專利名稱：對細胞進行膜片鉗測定的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用膜片鉗技術(shù)對細胞或類似結(jié)構(gòu)進行測定的方法以及進行所述測定的裝置。
活細胞通過包圍它們的脂膜產(chǎn)生一種內(nèi)部微環(huán)境，從而確保細胞機制的功能。所述脂膜實際上是帶電顆粒不能通過的。因此，由特化包埋的轉(zhuǎn)運蛋白攜帶離子通過所述脂膜。它們體現(xiàn)了多種生理學功能的基礎，包括細胞的電興奮性，物質(zhì)通過膜或細胞層的轉(zhuǎn)運和細胞中的若干種電信號和化學信號。
Sakmann和Neher在1981年所開發(fā)的膜片鉗方法，使細胞生物學研究發(fā)生了革命性變化。膜片鉗技術(shù)能夠通過離子轉(zhuǎn)運蛋白以高的時間分辨率直接測定電流。實際上，這種方法是能夠以幾毫秒的時間分辨率實時測定一種特化蛋白分子的構(gòu)象變化的唯一技術(shù)。例如，這種方法可以直接用靶蛋白評估信號分子或藥理學制劑的作用。另外，這種技術(shù)可以精確控制膜的電和化學環(huán)境，并且在所述膜的兩側(cè)施加信號傳導分子、藥物等。
這種技術(shù)可以檢驗多種轉(zhuǎn)運蛋白，包括有機和無機離子的生電離子轉(zhuǎn)運蛋白，選擇性和非選擇性離子通道和其他孔誘導膜蛋白。離子通道包括電壓控制的、配體控制的和儲存操縱的通道，這些通道對鈉離子、鉀離子、鈣離子和氯離子具有或不具有選擇性。甚至可以測定膜結(jié)合蛋白內(nèi)的電荷運動(門控電荷)。這使得所有膜結(jié)合蛋白都適用于所述技術(shù)，包括受體、酶、及其與其他蛋白或帶電荷分子的相互作用。離子通道以特殊方式分布在組織中，并且以具有多種功能為特征。因此，它們是用于操縱組織專一性功能的藥用化合物的理想目標。所述化合物的例子有利尿劑、抗糖尿病藥物、抗癲癇藥物、局部麻醉劑、抗心律不齊藥物、某些抗生素等。膜片鉗技術(shù)是分析所述化合物的生物學功能的一種非常靈敏的方法。這種方法的主要缺陷是具有復雜的實驗程序，需要人工操縱，以及對測定化合物和轉(zhuǎn)運蛋白的較低的處理能力。
膜片鉗技術(shù)以若干種不同方式存在。所有存在形式都需要顯微操作。在顯微鏡觀察控制下，通過機械方式使細胞進入玻璃微量移液管，并且通過吸力結(jié)合在移液管上。這會導致在細胞膜和移液管頂端之間形成電緊密結(jié)合，這是對微小電流進行低噪音高分辨記錄的前提。通過該技術(shù)的不同形式，記錄了通過移液管頂端膜片或通過相反的膜片層的電流。
細胞膜和玻璃毛細管之間的緊密結(jié)合通常被稱為“密封”。不同的密封質(zhì)量，可以對不同類型的細胞和不同大小的離子電流進行實驗研究。在1980年，Neher和Sakman披露了一種獲得新的密封質(zhì)量，即所謂的千兆歐密封的方法。這一發(fā)現(xiàn)獲得了1991年度的諾貝爾獎，并且，千兆歐密封使得人們首次能夠在小的哺乳動物、人類、昆蟲和其他細胞內(nèi)以皮安培范圍內(nèi)的電流精確測定離子電流。Neher和Sakman在1981年的文獻中寫到“細胞外膜片鉗技術(shù)使得首次能夠觀察單一離子通道中的電流(Neher和Sakmann，1976)。在該技術(shù)中，將一個小的加熱拋光的玻璃移液管壓在細胞膜上，形成電阻為50兆歐級的電密封(Neher等，1978)。這種密封的高電阻能確保源于小的膜片的大部分電流流入移液管，并從這里進入電流測定電路。該密封的電阻之所以重要還因為它決定著記錄中的背景噪音水平。
最近發(fā)現(xiàn)，當注意保持移液管表面清潔，并且對移液管內(nèi)部施加吸力時，可以獲得電阻為10-1000千兆歐的緊密的移液管-膜密封(Neher，1981)。我們稱這種密封為“千兆歐密封”，以便區(qū)別于常規(guī)的兆歐密封…千兆歐密封同樣是機械穩(wěn)定的…可以在保持移液管-細胞結(jié)合的前提下破壞所述膜片。這樣提供了一種進入細胞內(nèi)部的直接低阻抗方法，它可以對小細胞進行電位記錄和電壓鉗制”(Hamill，Marty，Neher，Sakmann，Sigworth，PflügersArch.39185-100，1981)。
“千兆歐密封”是在細胞到達移液管頂端以后的電阻和吸力達到千兆歐范圍時所獲得的。常見的數(shù)十個千兆歐的電阻表明，即使是諸如質(zhì)子的小離子也不能從膜和玻璃表面之間通過。以前認為，必須在膜和移液管頂端邊緣之間形成這樣的千兆歐密封，所述移液管頂端是通過機械力和液壓吸力接近所述膜的。采用這種千兆歐密封的新式操縱放大器，可以測定低至100fA(10-13A)范圍內(nèi)的直流電。在任何情況下，所測定的電流都表示通過所述膜的離子轉(zhuǎn)運加上通過所述裝置和制劑的峰電流的總和。
膜片鉗技術(shù)非常緩慢，并且需要高度專業(yè)化的人員，特別是因為需要進行顯微操作。在顯微鏡平臺上用顯微操作器接近單細胞并且施加吸力以便通過特定細胞的機械特性及其顯微操作性密封移液管，這需要高水平的靈活性和經(jīng)驗。例如，在抽吸之前施加的機械力對于膜和移液管頂端的結(jié)合來說是很關(guān)鍵的。另外，所述密封在機械上是不穩(wěn)定的，并且可能通過機械擾動和液壓紊流(例如，溶液交換)而喪失。顯微鏡和顯微操作器是必需的。這樣妨礙了小型化和多個移液管排列的主要理想結(jié)構(gòu)。
以上說明披露了膜片鉗技術(shù)的多種潛在用途，有可能需要同時檢查幾種細胞，并且自動獲得千兆歐密封。這一愿望受到了以下事實的妨礙，即必須通過機械方式使微量移液管的頂端與細胞膜密切接觸。DE-A1-19744649披露了一種用排列的多個移液管檢查多種細胞的裝置和方法。不過，在該專利申請中，采用了向細胞膜機械轉(zhuǎn)移所述移液管排列的相同原理(如上文所述)。WO99/66329披露了位于薄的平面基質(zhì)上的一系列孔，這些孔用于施加細胞并且能同時檢驗多個細胞。這種多孔基質(zhì)的生產(chǎn)復雜，成本昂貴，并且細胞與多個孔的結(jié)合是隨機的、難于實現(xiàn)和控制。細胞與平面基質(zhì)表面的密封在機械上是不穩(wěn)定的，并且容易通過溶液交換而喪失。另外，在諸如WO99/66329所披露的或本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的其他經(jīng)上皮測定裝置(例如，使用腔室)中的孔的所有平面設計中，如果某些孔沒有被細胞緊密密封的話，該實驗就容易受到干擾。泄露的孔會導致嚴重的泄露電流，該電流比通過待測定離子轉(zhuǎn)運蛋白的電流高若干個數(shù)量級。在這種結(jié)構(gòu)中，會由于孔之間的電干擾，特別是泄露孔之間的電干擾產(chǎn)生嚴重問題。大的電容能導致電噪音和紊亂，從而降低該測定的時間分辨率。在測定電壓控制的離子通道時這一點是特別重要的。
US6048722(相當于WO97/17426)披露了一種細胞生理學工作臺，用于自動獲取數(shù)據(jù)并進行灌注控制。該裝置將爪蟾卵母細胞保持在巴斯德移液管頂端內(nèi)，以便在卵母細胞膜和玻璃之間形成密封。這種密封的電阻不超過100-200兆歐。與哺乳動物細胞不同，爪蟾卵母細胞相當大。其外徑大于1毫米。因此，它們具有龐大的膜表面積，并且包括比其他細胞高出若干數(shù)量級的離子通道，使得離子電流在數(shù)百至一千納安培的范圍內(nèi)。因此，所謂的高阻抗密封(在10-200兆歐的數(shù)量級上)足以測定爪蟾卵母細胞中的大的電流。不過，這種細胞來源于兩棲動物，并因此在研究哺乳動物和人類細胞的離子通道功能方面具有有限的用途。在直徑通常為5-50微米的哺乳動物細胞上，離子電流通常只能達到1至數(shù)百個皮安培。為了測定如此小的電流，所述密封的阻抗必須比爪蟾卵母細胞高出若干個數(shù)量級，即在1-1000千兆歐，優(yōu)選10-1000千兆歐范圍內(nèi)。如上文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員認為，玻璃移液管的邊緣或邊沿必須壓在細胞膜上，以便獲得這種千兆歐密封。從US6048722中也可以證實這一點，該專利披露了生物傳感器的其他常規(guī)用途，該傳感器在記錄室內(nèi)包括膜片鉗移液管和注射針頭。該技術(shù)同樣需要在所述記錄室內(nèi)用諸如電極、針頭和膜片鉗移液管之類的探頭進行額外的顯微操作，以便固定爪蟾卵母細胞。以上要求導致了上文所述的相同的缺陷。
總之，本領(lǐng)域技術(shù)人員以前認為，必須在細胞膜和通過機械力和液壓吸力接近所述膜的移液管頂端邊緣之間形成千兆歐密封。
因此，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的所述缺陷。它是一種在膜和記錄室或膜片鉗技術(shù)所需要的保持基質(zhì)之間獲得千兆歐密封的新方法，它可以增加那些密封的機械穩(wěn)定性?？梢韵龑σ曈X顯微鏡控制的需要。本發(fā)明可以獲得記錄制品的小的電容量，導致測定的信號具有小的介電波動(噪音)和高的時間分辨率。它能夠通過膜片鉗技術(shù)對多個細胞同時和/或快速進行測定。該裝置可以方便地自動化，并且用簡單的或現(xiàn)有的部件進行組裝。該裝置可以是微型化的，以便并行布置多個記錄制品，并且將該裝置整合到現(xiàn)有的實驗室機械系統(tǒng)中。所述裝置應當以如下方式單獨安排多個記錄制品記錄室是以靈活的排列形式排列的，并且裝有為了記錄而制備的細胞的室可以方便地更換，并移動到所述排列中。多個記錄制品之間應當能夠形成電屏蔽。
本發(fā)明利用權(quán)利要求1所限定的方法和權(quán)利要求12所限定的裝置至少部分解決了上述問題。在權(quán)利要求2-11和13-22中披露了所述方法和/或裝置的優(yōu)選實施方案。權(quán)利要求23-25披露了毛細管、毛細管和試劑盒的用途。所有權(quán)利要求書的文字以參考形式構(gòu)成本說明書的一部分。
本發(fā)明提供了一種方法，其中，將一個細胞放置在毛細管腔內(nèi)，并且在細胞膜和毛細管內(nèi)壁之間獲得了超過1千兆歐，優(yōu)選10千兆歐阻抗的足夠緊密的密封。在獲得了千兆歐密封之后，就可以進行膜片鉗實驗，所述毛細管是錐形的，以便在該毛細管長度方向上具有至少一個內(nèi)徑小于待測定細胞外徑的部位。
錐形表示這樣一種形式的毛細管它能保持沿著該毛細管長度移動的細胞，并且避免該細胞的通過。錐形還意味著錐形形式的毛細管內(nèi)壁，它能周向包圍細胞，并且在毛細管的內(nèi)表面和細胞表面之間形成緊密接觸。因此，可以將毛細管設計成具有優(yōu)選的圓形內(nèi)部截面，并且沿其長度方向變窄形成錐體或噴嘴，以便保持并定位所述細胞，并且在細胞表面和錐形移液管的內(nèi)表面之間形成緊密的密封。很顯然，所述錐體的內(nèi)直徑、形狀和陡度可以改變，以便適應不同的細胞直徑。通過在所述錐體上采用非常小的內(nèi)徑，可以定位并保持非常小的細胞或亞細胞膜結(jié)構(gòu)，例如線粒體、溶酶體或細菌。到目前為止，這種結(jié)構(gòu)都是無法用膜片鉗方法直接接觸的，因為它們太小以至不能進行光學顯微和顯微機械操作。因此，本發(fā)明中的術(shù)語“細胞”包括由脂膜包圍的任何生物學結(jié)構(gòu)或人造結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“定位”表示細胞在錐體或毛細管中的足以進行膜片鉗實驗的任何固定作用，其中，在細胞膜和毛細管壁內(nèi)表面之間獲得了超過1，優(yōu)選10千兆歐阻抗的足夠緊密的結(jié)合或密封。
令人吃驚的是，可以在毛細管腔內(nèi)表面和細胞膜之間獲得在小的細胞(例如，哺乳動物細胞、人、植物、昆蟲細胞)中測定離子電流所需要的千兆歐密封，并且在透化細胞膜的一側(cè)之后，可以對所述細胞進行膜片鉗實驗，并且在進行所述實驗時不需要諸如膜片鉗移液管或注射針頭的其他探頭。對于本發(fā)明來說，只需要將所述細胞定位于毛細管的細小部分就足夠了，并且不需要諸如針頭、膜片鉗移液管或顯微操作器的其他裝置就能獲得千兆歐密封。另外，按照本發(fā)明方法獲得的千兆歐密封是機械穩(wěn)定的，并且能抗液壓和機械擾動。通常它可以將裝有密封細胞的毛細管從毛細管支架上取出，并將其轉(zhuǎn)移到另一個支架上，而又不喪失千兆歐密封。千兆歐密封還能抗機械震動，例如敲打毛細管?？梢栽诓黄茐乃雒芊獾那疤嵯?，用細小的管將液體注入所述毛細管中。
對于本發(fā)明來說，毛細管的長度并不重要?？梢允褂瞄L度完全不同的毛細管。在一種優(yōu)選實施方案中，毛細管的長度至少應該和完全放置在該毛細管內(nèi)部的細胞一樣。
以上說明證實，毛細管的變細部分或錐形部分能以不同方式實現(xiàn)。在一種簡單的優(yōu)選實施方案中，整個毛細管是錐形的，以便其內(nèi)徑沿著毛細管的長度逐漸或逐步降低。在本實施方案中，細胞將定位于毛細管錐形部分的內(nèi)部截面直徑接近細胞外徑的地方。在另一種優(yōu)選實施方案中，最小的截面位于毛細管的一端，所述細胞將從另一端導入該毛細管，以便將該細胞定位并密封在毛細管內(nèi)靠近細的開口部分。
在另一種優(yōu)選實施方案中，所述錐體位于一端，而所述細胞是從另一端導入所述毛細管，以便所述細胞定位并密封在小的開口中，并且所述細胞的一部分從開口中突出。這樣可以快速更換細胞膜突出部分的溶液。
在一種優(yōu)選實施方案中，所述錐形毛細管可以是類似于用于常規(guī)膜片鉗實驗的各種形式微量移液管的所謂微量移液管。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何制造和生產(chǎn)這種微量移液管。通常，微量移液管是在加熱(至少局部加熱)之后，通過從熔融的中間部分分離毛細管的兩端而從玻璃毛細管拉制而成的。熔融能確保移液管材料所需要的清潔表面，以便獲得千兆歐密封。
在一種優(yōu)選實施方案中，毛細管或移液管可以用諸如塑料(例如，聚苯乙烯)的不同非導電材料制成。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案中，毛細管或微量移液管是用玻璃制成的。業(yè)已證實玻璃能緊密密封生物膜，并且具有良好的介電性能。玻璃對于多種化學物來說是惰性的，并且容易清洗。另外，能夠以低成本用標準玻璃生產(chǎn)技術(shù)生產(chǎn)出具有多種錐形直徑的玻璃毛細管和微量移液管。在優(yōu)選實施方案中，無論是什么樣的材料，根據(jù)檢查的生物學結(jié)構(gòu)或所使用的細胞的直徑，所述最細部分的錐形/開口的內(nèi)徑低于50微米，特別是低于10微米(μm)。所述直徑的優(yōu)選下限是50納米(nm)。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，通過用懸浮在溶液中的細胞懸浮液填充或灌注所述毛細管，將細胞導入并定位于該毛細管內(nèi)。例如，可以將細胞懸浮液填充到微量移液管的大的開口中，并且向細的開口部分施加吸力，導致細胞定位于該移液管的錐形部分。所述定位是通過流體和/或細胞的簡單運動而實現(xiàn)的。一旦第一個細胞移動到所述錐體內(nèi)，細胞表面和毛細管內(nèi)壁之間的接觸，就會將細胞密封在毛細管內(nèi)，并且阻止液體流動。因此，其他細胞不能移動到所述錐體內(nèi)。因此，通過一個步驟就實現(xiàn)了將細胞導入毛細管，并且將細胞定位在所述錐體內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選施加5毫巴(0.5巴)至1巴的壓力梯度，特別是5毫巴至500毫巴的壓力梯度。
作為替代或補充，在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案中，將細胞導入并定位于毛細管中可以通過沉降實現(xiàn)。在這種情況下，將毛細管固定在垂直方向上，并通過重力使細胞定位，優(yōu)選作為對上述液壓流的補充。
作為替代或補充，在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案中，細胞在毛細管中的導入和定位可以通過離心實現(xiàn)。在這種情況下，通過離心使細胞懸浮液進入毛細管，并通過離心力對細胞進行定位，優(yōu)選作為對上述液體流的補充。為了用細胞獲得千兆歐密封，優(yōu)選以2-20g的離心力進行。對于直徑低于1微米的細菌和其他小的膜結(jié)構(gòu)來說，優(yōu)選以10-500g的離心力進行。
作為替代或補充，在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案中，細胞在毛細管中的導入和定位可以通過機械震動或通過使用沿著毛細管的縱向施加的電場而實現(xiàn)或完成。另一種實施方案使用與所述細胞結(jié)合或包含在所述細胞內(nèi)的磁性小球，并且使用磁場對所述細胞進行定位。另一種實施方案使用激光(光學鑷子)對細胞進行定位。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，至少所述毛細管的錐形部分首先用生理溶液填充(優(yōu)選通過消毒過濾器或通過離心進行凈化)。然后將細胞懸浮液鋪在所述溶液頂部。然后通過上述重力、離心力等使細胞穿過所述凈化溶液層朝向所述錐體運動，如上所述。由于在大多數(shù)情況下細胞都重于細胞懸浮液中的膜片段和其他常見的污染性顆粒，這一過程能夠在細胞進入毛細管的錐形部分的同時對細胞進行“漂洗”。另外，提高了完整細胞在任何其他顆粒之前進入所述細小的錐體部分的可能性。這樣有效降低了能另外防止隨后形成千兆歐密封的顆粒污染移液管錐形部分內(nèi)表面的危險。
一般，對于本發(fā)明的優(yōu)選實施方案來說，特別有利的是毛細管的內(nèi)表面是非常光潔的，以便提供千兆歐密封，特別是具有非常高的阻抗的千兆歐密封。因此，在生產(chǎn)毛細管時優(yōu)選使其具有非常光潔的內(nèi)表面，特別是至少在該毛細管的錐形/細小部分具有非常光潔的內(nèi)表面。另外，優(yōu)選在將所述毛細管用于膜片鉗實驗之前甚至是在進行所述膜片鉗實驗期間保持所述內(nèi)表面非常光潔。
根據(jù)本發(fā)明，為了用細胞在毛細管內(nèi)產(chǎn)生千兆歐密封，優(yōu)選滿足以下四項技術(shù)要求中的至少一項。很明顯，更優(yōu)選能滿足所有四項技術(shù)要求。
1.在錐形/變細部分的生產(chǎn)期間，熔化，優(yōu)選完全熔化所述毛細管，以確保任何粉塵顆粒或污染物浸沒到內(nèi)表面以下。
2.在生產(chǎn)之后，通過將所述毛細管保持在非常清潔的環(huán)境中，避免污染其內(nèi)表面，例如，通過在經(jīng)過過濾(優(yōu)選0.2微米的孔度)的空氣流下將其密封在無菌容器中。
3.在實驗期間避免污染其內(nèi)表面，例如，用一種消毒過濾的溶液例如生理鹽溶液填充至少所述錐形部分。
4.通過沉降和/或離心使細胞通過所述消毒過濾溶液層，避免在實驗期間來自細胞懸浮液的污染性顆粒污染其內(nèi)表面。
在優(yōu)選實施方案中，在所述定位的細胞或膜結(jié)構(gòu)上測定以下參數(shù)電壓鉗中的電流，電流鉗中的電壓，電阻，阻抗，電容量，光學熒光，胞質(zhì)基因共振，機械共振，流動性和/或剛性。
在優(yōu)選實施方案中，可以在進行膜片鉗實驗之前證實和/或控制細胞的定位。這一目的可以通過光學方法實現(xiàn)，例如通過分析激光對毛細管錐形部分的照明。在這種情況下，可以用染料、染料結(jié)合的抗體、配體、脂類等對所述細胞進行染色?？梢赃x擇染料，以便指示在細胞內(nèi)或細胞表面的化學變化，并因此提供除了細胞在毛細管內(nèi)的定位以外的生物學信息，例如細胞質(zhì)溶膠的化學變化。優(yōu)選通過測定通過所述毛細管的壓力和/或流量來控制并證實細胞的定位。壓力和/或流量的改變表明了細胞在毛細管錐形部分的定位。為了實現(xiàn)細胞的理想定位和細胞膜與毛細管內(nèi)表面之間的緊密密封，可以調(diào)控，優(yōu)選自動調(diào)控壓力和流量。另外，優(yōu)選測定沿毛細管的電阻，以便評估所述細胞相對錐形部分的定位并測定該密封的質(zhì)量。然后可以調(diào)控定位力，以便改善該密封的阻抗。這樣，可以控制液壓力或離心力，以便獲得不同類型細胞的細胞膜和毛細管內(nèi)表面之間的最佳密封。
根據(jù)本發(fā)明，可以將一種新的毛細管或微量移液管用于每一個膜片鉗實驗。這樣能確保將一個新的非常光潔的表面用于定位并密封一個新的細胞。在另一種優(yōu)選實施方案中，所述毛細管在一次膜片鉗實驗之后可以再利用。為此，通過吸力/沖洗將所述細胞從毛細管中清除。然后對毛細管進行清洗，并準備好用于另一個膜片鉗實驗。毛細管的清洗優(yōu)選通過用溶劑或化學物沖洗進行。作為補充或替代，可以將加熱和超聲波用于清洗毛細管內(nèi)表面。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯而易見的是可以用多種方式改進權(quán)利要求書中所限定的方法。例如，在將所述細胞密封在毛細管內(nèi)壁上之后，溶液交換可以在細胞的兩側(cè)進行。溶液交換可以用試管或用于抽吸和/或沖洗等的出口進行。另外，可以在所述密封的一側(cè)對所述細胞膜進行選擇性地透化。為了實現(xiàn)這一目的，可以使用壓力變化、超聲波、電壓躍變或透化化學物(例如，離子載體、表面活性劑、酶、溶劑)?？梢酝ㄟ^所述溶液交換裝置使用上述手段。選擇性地透化一個膜表面能夠使得其他膜表面的內(nèi)側(cè)可以接觸施加到毛細管中的物質(zhì)，并降低進入所述其他膜表面的電阻。根據(jù)本發(fā)明，不需要諸如針頭的其他探頭或機械移動所述探頭使所述細胞膜破裂。
很顯然，可以用本發(fā)明的方法檢查多種不同類型的細胞。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用直徑低于100微米，優(yōu)選低于50微米的細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)(如上文所述)。更優(yōu)選使用直徑為30-3微米的細胞或結(jié)構(gòu)。
舉例來說，可以檢查的細胞包括Jurkat淋巴瘤細胞、HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、來自神經(jīng)元組織的原代細胞如海馬狀突起、神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞等；骨骼肌、平滑肌、心肌、免疫細胞；上皮細胞和內(nèi)皮細胞等。另外，可以對細胞進行遺傳工程改造。例如，離子轉(zhuǎn)運蛋白可以在諸如CHO細胞的細胞系中表達。在一種優(yōu)選實施方案中，可以在膜片鉗實驗之后，從所述毛細管中收集諸如DNA或RNA的遺傳學材料。
在另一種實施方案中，本發(fā)明的方法可用于檢查人造或天然脂類小泡。優(yōu)選將離子轉(zhuǎn)運蛋白，可以是遺傳改變過的蛋白插入所述小泡中。另外，可以檢查亞細胞膜結(jié)構(gòu)(例如線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核)，植物細胞和原核細胞(例如細菌)，因為與現(xiàn)有膜片鉗技術(shù)的狀態(tài)不同，本發(fā)明方法可以對直徑遠遠超越1微米的結(jié)構(gòu)進行定位和密封。
在一種優(yōu)選實施方案中，材料是從定位的細胞中采集/收獲的，它可以是蛋白、脂類、RNA、DNA、酶和其他分子。
本發(fā)明還包括一種用于對細胞或其他膜結(jié)構(gòu)進行膜片鉗實驗的新裝置，優(yōu)選用于上述方法。該裝置包括至少一個毛細管，至少一個用于將細胞輸送到所述毛細管腔內(nèi)，并且將所述細胞定位于毛細管內(nèi)的裝置，以及進行膜片鉗測定所需要的其他常用裝置。所述毛細管以一種方式沿毛細管長度方向變細，至少在一個部位具有小于待測定細胞外徑的內(nèi)部直徑。另外，以這種方式設計所述毛細管，以便可以將細胞導入所述毛細管腔并且定位，以便在細胞膜和毛細管內(nèi)表面之間形成千兆歐密封。所述裝置的設計及其優(yōu)點直接與上文所披露的方法相關(guān)，并且該方法的說明是所述裝置說明書的明確部分。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，所述裝置包括可以用至少一種溶液或細胞懸浮液沖洗和排出所述毛細管腔的裝置。為此可以采用用于供給和排出所述毛細管的諸如水箱、管的液體容器，以及用于懸浮液和溶液的泵，移液管、閥和壓力/流量計。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，所述沖洗/排出裝置可以用被設計用于將所述細胞離心到毛細管中的裝置補充或取代。
所述裝置可以包括用于測定電阻的裝置(例如電極，優(yōu)選用氯化銀或碳纖維和電纜制成)或用于分析細胞/毛細管系統(tǒng)的光學特性的裝置，優(yōu)選激光源，光學纖維，和光學檢測儀。為了控制并調(diào)整細胞在毛細管內(nèi)的定位，可以使用所述裝置。
本發(fā)明的上述優(yōu)點在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中表現(xiàn)的最明顯，其中，使用了多個錐形毛細管，優(yōu)選微量移液管。所述毛細管優(yōu)選以規(guī)則間隔排列的形式排列。這樣可以實現(xiàn)膜片鉗方法的自動化，因為密封在毛細管中的細胞可以被同時檢查或依次快速檢查。
在使用多個毛細管的實施方案中，第一步可以將細胞定位在所述毛細管內(nèi)。由于定位的細胞受到了機械保護并且是可靠緊密的，第二步可以將裝有細胞的毛細管轉(zhuǎn)移到測定裝置中。另外，如果密封的努力或打開所述膜的努力失敗的話，可以更換裝有細胞的毛細管。在本實施方案中，可以組裝一系列定位的、密封的和開放的細胞。
在采用多個毛細管的實施方案中，可以方便地實現(xiàn)這種毛細管彼此之間以及毛細管與環(huán)境之間的電屏蔽。在這種場合下，優(yōu)選將金屬或任何其他導電材料的接地屏蔽物用于封閉所述毛細管。例如，所述屏蔽物可以是部分或完全包封所述毛細管的圓筒形式。
在采用多個毛細管的實施方案中，優(yōu)選使用多個液體容器，優(yōu)選微型孔，這些孔容納含有細胞和化合物的懸浮液或溶液。所述容器可以是微量滴定板上的孔。容器的數(shù)量和排列優(yōu)選與毛細管排列相關(guān)。這樣可以將液體從一個特定的孔轉(zhuǎn)移到相應的毛細管中，例如使用活塞移液管。
在上述實施方案中，所述毛細管和液體容器優(yōu)選以如下方式排列或移動，以便包括細胞懸浮液在內(nèi)的懸浮液或溶液能夠方便地轉(zhuǎn)移到毛細管腔中。附圖和


提供了所述結(jié)構(gòu)的例子。
在一種優(yōu)選實施方案中，所述裝置中的至少一個毛細管是沿該毛細管的長度方向變細的，以便至少在一個部位具有小于待測定細胞外徑的內(nèi)徑，以便采用在本發(fā)明中所披露的方法。所述毛細管優(yōu)選由玻璃制成，并且優(yōu)選是微量移液管。
所披露的特征和說明以及其他特征和說明來自以下實驗方法和

?？梢詫⒉煌奶卣鲉为毣蚪M合應用于所述實驗方法或附圖中。

圖1是比較用常規(guī)膜片鉗技術(shù)(A)和本發(fā)明方法(B)定位細胞的示意圖；圖2是本發(fā)明毛細管的一種實施方案的示意圖；圖3是分別選擇性地透化膜的一側(cè)的示意圖；圖4是處在密封狀態(tài)的含有細胞的毛細管的兩種其他實施方案的示意圖；圖5是用于自動化膜片鉗的裝置的示意圖，包括裝有細胞的毛細管和其他裝置；圖6是通過吸力和自動化膜片鉗自動定位的多個毛細管排列的示意圖；圖7是通過離心和自動化膜片鉗實現(xiàn)自動化定位的多個毛細管排列的示意圖；
圖8是隨著電壓躍變的電流軌跡，證實在細胞定位于毛細管內(nèi)期間，由于千兆歐密封的形成而導致的阻抗增加；以及圖9是定位于玻璃微量移液管頂端內(nèi)的細胞的顯微照片。
圖1表示本發(fā)明方法和現(xiàn)有常規(guī)膜片鉗技術(shù)的差異。圖1A表示通過常規(guī)膜片鉗方法實現(xiàn)的細胞與微量移液管頂端的結(jié)合(密封)。所述密封是在移液管開口邊緣和細胞膜之間形成的。箭頭表示在將移液管頂端壓在細胞上并且對移液管內(nèi)部施加真空時吸力/流動的方向。圖1B表示通過本發(fā)明的方法定位并密封細胞。箭頭表示在懸浮的細胞向微量移液管頂端移動時細胞的流動和/或移動方向，例如，在圖1B中，有三個懸浮的細胞向微量移液管頂端移動。圖1B還表示與錐形移液管內(nèi)壁形成密封的細胞?？梢詫υ摷毎M行膜片鉗實驗。與現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)不同，本發(fā)明的方法不需要朝向所述細胞移動微量移液管。將細胞沖洗到移液管腔中，并且定位于錐形部分。該方法不僅簡單，而且還沒有必要用顯微鏡控制定位以及用顯微操作器定位微量移液管。這樣就能夠在任何場合下將該裝置微型化和自動化。
圖2表示毛細管和用本發(fā)明方法定位和密封的細胞。將所述毛細管制成細管(外徑1.5毫米，內(nèi)徑1.2毫米)，并且在圖中所示例子中它向下收縮成一個小的開口(0.5-1微米)。將細胞(直徑大約等于10微米)定位于該錐形部分，并且細胞膜與所述錐形部分的內(nèi)表面形成密封，該錐形部分優(yōu)選是由玻璃制成。錐形部分開口上的兩條細小的線條指示在右側(cè)對細胞膜進行透化。在所述毛細管兩側(cè)插入用于輸送沖洗/排出溶液和懸浮液的細管(外徑0.2毫米，內(nèi)徑0.1毫米)。箭頭表示液體流動方向。所述沖洗/排出裝置可用于將細胞懸浮液填充到毛細管中(左側(cè)入口和出口)，或者排出細胞懸浮液，例如在實驗之后排出(左側(cè)入口和出口)。另外，可將所述管用于清洗毛細管(左側(cè)和右側(cè)入口和出口)或用于添加藥用物質(zhì)，膜透化化學物和其他化合物(左側(cè)和右側(cè)入口和出口)。另外，將電極插入毛細管腔中(例如氯化銀導線，外徑0.2毫米)，它對電流和/或電壓進行電測定，并且注入電流。可以根據(jù)相應的要求調(diào)整毛細管、錐形部分和入口和出口的尺寸，例如調(diào)整到具有不同大小的細胞類型的直徑。
圖3表示可以在周向密封的兩側(cè)對細胞膜進行透化，即可以在錐形部分的變小的入口一側(cè)或出口一側(cè)對細胞膜進行透化。所述透化作用可以用雙線條表示。在以上說明中提供了相關(guān)的信息。
圖4表示錐形毛細管的兩種額外的、替代的模型，細胞分別密封在細小部分。圖4的左側(cè)圖片表示向后彎折的錐形部分，在毛細管的最細的部分露出一個圓形的邊緣或邊沿。在圖4中的右側(cè)圖片表示具有沙漏形狀的毛細管，其錐形部分在最細部位的兩側(cè)是鏡像對稱的。在圖4中表示的特征在此被明確要求作為本發(fā)明說明書的一部分。
圖5表示本發(fā)明裝置的示意圖。圖5中示出了被制成類似于圖2所示模型的微量移液管的玻璃毛細管1。在錐形毛細管1的噴嘴狀部分，放置了一個用于實驗的細胞。將入口和出口2插入細胞兩側(cè)的毛細管腔的兩個末端。所述入口和出口與泵和壓力/流量計3連接，通過它們在容器5和毛細管1之間轉(zhuǎn)移液體，并且測定壓力和/或流率。將電極8插入毛細管1的兩側(cè)。所述電極用入口/出口下面的線條表示(圖2)。
在圖5中示出了激光源6和光線檢測儀7。由它們控制細胞在毛細管1中的定位和固定。所有相應的元件都與控制裝置4形成電連接，該控制裝置包括一臺計算機，并且記錄數(shù)據(jù)，進行電壓和/或電流鉗制(參見下文)，分析數(shù)據(jù)，以及控制和調(diào)節(jié)所述裝置。
圖6和7表示將多個毛細管組裝在一起的裝置。這些毛細管排列成平的規(guī)則的排列，并可以由該裝置定位于相應排列的多個容器上方。所述容器可以是在微量滴定板上的微量容器，如圖6和7所示。移液管的較大的開口朝向所述微量容器，并可以移動到這些容器內(nèi)。所述容器中可以填充細胞懸浮液。在圖6的下部，所述懸浮液被吸入移液管中。在圖7中通過離心使懸浮的細胞向移液管頂端移動。為此，將移液管排列支架安裝在一個轉(zhuǎn)子上。通過旋轉(zhuǎn)，離心力能將細胞移向移液管的變細部分。圖7的下部表示另一種微量滴定板。在該板上的容器中可以填充藥用物質(zhì)的溶液?？梢詫⒈３旨毎囊埔汗芘帕薪胨鋈萜髦校员銣y試藥用化合物。作為替代或補充，可以通過液體控制裝置，例如移液機構(gòu)將物質(zhì)或其溶液從容器中轉(zhuǎn)移到保持細胞的微量移液管中。
圖8和9將在下面的實驗說明中進行討論。
實驗說明使用微處理器控制的拉伸儀(Zeitz Instrumente，Augsburg，F(xiàn)RG)由硼硅玻璃(Clark Electromedical Ins truments，Reading，UK)拉制具有圖2所示尺寸的膜片鉗微量移液管。在拉伸儀中對移液管頂端進行火焰拋光，使其在含有150mM氯化鈉水溶液中的頂端阻抗降低到2-3兆歐。為了降低電容量，用硅橡膠或石蠟對某些移液管頂端的外表面進行涂覆。
用EPC9膜片鉗放大器(HEKA，Lambrecht，F(xiàn)RG)測定電壓鉗，并且獲得數(shù)據(jù)。以10kHz將所述數(shù)據(jù)數(shù)字化，并且在2kHz下過濾。用HEKA提供的軟件進行分析?！半妷恒Q”表示在膜片鉗測定中用于控制電參數(shù)的常用技術(shù)。高阻抗反饋電路將正確數(shù)量的電流注入所述生物學制品中，以便將電壓保持在理想值上。模擬電路以高時間分辨率為特征，并且能夠補償電容電流、串聯(lián)阻抗和泄露電流，這些電流有別于流經(jīng)檢查的膜結(jié)構(gòu)的離子電流。
用消毒過濾的改性林格溶液填充所述移液管，該溶液含有145mM氯化鈉，5mM氯化鉀、2mM氯化鈣、1mM氯化鎂，10mM葡萄糖和10mM HEPES(pH7.4)。通過用氯化銀涂覆的銀絲使所述移液管與所述預放大器形成電連接。用細玻璃管將懸浮在大約10μm的RPMI培養(yǎng)基中的100-500個直徑大約為5微米的Jurkat T細胞(ATCC，VA，USA)導入所述微量移液管中。然后將移液管頂端浸入裝有接地電極的溶液中。通過5mV電壓躍變測定電阻(參見圖8a)。對所述移液管施加0.5巴的壓力，將所述細胞沖向移液管頂端。一旦移液管的電阻增加到表明細胞定位于移液管錐形部分的水平就取消所述壓力梯度(圖8b)。
這種類型的實驗能夠再現(xiàn)移液管內(nèi)部和細胞膜之間的千兆歐密封。與常規(guī)膜片鉗方法類似，電阻在大于10千兆歐的范圍內(nèi)(參見圖8C)。
該實驗進一步證實所述細胞定位于移液管的變細的錐形部分，正如在圖9所示的顯微照片中所表明的。施加短的壓力脈沖(1巴，200毫秒)或電壓躍變(500mV，0.1毫秒)，能在細胞的一側(cè)對細胞膜進行穿孔。這一點表現(xiàn)在電容電荷移動的增強上(電流瞬變過程)。千兆歐密封通常在長時間內(nèi)(10-＞60分鐘)是穩(wěn)定的，并且甚至能耐受故意施加在微量移液管上的機械震動。
本文所披露的實驗明確表明，通過將細胞導入以具有變細的錐形部分為特征的玻璃毛細管，可以獲得細胞膜和移液管壁內(nèi)表面之間的穩(wěn)定的千兆歐密封。該密封的阻抗和穩(wěn)定性高到足以獲得上述優(yōu)點。
權(quán)利要求
1.一種用膜片鉗技術(shù)對細胞或類似結(jié)構(gòu)進行測定的方法，其中，將至少一個細胞引入毛細管內(nèi)腔中，使得沿著毛細管的長度，至少在一個位置具有小于所述細胞外徑的內(nèi)徑；在所述部位將所述細胞定位于所述毛細管內(nèi)部，在細胞膜和所述毛細管內(nèi)表面之間形成所謂的千兆歐密封，該密封具有至少1千兆歐，優(yōu)選至少10千兆歐的電阻；以及然后對所述細胞進行膜片鉗實驗。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過將含有該細胞的懸浮液或溶液沖洗或抽吸到毛細管中，將所述細胞引入并定位于毛細管內(nèi)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，通過對含有所述細胞的懸浮液或溶液施加離心和/或沉降作用，將所述細胞引入并定位于毛細管內(nèi)。
4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述毛細管是玻璃毛細管。
5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述毛細管是所謂的微量移液管。
6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述較小的內(nèi)徑低于50微米，優(yōu)選低于10微米。
7.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述細胞的直徑低于100微米，優(yōu)選低于50微米，其中直徑更優(yōu)選為30微米-3微米。
8.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，通過使所述細胞或含有所述細胞的所述懸浮液或溶液通過優(yōu)選的消毒過濾的液體或溶液特別是生理鹽溶液，將所述細胞或含有所述細胞的所述懸浮液或溶液引入所述毛細管內(nèi)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，在通過步驟之前將所述優(yōu)選的消毒過濾的液體或溶液填充到毛細管中，由此至少覆蓋將要產(chǎn)生千兆歐密封的位置。
10.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，在膜片鉗實驗之前或膜片鉗實驗期間控制所述細胞在毛細管內(nèi)的位置，優(yōu)選在細胞定位于毛細管腔內(nèi)之后，通過測定壓力或流動或電阻或者使用光學信號優(yōu)選激光來進行控制。
11.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，在膜片鉗實驗之后將所述細胞從毛細管中取出，并且清洗毛細管，優(yōu)選用合適的溶劑或化學物質(zhì)沖洗該毛細管。
12.一種用于對細胞或類似結(jié)構(gòu)以膜片鉗方法進行實驗的裝置，其特別適用于如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，該裝置包括至少一個毛細管，沿著該毛細管的長度，至少在一個部位具有小于細胞外徑的內(nèi)徑，該毛細管設計成將至少一個細胞保持并且定位在該毛細管腔內(nèi)，并且使得在細胞膜和所述毛細管內(nèi)表面之間形成所謂的千兆歐密封，該密封具有至少1千兆歐，優(yōu)選至少10千兆歐的電阻；至少一個被設計用于將所述細胞引入毛細管腔內(nèi)并且將所述細胞定位的裝置；和最終進行膜片鉗實驗所需要的其他裝置。
13.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中，所述用于引入和定位的裝置被設計成將至少一種包含所述細胞的懸浮液或溶液沖入毛細管腔和/或排出毛細管腔。
14.如權(quán)利要求13所述的裝置，其中，其包括以下裝置用于液體、懸浮液和溶液的作為儲蓄器的容器；連接儲蓄器和毛細管的入口和/或出口；用于液體、懸浮液和溶液的泵、閥和/或管；以及可選的用于測定壓力和流動的裝置。
15.如權(quán)利要求12-14中任一項所述的裝置，其中，所述用于引入和定位的裝置被設計用于將至少一種含有所述細胞的懸浮液或溶液離心分離到毛細管腔中。
16.如權(quán)利要求12-15中任一項所述的裝置，其中，所述毛細管是玻璃毛細管。
17.如權(quán)利要求12-16中任一項所述的裝置，其中，所述毛細管是所謂的微量移液管。
18.如權(quán)利要求12-17中任一項所述的裝置，其中，所包括的裝置用于測定電阻和/或優(yōu)選利用激光來發(fā)光，并且用于在將細胞引入毛細管之后或?qū)⒓毎朊毠芷陂g分析光學信號。
19.如權(quán)利要求12-18中任一項所述的裝置，該裝置被設計成對細胞自動進行膜片鉗實驗，其中，多個毛細管優(yōu)選布置成規(guī)則間隔的平的陣列。
20.如權(quán)利要求19所述的裝置，其中，將多個容器優(yōu)選微量滴定板上的孔設計成保持著含有細胞或化合物的溶液和懸浮液，并且其中容器的數(shù)量優(yōu)選布置成對應于毛細管的數(shù)量。
21.如權(quán)利要求20所述的裝置，其中，毛細管和容器以這種方式布置或定位，使得懸浮液或溶液及其相應的內(nèi)含物可以從容器轉(zhuǎn)移到毛細管，或者反之亦然。
22.如權(quán)利要求19-21中任一項所述的裝置，其中，在密封的嘗試失敗之后可以更換毛細管，并且優(yōu)選以這種方式使細胞開放，即，產(chǎn)生一毛細管陣列，其中，每一個毛細管包括準備用于膜片鉗測定的密封的開放細胞。
23.一種用于實施如權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法的毛細管，優(yōu)選玻璃毛細管，優(yōu)選微量移液管的用途，沿著該毛細管的長度，至少在一個位置具有小于細胞外徑的內(nèi)徑。
24.一種毛細管，優(yōu)選玻璃毛細管，優(yōu)選微量移液管，該毛細管至少在一個位置具有小于100微米的直徑，具有足以在膜片鉗實驗中提供千兆歐密封的清潔內(nèi)表面，該毛細管被密封在無菌容器或包裝中。
25.一種用于實施如權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法的試劑盒，其包括至少一個如權(quán)利要求24所述的毛細管。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種用于對細胞或類似結(jié)構(gòu)進行膜片鉗實驗的方法，其中，將至少一個細胞插入毛細管腔內(nèi)，并且定位于毛細管內(nèi)部，以便在細胞膜和所述毛細管內(nèi)表面之間產(chǎn)生超過1，優(yōu)選10千兆歐阻抗的足夠緊密的密封。在所述毛細管長度方向上具有至少一個部位具有小于所述細胞外徑的內(nèi)徑。優(yōu)選通過對含有所述細胞的懸浮液或溶液進行加壓、抽吸、沉降、離心，將述細胞插入并定位于毛細管內(nèi)。披露了用于使用該方法進行實驗的裝置。
文檔編號G01N33/483GK1466681SQ01816624
公開日2004年1月7日 申請日期2001年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月31日
發(fā)明者A·萊普勒－維恩赫斯, A 萊普勒-維恩赫斯 申請人:弗里昂有限責任公司