[0072] S220、將制作好的miRNA檢測芯片置于熒光顯微鏡下進行熒光檢測，得到初始熒 光強度。
[0073] 具體的，焚光顯微鏡為電動生物焚光顯微鏡。
[0074] S230、在miRNA檢測芯片中加入與待測miRNA互補的cDNA，得到miRNA/cDNA雜交 體。
[0075] 在檢測了芯片的初始熒光后，將芯片從熒光顯微鏡中取出，放置在平面操作臺上， 加入一定量的上述miRNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA。若樣本中含有目標miRNA，則由其轉(zhuǎn)錄成的cDNA 能夠與miRNA檢測芯片中的RNA探針雜交，形成miRNA/cDNA雜交體。
[0076] S240、加入核糖核酸酶水解miRNA/cDNA雜交體中的miRNA，釋放出雜交體中的 cDNA〇
[0077] 具體的，核糖核酸酶為RNase H，RNase H的濃度為60U/mL。RNase H是一種核糖 核酸內(nèi)切酶，可以特異性地水解DNA和RNA雜合鏈中的RNA，而不能水解單鏈或雙鏈DNA或 RNA中的磷酸二酯鍵，即不能水解單鏈或雙鏈DNA或RNA。
[0078] 具體的，水解操作為將核糖核酸酶滴加在miRNA檢測芯片表面，鋪滿探針區(qū)域，靜 置10分鐘，使核糖核酸酶切割miRNA/cDNA雜交體中的miRNA，釋放出雜交體中的cDNA，釋 放出來的cDNA又繼續(xù)與芯片表面剩余的完整的miRNA探針鏈再雜交、再水解。循環(huán)水解， 實現(xiàn)以少量的cDNA造成大量的miRNA水解。
[0079] S250、洗滌除去游離的cDNA、核糖核酸酶以及熒光標記物，將miRNA檢測芯片置于 熒光顯微鏡下進行熒光檢測，得到酶切后熒光強度。
[0080] 采用RNase-free water (不含核糖核酸酶的水）沖洗芯片表面，除去芯片上游離 的cDNA、核糖核酸酶、熒光標記物以及水解的miRNA等，再將miRNA檢測芯片置于熒光顯微 鏡下進行熒光檢測，得到酶切后熒光強度。
[0081] 若需要檢測兩種或兩種以上miRNA，采用含有兩種或兩種以上特異性RNA探針的 檢測芯片，按上述步驟檢測一種miRNA后，將檢測芯片再生，芯片再生步驟為采用lOmmol/ L的NaOH溶液再生芯片表面，再以RNase-free water (不含核糖核酸酶的水）沖洗芯片表 面，之后按上述步驟檢測另一種miRNA即可。
[0082] S260、通過比較初始熒光強度和酶切后熒光強度，獲得miRNA檢測芯片表面的特 異性RNA探針的降解量，從而得到待測miRNA的含量。
[0083] 通過比較初始熒光強度和酶切后熒光強度可以定性的檢測待測樣本中是否含有 目標miRNA〇
[0084] 進一步的，可以通過在芯片中加入已知濃度的cDNA，得到cDNA濃度與初始熒光強 度和酶切后熒光強度的差值的標準曲線。隨后將待測樣本提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA 加入芯片，得到樣本的初始熒光強度和酶切后熒光強度的差值，通過標準曲線可以定量的 計算出待測miRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的目標cDNA的含量，進一步反推出待測樣本中目標miRNA含 量。
[0085] 上述miRNA的檢測方法，所使用的miRNA檢測芯片中既含有特異性RNA探針又含 有用于檢測對照的單鏈DNA探針，并且均帶有熒光標記物質(zhì)。檢測時單鏈DNA探針可作為 參照物，一方面檢測miRNA檢測芯片的有效性，另一方面可以作為特異性RNA探針檢測結(jié)果 的對比參照，在同一個芯片中檢測實驗組與實驗對照組，提高檢測數(shù)據(jù)的可靠性。通過比較 芯片初始熒光強度和酶切后熒光強度，獲得miRNA檢測芯片表面的特異性RNA探針的降解 量，從而得到待測miRNA的含量。同時，釋放的cDNA可以反復(fù)與芯片表面的特異性RNA序 列結(jié)合，再水解，直到芯片表面的RAN探針完全被水解，從而形成了一種基于非PCR的放大 檢測效應(yīng)，操作簡便可以實現(xiàn)miRNA的高通量檢測。這種miRNA的檢測方法，通過簡便的熒 光檢測技術(shù)平臺，輔以高效的循環(huán)酶切信號放大技術(shù)，實現(xiàn)miRNA的靈敏檢測，為疾病相關(guān) miRNA表達譜篩查提供有效手段，具有較強的實際應(yīng)用潛力。
[0086] 以下為具體實施例部分。
[0087] 以下實施例中，如無特別說明，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，
[0088] 儀器：電動生物熒光顯微鏡（德國Zeiss);芯片（蘇州傯聚生物材料有限公司）。
[0089] 試劑：特異性RNA探針和單鏈DNA探針（大連Takara公司）；探針互補cDNA (大 連Takara公司）；RNase H酶（大連Takara公司）。
[0090] 實施例1構(gòu)建miRNA檢測芯片
[0091] 構(gòu)建含有兩種特異性RNA探針的miRNA檢測芯片，可以檢測mir-29a-3p和 mir-181a-5p，兩種特異性序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。單鏈DNA的序列 如SEQ ID No. 3所示。在構(gòu)建好的特異性序列的一端修飾生物素并且將異硫氰酸熒光素 (FITC)標記的鏈酶親和素結(jié)合在生物素上，接著在另一端修飾巰基，得到特異性RNA探針 和DNA探針。將稀釋好的1 y mol/L的特異性RNA探針和單鏈DNA探針分別手工點樣于清 洗處理好的芯片金膜表面，4°C密封保存16小時，使巰基化探針與金膜之間發(fā)生Au-S鍵自 組裝而對探針進行固定。探針固定好之后，采用lmm〇l/L的mPEG-SH無水乙醇溶液浸泡2 小時以上，封閉芯片表面為固定探針的空白區(qū)域。將芯片放在電動生物熒光顯微鏡下進行 熒光檢測，記錄其熒光強度，記為初始熒光強度。
[0092] 實施例2制作標準曲線
[0093] 從顯微鏡下取出芯片，放置在平面操作臺上，加入一系列已知濃度的mir-29a_3p 對應(yīng)的標準cDNA，靜置10分鐘。加入60U/mL的RNase H酶溶液，鋪滿探針區(qū)域，靜置10 分鐘，使RNase H酶切割miRNA/cDNA雜交體中的miRNA，釋放出雜交體中的cDNA，釋放出來 的cDNA又繼續(xù)與芯片表面剩余的完整的miRNA探針鏈再雜交、再水解。循環(huán)水解，實現(xiàn)以 少量的cDNA造成大量的miRNA水解。用RNase-free water洗滌除去游離的cDNA、RNase H酶以及熒光標記物，將miRNA檢測芯片置于熒光顯微鏡下進行熒光檢測，得到酶切后熒光 強度。cDNA濃度與A I (初始熒光強度一酶切后熒光強度）的關(guān)系如表1所示：
[0094] 表1 :cDNA濃度與A I關(guān)系表
[0095]
[0096] 根據(jù)表1繪制的標準曲線如圖4所示。
[0097] 實施例3cDNA與單鏈DNA探針結(jié)合酶切前后熒光強度對比
[0098] 電動生物熒光顯微鏡（德國Zeiss)下檢測miRNA檢測芯片上單鏈DNA探針區(qū)域的 初始熒光強度照片，檢測得熒光強度為1380,初始熒光強度照片如圖5a所示。將lOOnmol/ L人工合成的標準cDNA樣品滴加到單鏈DNA探針區(qū)域，靜置10分鐘，使其與單鏈DNA充分 雜交。之后將60U/mL的RNase H酶溶液滴加到芯片表面，靜置10分鐘。再用RNase-free water洗滌除去游離的cDNA、RNase H酶以及熒光標記物。將miRNA檢測芯片置于熒光顯 微鏡下進行熒光檢測，得到酶切后熒光強度，檢測得熒光強度為1300,酶切后熒光強度照片 如圖5b所示。由圖5a和圖5b可知，初始熒光強度與酶切后熒光強度相差不大，說明RNase H酶只特異性針對DNA和RNA雜合鏈中的RNA起作用。
[0099] 實施例4cDNA與RNA探針結(jié)合酶切前后熒光強度對比
[0100] 電動生物熒光顯微鏡（德國Zeiss)下檢測miRNA檢測芯片上特異性mir-29a-3p RNA探針區(qū)域的初始熒光強度，檢測得熒光強度為1400,初始熒光強度照片如圖6a所示。 將100nmol/L人工合成的mir-29a-3p對應(yīng)的標準cDNA樣品滴加到RNA探針區(qū)域，靜置10 分鐘，使其與RNA探針充分雜交，得到miRNA/cDNA雜交體，之后將60U/mL的RNaseH酶溶 液滴加到芯片表面，靜置10分鐘，使RNaseH酶酶切miRNA/cDNA雜交體中的miRNA，再用 RNase-free water洗滌