專(zhuān)利名稱(chēng)：分析患者對(duì)至少一種疾病的遺傳傾向性的方法和適應(yīng)該方法的擴(kuò)增的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分析患者對(duì)至少一種疾病如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或強(qiáng)直性脊椎炎的遺傳傾向性的一種方法。
每個(gè)個(gè)體具有他或她自身的遺傳背景，來(lái)自他或她的祖先。這種特殊的遺傳背景有時(shí)能夠有效導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生和/或發(fā)展感染病原體(例如AIDS病毒)、自身免疫病(例如風(fēng)濕性疾病)。主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的基因，特別是編碼HLA抗原(人白細(xì)胞抗原)的基因，在關(guān)節(jié)的自身免疫病理例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Lawrence，1970；Stastny，1978；Khan，1979；Stastny，1983；Gregersen，1986；Gregersen，1987；Stastny，1988；Todd，1988；Wordsworth，1989；Nepom，1989；Hiraiwa，1990；Nepom，1991)或強(qiáng)直性脊椎炎(Brewerton，1973；Schlosstein，1973；Benjamin，1990)的發(fā)展中起主要作用。
類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性的遺傳成分的相當(dāng)一部分可能與HLA-DRB基因關(guān)聯(lián)，該基因編碼參與將肽提呈給T淋巴細(xì)胞的HLA-DR分子的β鏈，這種提呈是免疫應(yīng)答調(diào)整機(jī)制中心的關(guān)鍵功能。更精確地說(shuō)，已經(jīng)表明在報(bào)道的與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的不同等位基因中，都存在相應(yīng)于HLA-DRβ1分子第三高變區(qū)70-74位的五氨基酸特殊序列。這種相應(yīng)于序列QKRAA或QRRAA或RRRAA(單字母氨基酸密碼)的“共有表位”的參與現(xiàn)已得到了很好證明。這種分子解釋也與當(dāng)基因型含有零個(gè)、一個(gè)或兩個(gè)易感性等位基因時(shí)可觀察到的疾病遞增的嚴(yán)重性(通常稱(chēng)為劑量效應(yīng))一致。
強(qiáng)直性脊椎炎是另一種炎癥性疾病，可觀察到它與HLA-B27抗原的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)(相對(duì)危險(xiǎn)性69.1)(Baarsma，1992)。在1977年，Schlosstein發(fā)表了HLA-B27和各種脊椎關(guān)節(jié)病之間的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)(Schlosstein，1977)。為了解釋HLA-B27分子的這種關(guān)聯(lián)，提出了各種假說(shuō)，也涉及提呈特定肽的功能。
HLA-B27和急性前色素層炎之間的正相關(guān)(相對(duì)危險(xiǎn)性8.2)已經(jīng)發(fā)表。
HLA-B27抗原的檢測(cè)具有明確的臨床價(jià)值，事實(shí)上這是在風(fēng)濕病學(xué)會(huì)診過(guò)程中被推薦普遍進(jìn)行的一種分析。
利用擴(kuò)增和分析特定目標(biāo)區(qū)域的分子生物學(xué)技術(shù)也可以檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)HLA-B*27等位基因。
于是，在1985年Weiss發(fā)表了HLA-B27基因的組構(gòu)、序列和表達(dá)。在1991年，Hill發(fā)表了一項(xiàng)通過(guò)PCR擴(kuò)增HLA-B基因多態(tài)區(qū)和使用特異性探針雜交檢測(cè)HLA-B*2703的技術(shù)(Hill，1991)。在1992年，Dominguez發(fā)表了在PCR擴(kuò)增HLA-B基因多態(tài)區(qū)之后用于B27基因分型的第一個(gè)方法的描述。
目前，關(guān)于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，通常在低分辨率或類(lèi)的HLA-DR分型的過(guò)程中常規(guī)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)易感性等位基因的鑒定，使得特別是能夠檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)HLA-DR4抗原或一個(gè)多個(gè)HLA-DRB1*gr04等位基因。
這些測(cè)試由專(zhuān)門(mén)研究HLA基因的中心，例如輸血中心或某些專(zhuān)門(mén)醫(yī)院完成。因此這種鑒定需要發(fā)送樣品，并需要使用相當(dāng)費(fèi)力的技術(shù)。所以有許多消極結(jié)果，例如-丟失樣品的風(fēng)險(xiǎn)，-這種鑒定需要花費(fèi)相當(dāng)多的時(shí)間，-上述鑒定相對(duì)高的費(fèi)用，和-缺乏需要服務(wù)的一方對(duì)提供服務(wù)者的控制。
本領(lǐng)域關(guān)于利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)HLA-DR和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)系的研究是非常有限的。
就強(qiáng)直性脊椎炎而言，現(xiàn)有技術(shù)基本上由免疫技術(shù)組成。用于鑒定B27抗原的專(zhuān)利申請(qǐng)WOA-95/30152就是如此。因此，關(guān)于強(qiáng)直性脊椎炎，常規(guī)利用血清學(xué)技術(shù)進(jìn)行對(duì)HLA-B27抗原的簡(jiǎn)單檢查(流式細(xì)胞術(shù)或細(xì)胞毒性，使用特異性抗B27抗體)。
這些技術(shù)是快速的，但由于B27抗原被自身抗體或肽掩蓋，有時(shí)會(huì)觀察到假陰性反應(yīng)(Neumüller，1993；Kirveskari，1997)。另外，和用于分析表達(dá)在淋巴細(xì)胞表面的抗原的任何技術(shù)一樣，必須注意要很好保存細(xì)胞，有時(shí)這是限制性的。
仍然在這一領(lǐng)域，現(xiàn)有技術(shù)也使用分子生物學(xué)技術(shù)。專(zhuān)利US-A-4,971,902涉及用于診斷患者對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎傾向性的探針。這些探針基于對(duì)DRB1*gr04等位基因群的識(shí)別。
然而，盡管這種DRB1*gr04等位基因群與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效關(guān)聯(lián)，并不是所有目前已知的等位基因(DRB1*gr0401-DRB1*gr0427)必然與這種疾病關(guān)聯(lián)。如果分型限于DRB1*gr04等位基因群，并依賴(lài)于存在的等位基因，那么該結(jié)果可能是，除了真正的陽(yáng)性和真正的陰性外，還會(huì)獲得不必要地警告醫(yī)生和患者的假陽(yáng)性。
無(wú)論使用血清學(xué)技術(shù)(用一組特異性已知的血清分析DR抗原結(jié)果按照DR1-DR10的命名法給出)，或分子生物學(xué)技術(shù)(分析DRB1等位基因結(jié)果按照DRB1*01-DRB1*10的命名法給出)，臨床醫(yī)生主要對(duì)可能含有“劑量效應(yīng)”信息的一個(gè)或多個(gè)DR4抗原或一個(gè)或多個(gè)DRB1*gr04等位基因的存在感興趣。
在結(jié)果提示對(duì)該疾病傾向性的情況下，為了指明DRB1*gr04等位基因(DRB1*gr0401-gr0427，按照1988年的正式命名法)，通常利用一種“DR4亞型分型(subtyping)”“高分辨率”的分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行第二種測(cè)試，只有DRB1*gr0401、gr0404、gr0405和gr0408等位基因報(bào)道與這種疾病相關(guān)。
這些測(cè)試可靠，但時(shí)間長(zhǎng)，需要幾天，而且昂貴。
本發(fā)明要求保護(hù)的分析方法使得分析從實(shí)用的角度看來(lái)被簡(jiǎn)化，更快，在制備擴(kuò)增子后需要不到兩個(gè)小時(shí)，而且相對(duì)廉價(jià)。
為了得到這一結(jié)果，本發(fā)明涉及一種用于分析患者對(duì)至少一種疾病的遺傳傾向性的方法，包括在按下列方式選擇的探針存在時(shí)，放置含有至少一個(gè)擴(kuò)增子的液體樣品，該擴(kuò)增子來(lái)自與所檢查疾病有關(guān)的至少一個(gè)目的多態(tài)區(qū)的擴(kuò)增。探針選擇如下-至少一個(gè)特異性“低分辨率”分型探針，其能夠與擴(kuò)增子所帶的并和所述疾病相關(guān)的至少一個(gè)基因或該基因的一群等位基因的目的多態(tài)區(qū)雜交，和-至少一個(gè)特異性“高分辨率”亞型分型探針，其能夠與“低分辨率”分型探針特異的等位基因或等位基因群的上述目的多態(tài)區(qū)雜交，高分辨率探針根據(jù)它們是否雜交，可辨別與所述疾病易感性相關(guān)的等位基因、和/或與所述疾病抗性相關(guān)的等位基因。
當(dāng)用至少一個(gè)相應(yīng)于其它等位基因群的特異性低分辨率分型探針，檢測(cè)到該基因或該基因的等位基因群的一個(gè)等位基因后，為了檢測(cè)另一個(gè)等位基因的存在，該方法包括當(dāng)至少一個(gè)對(duì)至少一個(gè)其它等位基因特異的探針存在時(shí)放置擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子相應(yīng)于用低分辨率探針檢測(cè)到的所述基因或所述該基因的等位基因群的多態(tài)性。
對(duì)被研究疾病特異的每一個(gè)低或高分辨率的探針含有至少一個(gè)所述被研究疾病的特征性基元。
當(dāng)希望檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它相關(guān)疾病的遺傳易感性HLA-DR等位基因時(shí)，使用-至少一個(gè)能夠與DRB1*gr04等位基因群雜交的低分辨率探針，-至少一個(gè)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性相關(guān)的、能夠與下列等位基因雜交的高分辨率探針DRB1*0101、DRB1*gr0401、DRB1*gr0404、DRB1*gr0405、DRB1*gr0408和DRB1*gr1402，-至少一個(gè)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳抗性相關(guān)的、能夠與下列等位基因雜交的高分辨率探針DRB1*gr0402、DRB1*gr0403、DRB1*gr0406、和DRB1*gr0407。
另外，使用至少一個(gè)能夠與DRB1*01等位基因群和DRB1*10等位基因雜交的低分辨率探針。
當(dāng)已檢測(cè)到DRB1*04等位基因群的一個(gè)等位基因后，希望檢測(cè)另一個(gè)等位基因的存在，使用至少一個(gè)能夠與下列等位基因雜交的探針DRB1*02、DRB1*03、DRB1*07、DRB1*08、DRB1*09、DRB1*11、DRB1*12、DRB1*13和DRB1*14。
關(guān)于與這些等位基因有關(guān)的探針，使用-SEQ ID NO 3探針，用于DRB1*gr04分型，-兩個(gè)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳易感性相關(guān)的高分辨率探針-SEQ ID NO 4，用于DRB1*gr0401，-SEQ ID NO 7，用于DRB1*0101、DRB1*gr0404、DRB1*gr0405、DRB1*gr0408和DRB1*1402，-兩個(gè)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳抗性相關(guān)的高分辨率探針-SEQ ID NO 5，用于DRB1*gr0402，和-SEQ ID NO 6，用于DRB1*gr0403、DRB1*gr0406和DRB1*gr0407。
更精確地，使用DRB1*gr0405特異的、并與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳易感性相關(guān)的高分辨率探針SEQ ID NO 8。
另外，下面兩個(gè)探針用于分型-SEQ ID NO 11，用于DRB1*01等位基因群，和-SEQ ID NO 15，用于DRB1*10等位基因。
當(dāng)已檢測(cè)到DRB1*gr04等位基因群的一個(gè)等位基因后，希望檢測(cè)另一個(gè)等位基因的存在時(shí)，使用下面四個(gè)分型探針-SEQ ID NO 13，用于DRB1*02，-SEQ ID NO 14，用于DRB1*07和DRB1*09，-SEQ ID NO 16，用于DRB1*08和DRB1*12，和-SEQ ID NO 12，用于DRB1*03、DRB1*11、DRB1*13和DRB1*14。
在任何情況下，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它相關(guān)疾病的遺傳易感性等位基因特異的每個(gè)低或高分辨率的探針，都含有一個(gè)下列特征性基元QKRAA、QRRAA或RRRAA。
使用至少一個(gè)能夠與DRB1基因群雜交的對(duì)照探針來(lái)檢測(cè)所有DRB1基因，例如SEQ ID NO 1TTC GAC AGC GAC GTG GGG。
如果目的是要檢測(cè)關(guān)于強(qiáng)直性脊椎炎和其它相關(guān)疾病遺傳易感性的等位基因，則使用至少一個(gè)能夠與HLA-B基因雜交并對(duì)HLA-B27等位基因群特異的低分辨率探針，例如SEQ ID NO 10。
如果目的是要檢測(cè)與對(duì)播散性紅斑狼瘡(lupus erythematosusdisseminatus)、膠原蛋白疾病、舍格倫綜合征(Sjgren’s syndrome)和其它相關(guān)疾病的遺傳易感性相關(guān)的等位基因，使用至少一個(gè)能夠與HLA-DR基因雜交并對(duì)HLA-DRB1*03等位基因群特異的低分辨率探針，例如SEQ ID NO 19。
無(wú)論進(jìn)行哪種檢測(cè)，相同低分辨率或高分辨率探針最多有38.89％的堿基被至少一個(gè)類(lèi)似堿基替代，例如肌苷。
根據(jù)實(shí)施本方法的一種變異方式，將每一個(gè)低分辨率或高分辨率探針?lè)湃胛⒘康味ò宓囊粋€(gè)孔中，獨(dú)立于其它探針。
根據(jù)實(shí)施本方法的另一種變異方式，所有反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。
在上述方法之前，進(jìn)行至少一次目的多態(tài)區(qū)的擴(kuò)增。
HLA-DR相關(guān)目的多態(tài)區(qū)的擴(kuò)增和HLA-B相關(guān)目的多態(tài)區(qū)的擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行。
根據(jù)一種變異實(shí)施方式，進(jìn)行至少一個(gè)區(qū)域的第二次擴(kuò)增，它比已經(jīng)在所述多態(tài)區(qū)上進(jìn)行的擴(kuò)增具有更高靶向性，這種有更高靶向性的區(qū)域是所研究疾病的目的區(qū)域，并在先前限定的探針存在時(shí)放置獲得的擴(kuò)增子。
根據(jù)這種方式，第一次擴(kuò)增在第二次具有更高靶向性的擴(kuò)增同時(shí)或在其之前進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及相應(yīng)于DRB1*gr04等位基因群的序列的擴(kuò)增，目的是將它用于一種分析患者對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳傾向性的方法中，它包括使用SEQ ID NO 20引物和SEQ ID NO 21引物。
本發(fā)明還涉及相應(yīng)于B27等位基因的序列的擴(kuò)增，目的是將它用于一種分析患者對(duì)強(qiáng)直性脊椎炎的遺傳傾向性的方法中，它包括聯(lián)合使用SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23和/或SEQ ID NO 25引物與SEQ ID NO 24和/或SEQ ID NO 26引物。
另外，本發(fā)明也可包括將上面兩段中描述的兩種擴(kuò)增結(jié)合起來(lái)，目的是將它用于一種分析患者對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或強(qiáng)直性脊椎炎的遺傳傾向性的方法中。
在此情況下，擴(kuò)增，其中用于擴(kuò)增相應(yīng)于DRB1*gr04等位基因群的序列的引物終濃度比用于擴(kuò)增相應(yīng)于B27等位基因的序列的引物終濃度要高[脫漏]。
在一種變異實(shí)施方式中，上述擴(kuò)增與對(duì)應(yīng)于DRB1*gr04等位基因所包含的更高靶向性區(qū)域的序列的擴(kuò)增相結(jié)合，它包括聯(lián)合使用SEQ ID NO21引物和SEQ ID NO 27引物。
所附實(shí)施例作為解釋性實(shí)施例給出，性質(zhì)上無(wú)任何限制性。它們使更清楚地理解本發(fā)明成為可能。
本發(fā)明涉及一種快速、經(jīng)濟(jì)的用于檢測(cè)遺傳性疾病的方法。這一新穎技術(shù)可用于所有遺傳性疾病，特別是用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎和其它自身免疫病，例如膠原蛋白疾病(狼瘡、硬皮病，等)，其在風(fēng)濕病學(xué)會(huì)診中也會(huì)遇到。
這是一種致力于分析一個(gè)個(gè)體對(duì)某些疾病的遺傳傾向性的方法，它使用分子生物學(xué)技術(shù)，可同時(shí)分析幾個(gè)基因。該方法可以有益地應(yīng)用于分析個(gè)體對(duì)與一個(gè)或多個(gè)基因關(guān)聯(lián)的一種疾病或一組相關(guān)疾病的遺傳傾向性。該方法可以應(yīng)用于分析個(gè)體對(duì)某些炎癥性自身免疫病，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊椎炎的遺傳傾向性。
該方法的優(yōu)點(diǎn)是，在多重但只是一次測(cè)試的一個(gè)步驟中獲得臨床感興趣(診斷感興趣、預(yù)后感興趣和治療方面感興趣)的一組完整的相關(guān)信息。該方法可分解成幾個(gè)步驟1)從來(lái)自該個(gè)體的生物學(xué)樣品中提取核酸，2)擴(kuò)增目的區(qū)域，它與一種病理狀態(tài)的遺傳傾向性有關(guān)的多態(tài)性已被描述，和3)采用一組雜交反應(yīng)同時(shí)分析擴(kuò)增子，該雜交反應(yīng)使用可以精確分析給定等位基因或等位基因群的一組分子探針。I-同時(shí)分析個(gè)體對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊椎炎的遺傳傾向性的實(shí)施例1°)從外周血樣品中提取脫氧核糖核酸(DNAs)這種抽提完全按常規(guī)進(jìn)行。實(shí)際上可使用任何能獲得隨后能夠用一種擴(kuò)增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的材料的DNA抽提技術(shù)。這些細(xì)胞裂解技術(shù)、提取和隨后的核酸純化是遺傳分析所推薦的常規(guī)技術(shù)，或使用商業(yè)產(chǎn)品的快速技術(shù)，例如來(lái)自QIGEA S.A.的QIAmp Blood試劑盒(商標(biāo))。2°)通過(guò)PCR同時(shí)擴(kuò)增該擴(kuò)增涉及以下位點(diǎn)-HLA-DR座位包括HLA-DRB基因相應(yīng)于5-94位密碼子的外顯子2區(qū)域(根據(jù)正式命名法)，-HLA-B座位包括HLA-B基因相應(yīng)于25-114位密碼子的外顯子2區(qū)域(根據(jù)正式命名法)。
下表1描述了擴(kuò)增上述兩個(gè)座位時(shí)使用的引物。它還給出了用于進(jìn)行這種擴(kuò)增的一組理化條件。
表1同時(shí)擴(kuò)增HLA-DR和HLA-B的目的區(qū)域(*)10X TEMAG緩沖液500mM Tris-HCl(pH8.8)、150mM硫酸銨、15mMMgCl2、500μM EDTA和0.1％明膠。3°)同時(shí)分析擴(kuò)增子這種分析利用一組使用一套寡核苷酸探針的雜交反應(yīng)，可精確分析對(duì)于研究特別是對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和對(duì)強(qiáng)直性脊椎炎的遺傳傾向性重要的HLA-DRB1和HLA-B*27等位基因或等位基因群。
表2描述了用于檢測(cè)這兩種疾病的一套探針。從左到右給出的標(biāo)示如下-在HLA命名法中指定的探針名，-在本文件中指定的序列編號(hào)，-涉及的HLA基因，-組成該探針的序列，和-密碼子(三核苷酸)在HLA基因上的位置
表2寡核苷酸探針(*)探針相應(yīng)于非編碼的互補(bǔ)鏈對(duì)于某些探針，斜體字表示的第二個(gè)序列指天然序列，即僅由四種核苷酸腺苷(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)組成的序列。其它序列除了某些用不同的核苷酸替代外，其余核苷酸相同。在本例中，它為肌苷。
某些序列不含有任何肌苷，如SEQ ID NO s 1、2、3、8、9、11、12、13、15、17和18。其它序列含有少數(shù)肌苷，如SEQ ID NO 19，在其總共16個(gè)核苷酸中有1個(gè)肌苷，即相對(duì)于基本序列有6.25％的不同。其它序列含有更多的肌苷，例如SEQ ID NO 6，在其總共18個(gè)核苷酸中有7個(gè)肌苷，即相對(duì)于基本序列大約有38.89％的差異。
使用肌苷可以進(jìn)一步提高探針對(duì)它們所雜交的序列的特異性。下表3中清楚地列出了捕獲探針的特異性。
表3捕獲探針的主要特異性在表3中，術(shù)語(yǔ)“特別是”有時(shí)與某些等位基因相關(guān)。該解釋在于存在其它等位基因的事實(shí)。因此，用SEQ ID NO 5可檢測(cè)DRB1*gr0402，但也可以檢測(cè)DRB1*gr0414。后者非常罕見(jiàn)，以致于到現(xiàn)在也沒(méi)有研究將它的存在與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎聯(lián)系起來(lái)。然而，既然這兩個(gè)等位基因的基元在目的多態(tài)區(qū)是相似的，那么很大可能它們對(duì)該疾病的易感性是相同的。
相應(yīng)于SEQ ID NO 17和18的探針D1和D6為檢測(cè)探針。
它們識(shí)別該相同基因的所有等位基因中都存在的區(qū)域。因此，SEQ IDNO 17探針選自HLA DR基因的一個(gè)保守區(qū)，而SEQ ID NO 18探針選自HLAB基因的一個(gè)保守區(qū)中。
這種探針?lè)治隹梢栽跇?biāo)準(zhǔn)化的微量滴定板上進(jìn)行。這些板含有8孔單獨(dú)板條，能夠根據(jù)所要進(jìn)行的測(cè)試數(shù)目組裝。由于方便和成本的需要，每次測(cè)試使用兩塊板條和[原文如此]有利的。
目標(biāo)是用最少的板條獲得結(jié)果，因?yàn)樯a(chǎn)成本必須盡可能低，而同時(shí)具有高水平的性能。其最小值相應(yīng)于兩塊板條。
因此，就類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊椎炎而言，可用兩塊板條，它們將被分別稱(chēng)為R1和R2。R1板條提供一種可能性，而至于R2可能有兩種方案。
表4多重測(cè)試的組織(探針在孔中的分布)R1板條含有一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(SEQ ID NO 1)，能夠檢測(cè)DRB1*基因的所有等位基因，從而能夠證實(shí)所擴(kuò)增的確實(shí)是在表1描述的引物P1和P2之間的目標(biāo)區(qū)域。陰性對(duì)照(SEQ ID NO 2)沒(méi)有診斷目的，它的存在僅僅是為了滿(mǎn)足某些標(biāo)準(zhǔn)。該序列絕不是對(duì)HLA特異的，而是相應(yīng)于在HLA基因中不存在的一個(gè)隨機(jī)序列。
SEQ ID NO 3可以對(duì)組成DRB1*gr04群的一組等位基因進(jìn)行分型。它可以鑒定所有的DRB1*gr04等位基因，這些等位基因?qū)儆谕ㄟ^(guò)利用血清學(xué)的HLA分型技術(shù)確定的組群，如DR4群。它是一種低分辨率探針，即用該探針能夠識(shí)別許多等位基因。
SEQ ID NO s 4-8本身可以對(duì)組成DRB1*gr04群的一些等位基因進(jìn)行亞型分型，確定那些共有一種特殊序列的等位基因。它們是高分辨率探針，即用這些探針中的一個(gè)能識(shí)別少數(shù)等位基因，或甚至一個(gè)等位基因。
所有這些探針用來(lái)檢測(cè)含有共有表位的等位基因，它們與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳傾向性相關(guān)。更具體地，SEQ ID NO 4和7探針可檢測(cè)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性相關(guān)的等位基因，SEQ ID NO 5和6探針可檢測(cè)與上述類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎抗性相關(guān)的等位基因。SEQ ID NO 8探針能夠證實(shí)DRB1*gr0405等位基因的存在。
R2板條含有一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(SEQ ID NO 9)，能夠檢測(cè)相應(yīng)于HLA-B基因外顯子2的擴(kuò)增子，從而能夠證實(shí)所擴(kuò)增的確實(shí)是在表1描述的引物P3和P4之間的目標(biāo)區(qū)域。
首先，它包含一個(gè)SEQ ID NO 10，能夠檢測(cè)B*27等位基因群，并用來(lái)確定一個(gè)個(gè)體是否對(duì)發(fā)展強(qiáng)直性脊椎炎有遺傳傾向性。
該板條的剩余孔由低分辨率探針，即SEQ ID NO s 11-16組成，能夠完成對(duì)任何個(gè)體兩個(gè)單倍型的分析，特別是指出用R1板條揭示的與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性或抗性相關(guān)的等位基因的存在是否涉及一個(gè)或兩個(gè)單倍型(劑量效應(yīng))。
依賴(lài)于在易感性等位基因、抗性等位基因和中性等位基因之間的平衡，發(fā)生嚴(yán)重程度或輕或重的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的危險(xiǎn)性是不同的，而且待實(shí)施的治療方法要適應(yīng)這些診斷。
就2a板條而言，除了有兩處改動(dòng)外，配置基本上與R2板條相同。
首先，兩個(gè)反應(yīng)合并成一組。因此，一個(gè)孔內(nèi)含有兩個(gè)不同的探針，即SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 16。
由此空出的一孔可加入一個(gè)新探針，SEQ ID NO 19，它與DRB1*03等位基因(DR3)的存在關(guān)聯(lián)。能夠以一種獨(dú)立的方式鑒定這組DRB1*03等位基因?qū)嶋H上是很明智的，發(fā)現(xiàn)該組等位基因與其它疾病，例如播散性紅斑狼瘡、膠原蛋白疾病、舍格倫綜合征或胰島素依賴(lài)性糖尿病有關(guān)。4°制備用于分析制備的擴(kuò)增子的試劑使用的反向雜交原理在申請(qǐng)人的WO-A-93/02213文件中描述，我們的專(zhuān)利申請(qǐng)中補(bǔ)認(rèn)為包含其內(nèi)容。簡(jiǎn)言之，特異性捕獲探針由于它們5’末端(存在-NH2功能基團(tuán))的修飾，從而被動(dòng)地吸附到組裝成微量滴定板的板條孔中的聚苯乙烯上。由于它們5’末端(存在-NH2功能基團(tuán))的修飾，檢測(cè)探針為共價(jià)結(jié)合了HRP酶(辣根過(guò)氧化物酶)的寡核苷酸。雜交緩沖液的組成改動(dòng)如下
-75mM Na2HPO4.2H2O，-25mM NaH2PO4.H2O，-pH 6.8，-500mM NaCl，-2％PEG 4000，-0.65％ Tween 20，-0.1％ 明膠，-0.14 g/l超聲處理的DNA，-0.001％環(huán)丙沙星鹽酸鹽，和-0.02％溴硝基二噁烷(bromonitrodioxane)。
多重測(cè)試由一塊R1板條和一塊R2或R2a板條組成，如表4所述。5°)程序1)擴(kuò)增子變性將10μl變性試劑(2N NaOH)加入到100μl制備的擴(kuò)增子溶液中。18-25℃孵育5分鐘。2)加入2ml雜交緩沖液和0.2ml含有檢測(cè)探針的溶液。3)將混合物按每孔100μl加入多重測(cè)試的16個(gè)已致敏孔中。用自粘紙蓋上。4)在孵箱中37℃(35-39℃)孵育60分鐘。5)在18-25℃洗滌除去未雜交物。6)向每孔中加入100μl底物溶液(OPD，鄰苯二胺)進(jìn)行酶反應(yīng)顯色。在18-25℃暗處孵育20分鐘。7)結(jié)果讀數(shù)直接或記錄光密度(在492nm讀數(shù))。8)結(jié)果解釋。II-實(shí)例和結(jié)果用已知HLA分型的不同樣品獲得的結(jié)果顯示如下1°)第一個(gè)樣品下表5和6表示用R1和R2兩塊板條獲得的結(jié)果。
表5R1板條 表6R2板條因?yàn)槭褂昧艘粔KR2板條，故可進(jìn)行兩種分析。
首先，HLA-DR分析表明-SEQ ID NO 1探針為陽(yáng)性HLA-DR擴(kuò)增和雜交測(cè)試正確，-SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4探針為陽(yáng)性存在DRB1*gr0401等位基因，和-SEQ ID NO 13為陽(yáng)性存在DRB1*02等位基因。
總之，存在一個(gè)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性等位基因(DRB1*gr0401)，第二個(gè)等位基因DRB1*02對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為中性。
其次，HLA-B分析表明-SEQ ID NO 9探針為陽(yáng)性HLA-B擴(kuò)增和雜交測(cè)試正確，和-SEQ ID NO 10探針為陰性沒(méi)有B*27等位基因。
被測(cè)樣品的患者對(duì)強(qiáng)直性脊椎炎不易感。
第一例樣品的HLA分型為-HLA-DRB1*gr0401/1602，和-HLA-B*5701。2°)第二個(gè)樣品下表7和8表示用R1和R2兩塊板條獲得的結(jié)果。
表7R1板條 表8R2板條有四個(gè)陽(yáng)性探針，它們是-SEQ ID NO 1探針HLA-DR擴(kuò)增和雜交測(cè)試正確。-SEQ ID NO 3探針存在至少一個(gè)DRB1*gr04等位基因，-SEQ ID NO 5探針存在至少一個(gè)DRB1*gr0402等位基因，和-SEQ ID NO 9探針存在至少一個(gè)B*等位基因，但由于SEQ ID NO 10為陰性，所以不存在B*27。
因此存在一個(gè)DR4等位基因，但該等位基因?qū)儆谂cRA遺傳易感性無(wú)關(guān)的一個(gè)亞型(DRB1*gr0402)。對(duì)第二個(gè)等位基因的鑒定能夠確定它為DRB1*02。
第三個(gè)樣品的HLA分型為-HLA-DRB1*gr0402/02，和-B*27以外的HLA-B。3°)第三個(gè)樣品下表9和10表示用R1和R2兩塊板條獲得的結(jié)果。
表9R1板條 表10R2板條就象前兩例一樣，能夠進(jìn)行兩種分析。
首先，HLA-DR分析表明-SEQ ID NO 1探針為陽(yáng)性HLA-DR擴(kuò)增和雜交測(cè)試正確，-SEQ ID NO 3探針為陰性沒(méi)有DRB1*gr04等位基因，-SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 12探針為陽(yáng)性存在DRB1*11或13等位基因，和-SEQ ID NO 13探針為陽(yáng)性存在DRB1*02等位基因。
總之，沒(méi)有一個(gè)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性的等位基因，然而，這兩個(gè)DR等位基因在類(lèi)的水平上得到鑒定。
其次，HLA-B分析表明-SEQ ID NO 9探針為陽(yáng)性HLA-B擴(kuò)增和雜交測(cè)試正確，和-SEQ ID NO 10探針為陽(yáng)性存在至少一個(gè)B*27等位基因。
第三例樣品的HLA分型為-HLA-DRB1*02/1301，和-HLA-B*27。4°)第四個(gè)樣品下表11和12表示用R1和R2a兩塊板條獲得的結(jié)果。
兩塊板條R1和特別是R2a的配置(見(jiàn)表4)，除了能夠分析類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊椎炎的遺傳易感性之外，還能夠更清楚地分析播散性紅斑狼瘡、膠原蛋白疾病、舍格倫綜合征和在風(fēng)濕病學(xué)會(huì)診中遇到的其它疾病的遺傳易感性。通過(guò)在一孔中聯(lián)合使用含有探針7、8、9和12的SEQ NO s 14和16完成這種試驗(yàn)，探針的特異性見(jiàn)表3。
表11R1板條 表12R2板條有6個(gè)陽(yáng)性探針，它們是-SEQ ID NO 1探針HLA-DR擴(kuò)增和雜交測(cè)試正確，-SEQ ID NO 3探針存在至少一個(gè)DRB1*gr04等位基因，-SEQ ID NO 4探針存在至少一個(gè)DRB1*gr0401等位基因，-SEQ ID NO 9探針存在至少一個(gè)B*等位基因，但由于SEQ ID NO 10為陰性，所以不存在B*27，-SEQ ID NO 12探針存在至少一個(gè)DRB1*03、11、13或14等位基因，和-SEQ ID NO 19探針存在至少一個(gè)DRB1*03等位基因。
在該患者中，由于DRB1*gr0401等位基因的存在，所以存在一個(gè)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳易感性等位基因，同樣，由于DRB1*03等位基因的存在，所以存在一個(gè)播散性紅斑狼瘡遺傳易感性等位基因。沒(méi)有涉及B*27的等位基因。
第四個(gè)樣品的HLA分型為-HLA-DRB1*gr0401/0301，和-B*27以外的HLA-B。III-結(jié)果的優(yōu)化目的是改進(jìn)進(jìn)行擴(kuò)增的條件。下表13中給出了最佳條件。
表13同時(shí)進(jìn)行的HLA-DR和HLA-B目標(biāo)區(qū)域的優(yōu)化擴(kuò)增因此，表1和表9擴(kuò)增條件的差別在于選擇了稍加修飾的引物P3和P4，引物P1、P2、P3和P4的新濃度以及擴(kuò)增程序中溫度的變動(dòng)。表14、15和16中具體列出了這些變動(dòng)導(dǎo)致的結(jié)果，每張表相應(yīng)于一例不同的患者樣品。
表14第一例樣品的比較研究該第一例樣品的分型為DRB1*gr0404/52。
表15第二例樣品的比較研究第二例樣品的分型為DRB1*gr0401/gr0402。
表16第三例樣品的比較研究第三例樣品的分型為DRB1*gr0403/gr0405。
所有這些值都是乘以1000后的OD值(OD×1000)。由于最大可讀值為2.5，當(dāng)數(shù)值比這個(gè)值大時(shí)，該值就被簡(jiǎn)單地標(biāo)為大于2500(＞2500)。
注意，所有最顯著的值以粗體標(biāo)出加以強(qiáng)調(diào)。這只涉及陽(yáng)性探針。對(duì)于第一例樣品，7個(gè)顯著的值都來(lái)自對(duì)初始條件優(yōu)化的條件。3個(gè)與引物的優(yōu)化有關(guān)，4個(gè)與引物和擴(kuò)增的優(yōu)化有關(guān)。對(duì)第二例樣品，5個(gè)顯著的值都來(lái)自對(duì)初始條件優(yōu)化的條件。1個(gè)與引物的優(yōu)化有關(guān)，4個(gè)與引物和擴(kuò)增的優(yōu)化有關(guān)。對(duì)第三例樣品，7個(gè)顯著的值都來(lái)自對(duì)初始條件優(yōu)化的條件。2個(gè)與引物的優(yōu)化有關(guān)，5個(gè)與引物和擴(kuò)增的優(yōu)化有關(guān)。
單獨(dú)對(duì)擴(kuò)增的優(yōu)化不如單獨(dú)對(duì)引物的優(yōu)化或?qū)σ锖蛿U(kuò)增的優(yōu)化有意義。不管怎樣，請(qǐng)注意，相應(yīng)于這19個(gè)顯著的值中，有18個(gè)支持對(duì)初始條件的擴(kuò)增的優(yōu)化。
比較根據(jù)表1和根據(jù)表13的擴(kuò)增技術(shù)，可看到，當(dāng)用于擴(kuò)增相應(yīng)于DRB1*gr04等位基因群的序列的引物終濃度比用于擴(kuò)增相應(yīng)于B27等位基因的序列的引物終濃度高時(shí)，擴(kuò)增更有效。IV-改進(jìn)在某些情況下，可能出現(xiàn)模棱兩可的情況。這樣，因?yàn)橐锊皇菍?duì)DR4特異的，所以其它等位基因被擴(kuò)增，可能造成難以解釋。這種情況例如下面三個(gè)實(shí)例；那么唯一的解決方法是用下表17中描述的特殊引物，在DR4上進(jìn)行更高靶向性的擴(kuò)增
表17HLA-DR目的區(qū)的靶向擴(kuò)增顯示這種模棱兩可的實(shí)例及其解決方法如下。1°)第一個(gè)樣品
表18R1板條 表19R2板條在這種情況下，在DRB1*gr04組(SEQ ID NO 3為陽(yáng)性)中區(qū)分DRB1*gr0401(SEQ ID NO 4為陽(yáng)性)和DRB1*gr0402(SEQ ID NO 5為陽(yáng)性)不可能不冒風(fēng)險(xiǎn)。另一個(gè)等位基因是gr52(SEQ ID NO 12為陽(yáng)性)。另外，原始數(shù)據(jù)傾向于支持DRB1*gr0402，因?yàn)镾EQ ID NO 5的陽(yáng)性值為1692，而對(duì)于DRB1*gr0401，SEQ ID NO 4的陽(yáng)性值為182。
然而，第二種分析將能夠區(qū)分這兩個(gè)等位基因。這清楚地體現(xiàn)在表20和21中。
表20R1板條 表21R2板條因此在這第二種分析中可以清楚地看到，它是DRB1*gr0401(SEQ ID NO4為陽(yáng)性)，而DRB1*gr0402(SEQ ID NO 5為陰性)[原文如此]。因此能夠區(qū)分DRB1*gr0401和DRB1*gr0402，這有非常重要的意義，因?yàn)檫@兩個(gè)等位基因?qū)︻?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有不同的影響。DRB1*gr0401與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性相關(guān)，而DRB1*gr0402與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳抗性相關(guān)。
因此，第一例樣品的分型為DRB1*gr0401/gr52。
2°)第二個(gè)樣品
表22R1板條 表23 R2板條在這種情況下，在DRB1*gr04組(SEQ ID NO 3為陽(yáng)性)中區(qū)分DRB1*gr0404(SEQ ID NO 7為陽(yáng)性)和DRB1*gr0405(SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8均為陽(yáng)性)不可能不冒風(fēng)險(xiǎn)。另一個(gè)等位基因是gr52(SEQ IDNO 12為陽(yáng)性)。
然而，第二種分析將能夠區(qū)分這兩個(gè)等位基因。這清楚地體現(xiàn)在表24和25中。
表24R1板條 表25R2板條因此在這第二種分析中可以清楚地看到，它是DRB1*gr0405(SEQ ID NO7和SEQ ID NO 8均為陽(yáng)性)，然而如果它是DRB1*gr0404，SEQ ID NO 8應(yīng)該為陰性。因此能夠區(qū)分DRB1*gr0404和DRB1*gr0405，這比前一例的意義要小，因?yàn)楦鶕?jù)目前的知識(shí)，這兩個(gè)等位基因?qū)︻?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有相同的影響。DRB1*gr0404和DRB1*gr0405都與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性相關(guān)。當(dāng)然，如果將來(lái)的知識(shí)證明這兩個(gè)等位基因中的一個(gè)比另一個(gè)有更顯著的影響，那么這第二種分析的重要性也會(huì)改變。
因此，第二例樣品的分型為DRB1*gr0405/gr52。
3°)第三個(gè)樣品
表26R1板條 表27R2板條在這種情況下，在DRB1*gr04組(SEQ ID NO 3為陽(yáng)性)中區(qū)分DRB1*gr0404(SEQ ID NO 7為陽(yáng)性)和DRB1*gr0405(SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8均為陽(yáng)性)不可能不冒風(fēng)險(xiǎn)。另一個(gè)等位基因是gr8+12(SEQID NO 16為陽(yáng)性)，根據(jù)目前的知識(shí)，它對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或強(qiáng)直性脊椎炎是中性的。還應(yīng)當(dāng)注意到，與前兩例不同，存在B*27等位基因。第二種分析再一次能夠區(qū)分這兩個(gè)等位基因。這清楚地體現(xiàn)在表28和29中。
表26R1板條 表27R2板條因此在這第二種分析中可以清楚地看到，由于SEQ ID NO 7為陽(yáng)性而SEQ ID NO 8為陰性，所以它是DRB1*gr0404，然而如果它是DRB1*gr0405，SEQ ID NO 8應(yīng)該為陽(yáng)性，就象前面的例子那樣。因此能夠區(qū)分DRB1*gr0404和DRB1*gr0405，這比第一例的意義要小，因?yàn)檫@兩個(gè)等位基因?qū)︻?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有相同的影響。DRB1*gr0404和DRB1*gr0405都與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性相關(guān)。然而，對(duì)第二例的評(píng)論可能會(huì)重復(fù)。
因此，第三例樣品的分型為DRB1*gr0404/gr8+12，并且存在至少一個(gè)B*27等位基因。V-結(jié)論正如這些實(shí)施例所證實(shí)的，本發(fā)明要求保護(hù)的方法能夠在一個(gè)或兩個(gè)步驟中同時(shí)進(jìn)行兩種檢查一種是以完全致力于臨床醫(yī)生所需信息的分析為基礎(chǔ)(DR1、DR4、DR10、DRB1*gr04亞型、基元QKRAA、QRRAA、RRRAA的存在、劑量效應(yīng))的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳易感性的檢查；另一種是對(duì)HLA-B*27的檢查，在風(fēng)濕病學(xué)會(huì)診中通常可提供大量信息。
當(dāng)進(jìn)行風(fēng)濕病學(xué)會(huì)診時(shí)，需要知道HLA-DR和HLA-B27信息的關(guān)系。試驗(yàn)的簡(jiǎn)單、可行、快速，以及因此對(duì)經(jīng)費(fèi)相當(dāng)大的影響是根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)。
按需要引入本文的參考文獻(xiàn)Baarsma，1992Baarsma GS，Current Eye Researc，1992，11 suppl.，1-9Benjamin，1990Benjamin，R，Parham p，今日免疫學(xué)(ImmuNO logy Today)，1990，11，137-142，通過(guò)關(guān)聯(lián)的罪過(guò)HLA-B27和強(qiáng)直性脊椎炎Brewerton，1972Brewerton DA，Caffrey M，Hard FD等，Lancet，1973，1，904-907.強(qiáng)直性脊椎炎和HL-A27.Dominguez，1992Dominguez O，Coto E，Martinez-Naves E，Choo SY，Lopez-Larrea C，免疫遺傳學(xué)(ImmuNO genetics)，1992，36，277-282.HLA-B27等位基因的分子分型(RM H#311)Gregersen，1986Gregersen PK，Shen M，Song QL，Merryman P，Degar S，Seki T，MaccariJ，Goldberg D，Murphy H，Schwenzer J，Wang CY，Winchester RJ，Nepom GT，Silver J，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，2642-2646.HLA-DR4單倍型的分子多樣性。Gregersen，1987Gregersen PK，Silver J，Winchester RJ，Arthritis Rheum.，1987，30，1205-1213.共有表位假說(shuō)。理解類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性的分子遺傳學(xué)一種方法。Hill，1991Hill AVS等，The Lancet，1991，March 16，337，640-642Hiraiwa，1990Hairaiwa A，Yamanaka K，Kwok WW，Mickelson EM，Masewicz S，HansenJA，Radka SF，Nepom GT，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，8051-8055.對(duì)識(shí)別HLA-Dw14 II類(lèi)表位的結(jié)構(gòu)要求與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的一個(gè)關(guān)鍵的HLA決定簇。Kana，1979Kana MA，Kushner I，Ballou SP等，Lancet，1979，1，921-922，家族性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和HLA-DRW4。Kirveskari，1997Kirveskari J，Kellner H，Wurela M，Soini H，F(xiàn)rankenberger B，Leirisalo-Repo M，Weiss EH，Granfors K，Br.J.Rheumatol.，1997，36，185-189，血清學(xué)HLA-B27分型的假陰性結(jié)果可能由改變的抗原表位引起并且能夠通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)。Lawrence，1970Lawrence J，Ann.Rheum.Dis.，1970，29，357-379Nepom，1989Nepom GT，Byers P，Seyfried C，Healey LA，Wilske KR，Stage D，Nepom BS，Arthritis Rheum.1989，32，15-21.類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的HLA基因。用特異性寡核苷酸探針鑒定易感性等位基因。Nepom，1989Nepom GT，Erlich H，Annu.Rev.ImmuNO 1.，1991，9，493-525.MHC II類(lèi)分子和自身免疫。Neumüller，1993Neumüller，J，F(xiàn)ischer M，Eberl R，Rheumatol.Int.，1993，13，163-167.由于抗原掩蓋引起的對(duì)強(qiáng)直性脊椎炎患者中HLA-B27血清學(xué)檢測(cè)的失敗。Schlosstein，1973Schlosstein L，Terasaki PI，Bluestone R，Pearson CM，N.Engl.J.Med.，1973，288，704，-706.一種HL抗原w27與強(qiáng)直性脊椎炎高度關(guān)聯(lián)。Stastny，1978Stastny P，N.Engl.J.Med.，1978，298，869-871.B細(xì)胞同種型抗原DRw4與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)聯(lián)。Stastny，1983Stastn P，Ball EJ，Dry PJ，Nunez G，ImmuNO 1.Rev.，1983，70，113-154.人免疫反應(yīng)區(qū)(HLA-D)和疾病易感性。Stastny，1988Stastny P，Ball E，Kahn M，Olsen N，Pincus T，Gao X，Br.J.Rheumatol.，1988，27，132-138.類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的HLA-DR4和其它遺傳標(biāo)記。Todd，1988Todd JA，Acha-Orbea H，Bell JI，Chao N，F(xiàn)ronek Z，Jacob CO，McDermott M，Sinha AA，Timmerman L，McDevitt HO，科學(xué)(Science)，1988，240，1003-1009。Weiss，1985Weiss EH，Kuon W，Doerner C，Lang M，Riethmüller G，免疫學(xué)(ImmuNObiology)，1985，170，367-380，分析HLA和疾病關(guān)系的一種分子方法。Wordsworth，1989Wordsworth BP，Lanchbury JS，Sakkas LI，Welsh KI，Panayi GS，BellJI，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，10049-10053.
序列表<110>bioMérieux<120>分析患者對(duì)至少一種疾病的遺傳傾向性的方法和適應(yīng)該方法的擴(kuò)增<130>HLASICK2<140><141><160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>DNA<213> 人<400> 1ttcgacagcg acgtgggg18<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人<400> 2tatgaaactt atggggatac 20<210> 3<211> 16<212> DNA<213> 人<400> 3gatacttcta tcacca 16<210> 4<211> 15<212> DNA<213> 人<400> 4gagcagaanc ggncc 15<210> 5<211> 15<212> DNA<213> 人<400> 5ctggaagacg ancgg 15<210> 6<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 6agcanangcn ggncnann 18<210> 7<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 7cagaggcgng nnncngtg 18<210> 8<211> 15<212> DNA<213> 人<400> 8gcctagcgcc gagta15<210> 9<211> 23<212> DNA<213> 人<400> 9aaatacctca tggagtggga gcc 23<210> 10<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 10tgccttngcc ttncagat 18<210> 11<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 11tggcagctta agtttgaa 18<210> 12<211> 16<212> DNA<213> 人<400> 12tactctacgt ctgagt 16<210> 13<211> 17<212> DNA<213> 人<400> 13cagcctaaga gggagtg 17<210> 14<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 14naggtngaca ncgtgtgc 18<210> 15<211> 15<212> DNA<213> 人<400> 15ggaggaggtt aagtt15<210> 16<211> 14<212> DNA<213> 人<400> 16ctctacgggn gagt 14<210> 17<211> 16<212> DNA<213> 人<400> 17gaacagccag aaggac16<210> 18<211> 19<212> DNA<213> 人<400> 18ctcgctctgg ttgtagtag 19<210> 19<211> 16<212> DNA<213> 人<400> 19ccgggtggac aacnac 16<210> 20<211> 27<212> DNA<213> 人<400> 20ccggatcctt cgtgtcccca cagcacg27<210> 21<211> 19<212> DNA<213> 人<400> 21tcgccgctgc actgtgaag 19<210> 22<211> 22<212> DNA<213> 人<400> 22gggaggagcg aggggacccc ag 22<210> 23<211> 22<212> DNA<213> 人<400> 23gggaggagcg aggggaccgc ag 22<210> 24<211> 18<212> DNA<213> 人<400> 24atctcggacc cggagact 18<210> 25<211> 11<212> DNA<213> 人<400> 25aggggaccgc a 11<210> 26<211> 20<212> DNA<213> 人<400> 26atctcggacc cggagactcg 20<210> 27<211> 21<212> DNA<213> 人<400> 27gtttcttgga gcaggttaaa c 2權(quán)利要求
1.用于分析患者對(duì)至少一種疾病的遺傳傾向性的方法，包括當(dāng)存在按下列方式選擇的探針時(shí)，放置含有至少一個(gè)擴(kuò)增子的液體樣品，該擴(kuò)增子來(lái)自與所檢查疾病有關(guān)的至少一個(gè)目的多態(tài)區(qū)的擴(kuò)增，探針的選擇如下-至少一個(gè)“低分辨率”的特異性分型探針，其能夠與擴(kuò)增子帶有的并與所述疾病相關(guān)的至少一個(gè)基因或該基因的一群等位基因的目的多態(tài)區(qū)雜交，和-至少一個(gè)特異性“高分辨率”亞型分型探針，其能夠與“低分辨率”分型探針特異的等位基因或等位基因群的所述目的多態(tài)區(qū)雜交，根據(jù)它們是否雜交，該高分辨率探針能夠區(qū)分與所述疾病易感性相關(guān)的等位基因和/或與所述疾病抗性相關(guān)的等位基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，當(dāng)已經(jīng)用至少一個(gè)相應(yīng)于另一群等位基因的特異性低分辨率分型探針檢測(cè)到該基因或該基因的等位基因群的一個(gè)等位基因時(shí)，以便檢測(cè)另一個(gè)等位基因的存在，該方法包括對(duì)至少一個(gè)其它等位基因特異的至少一個(gè)探針存在時(shí)放置擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子相應(yīng)于用低分辨率探針檢測(cè)的所述基因或該基因的所述等位基因群的多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所檢查疾病特異的每一種低或高分辨率探針，含有至少一個(gè)所述被檢查疾病的特征性基元。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3之任意一項(xiàng)的方法，用于檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它相關(guān)疾病的遺傳易感性HLA-DR等位基因，其特征在于使用-至少一個(gè)能夠與DRB1*gr04等位基因群雜交的低分辨率探針，-至少一個(gè)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳易感性相關(guān)的、能夠與下列等位基因雜交的高分辨率探針DRB1*0101、DRB1*gr0401、DRB1*gr0404、DRB1*gr0405、DRB1*gr0408和DRB1*gr1402，-至少一個(gè)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳抗性相關(guān)的、能夠與下列等位基因雜交的高分辨率探針DRB1*gr0402、DRB1*gr0403、DRB1*gr0406、和DRB1*gr0407。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于使用至少一個(gè)能夠與DRB1*01等位基因群和DRB1*10等位基因雜交的低分辨率探針。
6.權(quán)利要求4或5中的方法，當(dāng)已經(jīng)檢測(cè)到DRB1*04等位基因群的一個(gè)等位基因時(shí)，以便檢測(cè)另一個(gè)等位基因的存在，其特征在于使用至少一個(gè)能夠與下列等位基因雜交的探針DRB1*02、DRB1*03、DRB1*07、DRB1*08、DRB1*09、DRB1*11、DRB1*12、DRB1*13和DRB1*14。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6之任意一項(xiàng)的方法，其特征在于使用-SEQ ID NO 3探針，用于DRB1*gr04分型，-兩個(gè)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳易感性相關(guān)的高分辨率探針-SEQ ID NO 4，用于DRB1*gr0401，-SEQ ID NO 7，用于DRB1*0101、DRB1*gr0404、DRB1*gr0405、DRB1*gr0408和DRB1*1402，-兩個(gè)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳抗性相關(guān)的高分辨率探針-SEQ ID NO 5，用于DRB1*gr0402，和-SEQ ID NO 6，用于DRB1*gr0403、DRB1*gr0406和DRB1*gr0407。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于使用DRB1*gr0405特異的、并與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎遺傳易感性相關(guān)的高分辨率探針SEQ ID NO 8。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于使用下面兩個(gè)探針用于分型-SEQ ID NO 11，用于DRB1*01等位基因群，和-SEQ ID NO 15，用于DRB1*10等位基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，當(dāng)已經(jīng)檢測(cè)到DRB1*gr04等位基因群的一個(gè)等位基因時(shí)，以便檢測(cè)另一個(gè)等位基因的存在，其特征在于使用下面四個(gè)分型探針-SEQ ID NO 13，用于DRB1*02，-SEQ ID NO 14，用于DRB1*07和DRB1*09，-SEQ ID NO 16，用于DRB1*08和DRB1*12，和-SEQ ID NO 12，用于DRB1*03、DRB1*11、DRB1*13和DRB1*14。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-10之任意一項(xiàng)的方法，其特征在于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它相關(guān)疾病的遺傳易感性等位基因特異的每個(gè)低或高分辨率探針含有下列特征性基元中的一個(gè)QKRAA、QRRAA或RRRAA。
12.根據(jù)權(quán)利要求4-11之任意一項(xiàng)的方法，其特征在于使用至少一個(gè)能夠與DRB1基因群雜交的對(duì)照探針來(lái)檢測(cè)所有DRB1基因，該對(duì)照探針例如SEQ ID NO 1TTC GAC AGC GAC GTG GGG。
13.根據(jù)權(quán)利要求4-12之任意一項(xiàng)的方法，用于檢測(cè)強(qiáng)直性脊椎炎和其它相關(guān)疾病的遺傳易感性等位基因，其特征在于使用至少一個(gè)能夠與HLA-B基因雜交、并對(duì)HLA-B27等位基因群特異的低分辨率探針，例如SEQ ID NO 10。
14.根據(jù)權(quán)利要求4-13之任意一項(xiàng)的方法，用于檢測(cè)與播散性紅斑狼瘡、膠原蛋白疾病、舍格倫綜合征和其它相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)的遺傳易感性，其特征在于使用至少一個(gè)能夠與HLA-DR基因雜交、并對(duì)DRB1*03等位基因群特異的低分辨率探針，例如SEQ ID NO 19。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14之任意一項(xiàng)的方法，其特征在于相同低分辨率或高分辨率探針最多有38.89％的堿基被至少一個(gè)類(lèi)似堿基，例如肌苷所替代。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15之任意一項(xiàng)的方法，其特征在于將每一個(gè)特異的低分辨率或高分辨率探針?lè)湃胛⒘康味ò宓目字?，?dú)立于其它探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16之任意一項(xiàng)的方法，其特征在于所有反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17之任意一項(xiàng)的方法，其特征在于預(yù)先進(jìn)行至少一次目的多態(tài)區(qū)的擴(kuò)增。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18之任意一項(xiàng)的方法，其特征在于HLA-DR相關(guān)目的多態(tài)區(qū)的擴(kuò)增與HLA-B相關(guān)目的多態(tài)區(qū)的擴(kuò)增預(yù)先同時(shí)進(jìn)行。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19之任意一項(xiàng)的方法，其特征在于進(jìn)行至少一個(gè)區(qū)域的第二次擴(kuò)增，該第二次擴(kuò)增比已經(jīng)在多態(tài)區(qū)上進(jìn)行的擴(kuò)增具有更高靶向性，這種有更高靶向性的區(qū)域是與所檢查疾病有關(guān)的目的區(qū)域，其特征還在于，在先前限定的探針存在時(shí)放置獲得的擴(kuò)增子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其特征在于第一次擴(kuò)增在第二次具有更高靶向性的擴(kuò)增的同時(shí)或在其之前進(jìn)行。
22.對(duì)相應(yīng)于DRB1*gr04等位基因群的序列的擴(kuò)增，目的是將它用于分析患者對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳傾向性的方法中，其包括聯(lián)合使用SEQ ID NO 20引物和SEQ ID NO 21引物。
23.對(duì)相應(yīng)于B27等位基因的序列的擴(kuò)增，目的是將它用于分析患者對(duì)強(qiáng)直性脊椎炎的遺傳傾向性的方法中，其包括使用SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23和/或SEQ ID NO 25引物結(jié)合SEQ ID NO 24和/或SEQ IDNO 26引物。
24.擴(kuò)增，包括將根據(jù)權(quán)利要求22和23的兩次擴(kuò)增相結(jié)合，目的是將它[原文如此]用于分析患者對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或強(qiáng)直性脊椎炎的遺傳傾向性的方法中。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的擴(kuò)增，其中用于擴(kuò)增相應(yīng)于DRB1*gr04等位基因群的序列的引物終濃度比用于擴(kuò)增相應(yīng)于B27等位基因的序列的引物終濃度要高。
26.根據(jù)權(quán)利要求22-25之任意一項(xiàng)的、對(duì)相應(yīng)于DRB1*gr04等位基因所包含的更高靶向性區(qū)域的序列的擴(kuò)增，包括聯(lián)合使用SEQ ID NO 21引物和SEQ ID NO 27引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于分析患者對(duì)至少一種疾病的遺傳傾向性的方法。本發(fā)明也涉及適應(yīng)上述方法的一種擴(kuò)增過(guò)程。該方法包括在選擇的下列探針存在時(shí)放置含有至少一個(gè)類(lèi)型擴(kuò)增子的液體樣品,該擴(kuò)增子來(lái)自與所檢查疾病相關(guān)的至少一個(gè)目的多態(tài)區(qū)的擴(kuò)增,探針如下:至少一個(gè)稱(chēng)之為低分辨率的特異性分型探針,其能夠與來(lái)自擴(kuò)增子并與至少一種上述疾病相關(guān)的至少一個(gè)基因或所述基因的一群等位基因的目的多態(tài)區(qū)雜交;和至少一個(gè)稱(chēng)之為高分辨率的特異性亞型分型探針,其能夠與稱(chēng)之為低分辨率的特異性分型探針的等位基因或等位基因群的所述目的多態(tài)區(qū)雜交,該高分辨率探針根據(jù)它們的雜交與否能夠區(qū)分與上述疾病易感性相關(guān)的等位基因和/或與所述疾病抗性相關(guān)的等位基因。本發(fā)明特別適用于診斷領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N33/566GK1351672SQ0080780
公開(kāi)日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月20日
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