miRNA檢測芯片及其制作方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化檢測領域，尤其是涉及一種miRNA檢測芯片及其制作方法和應 用。
【背景技術】
[0002] microRNA(微小RNA，又稱miRNA)是一種長度為18~22nt的內(nèi)生性非編碼小 RNA分子，普遍存在于動植物體內(nèi)。microRNA是生物體內(nèi)重要的基因表達調(diào)控子，參與調(diào) 節(jié)胚胎早期發(fā)育、細胞增殖分化凋亡及新陳代謝等各個過程，其差異性表達與多種人類疾 病的發(fā)生發(fā)展密切相關。不同疾病的不同階段都有其相應的miRNA表達譜，且血清/血漿 內(nèi)源性miRNA相對比較穩(wěn)定。近年來，miRNA在臨床上被視作新型的生物標志物，可以為疾 病的診斷、治療提供全新的重要依據(jù)和研究思路。目前miRNA的主要檢測方法有Northern Blotting、微陣列技術以及RT-PCR等，這些技術都各自存在一定的檢測缺陷，如Northern Blotting方法復雜、耗時、成本高且靈敏度低；RT-PCR具有較好的準確性、較高的靈敏度， 可以檢測低豐度miRNA，但是由于miRNA的長度比引物更短造成擴增技術困難且不能高通 量檢測；微陣列技術雖然能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測miRNA，但其實驗用試劑、儀器設備昂貴，成 本高。
[0003] 基因芯片技術可以一次性對樣品中大量序列進行檢測和分析，廣泛應用于基因表 達分析、病毒和細菌的鑒定、醫(yī)療診斷等領域。然而傳統(tǒng)的基因芯片技術往往需要PCR實現(xiàn) 信號的擴增，操作過于繁瑣，靈敏度不高，難以適應高通量的基因的分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要提供一種操作簡便且可實現(xiàn)高通量檢測的miRNA檢測芯片及其制 作方法和應用。
[0005] -種miRNA檢測芯片，包括設有金膜的基底、特異性RNA探針和單鏈DNA探針；
[0006] 所述特異性RNA探針含有用于檢測目標miRNA的特異性序列，所述特異性序列可 與由所述目標miRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA雜交；
[0007] 所述特異性RNA探針的一端修飾生物素，所述生物素上結合有熒光標記物，所述 特異性RNA探針的另一端修飾巰基，所述特異性RNA探針修飾有巰基的一端通過Au-S鍵固 定在所述設有金膜的基底上；
[0008] 所述單鏈DNA探針用于檢測對照，所述單鏈DNA探針的一端修飾生物素，所述生物 素上結合有熒光標記物，所述單鏈DNA探針的另一端修飾巰基，所述單鏈DNA探針修飾有巰 基的一端通過Au-S鍵固定在所述設有金膜的基底上。
[0009] 在一個實施例中，所述特異性RNA探針為一種，所述特異性RNA探針的序列為SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 2。
[0010] 在一個實施例中，所述特異性RNA探針為兩種，所述特異性RNA探針的序列分別為 SEQ ID No. 1和 SEQ ID No. 2。
[0011] 在一個實施例中，所述單鏈DNA探針的序列如SEQ ID No. 3所示。
[0012] 在一個實施例中，所述熒光標記物為異硫氰酸熒光素標記的鏈酶親和素。
[0013] 上述miRNA檢測芯片的制作方法，包括如下步驟：
[0014] 構建用于檢測目標miRNA的特異性序列，所述特異性序列可與由目標miRNA逆轉(zhuǎn) 錄形成的cDNA雜交，在所述特異性序列的一端修飾生物素并且將熒光標記物結合在所述 生物素上，接著在所述特異性序列的另一端修飾巰基，得到特異性RNA探針；
[0015] 構建用于檢測對照的單鏈DNA序列，在所述單鏈DNA序列的一端修飾生物素并且 將熒光標記物結合在所述生物素上，接著在所述單鏈DNA序列的另一端修飾巰基，得到單 鏈DNA探針；
[0016] 在基底表面形成一層金膜，得到設有金膜的基底；
[0017] 將所述特異性RNA探針及所述單鏈DNA探針分別點樣至所述設有金膜的基底上， 4°C密封保存，使所述特異性RNA探針及所述單鏈DNA探針與所述設有金膜的基底之間發(fā)生 Au-S鍵自組裝而對探針進行固定；及
[0018] 采用無水乙醇溶液封閉空白區(qū)域，得到所述miRNA檢測芯片。
[0019] -種miRNA的檢測方法，包括如下步驟：
[0020] 提取待測miRNA，并以提取的所述待測miRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn) 錄形成與所述待測miRNA互補的cDNA ;
[0021] 將上述任一實施例所述的miRNA檢測芯片置于熒光顯微鏡下進行熒光檢測，得到 初始熒光強度；
[0022] 在所述miRNA檢測芯片中加入與所述待測miRNA互補的cDNA，得到miRNA/cDNA雜 交體；
[0023] 加入核糖核酸酶水解所述miRNA/cDNA雜交體中的miRNA，釋放出雜交體中的 cDNA ；
[0024] 洗滌除去游離的cDNA、核糖核酸酶以及熒光標記物，將所述miRNA檢測芯片置于 熒光顯微鏡下進行熒光檢測，得到酶切后熒光強度；以及
[0025] 通過比較所述初始熒光強度和所述酶切后熒光強度，獲得miRNA檢測芯片表面的 特異性RNA探針的降解量，從而得到待測miRNA的含量。
[0026] 在一個實施例中，所述得到酶切后熒光強度后，還包括芯片再生步驟，所述芯片再 生步驟為采用10mm〇l/L的NaOH溶液再生芯片表面，再以不含核糖核酸酶的水溶液沖洗芯 片表面。
[0027] 在一個實施例中，所述加入核糖核酸酶水解所述miRNA/cDNA雜交體中的miRNA 的操作中，所述水解操作為將核糖核酸酶滴加在所述miRNA檢測芯片表面，鋪滿探針區(qū)域， 靜置10分鐘，使核糖核酸酶切割所述miRNA/cDNA雜交體中的miRNA，釋放出雜交體中的 cDNA，釋放出來的cDNA又繼續(xù)與芯片表面剩余的完整的miRNA探針鏈再雜交、再水解。
[0028] 在一個實施例中，所述核糖核酸酶為RNase H，所述RNase H的濃度為60U/mL。
[0029] 上述miRNA檢測芯片中的特異性RNA探針和單鏈DNA探針均結合有熒光標記物， 并且特異性RNA探針含有用于檢測目標miRNA的特異性序列。當待測miRNA逆轉(zhuǎn)錄形成 的cDNA能與該特異性序列雜交時，形成miRNA/cDNA雜交體。再通過使用核糖核酸酶酶切 miRNA/cDNA雜交體中的miRNA，使得結合在特異性RNA探針上的熒光標記物脫離，通過比較 芯片初始熒光強度和酶切后熒光強度，獲得miRNA檢測芯片表面的特異性RNA探針的降解 量，從而得到待測miRNA的含量。同時，釋放的cDNA可以反復與芯片表面的特異性RNA序 列結合，再水解，直到芯片表面的RAN探針完全被水解，從而形成了一種基于非PCR的放大 檢測效應，操作簡便可以實現(xiàn)miRNA的高通量檢測。
【附圖說明】
[0030] 圖1為一實施方式的miRNA檢測芯片的結構示意圖；
[0031] 圖2為一實施方式的miRNA檢測芯片的制作方法的流程圖；
[0032] 圖3為一實施方式的miRNA的檢測方法的流程圖；
[0033] 圖4為cDNA濃度與初始熒光強度和酶切后熒光強度差值的標準曲線圖；
[0034] 圖5a為一實施方式的電動生物熒光顯微鏡下檢測miRNA檢測芯片上單鏈DNA探 針區(qū)域的初始熒光強度照片；
[0035] 圖5b為一實施方式的電動生物熒光顯微鏡下檢測miRNA檢測芯片上單鏈DNA探 針區(qū)域的酶切后熒光強度照片；
[0036] 圖6a為一實施方式的電動生物熒光顯微鏡下檢測miRNA檢測芯片上特異性 mir-29a-3p RNA探針區(qū)域的初始熒光強度照片；
[0037] 圖6b為一實施方式的電動生物熒光顯微鏡下檢測miRNA檢測芯片上特異性 mir-29a-3p RNA探針區(qū)域的酶切后熒光強度照片；
[0038] 圖7a為一實施方式的電動生物熒光顯微鏡下檢測miRNA檢測芯片上特異性 mir-181a-5p RNA探針區(qū)域的初始熒光強度照片；
[0039] 圖7b為一實施方式的電動生物熒光顯微鏡下檢測miRNA檢測芯片上特異性 mir-181a-5p RNA探針區(qū)域的酶切后熒光強