專(zhuān)利名稱(chēng)：多功能分子雷達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多功能分子雷達(dá)，是一種新型生物測(cè)量?jī)x器。通過(guò)光路和探測(cè)系統(tǒng)的整合，它可以在同一套裝置上實(shí)現(xiàn)激光掃描共焦熒光成像、雙光子熒光成像、單光子和雙光子熒光關(guān)聯(lián)譜儀、梯度場(chǎng)熒光關(guān)聯(lián)譜儀的全部功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞體系中特定生化成份的成像和目標(biāo)分子的運(yùn)動(dòng)學(xué)測(cè)量。
已有的激光掃描共焦熒光顯微鏡基本裝置如

圖1所示單光子共焦成像采用可見(jiàn)波段激光(波長(zhǎng)一般為488nm)進(jìn)行熒光激發(fā)。激發(fā)光經(jīng)衰減片(11)衰減后，透過(guò)低通雙色分束片(5)(波長(zhǎng)小于488nm時(shí)透過(guò))，再經(jīng)過(guò)X-Y掃描振鏡組(4)實(shí)現(xiàn)光束掃描，最后通過(guò)高數(shù)值孔徑顯微物鏡(3)聚焦在溶液或活細(xì)胞樣品(2)中。聚焦區(qū)域(1)內(nèi)特定熒光粒子所發(fā)出的背向熒光被顯微物鏡(3)收集，經(jīng)過(guò)X-Y掃描振鏡組(4)之后，被低通雙色分束片(5)反射，再經(jīng)過(guò)濾光片(6)去除散射的激發(fā)光和其他雜光，然后由透鏡(7)會(huì)聚于孔徑可調(diào)的共焦小孔上(8)上，被探測(cè)器(9)接收后輸入到信號(hào)系統(tǒng)(10)進(jìn)行信號(hào)采集與處理。共焦小孔與聚焦點(diǎn)(1)的像大小一致，利用空間濾波抑制焦點(diǎn)區(qū)(1)以外的熒光以及雜散光，提高熒光測(cè)量的信噪比。上述裝置技術(shù)成熟，一般用于活細(xì)胞體系的成像研究，但由于其采用的激發(fā)光源為可見(jiàn)或偏紫外，因此在長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)中對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的殺傷作用較大，而且其采用的波長(zhǎng)單一，無(wú)法實(shí)現(xiàn)連續(xù)可調(diào)。
雙光子熒光顯微鏡裝置基本與共焦顯微鏡相同，如圖2所示熒光激發(fā)光源采用紅外波段飛秒激光器，波段為680-1080nm；高通雙色分束片(12)對(duì)于波長(zhǎng)大于680nm的激發(fā)光束透過(guò)，可見(jiàn)波段熒光被反射。另外，由于只有在焦點(diǎn)處能夠產(chǎn)生雙光子熒光，不需要空間濾波，因而探測(cè)器前不加共焦小孔，該裝置的主要特點(diǎn)是采用了波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅外激發(fā)光，對(duì)活細(xì)胞樣品的殺傷作用較小，可適用于長(zhǎng)時(shí)間對(duì)樣品的觀測(cè)研究，由于其波長(zhǎng)連續(xù)可調(diào)，對(duì)于熒光染料選擇余地較大。但由于該項(xiàng)技術(shù)較新，其實(shí)用領(lǐng)域還有待進(jìn)一步探索。
已有技術(shù)中，針對(duì)活細(xì)胞或溶液體系，為了測(cè)量生物分子的結(jié)構(gòu)變化、微觀化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)酶動(dòng)力學(xué)等過(guò)程信息，一般采用熒光關(guān)聯(lián)譜儀。其原理是通過(guò)測(cè)量微區(qū)內(nèi)少量發(fā)光分子的熒光漲落信號(hào)，并對(duì)其作關(guān)聯(lián)分析，從而得到有關(guān)熒光分子濃度、擴(kuò)散速度等影響漲落的物理制信息。
單光子與雙光子激發(fā)熒光關(guān)聯(lián)譜儀的基本光路分別為圖3和圖4，其結(jié)構(gòu)分別與共焦熒光顯微鏡和雙光子熒光顯微鏡相似。主要區(qū)別在于圖一和圖二中的X-Y掃描振鏡組(4)被全反射鏡(13)分別取代。另外，熒光關(guān)聯(lián)譜儀的探測(cè)器為雪崩二級(jí)管單光子計(jì)數(shù)器(16)，信號(hào)系統(tǒng)(17)中采用多路定標(biāo)器和自關(guān)聯(lián)卡記錄數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)處理與系統(tǒng)控制軟件也與掃描熒光顯微鏡完全不同，包括自關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)處理與最小二乘法擬合功能，以便從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中獲得熒光粒子的擴(kuò)散系數(shù)和焦點(diǎn)區(qū)域內(nèi)熒光粒子數(shù)目等一系列參數(shù)。該裝置采用的技術(shù)屬于單分子探測(cè)領(lǐng)域，操作難度較大，適用于細(xì)胞體系中目標(biāo)生物分子的動(dòng)力學(xué)測(cè)量。
綜上所述，現(xiàn)有掃描熒光顯微鏡和熒光關(guān)聯(lián)譜儀都是獨(dú)立系統(tǒng)，功能單一。實(shí)際研究中，針對(duì)一個(gè)具體的生物體系開(kāi)展研究時(shí)，多參數(shù)復(fù)合測(cè)量是非常必要的。掃描成像的方法可以獲得細(xì)胞層次的信息，熒光關(guān)聯(lián)譜儀的方法可以獲得分子層次的信息。因此，在現(xiàn)有條件下，對(duì)一個(gè)特定生物對(duì)象進(jìn)行成像研究時(shí)，若需要同時(shí)對(duì)該對(duì)象的特定部位開(kāi)展分子動(dòng)力學(xué)方面的研究，需將其再移到熒光關(guān)聯(lián)譜儀上，由于在移動(dòng)過(guò)程中的研究環(huán)境會(huì)發(fā)生變化，同時(shí)要將成像區(qū)域與熒光關(guān)聯(lián)譜儀的研究區(qū)域相對(duì)應(yīng)也有相當(dāng)?shù)碾y度，其操作過(guò)程也較復(fù)雜，大大影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，建立兩套獨(dú)立的系統(tǒng)所需的光學(xué)器件數(shù)目較多，也存在一定程度上的浪費(fèi)。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的多功能分子雷達(dá)，包括激發(fā)光源部分、樣品激勵(lì)與熒光收集部分以及熒光信號(hào)探測(cè)與處理部分。激發(fā)光源部分包括可見(jiàn)激發(fā)光衰減片、紅外激光衰減片和高通分束片；樣品激勵(lì)與熒光收集部分包括激光聚焦點(diǎn)、顯微物鏡和X-Y掃描振鏡組；熒光信號(hào)探測(cè)與處理部分包括帶通分束片、濾光片、聚焦透鏡、可調(diào)共焦小孔、探測(cè)器和信號(hào)系統(tǒng)?？梢?jiàn)波段激發(fā)光經(jīng)衰減片衰減，高通雙色分束片反射后，透過(guò)多波段帶通分束片再經(jīng)過(guò)X-Y掃描振鏡組實(shí)現(xiàn)光束掃描，最后通過(guò)高數(shù)值孔徑顯微物鏡聚焦在樣品上。聚焦區(qū)域內(nèi)特定熒光粒子所發(fā)出的背向熒光被顯微物鏡收集，經(jīng)過(guò)X-Y掃描振鏡組之后，被多波段帶通分束片反射，再經(jīng)過(guò)帶通濾光片去除散射的激發(fā)光和其他雜光，然后由透鏡會(huì)聚于孔徑可調(diào)的共焦小孔上，被雪崩二級(jí)管單光子計(jì)數(shù)器接收后，輸入到信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)處理，得到熒光圖像與熒光關(guān)聯(lián)譜圖。
使用本發(fā)明設(shè)計(jì)的多功能分子雷達(dá)，實(shí)現(xiàn)了激光掃描雙光子(共焦)熒光顯微鏡與熒光關(guān)聯(lián)譜儀的一體化，在一套系統(tǒng)上、針對(duì)同一個(gè)樣品，進(jìn)行了不同類(lèi)型的多種測(cè)量，實(shí)驗(yàn)裝置和儀器調(diào)節(jié)過(guò)程簡(jiǎn)單，提高了工作效率。
圖1是共焦掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是雙光子掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是單光子激發(fā)熒光關(guān)聯(lián)譜儀結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4是雙光子激發(fā)熒光關(guān)聯(lián)譜儀結(jié)構(gòu)示意圖。
圖5是本發(fā)明設(shè)計(jì)的多功能分子雷達(dá)結(jié)構(gòu)示意圖。
圖1～圖5中，1是激光聚焦點(diǎn)，2是樣品，3是顯微物鏡，4是X-Y掃描振鏡組，5是低通雙色分束片，6是濾光片，7是聚焦透鏡，8是共焦小孔，9是探測(cè)器(光電倍增管)，10是信號(hào)系統(tǒng)(成像)，11是可見(jiàn)激發(fā)光衰減片，12是高通雙色分束片，13是濾光片，14是紅外激光衰減片，15是雙色分束片，16是探測(cè)器(單光子計(jì)數(shù)模塊)，17是信號(hào)系統(tǒng)(熒光關(guān)聯(lián)譜)，18是帶通分束片，19是濾光片，20是可調(diào)共焦小孔，21是信號(hào)系統(tǒng)(成像與熒光關(guān)聯(lián)譜)，22是高通分束片，I是激發(fā)光源部分，II是樣品激勵(lì)與熒光收集部分，III是熒光信號(hào)探測(cè)與處理系統(tǒng)。
使用本發(fā)明的多功能分子雷達(dá)，在一套系統(tǒng)上進(jìn)行了下列五種不同的測(cè)量過(guò)程1、本發(fā)明具有激光掃描共焦熒光成像功能，已開(kāi)展小鼠卵母細(xì)胞中鈣成像研究。可見(jiàn)波段激發(fā)光(實(shí)驗(yàn)中選波長(zhǎng)488nm激光)經(jīng)衰減片(11)衰減，高通雙色分束片(22)(對(duì)可見(jiàn)波段激發(fā)光反射，對(duì)紅外波段激發(fā)光透射，實(shí)驗(yàn)中反射488nm激發(fā)光)反射后，透過(guò)多波段帶通分束片(18)(透過(guò)紅外與可見(jiàn)激發(fā)光，反射波長(zhǎng)介于紅外與可見(jiàn)激發(fā)光之間的熒光與波長(zhǎng)小于可見(jiàn)光的熒光)，再經(jīng)過(guò)X-Y掃描振鏡組(4)實(shí)現(xiàn)光束掃描，最后通過(guò)高數(shù)值孔徑顯微物鏡(3)聚焦在溶液或活細(xì)胞樣品(2)中(實(shí)驗(yàn)中選用染有Fluo3的小鼠卵母細(xì)胞)。聚焦區(qū)域(1)內(nèi)特定熒光粒子所發(fā)出的背向熒光(實(shí)驗(yàn)中Fluo3發(fā)出波長(zhǎng)為514nm的熒光)被顯微物鏡(3)收集，經(jīng)過(guò)X-Y掃描振鏡組(4)之后，被多波段帶通分束片(18)反射，再經(jīng)過(guò)帶通濾光片(19)去除散射的激發(fā)光(包括可見(jiàn)激發(fā)光與紅外激發(fā)光)和其他雜光，然后由透鏡(7)會(huì)聚于孔徑可調(diào)的共焦小孔上(20)上，被雪崩二級(jí)管單光子計(jì)數(shù)器(16)接收后。輸入到信號(hào)系統(tǒng)(21)，配合以光子計(jì)數(shù)卡對(duì)信號(hào)進(jìn)行連續(xù)紀(jì)錄，經(jīng)處理后輸出圖像，開(kāi)展細(xì)胞內(nèi)鈣成像研究。
2、本發(fā)明具有激光掃描雙光子熒光成像功能，已開(kāi)展小鼠卵母細(xì)胞中鈣成像研究。熒光激發(fā)光源采用紅外波段飛秒激光器(實(shí)驗(yàn)中激光波長(zhǎng)選為720nm，熒光染料選用Indo-1)；經(jīng)紅外衰減片(14)衰減后，透過(guò)高通雙色分束片(22)后按照與前述單光子共焦測(cè)量完全相同的光路進(jìn)行激發(fā)和成像。但由于只有在焦點(diǎn)處能夠產(chǎn)生雙光子熒光(波長(zhǎng)490nm)，不需要空間濾波，探測(cè)器共焦小孔(20)調(diào)到最大，使熒光完全通過(guò)。開(kāi)展細(xì)胞內(nèi)鈣成像研究。
3、本發(fā)明具有單光子熒光關(guān)聯(lián)譜測(cè)量功能，已開(kāi)展溶液中熒光小球的動(dòng)力學(xué)研究。使用光路和操作與單光子共焦熒光成像基本相同。主要區(qū)別在于X-Y掃描振鏡組(4)鎖住，指向樣品中一個(gè)確定點(diǎn)，具體位置由軟件控制。另外，熒光關(guān)聯(lián)譜儀的信號(hào)系統(tǒng)(21)中包括多路定標(biāo)器和自關(guān)聯(lián)卡兩種數(shù)據(jù)記錄硬件，可以利用軟件計(jì)算自關(guān)聯(lián)，或利用硬件實(shí)時(shí)記錄自關(guān)聯(lián)函數(shù)。信號(hào)系統(tǒng)軟件還可以對(duì)自關(guān)聯(lián)函數(shù)進(jìn)行最小二乘法擬合，以便從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中獲得熒光粒子的擴(kuò)散系數(shù)和焦點(diǎn)區(qū)域內(nèi)熒光粒子數(shù)目等一系列參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中激發(fā)光采用波長(zhǎng)488nm的激光，熒光小球受激后發(fā)出波長(zhǎng)515nm的熒光，最后得到小球的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如擴(kuò)散系數(shù)，樣品濃度等。
4、本發(fā)明具有雙光子熒光關(guān)聯(lián)譜測(cè)量功能，已開(kāi)展溶液中熒光小球的動(dòng)力學(xué)研究。使用光路和操作與雙光子熒光成像基本相同。主要區(qū)別如前一節(jié)所述X-Y掃描振鏡組(4)鎖住，指向樣品中一個(gè)確定點(diǎn)。另外，信號(hào)系統(tǒng)(21)中采用多路定標(biāo)器和自關(guān)聯(lián)卡記錄數(shù)據(jù)，最小二乘法擬合。實(shí)驗(yàn)中激發(fā)光采用波長(zhǎng)850nm的激光，熒光小球受激后發(fā)出波長(zhǎng)505nm的熒光，最后得到小球的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如擴(kuò)散系數(shù)，樣品濃度等。
5、本發(fā)明具有梯度場(chǎng)熒光關(guān)聯(lián)譜測(cè)量功能，已開(kāi)展溶液中熒光小球在外加激光梯度場(chǎng)中的動(dòng)力學(xué)研究。其光路和操作過(guò)程與單光子熒光關(guān)聯(lián)譜測(cè)量基本相同，區(qū)別在于實(shí)驗(yàn)中，飛秒激光器失鎖模，作為紅外連續(xù)激光器使用，提供激光梯度場(chǎng)(實(shí)驗(yàn)中選取波長(zhǎng)為780nm的連續(xù)激光)?？梢?jiàn)波長(zhǎng)的激發(fā)光作為激勵(lì)光源(實(shí)驗(yàn)中選用波長(zhǎng)488nm的激光)。兩束激光經(jīng)分束片(22)后合束，并由成像系統(tǒng)聚焦于樣品(2)中同一個(gè)探測(cè)點(diǎn)(1)。
權(quán)利要求
1.一種多功能分子雷達(dá)，其特征在于該分子雷達(dá)包括激發(fā)光源部分、樣品激勵(lì)與熒光收集部分以及熒光信號(hào)探測(cè)與處理部分；所述的激發(fā)光源部分包括可見(jiàn)激發(fā)光衰減片、紅外激光衰減片和高通分束片；所述的樣品激勵(lì)與熒光收集部分包括激光聚焦點(diǎn)、顯微物鏡和X-Y掃描振鏡組所述的熒光信號(hào)探測(cè)與處理部分包括帶通分束片、濾光片、聚焦透鏡、可調(diào)共焦小孔、探測(cè)器和信號(hào)系統(tǒng)；可見(jiàn)波段激發(fā)光經(jīng)衰減片衰減，高通雙色分束片反射后，透過(guò)多波段帶通分束片再經(jīng)過(guò)X-Y掃描振鏡組實(shí)現(xiàn)光束掃描，最后通過(guò)高數(shù)值孔徑顯微物鏡聚焦在樣品上，聚焦區(qū)域內(nèi)特定熒光粒子所發(fā)出的背向熒光被顯微物鏡收集，經(jīng)過(guò)X-Y掃描振鏡組之后，被多波段帶通分束片反射，再經(jīng)過(guò)帶通濾光片去除散射的激發(fā)光和其他雜光，然后由透鏡會(huì)聚于孔徑可調(diào)的共焦小孔上，被雪崩二級(jí)管單光子計(jì)數(shù)器接收后，輸入到信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)處理，得到熒光圖像與熒光關(guān)聯(lián)譜圖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多功能分子雷達(dá),包括激發(fā)光源部分、樣品激勵(lì)與熒光收集部分以及熒光信號(hào)探測(cè)與處理部分,可見(jiàn)波段激發(fā)光經(jīng)衰減片衰減,高通雙色分束片反射后,透過(guò)分束片再經(jīng)過(guò)掃描振鏡組實(shí)現(xiàn)掃描,最后通過(guò)高數(shù)值孔徑顯微物鏡聚焦在樣品上,特定熒光粒子發(fā)出的背向熒光被顯微物鏡收集,經(jīng)過(guò)掃描振鏡組后被分束片反射,再經(jīng)過(guò)帶通濾光片去除散射的激發(fā)光等,然后由透鏡會(huì)聚于共焦小孔上,被單光子計(jì)數(shù)器接收后,輸入到信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行處理,得到熒光圖像與熒光關(guān)聯(lián)譜圖。使用本發(fā)明的多功能分子雷達(dá),可以在一套系統(tǒng)上、針對(duì)同一個(gè)樣品,進(jìn)行了不同類(lèi)型的多種測(cè)量,實(shí)驗(yàn)裝置和儀器調(diào)節(jié)過(guò)程簡(jiǎn)單,提高了工作效率。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1349093SQ0113667
公開(kāi)日2002年5月15日 申請(qǐng)日期2001年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月26日
發(fā)明者馬輝, 丁堯, 孫非, 劉廣, 金雷, 陳瓞延 申請(qǐng)人:清華大學(xué)