專利名稱:從豬血、羊血、豬脾、羊脾制取il－2為主的抗人癌協(xié)同劑的方法
本發(fā)明是涉及以豬、羊血、脾制取IL-2為主抗人癌協(xié)同劑的生產(chǎn)方法，該技術(shù)是屬于細胞工程技術(shù)。
白細胞介質(zhì)素-2(即IL-2)是80年代國際上開始研制的生物藥品。它是繼傳統(tǒng)治療腫瘤的三大療法(手術(shù)、化學、放射療法)之后的第四種療法即生物療法(BRM)的關(guān)鍵藥物。其本身大大劑量可有抗癌活性；用IL-2在人體外培養(yǎng)人的淋巴細胞，使淋巴細胞具有殺傷腫瘤細胞，而不損傷正常細胞，其殺傷腫瘤細胞能力大為增強的特性，并使淋巴細胞的數(shù)量得到大量、快速的增殖(此種經(jīng)IL-2激活的淋巴細胞稱之為LAK細胞)。美國癌研究中心Rosenberg，SA用LAK細胞加IL-2治療晚期惡性腫癌，獲得8例腫瘤完全消失的顯著效果，該作者又報道(Rosenberg，SA.Science 2331318.1986)用IL-2在人體外培養(yǎng)從患者手術(shù)切除的腫瘤分離獲得的“腫瘤浸潤淋巴細胞”(稱TIL細胞)，開始由105個細胞經(jīng)80天培養(yǎng)可增至1026個。TIL細胞較LAK細胞殺傷腫瘤的療效又提高50-100倍，此項成果震動了世界醫(yī)務界。但是目前所使用的IL-2是來自人體的淋巴細胞，人的扁桃腺、人的脾，這些都得從車禍等死者身上及時采取或從活人身上采取，再是僅采用IL-2(而不用IL1-7等)，提取工藝復雜，設備昂貴，藥物來源困難，所以價格極高。也有采用基因工程方法，將人的IL-2基因摻入大腸桿菌中，生產(chǎn)的IL-2稱之為重組IL-2(即rIL-2)，其價格也未降下來多少，用Rosenbery SA的劑量，一人一療程，需1000萬元人民幣，且含有大腸桿菌毒素無法完全消除，人體使用發(fā)高燒，有毒素反應。
本發(fā)明的目的在于提供一種具有多種抗癌因子協(xié)同作用的協(xié)同劑，療效高，使用安全，價格極其低廉、藥源廣泛的制取抗癌藥的方法。
為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，采用了豬、羊的血和脾取代人的血和脾等淋巴組織為藥源，再是取IL1-7及γ干擾素等與IL-2起協(xié)同作用，增強I-2的作用。
取新鮮豬脾、羊脾，抑菌、無菌操作制成細胞懸液或新鮮豬、羊的抗凝血，抑菌；經(jīng)分離淋巴細胞，加RPMI1640培養(yǎng)基、植物血凝素PHA-M、PHA-PL刀豆蛋白ConA絲裂原，細胞培養(yǎng)24-96小時，細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)純化，取分子量1萬-5萬道爾頓蛋白質(zhì)部分，除菌，制成協(xié)同劑。
上述中的抗凝血、抑菌，分離淋巴細胞，加培養(yǎng)基、絲裂原，細胞培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)上清液經(jīng)純化、除菌，制成協(xié)同劑均是細胞工程技術(shù)及制藥技術(shù)中的常規(guī)技術(shù)。
白細胞介素家族中的IL-1到IL-7以及γ-干擾素相互有協(xié)同增強抗腫瘤作用。IL-1可協(xié)同IL-2顯著增強LAK細胞殺傷腫瘤細胞活性1.3-286倍(Crump.1989)；IL-3增強LAK細胞殺傷腫瘤細胞活性132％；IL-4也能增強LAK的活性，也是殺腫瘤細胞的淋巴細胞的分化因子；IL-5能誘導淋巴細胞產(chǎn)生IL-2受體，增強IL-2作用；IL-6促進T淋巴細胞激活，產(chǎn)生對IL-2的應答能力；IL-7誘導T淋巴細胞表達IL-2受體并產(chǎn)生IL-2。干擾素與IL-2、IL-1、IL-4聯(lián)合應用有協(xié)同相加抗癌作用。據(jù)此本發(fā)明采取1萬至5萬道爾頓的低分子量蛋白質(zhì)，這就可取得包括IL-1至IL-7及干擾素等多種因子(這些因子分子量均在1萬至5萬分子量之間)的協(xié)同劑的劑型，達到協(xié)同增強抗腫瘤作用的效果。
低分子(分子量7萬道爾頓以下)異種蛋白質(zhì)具有人體可耐受的作用，例如豬、牛的低分子量的血漿蛋白質(zhì)(分子量在7萬道爾頓以下)免疫原性很低，輸入人體1000ml以上，不會引起過敏反應，又如，不同人的白蛋白(分子量為7萬道爾頓)人體可以互相輸注而不需驗血型。同樣，胰島素、降鈣素、ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)等都是來自動物可輸入人體治療人體疾病的常用藥?？拱┧庨T冬酰胺酶也來源于動物等都是證明。
本發(fā)明的主要優(yōu)點1.多因子協(xié)同作用，提高療效該制劑中含有IL-1到IL-7及干擾素等多種淋巴因子，其在生理條件下是相輔相成協(xié)同起作用的，可以提高本劑治癌的療效。不僅如此，本劑同時具有抗病毒、抗細菌、抗寄生蟲病，治療肝炎作用。
2.療效高、使用安全IL-2及其協(xié)同因子的抗癌效果，國內(nèi)外承認。本藥安全性已為臨床使用證明。經(jīng)美國進口貝克曼高壓液相色譜分析，以西德標準rIL-2作對照，證明本產(chǎn)品含有明顯IL-2蜂(見
圖1、圖2)。
實施例1豬脾細胞制備IL-2為主的協(xié)同劑具體制備過程如下經(jīng)檢疫新鮮的豬脾600g，立即放入抗菌素(每1000ml生理鹽水含40000單位慶大霉素及0.3g紅霉素，0.3g紅霉素先用2ml5％葡萄糖溶解)溶液浸泡2小時；在超凈臺中無菌操作，于大平皿上，用20ml注射器針芯在不銹鋼網(wǎng)上將脾研碎制成細胞懸液。按0.5ml/g比例加生理鹽水稀釋。100目不銹鋼網(wǎng)過濾，濾液以1∶3比例加淋巴細胞分離液，先將淋巴細胞分離液放離心管下部，然后小心沿管壁將細胞懸液重層其上，2000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘；取梯度離心的淋巴細胞層，加5倍體積的生理鹽水，2000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，棄上清，取淋巴細胞沉渣，計數(shù)細胞數(shù)，按5×106/ml濃度以RPM1640培養(yǎng)基(見人民軍醫(yī)出版社的“單克隆抗體在臨床醫(yī)學中的應用”一書的P284)稀釋細胞，按100u/ml慶大霉素，1mg/ml紅霉素(紅霉素每支先以2ml5％葡萄糖溶解)加入抗菌素，加植物血凝素PHA-M1(見CHEMICALCOMPANYSIGMA P1594、1595)μg/ml PHA-p1(見CHEMICALCOMPANYSLGMA P1594、1595)μg/ml，ConA(刀豆蛋白)20μg/ml。培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，5-7％CO2，37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。取培養(yǎng)上清，2000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，棄沉渣，取上清，獲500ml液體。用CTLL細胞測該上清IL-2治性為800u/ml。在超濾器中經(jīng)分子量5萬道爾頓超濾膜超濾，取5萬道爾頓以下部分，再經(jīng)1萬道爾頓超濾膜超濾，取1萬道爾頓以上部分，得25ml濃縮液。過sephadexG75層析柱，美國貝克曼Du6分光光度計280nm波長，檢測，取蛋白質(zhì)部分，得100mlI1-2協(xié)同劑，CTLL細胞MTT法測IL-2活性為4000u/ml，除菌分4℃保存。
臨床使用病例××，男，48歲，住院號35465臨床診斷右肩部腫物切術(shù)后(轉(zhuǎn)移腺癌)，多發(fā)性骨轉(zhuǎn)移肝硬化腹水，肝轉(zhuǎn)移?；颊咭烟幠[瘤晚期(IV期)，臥床不起不能自動翻身，黃疸。骨ECT檢查為多發(fā)性骨轉(zhuǎn)移。經(jīng)三周CMFA化療無效?；熤谐霈F(xiàn)腹水，腹圍110cm，衰竭尿少，不能進行任何化療，病人危在旦夕。僅用腹腔注射IL-2協(xié)同劑12000單位3次，異體LAK細胞三次總量2.0×109。二個月腹水不僅未增加而且減少為腹圍92.5cm。維持生命近半年，延長生存期2個月，注藥后無皮疹，無發(fā)燒，無急性或遲發(fā)性過敏反應，無肝腎功能障礙。
實施例2豬血細胞制備IL-2為主協(xié)同劑的具體實施過程如下采取新鮮豬血1000ml，0.01％肝素抗凝，慶大霉素100u/ml，紅霉素1mg/ml(先用2ml5％葡萄糖溶解)。2000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘其血漿層加5倍生理鹽水，2000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，收集淋巴細胞待用。其白細胞層，以1∶3加淋巴細胞分離液，先將淋巴細胞分離液放于離心杯下部，白細胞液重層于其上，2000轉(zhuǎn)/分，30分鐘其血漿層加取梯度離心的淋巴細胞層，加5倍體積生理鹽水2000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘取淋巴細胞沉渣，與前述梯度離心的淋巴細胞合并，加一倍生理鹽水洗一次，計數(shù)細胞數(shù)，以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋淋巴細胞為5×106/ml，加慶大霉素100u/ml，紅霉素1mg/ml(先用5％葡萄糖2ml溶解/支)加ConA(刀豆蛋白)20μg/ml，PHA-M1μg/ml，PHA-P1μg/ml，注入培養(yǎng)瓶中，在CO2培養(yǎng)箱中，5-7％CO2，37℃培養(yǎng)8小時。取培養(yǎng)上清，2000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，棄沉渣，取上清，獲450ml，在超濾器中經(jīng)分子量5萬道爾頓濾膜超濾，取5萬道爾頓以下部分，再經(jīng)1萬道爾頓濾膜超濾，取1萬道爾頓以上部分，得30ml濃縮液，過SephadexG75層析柱，美國貝克曼Du-6紫外可見光分光光度計檢測，280nm波長，取蛋白質(zhì)部分。得97mlIL-2協(xié)同劑。CTLL細胞MTT法測IL-2活性為4100單位/ml。0.30μm孔徑濾膜，除菌過濾，4000單位/支，分裝，4℃保存。
臨床使用病例254醫(yī)院患者，趙××，男，66歲，胃癌術(shù)后，IV期，肝轉(zhuǎn)移，胰腺轉(zhuǎn)移，腹膜轉(zhuǎn)移。左鎖骨上窩腫大淋巴結(jié)4.0×2.5cm，淋巴結(jié)穿刺為轉(zhuǎn)移腺癌。術(shù)后化療、中藥治療4個月無效，病情惡化，出現(xiàn)腹水，腹圍88cm。消瘦、貧血。放腹水，提取淋巴細胞以遼寧省腫瘤研究所制的IL-2協(xié)同劑進行體外培養(yǎng)、制TIL細胞，于1990年6月12日回輸1.1×109加IL-2協(xié)同劑(豬血)16000單位腹腔輸注。注前試敏(-)。并行左鎖骨上腫大轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)IL-2協(xié)同劑注射。結(jié)果轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)顯著縮小為2.2×2.2cm(腫塊二最大徑乘積由10縮小為4.84?？s小超過50％)，療效顯著，并連續(xù)肌注IL-2協(xié)同劑七天。注本藥前腹水迅速增漲，注藥后腹水不僅沒漲，反而腹圍由88cm減為84cm。用藥后患者無發(fā)疹，無發(fā)燒，無肝腎功能障礙，無急性或遲發(fā)性過敏反應。
實施例3羊脾細胞制備的IL-2為主的協(xié)同劑取新鮮羊脾500g，立即放入慶大霉素40u/ml，紅霉素0.3mg/ml的生理鹽水溶液中浸泡2小時，在超凈臺中無菌操作下，于大平皿上，用20ml注射器針芯在不銹鋼網(wǎng)上將脾研碎制成細胞懸液。按0.5ml/g比例加生理鹽水稀釋。100目不銹鋼網(wǎng)過濾，濾液以1∶3比例加淋巴細胞分離液，先將淋巴細胞分離液放離心管下部，然后小心將細胞懸液重層其上。2000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘。取梯度離心的淋巴細胞層，加5倍體積的生理鹽水，2000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，取淋巴細胞沉渣，計數(shù)淋巴細胞數(shù)，按5×106/ml濃度以RPM1640培養(yǎng)基稀釋細胞。加100u/ml慶大霉素，1mg/ml紅霉素(先以5％葡萄糖2ml溶解)。加植物血凝素PHA-M1μg/ml，PHA-M1μg/ml，ConA(刀豆蛋白)20μg/ml。注入培養(yǎng)瓶，放CO2培養(yǎng)箱中，5％CO2，37℃培養(yǎng)48小時。取培養(yǎng)上清，2000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，取上清獲得450ml液。用CTLL細胞測該上清IL-2活性650單位/ml。在超濾器經(jīng)分子量5萬道爾頓濾膜超濾，取5萬道爾頓以下部分，再經(jīng)1萬道爾頓濾膜超濾，取1萬道爾頓以上部分，得20ml濃縮液，過SephadexG75層析柱，用美國貝克曼Du6紫外可見光分光光度計檢測，280nm波長，取蛋白質(zhì)部分。得80mlIl-2協(xié)同劑，CTLL細胞MTT法測IL-2活性為3800u/ml，除菌，4000單位/支，分裝，4℃保存。
臨床病例劉××，女，54歲，住院號35243。臨床診斷卵巢癌術(shù)后III期，盆腹腔廣泛轉(zhuǎn)移，腹水，左卵巢超新生兒頭大，右卵巢鵝卵大。1990年2月8日行全宮雙附件大網(wǎng)切除術(shù)。術(shù)前、后化療三個療程，療效不佳。轉(zhuǎn)移瘤及腹水有增無減。多次放腹水，每次4000-6000ml血性腹水，送省腫瘤研究所制備腹水TIL細胞。1990年6月23日回輸IL-2協(xié)同劑體外增減的TIL細胞15ml。加IL-2協(xié)同劑20,000單位。1990年6月26日腹腔注射IL-2協(xié)同劑32,000單位，每日肌注IL-2協(xié)同劑4000單位共20次。療效觀察下腹部包塊(轉(zhuǎn)移瘤)由10×12cm減少為9×11cm(僅一次回輸，IL-2協(xié)同劑培養(yǎng)的TIL細胞)。腹水增長速度明顯減慢。用IL-2協(xié)同劑前16天，平均每天腹圍增加0.75-1cm，用藥后14天平均每天腹圍增長減為0.67-0.68cm。此例說明IL-2協(xié)同劑(羊脾)僅一次回輸TIL細胞，即能使轉(zhuǎn)移瘤包塊較明顯縮小，減慢腹水增生速度，藥物副作用觀察腹腔注射及肌肉注射無過敏反應，無發(fā)燒，無肝腎損傷。
實施例4羊血淋巴細胞制備IL-2為主的協(xié)同劑采取新鮮羊血(經(jīng)嚴格檢疫)500ml 0.01％肝素抗凝，慶大霉素100單位/ml，紅霉素1mg/ml(先用5％葡萄糖溶解)。2000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，其血漿層加5倍生理鹽水，2000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，收集淋巴細胞待用。其白細胞層，以1∶3加淋巴細胞分離液，淋巴細胞分離液放于離心杯下部，然后將白細胞液重層于其上，2000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，取梯度離心的淋巴細胞層，加5倍體積生理鹽水2000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，取淋巴細胞沉渣，與前述梯度離心收獲的淋巴細胞合并，加一倍生理鹽水洗一次。計數(shù)淋巴細胞數(shù)。以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋淋巴細胞為5×106/ml，加慶大霉素100u/ml，紅霉素1mg/ml(先用5％葡萄糖2ml溶解/支)加ConA20μg/ml，PHA-M1μg/m.PHA-P1μg/ml，注入培養(yǎng)瓶中，在CO2培養(yǎng)箱中，5％CO2，37℃培養(yǎng)96小時。取培養(yǎng)上清，2000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，取上清獲220ml液體，用CTLL細胞MTT法測上清IL-2活性為700單位/ml。在超濾器中經(jīng)分子量5萬道爾頓濾膜超濾，取5萬道爾頓以下部分，再經(jīng)1萬道爾頓濾膜超濾，取1萬道爾頓以上部分，得17ml濃縮液，過SephadexG75層析柱，美國貝克曼紫外可見光分光光度計檢測，280nm波長，取蛋白質(zhì)部分。得47mlIL-2協(xié)同劑。CTLL細胞MTT法測IL-2活性為3900單位/ml。0.30μm孔徑濾膜，除菌過濾，分裝4000單位/支，4℃保存。
圖1的箭頭所指的是本申請人作的天然自細胞介素活性峰部分；圖2的上部箭頭所指的是牛血清的蛋白峰(分子量7萬道爾頓)，下部箭頭所指的是德國進口標準重組白細胞介素-2峰。
權(quán)利要求
1.從豬血、羊血、豬脾、羊脾制取IL-2為主的抗人癌協(xié)同劑的方法，其特征在于取新鮮經(jīng)檢疫的豬脾、羊脾，抑菌、無菌操作制成細胞懸液或新鮮經(jīng)檢疫的豬、羊的抗凝血，抑菌；經(jīng)分離淋巴細胞，加RPMI1640培養(yǎng)基、植物血凝素PHA-M、PHA-P刀豆蛋白ConA絲裂原，細胞培養(yǎng)24-96小時，細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)純化、取分子量1萬-5萬道爾頓蛋白質(zhì)部分，除菌制成協(xié)同劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的從豬血、羊血、豬脾、羊脾制取IL-2為主的抗人癌協(xié)同劑的方法，其特征在于經(jīng)檢疫新鮮的豬脾立即放入抗菌素溶液中；分離淋巴細胞按5×106/ml濃度以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋細胞，加植物血凝素PHA-M1μg/ml，PHA-P1μg/ml ConA(刀豆蛋白)20μg/ml；細胞培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)上清經(jīng)純化，取5萬道爾頓以下，1萬道爾頓以上的分子量的蛋白質(zhì)，制成水針劑或凍干粉針劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的從豬血、羊血、豬脾、羊脾制取IL-2為主的抗人癌協(xié)同劑的方法，其特征在于采取新鮮豬血，分離淋巴細胞，加ConA(刀豆蛋白)20μg/ml PHA-M1μg/ml，PHA-P1μg/ml，細胞培養(yǎng)8小時，培養(yǎng)上清經(jīng)純化，取分子量1萬道爾頓至5萬道爾頓的蛋白質(zhì)，制成水針劑或凍干粉針劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的從豬血、羊血、豬脾、羊脾制取IL-2為主的抗人癌協(xié)同劑的方法，其特征在于取新鮮羊脾，分離淋巴細胞，加植物血凝素PHA-M1μg/ml，PHA-P1μg/ml，ConA(刀豆蛋白)20μg/ml細胞培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)上清經(jīng)純化，取分子量1萬道爾頓至5萬道爾頓的蛋白質(zhì)，制成水針劑或凍干粉針劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的從豬血、羊血、豬脾、羊脾制取IL-2為主的抗人癌協(xié)同劑的方法，其特征在于采取新鮮羊血，分離淋巴細胞，加ConA20μg/ml，PHA-M1μg/ml，PHA-P1μg/ml，細胞培養(yǎng)96小時，培養(yǎng)上清經(jīng)純化，取分子量1萬道爾頓至5萬道爾頓的蛋白質(zhì)，制成水針劑或凍干粉針劑。
專利摘要
從豬血、羊血、豬脾、羊脾制取IL-2為主的抗人癌協(xié)同劑的生產(chǎn)方法，是屬于細胞工程技術(shù)。本發(fā)明的要點是取新鮮豬脾、羊脾無菌操作制成細胞懸液或新鮮豬、羊的抗凝血，抑菌，再經(jīng)分離淋巴細胞，加絲裂原、細胞培養(yǎng)、純化，取分子量1萬-5萬道爾頓蛋白質(zhì)部分，制成協(xié)同劑。由于多因子協(xié)同作用可提高療效，并且具有使用安全等特點。
文檔編號A61P35/00GKCN1052732SQ90106410
公開日2000年5月24日 申請日期1990年10月26日
發(fā)明者張啟明, 梁偉, 孫鐵民 申請人:遼寧省腫瘤研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan