專利名稱：將酶標(biāo)結(jié)合物固化在微孔板上的酶免檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，一種將酶標(biāo)結(jié)合物固化在微孔板上的酶免檢測試劑的制作方法現(xiàn)在ELISA試劑的生產(chǎn)方法為在微孔板中預(yù)包被抗原或抗體，封閉空位后做成預(yù)包被板；將酶標(biāo)結(jié)合物用適當(dāng)濃度配制成酶標(biāo)結(jié)合物工作液，配以洗液、底物和終止液，組成酶免檢測試劑。在檢測時，加入待檢測樣品，然后加入酶標(biāo)結(jié)合物工作液，孵育，使得目標(biāo)物同包被于微孔板上的抗原或抗體以及酶標(biāo)結(jié)合物形成夾心結(jié)合，結(jié)合物通過固化在微孔中的抗原或抗體連接在微孔板上，洗去游離的酶標(biāo)結(jié)合物，加入底物后，反應(yīng)一段時間，加入終止液終止反應(yīng)，通過底物檢測在樣品中是否存在目標(biāo)物。
酶標(biāo)結(jié)合物為生物活性物質(zhì)，保存于液體中時，通常需要在-20℃保存，才能保證其穩(wěn)定活性；但現(xiàn)在的試劑通常做成試劑盒的形式，試劑盒中其他組分均為4-8℃貯存，這樣，酶標(biāo)結(jié)合物也不得不配制成工作液，保存在4-8℃，以便于運輸、銷售、保存和應(yīng)用，所以保證酶標(biāo)結(jié)合物的生物活性是試劑生產(chǎn)技術(shù)的最關(guān)鍵問題?，F(xiàn)在的方法主要是通過調(diào)整緩沖液配方、增加工作液中的蛋白濃度以及添加蛋白穩(wěn)定劑等，成本高，效果也不是太好，現(xiàn)在酶標(biāo)結(jié)合物的穩(wěn)定性是制約酶免試劑有效期的最大難題。
另外，在實際的操作過程中，由于各種試劑同時操作，同時檢測多種項目，經(jīng)常造成組分搭配混亂的現(xiàn)象，如甲試劑的酶標(biāo)結(jié)合物加在乙試劑的微孔中，從而得不到實驗結(jié)果，甚至得到相反的結(jié)果，給患者帶來不必要的麻煩，有時甚至是災(zāi)難性的后果。
還有，作為試劑的生產(chǎn)廠家，酶標(biāo)結(jié)合物占試劑成本中很大一部分，為了方便實際工作的使用，酶標(biāo)工作液多采用滴瓶式容器，加入時采用從滴液瓶滴加的方式，滴液瓶滴頭的大小很難控制，誤差在50％左右；這種誤差一方面會影響實驗的結(jié)果，所以，衛(wèi)生部一再強(qiáng)調(diào)不能用滴液瓶式滴加，而倡導(dǎo)用微量加樣器，但由于工作量明顯加大很多，實際工作中仍然是使用滴液瓶；由于這種誤差的存在，試劑生產(chǎn)廠家為了保證酶標(biāo)結(jié)合物的量，不得不給出最大的富裕量，這種浪費在45％以上，結(jié)合這種產(chǎn)業(yè)，每年的浪費是相當(dāng)驚人的。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案所述的將酶標(biāo)結(jié)合物固化在微孔板上的酶免檢測試劑的制作方法，選擇合格的微孔板。以合適的包被緩沖液調(diào)整包被抗原或抗體的濃度，配成包被工作液；用包被機(jī)或多道微量加液器，以每孔50μl-110μl的工作液量，將包被工作液均一的加入于微孔中，包被吸附足夠時間，吸出或甩出包被液。用封閉液封閉空位；以合適的酶標(biāo)緩沖液調(diào)整酶標(biāo)結(jié)合物的濃度，配成酶標(biāo)結(jié)合物工作液，用包被機(jī)或多道微量加液器將酶標(biāo)結(jié)合物工作液均一的以每孔50μl的工作液量加入微孔中；采用冷凍真空干燥或烘干的方法，制成固化酶標(biāo)結(jié)合物的檢測板待用；配以洗液、底物、終止液，組成ELISA試劑。
由于采用了如上所述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)越性傳統(tǒng)的ELISA試劑，在微孔板中預(yù)包被抗原或抗體，封閉空位后做成預(yù)包被板；將酶標(biāo)結(jié)合物用適當(dāng)濃度配制成酶標(biāo)結(jié)合物工作液，分裝在塑料容器中(通常為滴瓶)；配以洗液、底物和終止液；其在操作上，將試劑內(nèi)容物分別一一對應(yīng)放置，加入待檢標(biāo)本，再用滴瓶滴加或用加樣器加入相應(yīng)的酶標(biāo)結(jié)合物；孵育后，洗去游離的酶標(biāo)結(jié)合物及待測標(biāo)本；加入底物反應(yīng)后終止，通過酶標(biāo)儀讀取結(jié)果；本發(fā)明由于將酶標(biāo)結(jié)合物固相化，從而從根本上解決了酶標(biāo)結(jié)合物的穩(wěn)定性問題，使得試劑保存期大大延長；由于酶標(biāo)結(jié)合物已固化在微孔板上，在操作上，簡化了操作步驟，避免了不同的檢測項目之間由于包被的微孔板與酶標(biāo)結(jié)合物之間的搭配錯誤而造成的損失；酶標(biāo)結(jié)合物固相化操作可以采用機(jī)械化操作，可以保證酶標(biāo)結(jié)合物量的準(zhǔn)確，減少滴瓶式滴加的誤差，從而保證實驗的精密性和準(zhǔn)確性，也消除了目前的巨大的浪費；由于固相化酶標(biāo)結(jié)合物，使得反應(yīng)體積減少一半，這樣，在包被抗原或抗體時，包被液也可由原來的50μl-110μl減少至50μl；由于將酶標(biāo)結(jié)合物已固化在微孔中，在試劑組成中就減少了一個組分(酶結(jié)合物容器)從而在生產(chǎn)和運輸中均比傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)實用。
具體實施例本發(fā)明的酶免檢測試劑，以合適的酶標(biāo)緩沖液調(diào)整酶標(biāo)結(jié)合物的濃度，配成酶標(biāo)結(jié)合物工作液，用包被機(jī)或多道微量加液器將酶標(biāo)結(jié)合物工作液均一的以每孔50μl的工作液量加入微孔中；采用冷凍、真空干燥、烘干的方法，制成固化酶標(biāo)結(jié)合物的檢測板待用；配以洗液、底物、終止液，使其最大可能的保持酶標(biāo)結(jié)合物的穩(wěn)定性。
以乙型肝炎表面抗體(Anti-HBs)酶免診斷試劑的制作和使用方法為例說明如下1、材料1.1選用親和純化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)作包被抗原；1.2酶標(biāo)記乙型肝炎表面抗原(HRPO-HBsAg)；1.3包被緩沖液、封閉緩沖液、酶標(biāo)稀釋液、洗液、底物、終止液；2.步驟2.1首先選擇合格的微孔板，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為包被緩沖液調(diào)整包被抗原的濃度，配成包被工作液；2.2用包被機(jī)或多道微量加液器，按每孔50μl將包被工作液均一的加入于微孔中，包被吸附足夠時間，吸出或甩出包被液；2.3用封閉液封閉空位；2.4以合適的酶標(biāo)緩沖液調(diào)整酶標(biāo)結(jié)合物的濃度，配成酶標(biāo)結(jié)合物工作液；2.5用包被機(jī)或多道微量加液器將酶標(biāo)結(jié)合物工作液均一的加入微孔中；2.6采用真空干燥的方法，制成固化酶標(biāo)結(jié)合物的檢測板；
2.7搭配以洗液、底物、終止液，組成ELISA試劑；2.8將試劑于2-8℃冰箱中保存；3.使用方法3.1將上述ELISA試劑從2-8℃冰箱中取出，室溫平衡；3.2將板條做好標(biāo)記，安排每孔的加樣順序；3.3每孔50μl加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品；3.4將酶標(biāo)板于震蕩器上混勻；3.5將酶標(biāo)板于37℃恒溫箱中孵育；3.6自恒溫箱中取出酶標(biāo)板，甩去反應(yīng)物，每孔注滿洗板液，放置10-15秒，甩去洗板液，每孔注滿洗板液，如此洗五遍?；蛳窗鍣C(jī)洗板，五次；3.7將酶標(biāo)板與干凈衛(wèi)生紙上拍干，加入底物于37℃恒溫箱中顯色；3.8自恒溫箱中取出酶標(biāo)板，每孔加入50μl終止液終止反應(yīng)；3.9用酶標(biāo)儀于波長450nm/630nm判讀結(jié)果；經(jīng)試驗結(jié)果證明新方法制備的乙型肝炎表面抗體(Anti-HBs)酶免診斷試劑同目前的乙型肝炎表面抗體(Anti-HBs)酶免診斷試劑相比較，在靈敏度和特異性方面兩者完全吻合，符合試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種將酶標(biāo)結(jié)合物固化在微孔板上的酶免檢測試劑的制作方法，首先選擇合格的微孔板，以合適的包被緩沖液調(diào)整包被抗原或抗體的濃度，配成包被工作液；用包被機(jī)或多道微量加液器，以每孔50μl-110μl的工作液量，將包被工作液均一的加入于微孔中，包被吸附足夠時間，吸出或甩出包被液，用封閉液封閉空位，其特征在于所述的酶免檢測試劑，以合適的酶標(biāo)緩沖液調(diào)整酶標(biāo)結(jié)合物的濃度，配成酶標(biāo)結(jié)合物工作液，用包被機(jī)或多道微量加液器將酶標(biāo)結(jié)合物工作液均一的每孔適量的工作液加入微孔中；采用冷凍、真空干燥、烘干的方法，制成固化酶標(biāo)結(jié)合物的檢測板待用；配以洗液、底物、終止液。
2.如權(quán)利要求1所述的將酶標(biāo)結(jié)合物固化在微孔板上的酶免檢測試劑，以乙型肝炎表面抗體(Anti-HBs)酶免診斷試劑為例，其制作和使用方法如下1、材料1.1選用親和純化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)作包被抗原；1.2酶標(biāo)記乙型肝炎表面抗原(HRPO-HBsAg)；1.3包被緩沖液、封閉緩沖液、酶標(biāo)稀釋液、洗液、底物、終止液；2.步驟2.1首先選擇合格的微孔板，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為包被緩沖液調(diào)整包被抗原的濃度，配成包被工作液；2.2用包被機(jī)或多道微量加液器，按每孔50μl將包被工作液均一的加入于微孔中，包被吸附足夠時間，吸出或甩出包被液；2.3用封閉液封閉空位；2.4以合適的酶標(biāo)緩沖液調(diào)整酶標(biāo)結(jié)合物的濃度，配成酶標(biāo)結(jié)合物工作液；2.5用包被機(jī)或多道微量加液器將酶標(biāo)結(jié)合物工作液均一的加入微孔中；2.6采用真空干燥的方法，制成固化酶標(biāo)結(jié)合物的檢測板；2.7搭配以洗液、底物、終止液，組成ELISA試劑；2.8將試劑于2-8℃冰箱中保存；
3.使用方法3.1將上述ELISA試劑從2-8℃冰箱中取出，室溫平衡；3.2將板條做好標(biāo)記，安排每孔的加樣順序3.3每孔50μl加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品；3.4將酶標(biāo)板于震蕩器上混勻；3.5將酶標(biāo)板于37℃恒溫箱中孵育；3.6自恒溫箱中取出酶標(biāo)板，甩去反應(yīng)物，每孔注滿洗板液，放置10-15秒，甩去洗板液，每孔注滿洗板液，如此洗五遍?；蛳窗鍣C(jī)洗板，五次；3.7將酶標(biāo)板與干凈衛(wèi)生紙上拍干，加入底物于37℃恒溫箱中顯色；3.8自恒溫箱中取出酶標(biāo)板，每孔加入50μl終止液終止反應(yīng)；3.9用酶標(biāo)儀于波長450nm/630nm判讀結(jié)果。
全文摘要
一種將酶標(biāo)結(jié)合物固化在微孔板上的酶免檢測試劑的制作方法，首先選擇合格的微孔板，用包被緩沖液調(diào)整包被抗原或抗體的濃度，配成包被工作液；用包被機(jī)或多道微量加液器，以每孔50μl－110μl的工作液量，將包被工作液加入于微孔中，包被吸附足夠時間，吸出或甩出包被液，用封閉液封閉空位；以合適的酶標(biāo)緩沖液調(diào)整酶標(biāo)結(jié)合物的濃度，配成酶標(biāo)結(jié)合物工作液，用包被機(jī)或多沖液調(diào)整酶標(biāo)結(jié)合物的濃度，配成酶標(biāo)結(jié)合物工作液，用包被機(jī)或多道微量加液器將酶標(biāo)結(jié)合物以每孔適量的工作液均一的加入微孔中；采用冷凍、真空干燥、烘干的方法，制成固化酶標(biāo)結(jié)合物的檢測板待用；配以洗液、底物、終止液。
文檔編號G01N33/543GK1420357SQ0215526
公開日2003年5月28日 申請日期2002年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者常立峻, 李振勇 申請人:華美生物工程公司