用于表征生物細(xì)胞的行為特性的振動微板生物感測的制作方法
【專利摘要】本文描述了表征至少一個生物細(xì)胞的特性或行為的方法。該方法包括如下步驟：提供微板；將所述微板的至少一個表面浸在細(xì)胞培養(yǎng)基中以使至少一個待表征的生物細(xì)胞與該微板接觸；振動該微板；提供多個與所述微板偶聯(lián)的彼此分隔開的傳感器；在振動該微板的過程中，從每個傳感器獲得各自的傳感數(shù)據(jù)時間序列，所述微板和傳感器排列成使得所獲得傳感數(shù)據(jù)時間序列不彼此獨(dú)立；處理所述傳感數(shù)據(jù)時間序列以表征所述至少一個生物細(xì)胞的特性或行為。還描述了用于表征至少一個生物細(xì)胞的特性或行為的相應(yīng)系統(tǒng)。
【專利說明】用于表征生物細(xì)胞的行為特性的振動微板生物感測
[0001]本申請是申請?zhí)枮?01080029139.9、發(fā)明名稱為“用于表征生物細(xì)胞的行為特性的振動微板生物感測”的申請的分案申請，該母案申請是2010年6月25日提交的PCT申請PCT/GB2010/001252進(jìn)入中國國家階段的申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于表征至少一個生物細(xì)胞的特性或行為的方法和系統(tǒng)。例如，所述方法和系統(tǒng)可用于表征細(xì)胞特性和 行為，如細(xì)胞繁殖、細(xì)胞極性、細(xì)胞移動、細(xì)胞生長、細(xì)胞收縮、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和體外微生物生長。
【背景技術(shù)】
[0003]當(dāng)前，對生物細(xì)胞物理特性和行為的測量主要在顯微鏡下利用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)、監(jiān)測和操作的任務(wù)可能乏味而費(fèi)時。細(xì)胞對外界刺激的應(yīng)答常常難以實(shí)時觀測。
[0004]工程師、物理學(xué)家、化學(xué)家和生物學(xué)家對機(jī)械換能器原理在設(shè)計(jì)微電子機(jī)械系統(tǒng)(MicroElectroMechanical Systems, MEMS)傳感器中的應(yīng)用越來越感興趣。應(yīng)用最廣泛的機(jī)械裝置是微懸臂梁。它已在MEMS中用于建立不同類型的傳感器，如帶有AFM集成尖頭的力傳感器(force sensors with integrated tips for AFM)、雙金屬溫度和熱傳感器、質(zhì)量載荷傳感器、介質(zhì)粘彈性傳感器，以及熱重法傳感器和應(yīng)力傳感器。微制造技術(shù)、表面功能化生物化學(xué)和懸臂梁傳感方法的結(jié)合為開發(fā)以臨床和環(huán)境應(yīng)用為目的的生物傳感器提供了機(jī)遇。由Basel等撰寫的文章“A high-sensitivity micromachinedbiosensor” (Biosensors and Bioelectronics,第 12 卷，第 8 期，1997,第 4頁)提出了用微懸臂梁檢測粘著于功能化表面上的受體包被磁珠的存在情況。由Fritz等撰寫的文章“Translating biomolecular recognition into nanomechnaics，，(Science,第 288 卷，第5464期，2000年4月14日，第316-318頁)用兩個平行微懸臂梁監(jiān)測了 ssDNA的雜交，兩個平行微懸臂梁之間的差異性偏轉(zhuǎn)允許區(qū)分僅有單個堿基錯配的兩個相同的12聚寡核苷酸。
[0005]盡管如此，仍需要能夠?qū)崿F(xiàn)在體外對基本生物學(xué)過程(例如細(xì)胞的移動、收縮、遷移、增殖或分化，以及微生物生長)進(jìn)行動態(tài)和接觸性測量的微傳感系統(tǒng)。已經(jīng)提出了此類傳感器的許多應(yīng)用領(lǐng)域。由Bhadriraju和Chen撰寫的文章“Engineering cellularmicroenvironments to improve cell-based drug testing，，(DDT,第 7 卷，第 11 期，第612-620頁，2000年6月)提出利用改造細(xì)胞微環(huán)境來改善基于細(xì)胞的藥物測試。由Ono 等撰寫的文章“Morphological changes and cellular dynamics of oligodentrocytelineage cells in the developing vertebrate central nervous system，，(Developmentalneuroscience，第23卷，第4_5期，第346-355頁，2001年)認(rèn)為，對少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及其包括細(xì)胞遷移和增殖在內(nèi)的細(xì)胞動態(tài)的研究將提供對OPC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布的潛在分子機(jī)制的認(rèn)識。由Ludtke等撰寫的文章“The Effect of Cell Divisionon the Cellular Dynamics of Microinjected DNA and Dextran”(卷 5:579-588 (2002),Molecular Therapy, 6 (I)，2002年7月，第134頁)通過顯微注射DNA和葡聚糖顯示了細(xì)胞分裂對細(xì)胞動態(tài)的影響。
[0006]為提供除顯微鏡以外的另一種細(xì)胞測量手段，本發(fā)明試圖提供一種微傳感方法和系統(tǒng)以對細(xì)胞生長和動態(tài)特性(如體外移動、收縮、形態(tài)學(xué)變化、遷移)進(jìn)行更好的檢測和監(jiān)測。本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)旨在對現(xiàn)有成像系統(tǒng)提供補(bǔ)充。
[0007]發(fā)明概沭
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了對至少一個生物細(xì)胞的特性或行為進(jìn)行表征的方法。該方法包括以下步驟:提供微板；將所述微板的至少一個表面浸沒于細(xì)胞培養(yǎng)基中，以使至少一個待表征的生物細(xì)胞與所述微板接觸；振動所述微板；提供與所述微板偶聯(lián)的彼此分隔開的多個傳感器；在振動所述微板的過程中，從每個傳感器獲得各自的傳感數(shù)據(jù)時間序列，所述微板和傳感器排列成使得所得的傳感數(shù)據(jù)時間序列不彼此獨(dú)立；處理所述傳感數(shù)據(jù)時間序列，以對所述至少一個生物細(xì)胞的特性或行為進(jìn)行表征。
[0009]因此，為克服與使用顯微成像系統(tǒng)測量生物細(xì)胞物理特性和行為有關(guān)的困難，并使得對細(xì)胞特性和行為進(jìn)行一致的定量測量成為可能，本發(fā)明提供了集成的細(xì)胞監(jiān)測方法，這通過利用來自于浸沒于細(xì)胞培養(yǎng)液中的板的動態(tài)信息和先進(jìn)的系統(tǒng)識別技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明克服了與利用顯微成像系統(tǒng)使細(xì)胞對外界刺激的應(yīng)答實(shí)時可見有關(guān)的常見難題。板動態(tài)和自動時間序列分析的集成能提供細(xì)胞的動態(tài)信息史，而不完全依賴于連續(xù)成像監(jiān)測?，F(xiàn)有技術(shù) 均不能提供本發(fā)明所能夠提供的細(xì)胞信息。此外，本發(fā)明提供了一種天然的細(xì)胞生長環(huán)境，例如沒有熒光或激光漂白。本發(fā)明還使得對生物細(xì)胞的實(shí)時連續(xù)監(jiān)測成為可能。本發(fā)明具有高靈敏度和快速響應(yīng)時間。
[0010]此外，微板的動態(tài)比上述公知的微懸梁臂更為復(fù)雜。由于其更有意思的動態(tài)特性，微板作為微傳感介質(zhì)與微懸梁臂相比可提供額外的信息。并且，微板因?yàn)榛罴?xì)胞可在其表面的細(xì)胞培養(yǎng)基中維持而具有維持細(xì)胞(和微生物)天然培養(yǎng)環(huán)境的新益處。
[0011]本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，細(xì)胞表征方法的處理步驟包括:指定細(xì)胞動態(tài)行為類別；和處理傳感數(shù)據(jù)時間序列以確定所述至少一個細(xì)胞的動態(tài)行為是否在所指定的細(xì)胞動態(tài)行為類別內(nèi)。另一實(shí)施方案中，處理步驟包括:指定細(xì)胞特性；和處理傳感數(shù)據(jù)時間序列以確定對至少一個細(xì)胞的指定特性的測量。
[0012]處理步驟可以包括在一個或多個時間域、頻率域和小波域中分析傳感數(shù)據(jù)時間序列。處理步驟可以包括分析頻率響應(yīng)函數(shù)(frequency response function, FRF)。處理步驟可以包括使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和Karhunen-Loeve分解。
[0013]—個實(shí)施方案中,微板被周期性地振動。另一實(shí)施方案中，微板被隨機(jī)地振動。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了用于表征至少一個生物細(xì)胞的特性或行為的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括:細(xì)胞培養(yǎng)基容器；置于所述容器中的微板，以使得當(dāng)所述容器至少部分充滿細(xì)胞培養(yǎng)基時，所述微板的至少一個表面浸入細(xì)胞培養(yǎng)基中；至少一個可用于振動所述微板的驅(qū)動器；與所述微板偶聯(lián)的彼此分隔開的多個傳感器，每個傳感器可在振動所述微板的過程中提供相應(yīng)的傳感數(shù)據(jù)時間序列，所述微板和傳感器排列成使得所提供的傳感數(shù)據(jù)時間序列不彼此獨(dú)立；和處理器，其可接收來自傳感器的傳感數(shù)據(jù)時間序列處理所接收的傳感數(shù)據(jù)時間序列，以對與該微板接觸的至少一個生物細(xì)胞的特性或行為進(jìn)行表征。[0015]微板邊界條件可以選自例如夾具式、懸臂式、自由式和點(diǎn)支撐式。
[0016]傳感器可以選自壓阻計(jì)傳感器(piezoresistive gauge sensor)、光學(xué)傳感器、應(yīng)變傳感器和加速度傳感器。
[0017]一個實(shí)施方案中，所述至少一個驅(qū)動器包括壓阻式換能器。另一實(shí)施方案中，所述至少一個驅(qū)動器包括聲驅(qū)動器。
[0018]—個實(shí)施方案中，所述容器為培養(yǎng)皿。
[0019]本發(fā)明的其它優(yōu)選特征陳述于所附權(quán)利要求中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]現(xiàn)在將根據(jù)附圖通過舉例來闡述本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0021]圖1a為用于本發(fā)明生物傳感系統(tǒng)的生物傳感平臺的平面圖。
[0022]圖1b為圖1a中生物傳感平臺的側(cè)視圖。
[0023]圖2為用于本發(fā)明生物傳感系統(tǒng)的生物傳感平臺的透視圖。
[0024]圖3為用于構(gòu)建非線性處理模型的自動化生物傳感系統(tǒng)裝置示意圖，顯示了其主要功能及元件。
[0025]圖4為集成式生 物傳感平臺的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。
[0026]圖5顯示了生物傳感平臺的微板表面上覆蓋的內(nèi)皮細(xì)胞的激光掃描測微儀(LSM)圖像。
[0027]圖6展示了生物傳感平臺的動態(tài)測試裝置。
[0028]圖7、圖8和圖9展示了 3種不同類型微板在3種不同細(xì)胞密度下的頻率響應(yīng)函數(shù)(FRF)。圖7使用了 100 μ m的正方形C-F-F-F微板；圖8使用了 200 μ m的正方形C-F-C-F微板；圖8使用了 300 μ m的正方形C-C-C-C微板。在各個實(shí)例中，(a)和(b)顯示內(nèi)皮細(xì)胞包被在微板表面上，和(c)顯示根據(jù)細(xì)胞密度歸一化的速度幅值。
[0029]圖10、11和12表明隨著三個測試微板(分別為N0.1,N0.1I和N0.1II)上細(xì)胞數(shù)量增加時FDRn的趨勢。FDRn是頻差比(Frequency Difference Ratio),通過在測量的共振模式η下裝載細(xì)胞和不裝載細(xì)胞的膜之間的歸一化的共振頻率差異來評估。
[0030]圖13顯示了每批實(shí)驗(yàn)中圖10、11和12所示三種微膜的AFDR指標(biāo)。AFDR是所有測量FDRn的平均值。
[0031]圖14顯示了基于簡單圖像處理技術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞群定量。
[0032]圖15為用于細(xì)胞識別的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的示意圖。
[0033]圖16顯示了使用以樣品I至14訓(xùn)練的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所得的樣品編號15至18的CDR預(yù)測結(jié)果。
[0034]優(yōu)選實(shí)施方案詳述
[0035]本發(fā)明的微米/納米級生物傳感系統(tǒng)包括細(xì)胞培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)液)容器(未顯示)。生物傳感平臺置于細(xì)胞培養(yǎng)基容器中。
[0036]圖1a和Ib顯示了生物傳感平臺10的一個實(shí)施方案的平面圖和側(cè)視圖。圖2中的透視圖顯示了一個稍有不同的實(shí)施方案。
[0037]生物傳感平臺10主要是由SIO基底12形成的。生物傳感平臺10包括微板14，兩個壓阻式換能器(PZT)形式的驅(qū)動器16，四個彼此分隔開的傳感器18，和電源輸入(未顯示)。該生物傳感系統(tǒng)還包括可形成該生物傳感系統(tǒng)的一部分的處理器(未顯示)。生物傳感平臺10被設(shè)計(jì)為可在流體(如水)中運(yùn)行，在高阻尼條件下具有良好的生物靈敏度。生物傳感平臺10可以單邊或雙邊浸沒于置于流體容器中的細(xì)胞培養(yǎng)液中，以維持天然細(xì)胞生活環(huán)境。生物傳感平臺12使用生物相容性材料，例如硅和金，以在其浸沒于細(xì)胞培養(yǎng)基時使得生物細(xì)胞能夠利用其作為天然的生長基底。
[0038]微板14是作為微米/納米級傳感平臺的薄型微制造膜。微制造膜(板/隔板)是一種有望代替微懸臂梁的質(zhì)量傳感結(jié)構(gòu)。與微懸臂梁相比，微膜可具有更大的傳感面積、在液體中更高的靈敏度和更低的脆性。此外，微膜在質(zhì)量傳感的應(yīng)用中具有與微懸臂梁相同的優(yōu)點(diǎn)。微板14是可變形的。微板14在X和Y方向上具有數(shù)十至數(shù)百微米范圍內(nèi)的尺寸。例如，微板14在X和Y方向上可具有數(shù)十至數(shù)千微米(例如100-400μπι)的尺寸。如圖1b中所示，板在Z方向上的深度約為3 μ m，但幾納米至幾十微米范圍內(nèi)的深度也適用。這些尺寸意為代表性而非限定。微板14可以通過多種不同邊界條件(例如，夾具式、懸臂式、自由式和點(diǎn)支撐式等)得以支撐。在圖2所示的實(shí)施方案中，微板14為矩形。微板14通過四個鉸合件(hinge) 20支撐，每個鉸合件各自位于微板14四邊之一的中心。這是微板邊界條件的一個實(shí)例。
[0039]驅(qū)動器(即激發(fā)源)被用于使細(xì)胞培養(yǎng)基中的微板14振動。在圖1a和Ib所示的實(shí)施方案中，驅(qū)動器為兩個PZT(鋯鈦酸鉛)薄膜16。PZT16放置于微板14區(qū)域的內(nèi)部或旁邊，以在有限的能耗下提供強(qiáng)大的激發(fā)力。因此，生物傳感系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為能夠自激發(fā)。作為使用PZT驅(qū)動器的替代選擇,微板14也可通過聲激發(fā)(sound excitation)來驅(qū)動。驅(qū)動器16可集成到生物傳感平臺10中。驅(qū)動器16可集成到微板14中。
[0040]生物傳感系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為能夠自傳感(self-sensing)。圖1a和圖2顯示了四個分布式(distributive)壓阻計(jì)(PZR)傳感器18。傳感器18被置于精心選擇的位置處，以得到微板14的全域動態(tài)/振動信息。傳感器18可嵌入微板14內(nèi)。使用先進(jìn)的微制造技術(shù)來生產(chǎn)傳感元件14和相關(guān)的連接軌道22，如圖2所示。作為使用PZR傳感器的替代選擇，不同的傳感器類型均可使用，例如光學(xué)、應(yīng)變或加速度傳感器。傳感器18可集成到生物傳感平臺10中。傳感器18可集成到微板14中。傳感器18的位置可被優(yōu)化，以使分辨靈敏度最大化并使微板表面上的高性能范圍最大化。
[0041]PZT驅(qū)動器16和壓阻計(jì)傳感器18具有良好的CMOS電路相容性，并容易與其它電子組件集成在一起。生物傳感平臺10的電子部件(例如電極線、金片和連接探針)用生物相容性材料密封。整個生物傳感平臺10用標(biāo)準(zhǔn)DIL (雙列直插式)封裝。信號流(輸入和輸出信號)可由外部處理儀器或內(nèi)部電子芯片來處理。
[0042]使用先進(jìn)的工具和流程來進(jìn)行生物傳感平臺的微米/納米制造，包括納米制造中的光和電子束蝕刻、等離子蝕刻和能夠蝕刻并快速成型的聚焦離子束工具。
[0043]在使用中，生物傳感系統(tǒng)用于區(qū)分單個細(xì)胞或細(xì)胞群的特性或行為。
[0044]細(xì)胞培養(yǎng)基容器部分地或完全地被細(xì)胞培養(yǎng)基充滿。生物傳感平臺10的微板14被放置到細(xì) 胞培養(yǎng)基容器中，使得微板14的至少一個表面淹沒或浸于細(xì)胞培養(yǎng)基中。例如，微板14可完全浸沒于細(xì)胞培養(yǎng)基中?；蛘?僅微板14的底面浸入在細(xì)胞培養(yǎng)基中。微板14浸沒在細(xì)胞培養(yǎng)基中使得細(xì)胞培養(yǎng)基中的生物細(xì)胞可以利用微板14作為天然生長基底。因此，至少一個生物細(xì)胞與微板14有接觸，其行為/特性將通過所述生物傳感系統(tǒng)和方法進(jìn)行表征。
[0045]微板14隨后由驅(qū)動器(例如PZT16)振動。微板14可被周期性地(例如，使用正弦函數(shù))激發(fā)，或是以寬頻段隨機(jī)信號(例如，偽隨機(jī)二元信號、白噪音或脈沖隨機(jī))隨機(jī)地激發(fā)。激發(fā)/振動的類型將因?qū)嵤┠康亩?。微?4被振動是因?yàn)榻佑|的生物細(xì)胞自身對微板14不施加顯著的力。接觸的生物細(xì)胞對微板14的質(zhì)量、剛度和拉伸特性產(chǎn)生影響。因此，這些變量的測量值(例如，應(yīng)變儀測量值)可用于對接觸的生物細(xì)胞對微板14的影響進(jìn)行定量，并由此推斷待表征細(xì)胞的行為/特性。使用靜態(tài)微板14，接觸細(xì)胞對微板14的偏轉(zhuǎn)非常微弱，使得難以檢測微板14內(nèi)應(yīng)力場的信號。所以，可能難以推斷待表征細(xì)胞的特性/行為。因此， 有利地使微板14以朝向或遠(yuǎn)離所接觸生物細(xì)胞的方向進(jìn)行振動，以在微板14內(nèi)應(yīng)力場中由于細(xì)胞存在而產(chǎn)生的更強(qiáng)信號。作為替代/補(bǔ)充，微板14可向其它方向振動，而不僅朝向或遠(yuǎn)離接觸生物細(xì)胞。振動微板14還具有其它優(yōu)點(diǎn):振動提供了關(guān)于微板14動態(tài)特征的額外信息(例如，固有頻率偏移、模式形狀變化和其他非線性耦合效應(yīng))。該額外的動態(tài)信息也可用于表征接觸細(xì)胞的特性或行為。
[0046]當(dāng)微板被振動時，從各個傳感器18獲取各自的傳感數(shù)據(jù)時間序列。微板14是提供接觸生物細(xì)胞和傳感器18之間非線性偶聯(lián)的連續(xù)型介質(zhì)。因此，傳感器18通過微板14的形變響應(yīng)和與微板14接觸的生物細(xì)胞偶聯(lián)，以使得傳感數(shù)據(jù)時間序列不彼此獨(dú)立。這意味著，雖然傳感器18從微板14接收局部傳感數(shù)據(jù)，但來自于特定傳感器18的傳感數(shù)據(jù)時間序列可顯示出遠(yuǎn)離該傳感器的細(xì)胞運(yùn)動。換言之，傳感器18通過微板14間接感測生物細(xì)胞的特性/行為。生物傳感平臺利用其動態(tài)/振動特征的變化作為信息源，以感測表面接觸的生物細(xì)胞和顆粒。通過解讀同步集合感測到的傳感器18的應(yīng)答，任何細(xì)胞擾動的性質(zhì)均可以確定接觸生物細(xì)胞特性或行為的方式來進(jìn)行區(qū)分。由于在傳感器18之間以偶聯(lián)機(jī)制起作用的微板14的存在，傳感器18以非獨(dú)立(即偶聯(lián))的形式應(yīng)答。由于該系統(tǒng)的偶聯(lián)性質(zhì)，微板14上僅需要相對少數(shù)量的分布式傳感器18。生物傳感平臺10的分辨率不受限于傳感器18的分隔距離，因此可用于檢測比最小制造量級還小很多的變化。此外，由于系統(tǒng)的偶聯(lián)性質(zhì)，還可以在微板14的除了細(xì)胞接觸表面以外的表面上提供傳感器18。這增加了該方法的魯棒性(robustness)。
[0047]得到傳感數(shù)據(jù)時間序列后，用先進(jìn)的系統(tǒng)鑒定方法和嵌入式IT工具處理這些時間序列，以表征至少一個生物細(xì)胞的特性或行為。在處理步驟中，將來自每一個傳感器的傳感數(shù)據(jù)時間序列與來自每一個其它傳感器的傳感數(shù)據(jù)時間序列一起進(jìn)行處理(即，對數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合處理)。處理是非線性的。例如，非線性信號處理技術(shù)如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或Karhunen-Loeve分解可用于處理偶聯(lián)的同步時間序列(以時間域或是頻率域)。
[0048]非線性處理模型利用傳感數(shù)據(jù)時間序列中的動態(tài)信息來檢測細(xì)胞特性和行為。來自微板14的空間動態(tài)信息(即模式形狀、傳感器之間的偶聯(lián)等)用于導(dǎo)出關(guān)于微板14上細(xì)胞的空間動態(tài)信息(例如，極性、干細(xì)胞生長)。用系統(tǒng)鑒定工具將處理步驟的輸出與待表征細(xì)胞/組織的特性或行為關(guān)聯(lián)起來。換言之，動態(tài)信息將與動態(tài)細(xì)胞特性的狀態(tài)和特征關(guān)聯(lián)起來。例如，目的特性或行為可以是藥物開發(fā)、微生物和腫瘤篩查或者干細(xì)胞生物學(xué)中所必需的。這可包括靜態(tài)或動態(tài)特性或行為，如繁殖、極性、細(xì)胞的移動/生長、收縮、遷移、增殖或分化以及體外微生物生長。本發(fā)明的系統(tǒng)和方法可用于在細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞操作和細(xì)胞手術(shù)過程中導(dǎo)出接觸的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的大小、形狀和運(yùn)動信息。生物傳感方法和系統(tǒng)的一個目標(biāo)是檢測細(xì)胞培養(yǎng)和生長過程中細(xì)胞在形態(tài)、遷移、增殖、分化和收縮性方面的變化。通過系統(tǒng)鑒定算法，使用相對少的傳感元件18，利用微板14的動態(tài)特征(如速度和加速度)推導(dǎo)所需信息。將微板14的動態(tài)應(yīng)答信號(即傳感數(shù)據(jù)時間序列)應(yīng)用于智能時間序列鑒定算法，以導(dǎo)出期望的細(xì)胞特性或行為信息。細(xì)胞特性/行為的辨識通過使用嵌入的信息工具完成。根據(jù)應(yīng)用的目的，輸出可以為各種描述符的離散形式或連續(xù)形式。
[0049]生物傳感系統(tǒng)中所用非線性處理模型用訓(xùn)練數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練。微板14在不同的載荷條件下差異性地振動。因此，非線性處理模型將已知的微板14在液體環(huán)境中的動態(tài)考慮在內(nèi)。例如，微板動態(tài)將受因微板14與細(xì)胞培養(yǎng)基(通常具有比水稍高的密度)相互作用而導(dǎo)致的聲壓波的影響。因此，通過使用微掃描激光振動計(jì)研究微板14在液體中的動態(tài)和聲波輻射的微尺度效應(yīng)的結(jié)果，建立了非線性處理模型。微掃描激光振動計(jì)用于測量微板14在液體中的動態(tài)和聲波輻射，如固有頻率、固有模式、某些受迫條件下的受迫響應(yīng)。因此，微掃描激振動計(jì)的使用使得適當(dāng)?shù)姆蔷€性處理模型(例如，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))得以建立。換言之，將使用微掃描激光振動計(jì)獲得的結(jié)果作為例如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練數(shù)據(jù)。通過模擬浸沒的微板的動態(tài)，可以建立非線性處理模型以從振動的微板14的傳感數(shù)據(jù)時間序列推導(dǎo)出載荷條件。在建模過程中，可通過模擬獲得不同傳感位置處的位移/速度/加速度。將動態(tài)信號(即傳感數(shù)據(jù)時間序列)中提取出的參數(shù)與外力/載荷聯(lián)系在一起的非線性處理模型是利用系統(tǒng)鑒定技術(shù)如Karhunen-Loeve分解、小波分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法建立的。非線性處理模型可通過用偽隨機(jī)二元序列(PRBS)激發(fā)和鑒定方法通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測試和驗(yàn)證。PRBS信號的優(yōu)點(diǎn)在于具有這一特性:其自相關(guān)函數(shù)是脈沖函數(shù)的準(zhǔn)確近似。所有頻率的動態(tài)均由PRBS信號激發(fā)。因此可導(dǎo)出微板14在任何受力條件下的動態(tài)。振動模型隨后可用于通過微板14上不同位置的振動傳感時間序列來推導(dǎo)施加于微板14上的受力/載荷。當(dāng)系統(tǒng)鑒定技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞/組織監(jiān)測時，可推導(dǎo)細(xì)胞動態(tài)的狀態(tài)和條件。微板14的加速度幅度在微板被浸沒時會更 小，這是由于各個模式在微板14平面上產(chǎn)生一個聲壓，簡正模式(normal mode)開始在液體中偶聯(lián)。盡管如此，通過將傳感器18置于適當(dāng)?shù)奈恢?，可通過適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)鑒定技術(shù)將主要的模式形狀與微板14上的載荷和動態(tài)條件聯(lián)系起來。非線性處理模型將所檢測瞬間的細(xì)胞行為與從微板傳感表面導(dǎo)出的信息之間的關(guān)聯(lián)考慮在內(nèi)。將利用顯微鏡系統(tǒng)的CCD照相機(jī)用于監(jiān)測可視行為，其輸出通過同步化視覺處理系統(tǒng)與來自生物傳感系統(tǒng)的信息和傳感數(shù)據(jù)輸出相關(guān)聯(lián)。圖3中顯示了實(shí)驗(yàn)性設(shè)置的功能。
[0050]如上所述，生物細(xì)胞受外部刺激而表現(xiàn)出的一系列響應(yīng)常常難以用現(xiàn)有顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時顯現(xiàn)。本文中描述的生物傳感方法和系統(tǒng)增強(qiáng)了顯微成像系統(tǒng)的可用測量，并且顯著提高了提供給細(xì)胞生物學(xué)家的信息水平。本發(fā)明微板動態(tài)方法和系統(tǒng)的三種可能的應(yīng)用如下所述。以下各類應(yīng)用實(shí)例中，生物傳感平臺均浸入細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞隨后附著于微板并于其上生長。
[0051]第一種可能的應(yīng)用涉及膜極性。白細(xì)胞如單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在靜息狀態(tài)不表現(xiàn)任何極性，不過，響應(yīng)于趨化性刺激時，膜受體變成極化的并向刺激所在方向運(yùn)動。類似地，腫瘤轉(zhuǎn)移潛勢可定義為極化并定殖于新位點(diǎn)的能力?，F(xiàn)有分析細(xì)胞遷移的技術(shù)是基于應(yīng)答于觸發(fā)物而跨越多孔膜的移動，其中方法靈敏度的缺陷決定了需要大體積樣品來觀察遷移。在分析腫瘤對轉(zhuǎn)移抑制因子的響應(yīng)時，僅有小體積樣品可用，需要提高分析的靈敏度。使用本發(fā)明系統(tǒng)和方法，可以檢測細(xì)胞膜的再分布和跨微板的遷移，作為嗜中性粒細(xì)胞對一系列趨化劑以及腫瘤對可能抑制轉(zhuǎn)移潛勢的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(如TAPI)的響應(yīng)的指示標(biāo)記。此類技術(shù)的開發(fā)提供了更高的藥物開發(fā)靈敏度和速度。
[0052]第二種潛在的應(yīng)用涉及細(xì)胞增殖、分化和凋亡。在胚胎發(fā)生過程中和活躍再生組織如腫瘤中，其中的細(xì)胞持續(xù)分裂。細(xì)胞增殖表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量增加，其中可在任何一個時間對數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞進(jìn)行研究。同樣，這種技術(shù)是粗放的，需要大量數(shù)目的細(xì)胞，而研究中將必然會有細(xì)胞的混合物。需要簡單的技術(shù)來允許用少量樣品進(jìn)行細(xì)胞生長的靈敏檢測。為達(dá)到這一目的，顯微解剖可用于從腫瘤中提取單個細(xì)胞，細(xì)胞分裂的速度將根據(jù)本發(fā)明的方法和系統(tǒng)用微板動態(tài)以大小和質(zhì)量的變化來檢測?？梢匝芯坎煌瑫r間和劑量范圍下對一系列化學(xué)治療劑包括甲氨蝶呤的響應(yīng)性，作為分化或凋亡過程中引發(fā)的細(xì)胞形狀變化。
[0053]第三種潛在的應(yīng)用涉及從干細(xì)胞發(fā)育為肌細(xì)胞。干細(xì)胞缺乏祖細(xì)胞確定性，使得其能發(fā)育成一系列成熟細(xì)胞類型。干細(xì)胞生物學(xué)因此促成了干細(xì)胞生物工程領(lǐng)域的快速發(fā)展；對環(huán)境信號的操作影響細(xì)胞的存活、增殖、自我更新和分化。這樣，多元分析方法已被成功用于優(yōu)化不同的干細(xì)胞培養(yǎng)過程。同樣，該過程可通過使用感測形態(tài)學(xué)和功能上微小變化(包括具有收縮表型的那些)的技術(shù)而得以增強(qiáng)?？梢哉T導(dǎo)干細(xì)胞成熟形成平滑肌細(xì)胞，并可隨后根據(jù)本發(fā)明方法和系統(tǒng)用微板動態(tài)以單個細(xì)胞為基礎(chǔ)分析成熟形成收縮肌的效率。
[0054]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0055]現(xiàn)在提供關(guān)于已根據(jù)本發(fā)明利用生物傳感平臺10進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。具體地，研究了基于微制造矩形硅膜(即微板14)的生物傳感系統(tǒng)。一個分布式傳感方案監(jiān)測了傳感結(jié)構(gòu)的動態(tài)。將人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法用于處理測量的數(shù)據(jù)并表征細(xì)胞的存在和密度。因此，在這些實(shí)驗(yàn)中，待表征的細(xì)胞特性是細(xì)胞的存在情況和密度。不指定任何特定的生物學(xué)應(yīng)用，本研究主要著眼 于這類生物傳感器作為普通生物傳感平臺的性能測試。對這些微制造膜進(jìn)行的生物傳感實(shí)驗(yàn)包括在膜的傳感表面接種不同密度的細(xì)胞并以一系列頻率響應(yīng)函數(shù)(FRF)的形式檢測各個測試硅膜的相應(yīng)動態(tài)信息。所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行以模擬實(shí)際工作環(huán)境。選擇EA.Hy926內(nèi)皮細(xì)胞系用于生物實(shí)驗(yàn)。EA.Hy926內(nèi)皮細(xì)胞系代表一種特定類別的生物顆粒，具有不規(guī)則的形狀、不均一的密度和不確定的生長行為，難以用傳統(tǒng)生物傳感器進(jìn)行檢測。最終的預(yù)測結(jié)果顯示，基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法從分布式傳感測量進(jìn)行細(xì)胞特征鑒定的方法在生物傳感器中的應(yīng)用潛力巨大。
[0056]應(yīng)當(dāng)注意的是，這些實(shí)驗(yàn)僅作為實(shí)例展示，其任何方面均不應(yīng)被認(rèn)為限制所附權(quán)利要求中所述的本發(fā)明范圍。
[0057]1、膜生物傳感設(shè)備的制造
[0058]在這些實(shí)驗(yàn)中，硅膜(即微板14)是使用標(biāo)準(zhǔn)微制造技術(shù)從絕緣體上的硅(silicon on insulator, SOI)晶片制造的。通過電感I禹合等離子體(inductively coupledplasma, ICP)用深反應(yīng)離子蝕刻(Deep Reactive 1n etching, DRIE)工藝從 SOI 晶片(即SOI基底12)的背面產(chǎn)生膜，終止于包埋的氧化物層。膜的邊界條件也通過DRIE從晶片頂面界定，利用包埋的氧化物層作為終止層。包埋的氧化物層最終被移除以形成邊界孔。制造并測試了三種不同的微膜邊界條件:兩個相對的夾具式邊緣和另兩個自由邊緣(C-F-C-F)、懸臂梁(C-F-F-F)和全部夾具式邊緣(C-C-C-C)。所有膜均被設(shè)計(jì)為正方形，其邊長為100 μ m、200 μ m 或 300 μ m。[0059]為了動態(tài)測試上述膜結(jié)構(gòu)，使用外部驅(qū)動器來激發(fā)，使用激光振動計(jì)進(jìn)行振動測定。在這些膜上進(jìn)行大量的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)其生物傳感性能。
[0060]圖4為基于100 μ m正方形傳感膜的集成式微系統(tǒng)(即生物傳感平臺10)的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，被制造成帶有分布式壓阻式傳感器(即傳感器18)和PZT驅(qū)動器(即驅(qū)動器16)。此類微系統(tǒng)使得該設(shè)備能夠自我傳感并自我激發(fā)。這個微系統(tǒng)能夠嵌入電子線路中以建立芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)。
[0061]就分布式壓阻式傳感器的制造而言，將500nm厚的多晶硅層通過低壓化學(xué)氣相沉積(PCVD)而沉積在SOI晶片的氧化設(shè)備層上。該層隨后通過離子束植入術(shù)用50Kev硼源進(jìn)行摻雜，產(chǎn)生lel5的摻雜密度，以增強(qiáng)壓阻偏轉(zhuǎn)靈敏度。兩個傳感器的形狀通過光刻術(shù)和隨后的反應(yīng)離子蝕刻(reactive ion etching, RIE)形成。
[0062]在PZT膜的制造中，在SOI上沉積由IOOnm厚的Pt/Ti底部電極、Iym PZT膜和IOOnm厚的Pt頂部電極組成的三明治結(jié)構(gòu)。頂部和底部電極用電子束蒸發(fā)器系統(tǒng)通過蒸鍍方法沉積，沉積的PZT以旋轉(zhuǎn)形式堆積在溶膠-凝膠上，隨后退火以產(chǎn)生所需的PZT膜。將頂部和底部電極圖案化，通過離子束銑削蝕刻。蝕刻掉多余的PZT材料。
[0063]2.牛物學(xué)實(shí)駘
[0064]這些實(shí)驗(yàn)中所用人雜交EA.hy926細(xì)胞來自于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和A549/8人肺癌細(xì)胞系的融合。EA.hy926是表達(dá)人血管內(nèi)皮的特征性高度分化功能的永生化人內(nèi)皮細(xì)胞系。人EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞 系維持于30ml添加有10% FBSUOOy g/ml鏈霉素和100U/ml青霉素以及IOml ΗΑΤ(100 μ M次黃嘌呤，0.4μ M氨基蝶呤，16 μ M胸苷)的Dulbecoo改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。細(xì)胞在5% CO2和95%空氣氣氛的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)于75cm2瓶中，并在達(dá)到90%會合時傳代。一旦細(xì)胞大致達(dá)到90%會合，即除去培養(yǎng)基并用5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞。EA.hy926細(xì)胞的傳代過程簡言之即為，從細(xì)胞中移除細(xì)胞培養(yǎng)基并隨后用IOml無菌PBS清洗細(xì)胞直到培養(yǎng)基呈無色。隨后通過加入2.5ml胰蛋白酶進(jìn)行3分鐘標(biāo)準(zhǔn)孵育而使EA.hy926細(xì)胞脫壁。還通過用5ml新DMEM培養(yǎng)基反復(fù)吸打而使細(xì)胞團(tuán)均勻分散。
[0065]圖5顯不了微膜表面上包被的內(nèi)皮細(xì)胞的激光掃描測微儀(LSM)圖像。內(nèi)皮細(xì)胞緊緊附著于硅表面，表現(xiàn)出典型的鋪展模式。
[0066]生物實(shí)驗(yàn)分為兩個階段:(I)將一定量的細(xì)胞接種于膜上，和(2)測定膜的相應(yīng)動態(tài)。動態(tài)測試設(shè)備顯示于圖6。相同的微膜被重復(fù)使用數(shù)次，以得到一批不同細(xì)胞密度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下:
[0067]1.首先，清洗硅微膜并用沖洗(乙醇和丙酮的混合物)、高壓滅菌和紫
[0068]外線照射的方法滅菌。
[0069]2.將細(xì)胞接種于微膜上之前，確定傳代過程中懸液的細(xì)胞密度。取20 μ I細(xì)胞懸液并與20 μ I臺盼藍(lán)混合，以估計(jì)活細(xì)胞數(shù)量。隨后通過改良的紐鮑爾血球計(jì)數(shù)器對新的混合物進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。一旦確定了細(xì)胞密度，用培養(yǎng)基制備5ml已知密度的EA.Hy926細(xì)胞懸液。通過控制孵育時間，可以獲得膜表面上的多種細(xì)胞密度和分布。
[0070]3.使用LSM(激光掃描顯微術(shù))圖像來記錄細(xì)胞在膜傳感表面上的分布。細(xì)胞的密度或分布可基于該LSM圖像進(jìn)行定量。
[0071]4.帶有附著細(xì)胞的膜的動態(tài)通過圖6中的基礎(chǔ)激發(fā)裝置進(jìn)行測量。將帶有細(xì)胞和不帶細(xì)胞的每個特定微板的FRF數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以推斷細(xì)胞的信息，記錄在LSM掃描圖像中。
[0072]5.最后，從微膜表面移除細(xì)胞，在重復(fù)第I步的清潔步驟后，再滅菌
[0073]的微膜被用于下一個實(shí)驗(yàn)。
[0074]圖7、8和9展示了三種不同細(xì)胞密度下三種不同類型微膜的頻率響應(yīng)函數(shù)。圖7使用了 100 μ m的正方形C-F-F-F微膜；圖8使用了 200 μ m的正方形C-F-C-F微膜；圖9使用了 300 μ m的正方形C-C-C-C微膜。在每種情況下，(a)和(b)顯示內(nèi)皮細(xì)胞包被在微膜表面上，(c)顯示根據(jù)細(xì)胞密度歸一化的速度幅值。
[0075]細(xì)胞載荷引起的膜動態(tài)的最主要變化是共振頻率fn的改變。第一模式形狀幾乎保持恒定，各個FRF的幅值用第一共振模式的幅值自身歸一化。發(fā)現(xiàn)共振模式的相對振幅在細(xì)胞裝載后顯著變化。這意味著附著細(xì)胞在膜表面上的額外質(zhì)量載荷也引起了振動形狀的擾動。靶細(xì)胞的質(zhì)量m或數(shù)量可通過檢測共振頻率的遷移△4來估算。式(I)表明了在假設(shè)剛度k保持恒定的前提下，動態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量變化Am與頻率遷移Af之間的關(guān)系。該方法已被廣泛用于以微懸臂梁為基礎(chǔ)的生物傳感器。
【權(quán)利要求】
1.表征至少一個微生物細(xì)胞的特性或行為的方法，該方法包括以下步驟: 提供微板； 將所述微板的至少一個表面浸入細(xì)胞培養(yǎng)基中，以使至少一個待表征的微生物細(xì)胞與該微板接觸； 振動該微板； 提供與所述微板偶聯(lián)的彼此分隔開的多個傳感器； 在振動該微板的過程中，從各個傳感器獲得各自的傳感數(shù)據(jù)時間序列，所述微板和所述傳感器排列成使得所得傳感數(shù)據(jù)時間序列不彼此獨(dú)立； 處理所述傳感數(shù)據(jù)時間序列，以對所述至少一個微生物細(xì)胞的特性或行為進(jìn)行表征。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述處理步驟包括: 指定細(xì)胞動態(tài)行為類別；和 處理所述傳感數(shù)據(jù)時間序列，以確定所述至少一個細(xì)胞的動態(tài)行為是否屬于所指定的細(xì)胞動態(tài)行為類別。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述處理步驟包括: 指定細(xì)胞特性；和 處理所述傳感數(shù)據(jù)時間序列，以確定對所述至少一個細(xì)胞的指定特性的測量。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述處理步驟包括在一個或多個時間域、頻率域和小波域中分析所述傳感數(shù)據(jù)時間序列。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述處理步驟包括分析頻率響應(yīng)函數(shù)(FRF)。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述處理步驟包括使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和Karhunen-Loeve分解中的一種或兩種。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中振動所述微板的步驟包括周期性地振動該微板。
8.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中振動所述微板的步驟包括隨機(jī)地振動該微板。
9.用于表征至少一個微生物細(xì)胞的特性或行為的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括: 用于裝細(xì)胞培養(yǎng)基的容器； 微板，其置于所述容器中，以使得當(dāng)該容器至少部分充入細(xì)胞培養(yǎng)基時，所述微板的至少一個表面浸入細(xì)胞培養(yǎng)基中； 至少一個驅(qū)動器，其用于振動所述微板； 與所述微板偶聯(lián)的彼此分隔開的多個傳感器，每個傳感器可用于在振動微板的過程中提供各自的傳感數(shù)據(jù)時間序列，所述微板和傳感器排列成使得所提供的傳感數(shù)據(jù)時間序列不彼此獨(dú)立；和 處理器，其可用于接收來自傳感器的傳感數(shù)據(jù)時間序列，并處理所接收的傳感數(shù)據(jù)時間序列以對與該微板接觸的至少一個微生物細(xì)胞的特性或行為進(jìn)行表征。
10.權(quán)利要求9的系統(tǒng)，其中所述微板的邊界條件選自夾具式、懸臂式、自由式和點(diǎn)支撐式。
11.權(quán)利要求9或10的系統(tǒng)，其中所述傳感器選自于壓阻計(jì)傳感器、光學(xué)傳感器、應(yīng)變傳感器和加速度傳感器。
12.權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述至少一個驅(qū)動器包括壓阻式換能器。
13.權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述至少一個驅(qū)動器包括聲驅(qū)動器。
14.權(quán)利要求9至13 中任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述容器為培養(yǎng)皿。
【文檔編號】C12M3/00GK104017855SQ201410214356
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2009年6月30日
【發(fā)明者】馬向紅, 伍章明, 彼得·奈杰爾·布雷特, 邁克爾·T·賴特, 海倫·R·格里菲思 申請人:阿斯頓大學(xué)