干細胞以及紅細胞系和髓細胞系祖細胞以刺激紅細胞生成和髓細胞生成。
背景技術(shù)：
最近已經(jīng)鑒定了單核細胞和巨噬細胞上的血紅蛋白清除劑受體(Kristiansen，2001)。該受體通過介導(dǎo)觸珠蛋白一血紅蛋白復(fù)合物的胞吞作用而清除血紅蛋白。該受體已經(jīng)鑒定為M130/CD163，是急性期調(diào)節(jié)的跨膜蛋白質(zhì)，據(jù)報道專門在單核細胞和巨噬細胞上表達。CD163屬于富含半胱氨酸的B基團清除劑受體超家族，該受體家族包括分別存在于B、T和CD4-8-γδT淋巴細胞上的CD5、CD6和WC1。血紅蛋白和多聚體觸珠蛋白的復(fù)合物與血紅蛋白和二聚體觸珠蛋白的復(fù)合物相比，對CD163的功能性親和力更高。
先前對培養(yǎng)的單核細胞上抗體介導(dǎo)的CD163交聯(lián)進行研究已經(jīng)證明表面CD163的連接誘導(dǎo)酪氨酸激酶依賴性信號，引起細胞內(nèi)鈣的動員、肌醇三磷酸產(chǎn)生以及抗炎癥細胞因子(包括白細胞介素6(IL-6)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF))分泌增強(van denHeuvel等人，1999)。
紅細胞生成作用定義為血細胞的產(chǎn)生和發(fā)育，包括紅細胞、粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞(esoinophils)、嗜堿性粒細胞、巨核細胞、B細胞和T細胞(Wintrobe，1999)。發(fā)生紅細胞生成作用是造血干細胞增殖和分化的結(jié)果。造血干細胞是多潛能細胞，能夠產(chǎn)生血液中發(fā)現(xiàn)的多個細胞系。造血干細胞存在于骨髓中，其生長、增殖和分化受造血生長因子和骨髓內(nèi)基質(zhì)細胞的影響。干細胞被認為平常以靜止的非分裂狀態(tài)存在，直至受到特異的生長因子的刺激，其于是分裂并產(chǎn)生高度增殖性祖細胞，產(chǎn)生一種或多種血細胞系，例如紅細胞系、髓細胞系或淋巴細胞系。
稱為血細胞減少癥的某些臨床疾病，其特征在于循環(huán)血液中特定類型細胞的水平降低。例如中性粒細胞減少癥是循環(huán)中的中性粒細胞水平減低的一種疾病。該疾病可利用兩種不同的造血生長因子GM-CSF或G-CSF治療。然而，使用這些生長因子常常伴隨高發(fā)的不良副作用。例如，同種異體的骨髓移植后給藥G-CSF可引起呼吸困難、胸痛、惡心、低氧血癥、發(fā)汗、過敏性反應(yīng)、昏厥和面色潮紅(Khoury等人，2000)。
中性粒細胞減少癥也和AIDS相關(guān)，其當(dāng)前用生長因子治療(Dubreui1-Lemaire等人，2000)。還有嚴重的先天性中性粒細胞減少癥的形式(Dale等人，2000)，其中生長因子給藥治療對很低百分比的患者無效。
貧血癥是血紅蛋白不足以滿足身體對氧運輸需求的病理結(jié)果。歷史上，利用血液或紅細胞輸血治療某些貧血癥。多種輸血相關(guān)的并發(fā)癥(包括溶血、發(fā)熱和變態(tài)反應(yīng)，以及傳播疾病的可能性)使這種療法不夠理想。在治療貧血癥中需要刺激紅細胞生長和發(fā)育(紅細胞生成)。貧血癥有幾種病因，包括過量失血、紅細胞破壞增加、紅細胞合成降低以及血紅蛋白產(chǎn)生異常。缺鐵(飲食、胃腸道吸收不良(maladsorption)、發(fā)育紅細胞運輸鐵或利用鐵的效率低)、紅細胞生成素(Epo)生成不足(腎功能障礙)或者骨髓衰退可引起紅細胞產(chǎn)生減少。既然在鐵和Epo依賴性貧血癥中骨髓的紅細胞生成活性完好，可以分別用鐵或Epo治療這種貧血癥。
缺鐵性貧血癥一般通過口服或靜脈內(nèi)給予鐵進行治療。慢性腎衰竭患者由于腎臟不能生成Epo，一般患有Epo依賴性貧血癥。這些患者經(jīng)受透析，并90％是臨床上貧血的。傳統(tǒng)治療透析患者的貧血癥包括多次輸血，其已經(jīng)基本由給予EPO所取代。實際上，大約88％的透析患者用Epo治療。Epo治療的患者中，三分之一發(fā)展為高血壓，一般利用抗高血壓藥物進行糾正。紅細胞系祖細胞經(jīng)Epo刺激分化為成熟紅細胞，并合成紅細胞的主要蛋白質(zhì)，血紅蛋白。
Epo治療的主要限制因素是長期治療的費用。慢性腎衰竭患者一般使用的Epo劑量為225單位/公斤/周，分三次給藥。在美國，對于Epo治療的醫(yī)療保險每1,000單位償付$10.00，因此70公斤患者一般每年的費用將是大約$8,000。1995年，175,000名美國患者透析，僅該病的市場就超過八億八千三百萬美元。估計1996年治療費用為約11億美元。因此，可降低治療貧血癥所需Epo的新療法對患者和保健系統(tǒng)均有益。發(fā)現(xiàn)能夠降低治療Epo依賴性貧血癥所需Epo的其它藥物將有益處。
此外，很多貧血癥對Epo治療沒有響應(yīng)。該類貧血癥的例子包括化療誘導(dǎo)的貧血癥以及慢性疾病(包括惡性腫瘤)的貧血癥。獲得性免疫缺陷患者也會患有貧血癥，用AZT治療的AIDS患者也如此?？赡苡捎贓po生成抑制或者骨髓對Epo的反應(yīng)性降低而致無效性紅細胞生成，從而引起該類貧血癥。治療這類貧血癥包括治療其原發(fā)的病癥。然而，如果原發(fā)病癥不容易治療，那么貧血癥的治療可包括紅細胞輸血。輸血不利的副作用包括急性和遲延性溶血反應(yīng)，以及潛在的輸血傳播性疾病。
由此看來，本領(lǐng)域有必要開發(fā)通過刺激患者血細胞生成而增加血細胞數(shù)目的改進方法。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)確定活化血紅蛋白清除劑受體CD163能夠刺激紅細胞系和髓細胞系祖細胞兩者的生長、增殖和分化，導(dǎo)致血細胞生成增加。本發(fā)明人還證明CD34+造血干細胞表達CD163。
因此，本發(fā)明提供了刺激能夠表達CD163受體、或者能夠?qū)υ撌荏w刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進行應(yīng)答的干細胞的生長、增殖、分化和/或動員的方法，包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化干細胞CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明也提供刺激血細胞生成的方法，包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明進一步提供刺激紅細胞生成的方法，包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明還提供刺激髓細胞生成的方法，包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明也包括藥物組合物，其包含有效量的、與適當(dāng)?shù)南♂寗┗蜉d體混合的、能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明另外提供細胞培養(yǎng)添加劑，其用于增強干細胞和/或祖細胞以及細胞的生長、增殖、分化和/或動員，其包含有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明也提供選擇樣品中干或祖細胞的方法，包含(a)將樣品與能夠結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細胞。
根據(jù)以下詳細說明書，顯而易見本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。然而應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的詳細說明書以及表示本發(fā)明優(yōu)選實施方案的特定實施例僅以說明方式給出，因為在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變更和修改對本詳細說明書領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是顯而易見的。
附圖簡述本發(fā)明將結(jié)合附圖進行描述，其中

圖1為利用抗CD163抗體的CD34+細胞的Western印跡分析。
圖2表明造血集落形成試驗中CD163抗體的影響。
圖3表明從BFU-E集落制備的細胞裂解物中可檢測到CD163免疫反應(yīng)性。
發(fā)明詳述I.發(fā)明方法如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)證明CD34+干細胞表達血紅蛋白清除劑受體CD163。因此，本發(fā)明提供了刺激干細胞生長、增殖、分化和/或動員的方法，其包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化干細胞上CD163的物質(zhì)。本發(fā)明也提供了有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)刺激干細胞生長、增殖、分化和/或動員的用途。本發(fā)明另外提供了有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備刺激干細胞生長、增殖、分化和/或動員的藥物的用途。
此處所用短語″能夠活化CD163的物質(zhì)″包括能夠結(jié)合、交聯(lián)或者連接細胞上CD163血紅蛋白清除劑受體或者CD163相關(guān)受體、并導(dǎo)致刺激該細胞生長、增殖、分化和/或動員的所有物質(zhì)。該術(shù)語還包括能夠激活因響應(yīng)CD163或CD163相關(guān)受體的活化而活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的任何物質(zhì)。例如，該物質(zhì)可激活因響應(yīng)CD163的活化而活化的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括而不限于酪氨酸激酶、鈣動員以及肌醇三磷酸(IP3)和肌醇四磷酸(IP4)動員。短語″能夠活化CD163途徑的物質(zhì)″進一步包括，可阻斷因響應(yīng)CD163或CD163相關(guān)受體的活化而活化的任何信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑失活的任何物質(zhì)。
此處所用短語″刺激干細胞的生長、增殖、分化和/或動員″是指與不存在該物質(zhì)時的干細胞的生長、增殖、分化和/或動員相比，能夠刺激或增強干細胞生長、增殖、分化和/或動員的物質(zhì)。
此處所用術(shù)語″有效量″是指在達到所希望的結(jié)果(例如，刺激干細胞、紅細胞系和/或髓細胞系祖細胞的生長、增殖、分化和/或動員和/或刺激血細胞生成、紅細胞生成或髓細胞生成)所需的劑量和時間的有效量。
此處所用術(shù)語″動物″包括動物界的所有成員，優(yōu)選人類。給予動物一種物質(zhì)包括體內(nèi)和離體給藥。
此處所用術(shù)語″細胞″包括單個細胞以及多個細胞或細胞群體。給予細胞一種物質(zhì)包括體外和體內(nèi)給藥。
此處所用術(shù)語″干細胞″是指能夠在動物中分化為包括造血細胞在內(nèi)的任何細胞的細胞。干細胞表達或者能夠表達CD163受體或者應(yīng)答該受體刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
優(yōu)選的干細胞是CD34+干細胞。傳統(tǒng)上認為CD34+細胞是″干″細胞是由于它們能夠自我更新并用各系造血細胞重新增殖為個體。利用共同表達的其它標志(例如CD38)及其再輸入并重新增殖造血系統(tǒng)的能力，將CD34+細胞進一步分為亞群(例如Henon等人，2001)。
刺激干細胞可促進從血管外骨髓處到循環(huán)血液的干細胞動員，這是將供者外周血用于自體或異體移植所需的方案。重組人G-CSF廣泛用來動員CD34+干細胞(綜述參見Korbling，1998)。本發(fā)明人已經(jīng)證明CD34+細胞表達CD163，刺激該細胞的CD163途徑很可能會使其生長和增殖，并可能動員到外周血中。代之以使用CD163的刺激物(例如交聯(lián)的抗體)或聯(lián)用減量的G-CSF可以動員可移植的干細胞，而沒有與細胞因子給藥有關(guān)的副作用。
本發(fā)明人已經(jīng)表明，活化CD163途徑可用于刺激多系血細胞生成，因為已經(jīng)證明能夠通過活化CD163刺激紅細胞系和髓細胞系祖細胞。刺激血細胞生成用于產(chǎn)生血細胞以及免疫系統(tǒng)的細胞，包括紅細胞、髓細胞(例如單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和巨核細胞)和淋巴細胞(B細胞、T細胞和NK細胞)，以及髓樣和淋巴樣起源的樹突狀細胞。
因此，本發(fā)明提供刺激血細胞生成的方法，其包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)刺激血細胞生成的用途。本發(fā)明進一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備刺激血細胞生成的藥物的用途。
刺激血細胞生成用于治療多種疾病，包括細胞減少癥，并用于刺激血細胞發(fā)育以供移植之用，或者刺激免疫系統(tǒng)的細胞以用于治療免疫缺陷。
此處所用短語″刺激血細胞生成″是指與不存在該物質(zhì)時的適血干細胞或祖細胞的生長、增殖、分化和/或動員相比，能夠刺激或增強造血干細胞或造血祖細胞(例如紅細胞系、髓細胞系或淋巴細胞系祖細胞)生長、增殖、分化和/或動員的物質(zhì)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定能夠活化CD163的物質(zhì)是否能刺激血細胞生成。例如，集落形成試驗是定量造血干細胞和祖細胞的方法(McCulloch，1984)。在集落形成試驗中，將細胞鋪于半固體培養(yǎng)基例如甲基纖維素，其中含有支持造血祖細胞生長、存活和分化的各種細胞因子。形成的造血集落種類包括紅細胞系爆式集落形成單位(BFU-E)、紅細胞系集落生成單位(CFU-E)、粒細胞巨噬細胞系集落形成單位(CFU-GM)、巨噬細胞系集落形成單位(CFU-M)、巨核細胞系集落形成單位(CFU-Meg)以及粒細胞、紅細胞、單核細胞、巨核細胞系(GEMM)集落。在半固體試驗中，干或祖細胞可應(yīng)答各種細胞因子，已經(jīng)針對紅細胞系祖細胞(例如聯(lián)用IL-3和EPO)的生長和分化或成粒細胞系/單核細胞系集落(例如IL-10、IL-6和SCF)優(yōu)化了這些細胞因子的組合。需要某些組合(除計數(shù)更原始的″混合″集落以外)來分別計數(shù)髓細胞系和紅細胞系集落(例如，包括G-CSF和GM-CSF的組合，綜述參見Messner；1991，718-22)。
每個干細胞或祖細胞增殖并分化形成形態(tài)不同的集落。根據(jù)其在半固體培養(yǎng)基中生成形態(tài)上可識別的集落的能力來鑒定兩種功能不同的紅細胞系祖細胞(BFU-E和CFU-E)。BFU-E代表最原始的紅細胞系祖細胞，形成大的多叢(multi-clustered)血紅蛋白化集落。CFU-E是更加分化的紅細胞系祖細胞，形成較小的血紅蛋白化集落。BFU-E是可以確認的最原始祖細胞，完全負責(zé)紅細胞生成，并比較成熟的CFU-E具有更大的自我更新能力。紅細胞系祖細胞集落的發(fā)育一般需要培養(yǎng)基中存在紅細胞生成素(Epo)。然而在初期，原始的紅細胞系祖細胞以Epo非依賴方式增殖。
集落形成試驗提供了定量造血干細胞和祖細胞的方法，也為獲得有關(guān)影響干和祖細胞后代增殖和分化的因素的信息提供了方法。例如，紅細胞系祖細胞集落起源于單個祖細胞的分裂和分化，因此成熟集落主要由血紅蛋白化的有核紅細胞組成。形態(tài)學(xué)上，紅細胞系集落的大小可提供有關(guān)紅細胞系祖細胞后代增殖的速率或幅度的信息。此外，較紅的紅細胞系集落提示血紅蛋白含量較多，并且有核紅細胞的分化度可能較高。
如前所述，本發(fā)明人已經(jīng)表明CD163活化可增強紅細胞系細胞的增殖和分化。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明提供刺激紅細胞生成的方法，其包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)刺激紅細胞生成的用途。本發(fā)明進一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備刺激紅細胞生成的藥物的用途。
此處所用短語″刺激紅細胞生成″是指與不存在該物質(zhì)時紅細胞系細胞或紅細胞系祖細胞或干細胞的生長增殖、分化和/或動員相比能夠刺激或增強紅細胞系細胞或紅細胞系祖細胞或干細胞生長、增殖、分化和/或動員的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定能夠活化CD163的物質(zhì)是否能刺激紅細胞生成。例如，可以使用如上所述以及實施例中所述的集落形成試驗。
刺激紅細胞生成可用于治療貧血癥。因此，在特定實施方案中，本發(fā)明涉及治療貧血癥的方法，其包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)治療貧血癥的應(yīng)用。本發(fā)明進一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備治療貧血癥的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明人也已表明，活化CD163可增強髓細胞系細胞的增殖。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明提供刺激髓細胞生成的方法，其包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)刺激骨髓細胞生成的應(yīng)用。本發(fā)明進一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備刺激骨髓細胞生成的藥物的應(yīng)用。
此處所用短語″刺激髓細胞生成″是指與不存在該物質(zhì)時髓細胞或髓細胞系祖細胞或干細胞的生長、增殖、分化和/或動員相比，能夠刺激或增強髓細胞或髓細胞系祖細胞或干細胞生長、增殖、分化和/或動員的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定能夠活化CD163的物質(zhì)是否能刺激髓細胞。例如，可以使用如上所述以及實施例中所述的集落形成試驗。
刺激骨髓細胞生長、增殖、分化和/或動員可用于治療中性粒細胞減少癥。通過CD163途徑活化CD163而刺激骨髓細胞可以取代或增強生長因子對于克服骨髓移植相關(guān)的中性粒細胞減少的效果，而且具有副作用較小的好處。該方法還能用來治療AIDS相關(guān)的中性粒細胞減少癥或者嚴重的先天性中性粒細胞減少癥。因此，在特定實施方案中，本發(fā)明提供治療中性粒細胞減少癥的方法，其包含給予有此需要的細胞或動物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)治療中性粒細胞減少癥的應(yīng)用。本發(fā)明進一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備治療中性粒細胞減少癥的藥物的應(yīng)用。
此處所用以及本領(lǐng)域所理解的″治療″是為了獲得有利的或者期望得到的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方法。有利的或者期望得到的臨床結(jié)果可包括而不限于，減輕或改善一種或多種癥狀或病情、降低疾病程度、穩(wěn)定(即不惡化)疾病狀況、預(yù)防疾病傳播、延遲或減緩疾病發(fā)展、改善或緩和病況以及緩解(無論部分或全部)，無論其是否可以檢測到。″治療″還可以意味著與若不接受治療的預(yù)期存活相比存活延長。
II.活化CD163的物質(zhì)本發(fā)明包括可活化CD163(如上所述)的任何和所有物質(zhì)在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。該物質(zhì)可以是任何類型的物質(zhì)，包括而不限于蛋白質(zhì)(例如抗體)、肽、核酸、碳水化合物、有機化合物、無機化合物、小分子、藥物、CD163配基、CD163受體的可溶性形式、CD163的任何和所有激動劑以及抑制CD163拮抗劑的任何和所有物質(zhì)。
在優(yōu)選實施方案中，活化CD163的物質(zhì)是與所治療細胞的CD163受體結(jié)合的物質(zhì)。結(jié)合CD163的物質(zhì)的例子包括抗體和CD163配基。
(a)抗體在特定的實施方案中，可活化CD163的物質(zhì)是與CD163受體結(jié)合的抗體。CD163的抗體可來自易于得到的商業(yè)來源，例如Serotec Inc.或Maine Biotechnology Services。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本領(lǐng)域已知技術(shù)很容易制備CD163的抗體，例如Kohler和Milstein，Nature 1975，256495以及美國專利NO.RE 32，011；4,902,614；4,543,439和4,411,993所述技術(shù)，在此引入以供參考。(也參見Monoclonal Antibodies，HybridomasA New Dimension inBiological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKearn，andBechtol(eds.)，1980，以及AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow and Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988，也在此引入以供參考)。
例如，利用標準方法，通過使用CD163的肽可制備多克隆抗血清或單克隆抗體?？梢杂迷诓溉閯游镏幸l(fā)抗體反應(yīng)的免疫原性肽免疫哺乳動物(例如小鼠、倉鼠或兔)。給予肽免疫原性的技術(shù)包括結(jié)合載體或者本領(lǐng)域公知的其它技術(shù)。例如，可以在佐劑存在下給予蛋白質(zhì)或肽?？梢酝ㄟ^檢測血漿或者血清中的抗體滴度監(jiān)測免疫進程。標準ELISA或者其它的免疫測定方法能夠以免疫原為抗原來評定抗體的水平。免疫之后，可以得到抗血清，如果需要，還可從血清中分離多克隆抗體。
為了制備單克隆抗體，可以從免疫動物收集抗體產(chǎn)生細胞(淋巴細胞)，利用標準的體細胞融合方法與骨髓瘤細胞融合，從而使這些細胞永生化，產(chǎn)生雜交瘤細胞。該技術(shù)為本領(lǐng)域所公知(例如，Kohler和Milstein最先開發(fā)的雜交瘤技術(shù)(Nature 256，495-497(1975))以及其它技術(shù)，例如人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，Immunol.Today 4，72(1983))，制備人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy(1985)Allen R.Bliss，Inc.，pages 77-96)，以及組合抗體文庫的篩選(Huse等人，Science246，1275(1989))。免疫化學(xué)篩選可產(chǎn)生與肽特異性反應(yīng)的抗體的雜交瘤細胞，分離單克隆抗體。
此處所用術(shù)語″抗體″意在包括也與CD163特異性反應(yīng)的其片段或其肽?？贵w可以利用傳統(tǒng)方法片斷化，并利用上述相同方法篩選該片段。例如，可以通過用胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生F(ab’)2片段。得到的F(ab’)2片段經(jīng)處理還原二硫鍵制備Fab’片段。
嵌合抗體衍生物(即結(jié)合非人動物可變區(qū)和人恒定區(qū)的抗體分子)也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。嵌合抗體分子可包括例如小鼠、大鼠或其它物種抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及人的恒定區(qū)?？捎贸Ｒ?guī)方法來制備包含識別CD163抗原的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體。(例如參見Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985)；Takeda等人，Nature 314，452(1985)，Cabilly等人，美國專利No.4,816,567；Boss等人，美國專利No.4,816,397；Tanaguchi等人，歐洲專利公開EP171496；歐洲專利公開0173494，英國專利GB 2177096B)?？梢云谕逗峡贵w比相應(yīng)的非嵌合抗體在人類受試者中的免疫原性可能更小。
此處所述的與本發(fā)明的蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)的單克隆或嵌合抗體，可以通過制備人恒定區(qū)的嵌合體而進一步人源化，其中可變區(qū)部分，特別是抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守框架區(qū)來源于人，只有高變區(qū)是非人類來源。可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備這種免疫球蛋白分子(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，7308-7312(1983)；Kozbor等人，Immunology Today，4，7279(1983)；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92，3-16(1982))，以及PCT公開WO92/06193或EP0239400)。人源化抗體還可以是商業(yè)上制備的(Scotgen Limited，2Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain.)也可以通過篩選編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達文庫(在細菌中表達由編碼CD163或其部分的核酸分子產(chǎn)生的肽)產(chǎn)生與CD163反應(yīng)的特異性抗體或抗體片段。例如，可以利用噬菌體表達文庫在細菌中表達完整的Fab片段、VH區(qū)和FV區(qū)(例如參見Ward等人，Nature341，544-546(1989)；Huse等人，Science 246，1275-1281(1989)；以及McCafferty等人，Nature 348，552-554(1990))。另外，SCID-hu小鼠(例如Genpharm Inc開發(fā)的模型)可用于制備抗體或其片段。
本發(fā)明的抗體也包括雙功能抗體，其包含與干細胞表面上另一抗原的特異性抗體直接連接的CD163特異性抗體。將一個抗體與另一抗體化學(xué)偶聯(lián)(例如使用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二巰基)丙酸酯(SPDP))可制備雙功能抗體。本發(fā)明的C35抗體還包括雙特異性抗體。雙特異性抗體包含CD163特異性抗體的可變區(qū)以及特異性針對所靶向的干細胞表面上至少一種抗原的可變區(qū)。雙特異性抗體可通過形成雜合的雜交瘤來制備。雜合的雜交瘤可利用本領(lǐng)域已知的方法制備，例如Staerz & Bevan(1986，PNAS(USA)831453)以及Staerz & Bevan(1986，Immunology Today，7241)公開的方法。雙特異性抗體也可通過化學(xué)方法構(gòu)建，例如利用Staerz等人(1985，Nature，314628)以及Perez等人(1985，Nature，316354)描述的方法，或者通過表達重組免疫球蛋白基因構(gòu)建體的方法構(gòu)建。
(b)其它物質(zhì)除抗體之外，可活化CD163的其它物質(zhì)也可以鑒定并用于本發(fā)明的方法中。例如，可通過將CD163與可能結(jié)合CD163的物質(zhì)反應(yīng)，然后檢測在CD163和該物質(zhì)之間是否形成復(fù)合物來鑒定可以結(jié)合干細胞或祖細胞上CD163的物質(zhì)?？梢赃M一步評價在此分析中結(jié)合CD163的物質(zhì)以確定其是否適用于本發(fā)明的方法。
因此，本發(fā)明也包括可結(jié)合CD163的物質(zhì)的鑒定方法，包含以下步驟(a)在能夠使CD163和待測物質(zhì)形成復(fù)合物的條件下，將CD163和待測物質(zhì)反應(yīng)，以及(b)分析CD163和待測物質(zhì)的復(fù)合物、游離的該物質(zhì)或者未復(fù)合的CD163，其中存在復(fù)合物表明待測物質(zhì)能夠結(jié)合CD163。
可考慮諸如該物質(zhì)和該蛋白質(zhì)的性質(zhì)和量因素，選擇使該物質(zhì)和CD163的復(fù)合物形成的條件。
可利用常規(guī)分離技術(shù)(例如鹽析、層析、電泳、凝膠過濾、分級分離、吸附、聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝集或其組合)分離物質(zhì)-CD163復(fù)合物、游離物質(zhì)或未復(fù)合的蛋白質(zhì)。為了便于組分分析，可使用針對CD163或該物質(zhì)的抗體、或標記的CD163、或標記的物質(zhì)。可以用可檢測的物質(zhì)標記抗體、CD163或該物質(zhì)。
本發(fā)明方法使用的CD163或待測物質(zhì)可以是不溶性的。例如，CD163或該物質(zhì)可結(jié)合合適的載體。合適載體的例子有瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、Sephadex、Sepharose、聚苯乙烯羧甲基纖維素、濾紙、離子交換樹脂、塑料膜、塑料管、玻璃珠、二氧化硅、聚胺-甲基乙烯基-醚-馬來酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-馬來酸共聚物、尼龍、絲等。載體可能是例如管、試驗板、珠、圓盤、球等形狀。
可利用已知的化學(xué)或物理方法，例如溴化氰偶聯(lián)，通過該物質(zhì)與合適的不溶性載體反應(yīng)而制備不溶性的CD163或物質(zhì)。
上述分析中，CD163或待測物質(zhì)也可表達在細胞表面上。
III.組合物本發(fā)明也包括包含可活化CD163的物質(zhì)的藥物組合物，其用于刺激血細胞生成、刺激紅細胞生成、刺激髓細胞生成或刺激干細胞和/或祖細胞生長、增殖、分化和/或動員。因此，本發(fā)明提供刺激血細胞生成的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合的有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明也提供刺激紅細胞生成的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合的有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明也提供刺激髓細胞生成的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合的有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明進一步提供刺激干細胞生長、增殖、分化和/或動員的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明進一步提供刺激紅細胞系的和/或髓細胞系細胞生長、增殖、分化和/或動員的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合的有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
為了刺激紅細胞生成，該藥物組合物可另外包含一種或多種造血生長因子，例如紅細胞生成素。為了刺激髓細胞生成，該藥物組合物可另外包含一種或多種造血生長因子，例如G-CSF，GM-CSF，IL-3等。
這種藥物組合物可以傷口內(nèi)、靜脈內(nèi)、表面、直腸、非腸道、局部、吸入或皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)腹膜、口腔和腦內(nèi)使用。該組合物可以是液體、固體或半固體形式，例如丸、片、膏、膠囊(gelatincapsules)、膠囊(capsules)、栓、軟膠囊、凝膠、膜、小管、溶液或混懸液。
本發(fā)明的藥物組合物可用于人或動物給藥。給藥劑量取決于個體需求、預(yù)期效果和選擇的給藥途徑。
可以利用本身已知的制備可給予病人的藥物可接受的組合物的方法來制備藥物組合物，這樣將有效量的活性物質(zhì)與藥物可接受的賦形劑組合成混合物。例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences描述了合適的賦形劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)。
在此基礎(chǔ)上，該藥物組合物包含而不僅僅限于活性化合物或物質(zhì)，其結(jié)合一種或多種藥物可接受的賦形劑或稀釋劑，并包含于合適pH以及與生理性液體等滲的緩沖液中。該藥物組合物也另外包含其它的藥劑，例如可以刺激血細胞生成、紅細胞生成或髓細胞生成、或者可以刺激干細胞和/或祖細胞生長、增殖、分化和/或動員的其它藥劑。
IV.培養(yǎng)添加劑可活化CD163的物質(zhì)可用作培養(yǎng)基的添加劑增強哺乳動物祖細胞或干細胞生長、增殖、分化和/或動員，或者刺激血細胞生成、紅細胞生成或髓細胞生成。因此，本發(fā)明提供了用于增強祖細胞和/或干細胞生長、增殖、分化和/或動員的細胞培養(yǎng)添加劑，其包含有效量的可活化CD163的物質(zhì)?；罨疌D163的物質(zhì)可以添加到傳統(tǒng)上用于造血干細胞表達的無血清培養(yǎng)基中。例如，添加生長因子(例如干細胞因子(SCF)、白細胞介素3(IL-3)、GM-CSF、Flt配基(FL)、血小板生成素(TPO)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF))的無血清培養(yǎng)基(Kobari等人，2000所述)能夠補充可活化CD163的物質(zhì)。
V.細胞富集或檢測如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)證明來源于臍帶血液或者成人骨髓或外周血的CD34+細胞上存在CD163受體。這些細胞上存在CD163提供了重要的研究和臨床工具，因為能夠進一步檢查CD34+/CD163+亞群細胞再移植和重新增殖造血系統(tǒng)各部分的能力。此外，可以根據(jù)CD163的表達富集或分選各種來源(骨髓、動員的外周血或臍帶血)的″干″細胞。
因此，本發(fā)明提供選擇樣品中造血祖細胞或干細胞的方法，包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細胞。
在優(yōu)選實施方案中，該物質(zhì)是可結(jié)合CD163的抗體，利用免疫化學(xué)技術(shù)選擇細胞。例如，利用抗CD163抗體，將抗體與固相支持物復(fù)合，將CD163陽性細胞從樣品的其它細胞中去除，然后從固相支持物上去除CD163陽性細胞，可以″分選″或選擇表達CD163受體的干細胞。例如，抗CD163抗體可以與磁珠復(fù)合。CD163陽性細胞可以結(jié)合抗體，并利用磁力源與樣品中其它細胞分開。與非CD163陽性細胞分離后，將CD163陽性細胞和磁珠分離。另外，利用熒光標記的抗CD163通過熒光活化細胞分選(FACS)，干細胞上CD163的表達可用于分選這些細胞。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，許多純化CD163陽性細胞的其它方法應(yīng)當(dāng)是顯而易見的。該方法可用于選擇能夠形成紅細胞系和髓細胞系集落的細胞，或者潛在地能夠利用紅細胞系和髓細胞系細胞重新繁殖生物體的細胞。因此，本發(fā)明提供選擇能夠形成紅細胞系和髓細胞系集落的細胞的方法，包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細胞，其中結(jié)合的細胞能夠形成紅細胞系和髓細胞系集落。本發(fā)明也提供選擇潛在地能夠利用紅細胞系和髓細胞系細胞重新繁殖生物體的細胞的方法，包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細胞，其中結(jié)合的細胞潛在地能夠利用紅細胞系和髓細胞系細胞重新繁殖生物體。
本發(fā)明還包括在陰性選擇方案中可結(jié)合CD163的物質(zhì)(例如抗體)從樣品中去除祖細胞或干細胞的應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供從樣品中去除造血細胞的方法，包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)從樣品中去除與該物質(zhì)結(jié)合的細胞。
以下非限制性實施例闡釋本發(fā)明實施例實施例1CD34+細胞表達CD163來源于冷凍保存的成人骨髓(ABM)的CD34+細胞，利用Cytofix/Cytoperm溶液(Pharmingen Transduction Laboratories，adivision of BD BioSciences；Becton，Dickson and Company)4℃滲透30分鐘，洗滌后與熒光標記的同型對照抗體(IgG1-FITC)或熒光標記的Mac-158小鼠抗人CD163單克隆抗體(MBS；Mac158-FITC)溫育。在平行實驗中，來自相同骨髓樣品的細胞也用熒光標記的抗CD34(HPCA-2-PE)和抗CD45(H130-FITC)進行細胞外染色。利用EPICSXL流式細胞儀(Beckman Coulter，Inc)分析樣品。結(jié)果如表1所示，表明超過95％的骨髓細胞是CD34/CD45+，這些細胞大部分也可用抗CD163抗體染色。表1CD34+骨髓細胞的流式細胞術(shù)分析
實施例2Western印跡可檢測CD34+細胞表達的CD163在含有蛋白酶抑制劑混合物的CHAPS緩沖液(0.5％CHAPS、10mMTris、1mM MgCl2、1mM EDTA和10％甘油)中重懸來源于成人骨髓的CD34+細胞來制備細胞裂解物。重懸細胞冰浴30分鐘。離心裂解物，將上清液轉(zhuǎn)到新管中。在非還原性SDS載樣緩沖液中重懸上清液供Western印跡分析。然后樣品通過8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)到尼龍膜。用包含脫脂奶粉的溶液封閉尼龍膜，然后先用Mac-158抗人CD163抗體、繼之以偶聯(lián)辣根過氧化物酶(BIO-RAD Laboratories，Inc.)的山羊抗小鼠抗體進行檢測。利用Amersham plc的增強化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測結(jié)合的二抗。
如圖1表明，在從CD34+細胞制備的細胞裂解物中檢測出CD163免疫反應(yīng)性。
實施例3在CD34+細胞的細胞表面表達CD163利用流式細胞術(shù)分析冷凍保存的來源于成人骨髓和臍帶血(UCB)低密度單核細胞(LDMNC)的CD34+細胞確定CD34+細胞胞外表達的CD163水平。細胞用熒光標記的抗CD34(HPCA-2-PE)和抗CD163(Mac158-FITC)抗體染色，然后利用EPICS XL流式細胞儀分析。結(jié)果如表2所示。表2CD163和CD34的共表達
n＝樣本數(shù)大部分CD163+細胞可用抗CD34抗體共同染色，表明CD34+細胞表達CD163。人CD163受體先前描述為只在單核/巨噬細胞樣細胞上表達的受體。這些資料表明人造血干細胞群也表達CD163。實施例4刺激CD163受體導(dǎo)致紅細胞系細胞生長利用集落形成試驗，在支持紅細胞系祖細胞集落(BFU-E)的條件下，檢測小鼠抗人抗CD163單克隆抗體(EDHu-1，Serotec)的影響。由單個原始的紅細胞系祖細胞在半固體培養(yǎng)基中形成這些集落相對較大，且是多叢的。培養(yǎng)12-16天后，集落內(nèi)的細胞一般血紅蛋白化。將臍帶血(UCB)富集的CD34+細胞，或者來源于成人骨髓(ABM)的CD34+細胞在有或無50ug/mL抗CD163抗體存在的情況下接種到含10ng/mL白細胞介素-3(IL-3)和2U/mL紅細胞生成素(Epo)的甲基纖維素中。評價該抗體對紅細胞系祖細胞數(shù)目的影響，結(jié)果如表3所示表3由抗CD163抗體(Ab)刺激的CFA中的ABM或UCB的CD34+細胞
*相對增加倍數(shù)50ug/ml抗CD163抗體比相應(yīng)的對照平板產(chǎn)生更多的BFU-E。利用不同的抗CD163抗體(Mac158)刺激CD163也得到類似結(jié)果。通過CD163受體刺激CD34+細胞可增強臍血或成人骨髓中紅細胞系祖細胞的增殖。
實施例5刺激CD163增強紅細胞系細胞的增殖和分化利用集落形成試驗，在支持紅細胞系祖細胞集落形成的條件下，檢測活化的抗CD163抗體的影響。將從臍血LDMNC富集的CD34+細胞在存在同型對照抗體(50ug/mL)或抗CD163抗體(EDHu-1；50ug/mL)的情況下接種到含10ng/mL IL-3和2.0U/mL Epo的甲基纖維素中(1,000細胞/mL)。在濕潤的恒溫箱中于5％CO2、37℃溫育甲基纖維素平板。14天后計數(shù)集落(BFU-E)，評價其形態(tài)學(xué)。除實施例4表明的紅細胞系集落數(shù)目增加以外，與同型對照相比，抗CD163抗體也增加紅細胞系祖細胞集落的大小和紅色(圖2)。利用不同的抗CD163抗體(Mac158)刺激CD163也得到類似結(jié)果。利用來源于成人骨髓的CD34+細胞也得到類似結(jié)果。這些資料提示刺激CD163增強BFU-E集落中紅細胞系細胞的增殖(增加集落大小)和分化(增加血紅蛋白的生成，并因而產(chǎn)生較紅的集落)。
實施例6紅細胞系細髓表達CD163將成人骨髓CD34+細胞接種到含10ng/mL IL-3以及0.5或2.0U/mL Epo甲基纖維素(1,000細胞/mL)中。在濕潤的恒溫箱中于5％CO2、37℃溫育甲基纖維素平板。14天后，從平板收集BFU-E集落的細胞，洗滌、計數(shù)并沉淀。細胞沉淀-80℃冷凍。從等量細胞制備細胞裂解物，如實施例3所述，將等體積裂解物進行Western印跡分析。
如圖3所示，在從BFU-E集落制備的細胞裂解物中很容易檢測出CD163免疫反應(yīng)性。此外，在降低Epo濃度的條件下，CD163的免疫反應(yīng)性水平提高，提示Epo可調(diào)節(jié)CD163的表達。
實施例7CD163刺激補償最適度下的EPO濃度也用無血清集落形成試驗檢測CD163抗體的影響。將成人外周血低密度單核細胞(APB LDMNC)細胞在有或無兩種不同的抗CD163抗體EDHu-1或Mac158的情況下接種到含1％BSA、10ug/mL胰島素、200ug/mL人轉(zhuǎn)鐵蛋白、10ng/mL IL-3和0.2或2.0U/mL Epo的甲基纖維素中(1×105細胞/mL)。平板在37℃、5％CO2下溫育14天，然后計數(shù)紅細胞系祖細胞集落。如表4表明，與未處理細胞相比，抗CD163抗體處理的細胞檢測到更多的BFU-E集落。此外，在抗CD163抗體存在下形成的集落與沒有該抗體的情況下相比更大并更紅。因而CD163活化導(dǎo)致紅細胞系祖細胞的增殖增強，并對于有血清和無血清集落形成試驗中的BFU-E集落紅細胞系細胞的增殖和分化增強。在減少EPO的條件下，用EDHu-1或Mac158刺激CD163導(dǎo)致紅細胞系祖細胞集落的數(shù)目增加(表4)。這些集落也比對照平板的集落大并紅。利用從成人骨髓或臍帶血分離的CD34+細胞得到類似結(jié)果。在含血清集落形成試驗中也得到類似結(jié)果。缺少Epo時，不論是否存在抗CD163抗體，集落形成試驗均未發(fā)現(xiàn)紅細胞系集落。
這些資料提示刺激CD163增強紅細胞系祖細胞的增殖，并且對于EPO濃度降低的有血清和無血清分析增強其紅細胞系細胞的增殖和分化。然而，在紅細胞系集落的形成中，刺激CD163不能完全取代EPO。表4高和低濃度的EPO、有或沒有抗CD163抗體(Ab)的情況下在無血清CFA中刺激BFU-E
*相對增加倍數(shù)實施例8刺激CD163增強CFU-GM祖細胞的增殖在針對髓細胞系祖細胞(CFU-GM)集落生長優(yōu)化的條件下(50ng/mlSCF、4pg/ml IL-1β、6.25ng/ml IL-6)，利用集落形成試驗檢測交聯(lián)的抗CD163抗體(EDHu-1)的影響。在有或沒有50ug/mL抗CD163抗體的情況下，將來源于臍帶血的CD34+按2×103細胞/ml的濃度接種甲基纖維素。37℃培養(yǎng)14天后，評價抗CD163抗體對CFU-GM數(shù)目的影響，如表5所示。表5抗CD163抗體刺激CFU-GM增殖CFU-GM/2×103細胞對照130+50ug/ml EDHu-1 21950ug/ml時，與對照樣品相比，EDHu-1抗體使CFU-GM數(shù)目增加1.7倍。這提示早期髓細胞系祖細胞表達CD163受體，刺激該受體可增強這些細胞的增殖。
實施例9CFU-GM集落中的骨髓細胞表達CD163，其表達不限于CD14+細胞在針對髓細胞系祖細胞(CFU-GM)集落生長優(yōu)化的條件下(50ng/ml SCF、4pg/ml IL-1b、6.25ng/ml IL-6)，將來源于臍帶血細胞的CD34+按2×103細胞/ml接種甲基纖維素，于37℃、5％CO2下濕潤的恒溫箱中培養(yǎng)。14天后，從產(chǎn)生的集落中收集細胞，洗滌、計數(shù)，并分別利用TUK4和Mac158熒光標記抗體，通過流式細胞術(shù)檢測CD14和CD163的表達。結(jié)果如表6所示。表6CFU-GM集落細胞上CD163和CD14的表達
已經(jīng)參考目前認為優(yōu)選的實施例描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不局限于公開的實施例。相反，本發(fā)明意在涵蓋所附權(quán)利要求書精神和范圍內(nèi)包括的各種修改及等效方案。
所有出版物、專利和專利申請等全文在此引入以供參考，如同明確而逐一指明全文引入各個出版物、專利或?qū)＠暾堃怨﹨⒖肌?br> 權(quán)利要求
1.有效量的可活化CD163的物質(zhì)用于刺激干細胞生長、增殖、分化和/或動員的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中干細胞是CD34陽性細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，用于刺激血細胞生成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于刺激紅細胞生成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，用于治療貧血癥。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的用途，其進一步包含給予一種或多種造血生長因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中造血生長因子是紅細胞生成素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，用于刺激髓細胞生成。
9.根據(jù)權(quán)利要求書8的用途，用于治療中性粒細胞減少癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的用途，其進一步包含給予一種或多種造血生長因子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中造血生長因子是G-CSF或GM-CSF。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項的用途，其中所述的物質(zhì)結(jié)合CD163。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中所述的物質(zhì)是結(jié)合CD163的抗體。
14.用于增強干細胞或祖細胞生長、增殖、分化和/或動員的細胞培養(yǎng)添加劑，其包含有效量的可活化CD163的物質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的細胞培養(yǎng)添加劑，其中不含血清。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的細胞培養(yǎng)添加劑，其中包含血清。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16的細胞培養(yǎng)添加劑，用于增強紅細胞系祖細胞生長、增殖、分化和/或動員。
18.根據(jù)權(quán)利要求書17的細胞培養(yǎng)添加劑，其進一步包含紅細胞生成素。
19.根據(jù)權(quán)利要求14-16的細胞培養(yǎng)添加劑，用于增強髓細胞系祖細胞生長、增殖、分化和/或動員。
20.根據(jù)權(quán)利要求14-16的細胞培養(yǎng)添加劑，用于增強造血祖細胞或干細胞生長、增殖、分化和/或動員。
21.選擇樣品中造血干或祖細胞的方法，其包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中干或祖細胞是CD34陽性細胞。
23.選擇能夠形成紅細胞系和髓細胞系集落的細胞的方法，其包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細胞。
24.選擇能夠利用髓細胞系和紅細胞系細胞再增殖生物體的細胞的方法，其包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細胞。
25.選擇樣品中干或祖細胞的方法，其包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)從樣品中去除與該物質(zhì)結(jié)合的細胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求21-25中任何一項的方法，其中可結(jié)合CD163的物質(zhì)是抗體。
全文摘要
本發(fā)明描述了刺激干細胞和/或祖細胞生長、增殖、分化和/或動員的方法和組合物。該方法涉及給予有效量的可活化CD163血紅蛋白清除劑受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。該方法和組合物用于刺激血細胞生成，并治療多種疾病，包括血細胞減少癥、貧血癥，以及用于制備供移植的細胞。
文檔編號G01N33/50GK1462192SQ02801429
公開日2003年12月17日 申請日期2002年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月26日
發(fā)明者S·G·米勒, D·貝爾, K·E·馬修斯 申請人:赫姆索爾公司