本發(fā)明屬于中藥活性物質提取領域，具體涉及附子中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取工藝及耐寒作用。

背景技術：

附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根。附子具有補火助陽、逐風寒濕邪之功效。主治亡陽虛脫、肢冷脈微、陽痿、宮冷、心腹冷痛、虛寒吐瀉、陰寒水腫、寒濕痹痛等。2012年成都中醫(yī)藥大學耿昭在《附子的化學成分研究》的碩士論文中首次報道了從附子中分離出反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，報道稱該物質為白色膠狀物，易溶于水、甲醇，難溶于氯仿，分離工藝是在正丁醇部分中經(jīng)氯仿、甲醇混合溶劑洗脫得到，該文獻記載5.5kg附子分離得到8mg反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，收率僅0.000145％，分離過程較難重現(xiàn)。2013年成都中醫(yī)藥大學李小紅、郭力等在《附子的化學成分研究》(中國實驗方劑學雜志，2013,19(19)86-89)報道了從附子中分離出反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，稱該物質為無色針狀結晶，分離工藝是95％乙醇回流提取，再經(jīng)硅膠柱層析分離精制得到，該文獻記載5kg附子分離得到100mg反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，收率僅為0.002％。

反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，CAS號：117405-51-3，分子式：C₁₆H₂₀O₉，分子量：356.3，結構式如下：

耐寒性指耐受寒冷而能生存的特性。組織液和細胞液等處于冰點以下的溫度時，生物表現(xiàn)其耐寒性必須具有高的耐過冷的能力或具有高的耐凍性。目前，尚未見到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷與動物耐寒有直接關聯(lián)的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種促進機體冷習服能力的單體藥物的提取方法及應用。

為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：

將附子原料藥粉碎、過篩，得附子粉末，將附子粉末與95％乙醇混合后進行回流提取，得浸提液；將浸提液減壓濃縮，得浸膏；將浸膏經(jīng)中等極性溶劑萃取得反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品，將反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品依次經(jīng)過硅膠柱層析、反相硅膠柱層析分離后進行重結晶，得到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷。

所述附子原料藥選自生附子。

所述附子粉末為30～40目。

所述95％乙醇的用量為每1kg附子原料藥使用12～16L。

所述回流提取進行2～3次，每次1～2小時，回流溫度控制為75～79℃。

所述硅膠柱層析的條件包括：硅膠粒徑為300～400目，等度洗脫，流動相為乙醇與水的混合溶劑(乙醇體積分數(shù)85～95％)；所述反相硅膠柱層析的條件包括：硅膠柱為反相C18硅膠柱，等度洗脫，流動相為乙腈與水的混合溶劑(乙腈體積分數(shù)為5～15％)。

所述中等極性溶劑萃取具體包括以下步驟：將浸膏與水混合后用NaOH進行堿化，然后用三氯甲烷或二氯甲烷萃取，上層水相冷凍干燥，得反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品。

所述重結晶具體包括以下步驟：將反相硅膠柱層析的洗脫液冷凍干燥后用水溶解，然后用HCl調pH至5～6后靜置沉淀(4～10℃)，分離沉淀得到粗結晶，將粗結晶用水溶解后靜置沉淀(4～10℃)，將沉淀真空干燥，得到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明提出的提取方法，通過優(yōu)化提取分離工藝，使得附子中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取效率從文獻的0.000145％、0.002％，提高到本發(fā)明的0.2827％。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并揭示了反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷具有促進機體冷習服的的作用，可在制備提高機體耐寒能力的藥物中應用。

附圖說明

圖1是提取的反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的質譜圖譜；其中，(a)為鈉譜，(b)為氫譜。

圖2是提取的反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的紅外圖譜。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。所述實施例是對本發(fā)明的解釋，而不是限定。

(一)附子中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取工藝

1、儀器、材料與試劑

附子藥材(生附子)于2016年5月購自安國藥材市場，產(chǎn)地四川江油(批號：20160508)，經(jīng)陜西中藥研究所鑒定為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根。

反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷對照品(山東博洛德生物科技公司，批號：AWSTG20160612，純度99.5％)。

硅膠(300～400目，青島海洋化工公司)。

反相C18硅膠柱(75m，日本Cosmosil公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，上海化學試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀系統(tǒng)：LC-20AD輸液泵、SPD-M20A紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱、LC-Solution色譜工作站(日本島津公司)；ODS色譜柱(C18-AR-Ⅱ，4.6mm×250mm，日本Cosmosil公司)。

ME215S型電子天平(德國Starorious公司)；UV-2600紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；BP-Purifier-100制備中壓液相系統(tǒng)(蘇州利穗有限公司)；C18填料(75m，日本Cosmosil公司)；400MHz核磁共振儀(美國Bruker公司)。

2、方法

2.1 反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷液相分析(HPLC)條件

流動相：水:甲醇:0.05％磷酸(體積比66:24:10)

流速：1.0mL/min

柱溫：30℃

檢測波長：290nm

進樣量：10μL

2.2 提取與分離

2.2.1 反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取

稱取附子藥材(生附子)，粉碎，過40目篩，將40目粗粉3980g用95％乙醇(即體積分數(shù)95％的乙醇水溶液)回流提取2次(每次2h，放冷，濾過)，95％乙醇用量按照1kg附子藥材計為12L，回流溫度控制在75～79℃，合并2次濾液，在65℃下減壓濃縮回收乙醇，得到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷醇浸膏，浸膏收率10.04％。

HPLC檢測其中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的含量，醇浸膏中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷含量為2.819％。

2.2.2 反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的硅膠柱精制

2.2.2.1 醇浸膏精制

將醇浸膏用水溶解(例如膏:水質量比＝0.8:1)，用NaOH調至呈堿性(例如pH＝10)，中等極性溶劑(例如三氯甲烷)萃取3次，下層濃縮得總生物堿，上層水相冷凍干燥，得反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品。

2.2.2.2 硅膠分離

取300～400目硅膠100g，裝入中壓柱(15cm×2.5cm)，柱體積70mL，將反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品1.0g硅膠拌樣，上樣后以95％乙醇等度洗脫，流速為50mL/min，檢測波長為290nm，每50mL接收一瓶，收集第30分鐘到第60分鐘的洗脫液，低溫(40～60℃)濃縮得膏狀物。

2.2.2.3 反相硅膠分離

取反相C18硅膠柱(15cm×2.5cm)，將2.2.2.2制備的膏狀物上柱，體積分數(shù)11％乙腈水溶液等度洗脫，流速為50mL/min，檢測波長為290nm。每50mL收集一瓶，收集第15分鐘到第30分鐘的洗脫液，HPLC檢測其反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的含量，得率為0.2827％。收集目標物即洗脫液，低溫(40～60℃)濃縮盡量除去溶劑后冷凍干燥，室溫下，加3～5倍質量蒸餾水溶解，用HCl調pH至5～6(此處對于pH有嚴格要求，否則無法形成結晶析出)，重結晶(4℃冰箱內靜置)，濾過，室溫下，粗結晶再用5倍質量蒸餾水溶解，重結晶(4℃冰箱內靜置)，濾過，真空干燥(40～60℃)，最終樣品經(jīng)過鑒定為反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷(參見圖1以及圖2)，純度為99.8％。

(二)反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的耐寒作用研究

1、材料與方法

1.1 實驗動物

昆明系雄性健康小鼠18g～22g，由中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學實驗動物繁育場提供。

1.2 實驗樣品資料

1^#樣品：附子藥材(生附子)40目粗粉(去離子水配成溶液)；

2^#樣品：附子藥材(生附子)95％乙醇提取物(干燥成粉，用去離子水配成溶液)；

3^#樣品：附子藥材(生附子)水煎煮提取物(干燥成粉，用去離子水配成溶液)；

4^#樣品：附子藥材(生附子)醇浸膏硅膠柱層析洗脫物(干燥成粉，用去離子水配成溶液)；

5^#樣品：反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷對照品(去離子水配成溶液)；

6^#樣品：空白對照(去離子水)。

1.3 小鼠耐寒實驗

昆明系雄性健康小鼠18g～22g，隨機分組，每組12只，連續(xù)灌胃給藥，以生附子原粉當量折算，劑量為0.003g/kg/d，1～5組小鼠分別給予上述1^#～5^#號樣品，空白對照組小鼠給予等體積去離子水。動物4℃環(huán)境暴露，同時給藥期間正常飲水飲食，連續(xù)給藥5天后，在-10℃觀察小鼠凍亡時間(禁水禁食)，結果見表1。

2、結果與分析

表1.小鼠耐寒實驗測定結果

參見表1，2、4、5組小鼠在-10℃條件存活時間分別是54.5±6.3、63.7±4.9、74.6±5.7，與空白對照組(或第1組)相比均有明顯統(tǒng)計學差異，分別是P<0.01，即2、4、5組小鼠較空白對照組(或第1組)小鼠存活時間極顯著的延長。第5組與第2、4組相比，小鼠存活時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

3、結論

附子中分離得到的反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷具有促進動物(特別是哺乳動物)冷習服，增加機體耐寒能力的作用。