專利名稱：用大規(guī)模培養(yǎng)的麻黃細(xì)胞培養(yǎng)物作原料生產(chǎn)麻黃堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用生物技術(shù)生產(chǎn)麻黃堿的方法。特別涉及，通過(guò)利用麻黃細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)或利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物作為原料，連續(xù)或半連續(xù)地工業(yè)化生產(chǎn)麻黃堿。
麻黃植物中主要含有麻黃堿、偽麻黃堿、L-N甲基麻黃堿、d-N甲基偽麻黃堿、L-去甲基麻黃堿、d-去甲基偽麻黃堿等。麻黃草是一種常用中草藥，具有發(fā)汗，平喘，祛風(fēng)等作用。麻黃堿與腎上腺素一樣能夠興奮交感神經(jīng)；但麻黃堿可以口服，且作用時(shí)間長(zhǎng)，此點(diǎn)為腎上腺素所不能。麻黃堿能使支氣管擴(kuò)張，鼻黏膜收縮，并使血壓升高，臨床用于特效治療咳嗽，氣喘，枯草熱，百日咳等；并能減低月經(jīng)痛病的疼痛，亦能作散瞳藥。
早在1904年，已有人開(kāi)始研究化學(xué)合成法制備麻黃堿。然而，化學(xué)合成的方法得到的麻黃堿為消旋的混合物，其中含有等量的左旋和右旋麻黃堿，左旋麻黃堿幾乎無(wú)醫(yī)療作用，且右旋麻黃堿難以從混合物中分離。1921年，Hildebrandt及Klavehn利用Nueberg發(fā)明了生物縮合法，能使苯甲酸和乙醛縮合制得1-乙?；郊状迹倥c甲胺縮合，再籍活性鋁還原，并用膠狀鉑為接觸劑，最后得到1-麻黃堿。這一方法工藝復(fù)雜，成本也較高。
目前，麻黃堿的生產(chǎn)是利用天然的麻黃植物進(jìn)行提取，如全國(guó)最大的麻黃堿生產(chǎn)廠——內(nèi)蒙的赤峰制藥廠及國(guó)內(nèi)的大小十幾個(gè)廠家，都是利用天然植物麻黃生產(chǎn)麻黃堿。這些廠年消耗麻黃植物將近60,000噸左右，幾年內(nèi)麻黃植物即將枯竭。該方法需要耗費(fèi)大量的天然資源，以保證生產(chǎn)的順利進(jìn)行。經(jīng)過(guò)多年的采挖，麻黃植物資源已相當(dāng)缺乏。內(nèi)蒙的赤峰制藥廠還種植大面積的麻黃植物，但麻黃革的量仍不能滿足生產(chǎn)的需要。原因是種植的麻黃植物一般需要3年時(shí)間才可收獲。種植過(guò)麻黃植物的土壤具有毒性，需荒廢1-2年方可種植其他植物。并且人工種植需占用大量可耕地。在劉國(guó)鈞的“新疆麻黃植物立地條件的探討”新疆植物學(xué)研究文集一文中述及麻黃植物群落貧乏，在10×5平方米的樣地上只記載5-10個(gè)群落，有的只有2-3個(gè)群落。另外，新疆麻黃經(jīng)含量測(cè)定，具有工業(yè)價(jià)值的可利用量?jī)H為蘊(yùn)藏量的1/3，成本高，產(chǎn)率低。鑒于以上情況，有必要開(kāi)發(fā)生產(chǎn)麻黃堿的其他方法。
本發(fā)明的目的在于克服已有的化學(xué)合成麻黃堿方法中技術(shù)路線復(fù)雜和從天然麻黃草中提取麻黃堿的方法需消耗大量麻黃草，而麻黃植物趨于枯竭以及種植占用大量可耕地等缺點(diǎn)，為保護(hù)自然資源及生態(tài)環(huán)境，節(jié)約耕地并提高麻黃堿的產(chǎn)量，進(jìn)行可持續(xù)發(fā)展的生產(chǎn)，故而提供一種利用麻黃細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，利用細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)麻黃堿的方法。
本發(fā)明基于從麻黃植物細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25的培養(yǎng)物生產(chǎn)麻黃堿，本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1.微生物的名稱麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25
2.微生物的保藏麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25，已于1998年9月23日保藏在中國(guó)微生物保藏中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCC，保藏的編號(hào)為CGMCC 0359。
3.微生物的特性利用麻黃植株誘導(dǎo)出產(chǎn)生麻黃堿的麻黃細(xì)胞ZHJ-25，該麻黃細(xì)胞有如下的特征(1)麻黃細(xì)胞的形態(tài)特征在含有2，4-D和吲哚乙酸的瓊脂培養(yǎng)基上于23-26℃培養(yǎng)2天后觀察，即可看出細(xì)胞在增長(zhǎng)，在原有的細(xì)胞團(tuán)上增殖出細(xì)小的顆粒狀的細(xì)胞，再培養(yǎng)3-5天后就可觀察到0.5-5mm大小的細(xì)胞團(tuán)。麻黃細(xì)胞呈橢球體和球體，細(xì)胞的直徑大約為10-150微米左右。
(2)麻黃愈傷組織的特征麻黃的細(xì)胞經(jīng)增殖形成愈傷組織，麻黃愈傷組織有的呈現(xiàn)出聚集體，有的呈現(xiàn)出分散形的狀態(tài)。愈傷組織邊緣呈現(xiàn)類顆粒的波狀，微粘。在懸浮培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)1mm左右的細(xì)小的顆粒狀，懸浮于培養(yǎng)液中，待到生產(chǎn)的后期，由于愈傷組織產(chǎn)生出麻黃堿，細(xì)胞的比重加大，細(xì)胞易沉降于液體的底部。顏色為淺黃色到深棕色不等。
(3)生理生化特征可利用多種糖源，最合適的培養(yǎng)溫度為25℃，低于10℃或高于40℃細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至死亡。最合適的pH為5.8，在光照及暗培養(yǎng)中細(xì)胞均可生產(chǎn)麻黃堿及衍生物，只是麻黃堿及衍生物的含量不同。過(guò)氧化物同工酶，是麻黃細(xì)胞ZHJ-25生長(zhǎng)活性標(biāo)志，苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶與麻黃細(xì)胞ZHJ-25中的麻黃堿及衍生物的代謝產(chǎn)率成正比關(guān)系。
麻黃細(xì)胞的特征簡(jiǎn)述如下表表1 ZHJ-25麻黃屬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)條件
本發(fā)明優(yōu)化了該細(xì)胞的生長(zhǎng)條件，并可連續(xù)或半連續(xù)地生產(chǎn)麻黃堿。培養(yǎng)的溫度為22-26℃。
本發(fā)明提供的采用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿的方法步驟如下1.麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359的獲得(i) 將麻黃植株用洗滌靈洗凈，再用蒸餾水沖洗三遍。放入通常消毒劑如次氯酸鈉，雙氧水，升汞等配制的水溶液中，滅菌10-30分鐘；(ii)將上述(i)洗凈植物的莖切成0.5cm長(zhǎng)短，接到含1.0-10％(重量/體積)糖的培養(yǎng)基中，如表2中所示，在23-26℃保溫培養(yǎng)5-30天；(iii)將上述(ii)的生長(zhǎng)后所得愈傷組織從外植體上切下，轉(zhuǎn)移到新配制的培養(yǎng)基中，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
2.配制培養(yǎng)基，組分如表2所示表2麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
>按比例將如表2所示的各種試劑放入一燒杯，水定容至500毫升，用堿調(diào)pH為5.8，再加入0.7％瓊脂煮沸，分裝入50毫升三角燒瓶，每只三角燒瓶中裝20毫升，封口膜封口，將其放入壓力滅菌鍋中，121℃滅菌15分鐘，冷卻后作為固體培養(yǎng)基。若不加入瓊脂，調(diào)完pH后分裝即可，滅菌條件同樣。
3.麻黃堿生產(chǎn)及繼代培養(yǎng)(可有三條途徑)(1)固體培養(yǎng)(i)將麻黃細(xì)胞接入上述已滅菌裝有20毫升固體培養(yǎng)基的50毫升三角燒瓶中。(ii)在25±2℃培養(yǎng)10-15天，可轉(zhuǎn)入新配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。(iii)將細(xì)胞培養(yǎng)20-50天后，取出培養(yǎng)的細(xì)胞，60℃左右干燥，即得含有麻黃堿的原料。重復(fù)步驟(i)和(ii)，即可將麻黃細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)。
(2)懸浮培養(yǎng)(i)將三角燒瓶中生長(zhǎng)10-15天的細(xì)胞轉(zhuǎn)入250毫升和500毫升或3升的三角燒瓶，其中裝有100-1000毫升表2的液體培養(yǎng)基，搖床的轉(zhuǎn)速為100-150rpm，在25±2℃培養(yǎng)13-16天。(ii)將細(xì)胞培養(yǎng)在同樣的條件下，培養(yǎng)20-50天可得含有麻黃堿的原料。重復(fù)步驟(i)，即可將麻黃細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)。
(3)生物反應(yīng)器培養(yǎng)(i)利用3升搖瓶進(jìn)行繼代培養(yǎng)的麻黃細(xì)胞轉(zhuǎn)入一級(jí)生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，在25±2℃培養(yǎng)10-15天；(ii)將上述反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)入較前者有效體積大的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，在25±2℃培養(yǎng)20-50天，即可將麻黃細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)。
在本發(fā)明提供的表2所列麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成外，還包括通常所用的MS，N6，SH，B5，White，Heller，E等培養(yǎng)基均可用來(lái)培養(yǎng)麻黃細(xì)胞。本發(fā)明的麻黃細(xì)胞可利用硝態(tài)氮和氨態(tài)氮，故培養(yǎng)基中加入硝酸鉀和硫酸氨，利用的磷酸及硫酸鹽是以硫酸氨及磷酸二氫鈉的形式加入；利用的硼，銅，鋅，鐵等微量元素是以硫酸銅，硫酸鋅，硼酸鈉及乙二胺四乙酸鈉鐵等的形式加入；鈣離子的利用是以氯化鈣形式加入，利用的激素是吲哚乙酸及動(dòng)力精等。利用的碳源包括單糖，雙糖，多糖等。另外，加入含有微量元素，維生素，多糖及氨基酸等真菌培養(yǎng)液5-50％，可刺激細(xì)胞分泌麻黃堿，提高麻黃堿的產(chǎn)率。麻黃堿的定量分析1.用高壓液相色譜定量分析本發(fā)明麻黃堿的含量的條件表3高壓液相色譜定量分析麻黃堿
2.酸堿滴定法定量分析麻黃細(xì)胞ZHJ-25中麻黃堿的含量將干燥后的細(xì)胞培養(yǎng)物研磨，過(guò)100目的篩網(wǎng)，取1.0克樣品加入放有100ml乙醚和2ml 10％氫氧化鈉的具塞錐形瓶中，密閉振搖1小時(shí)，靜止約2小時(shí)后，用附有濾紙并裝有2克無(wú)水硫酸鈉的漏斗過(guò)濾，殘?jiān)儆蒙倭恳颐严礈烊?，合并濾液。將濾液用飽和氯化鈉洗滌，然后加入0.1M的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液20ml，振搖10分鐘，酸液用氫氧化鈉滴定，以甲基紅為指示劑。本發(fā)明的麻黃堿的特性1.形狀麻黃堿為無(wú)色蠟狀固體；2.熔點(diǎn)如表4所示；3.分子量165；4.分子式C10H15NO；5.分子結(jié)構(gòu)式
R1＝H，R2＝CH3R1＝R2＝HR1＝R2＝CH36.比旋度如表4表4麻黃堿的熔點(diǎn)及比旋度值<
>7.穩(wěn)定性在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定8.溶解性(-)麻黃堿易溶于酒精和水，可溶于氯仿，乙醚，苯，甲苯等有機(jī)溶劑，能與無(wú)機(jī)酸或堿反應(yīng)；而(+)偽麻黃堿則難溶于水，堿性較(-)麻黃堿略強(qiáng)，易于與酸結(jié)合成鹽。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)含量穩(wěn)定天然的麻黃屬植物由于生長(zhǎng)區(qū)域不同，其植株中所含的麻黃堿的量不穩(wěn)定，受病蟲(chóng)害、不良?xì)夂驐l件等的影響，而細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿不受上述條件的影響。(2)含量高一般麻黃屬植物中麻黃堿的含量為0.8-1.75％，而麻黃細(xì)胞培養(yǎng)物中的麻黃堿為天然的幾倍甚至十幾倍。(3)保護(hù)環(huán)境，節(jié)約耕地，可工業(yè)化生產(chǎn)天然植株的不當(dāng)采挖，可造成土地的荒漠化。另外由于麻黃屬植株的人工栽培需要的時(shí)間大約2-3年，收獲后因土地毒化無(wú)法種植植物，也使得土地閑置。而植物細(xì)胞培養(yǎng)不需占用耕地，可在廠房?jī)?nèi)進(jìn)行，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明

圖1苯丙氨酸的加入對(duì)麻黃堿產(chǎn)量的影響圖2真菌發(fā)酵液的加入對(duì)麻黃堿產(chǎn)量的影響實(shí)施例1 麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿(1)按比例將如表5所示的各種試劑放入一燒杯，加入蔗糖，定容至500毫升，用1NKOH調(diào)pH為5.8，再加入0.7％瓊脂煮沸，分別裝入50毫升三角燒瓶，每只三角瓶中裝20毫升，蓋上封口膜，將封口的三角瓶在滅菌鍋中121℃滅菌15分鐘，冷卻；(2)將麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359接入上述(i)中的50升三角燒瓶的培養(yǎng)基中，在25±2℃培養(yǎng)10-15天；(3)一部分麻黃細(xì)胞可重復(fù)步驟(ii)達(dá)到繼代培養(yǎng)的目的；(4)將上述部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20-50天后，取H培養(yǎng)的細(xì)胞60℃左右干燥，得含有麻黃堿的原料。
表5麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
實(shí)施例2麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿(i)按比例將如表6所示的各種溶液放入一燒杯，加入蔗糖，定容至500毫升，加入1NNaOH調(diào)pH為5.8，再加入0.7％瓊脂煮沸，分別裝入100毫升三角瓶，每只三角瓶中裝30毫升，蓋上封口膜，將封口的三角瓶在121℃滅菌15分鐘，冷卻(ii)將麻黃細(xì)胞接入(i)的三角瓶中，在25±2℃培養(yǎng)10-15天。(iii).部分(ii)中培養(yǎng)的麻黃細(xì)胞可重復(fù)步驟(ii)，達(dá)到繼代培養(yǎng)的目的。(iv)將(ii)部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20-50天后，取出培養(yǎng)的麻黃細(xì)胞60℃左右干燥，即得含有麻黃堿的原料。
表6麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
實(shí)施例3麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿按表7所示培養(yǎng)基的配方配制培養(yǎng)基，將已培養(yǎng)了10-15天的ZHJ-25麻黃細(xì)胞接入已滅好菌的含有100毫升新配培養(yǎng)基250毫升三角燒瓶中，在轉(zhuǎn)速為100-120rpm的搖床上培養(yǎng)20-50天后，取出培養(yǎng)的細(xì)胞60℃左右干燥，即得含有麻黃堿的原料。
表7麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
實(shí)施例4麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿按表8所示培養(yǎng)基的配方配制培養(yǎng)基，將已培養(yǎng)了10-15天的ZHJ-25麻黃細(xì)胞接入已滅好菌的含有250毫升新配液體培養(yǎng)基的1L三角燒瓶中，在轉(zhuǎn)速為100-120rpm的搖床上培養(yǎng)20-50天后，取出培養(yǎng)的細(xì)胞60℃左右干燥，即得含有麻黃堿的原料。
表8麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
實(shí)施例5麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿表9麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
按表9所示培養(yǎng)基的配方配制培養(yǎng)基，將已培養(yǎng)了10-15天的ZHJ-25麻黃細(xì)胞接入已滅好菌的含有1L新配液體培養(yǎng)基的3L三角燒瓶中，在轉(zhuǎn)速為100-120rpm的搖床上培養(yǎng)20-50天后，取出培養(yǎng)的細(xì)胞干燥，即得含有麻黃堿的原料。實(shí)施例6苯丙氨酸的加入對(duì)麻黃堿產(chǎn)率的影響將生長(zhǎng)10-15天的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到表10所示的培養(yǎng)基上，直至麻黃堿的含量達(dá)到最大為止。圖1所示的是，在生產(chǎn)培養(yǎng)基中加入不同量的苯丙氨酸，麻黃堿的含量有所增加。苯丙氨酸的含量有0mg/L增加至20mg/L時(shí)，麻黃堿的產(chǎn)率從70mg/L增加到860mg/L。實(shí)施例7真菌發(fā)酵液的加入對(duì)麻黃堿含量的影響將生長(zhǎng)10-15天的麻黃細(xì)胞轉(zhuǎn)移至表11所示的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至麻黃堿的含量達(dá)到最大為止。圖2為加入真菌培養(yǎng)液及菌絲體后的麻黃細(xì)胞中麻黃堿含量的變化。從圖中可以看出，當(dāng)真菌發(fā)酵液及從10％增加到50％(重量百分比)時(shí)，麻黃堿的含量從50mg/L增加到980mg/L。
表10麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
表11麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
實(shí)施例8麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿按表12所示培養(yǎng)基的配方配制培養(yǎng)基，將已培養(yǎng)了10-15天的ZHJ-25麻黃細(xì)胞按入已滅好菌的含有1L新配表12液體培養(yǎng)基的3L三角燒瓶中，在轉(zhuǎn)速為100-120rpm的搖床上培養(yǎng)10-15天后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入有效體積為50升的生物反應(yīng)器中(其中裝有40升裝有滅完菌的培養(yǎng)液)，培養(yǎng)20-50天，取出培養(yǎng)的細(xì)胞60℃左右干燥，即得含有麻黃堿的原料。實(shí)施例9麻黃細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)麻黃堿(i)按表13所示培養(yǎng)基的配方配制培養(yǎng)基，將已培養(yǎng)了10-15天的ZHJ-25麻黃細(xì)胞接入已滅好菌的含有1L新配液體培養(yǎng)基的3L三角燒瓶中，在轉(zhuǎn)速為100-120rpm的搖床上培養(yǎng)10-15天后；(ii)將(i)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至有效體積為50升的通氣攪拌生物反應(yīng)器中(其中裝有40升培養(yǎng)液)，培養(yǎng)10-15天；(iii)將(ii)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至有效體積為250升的通氣攪拌生物反應(yīng)器中(其中裝有240升培養(yǎng)液)，培養(yǎng)20-50天后取出培養(yǎng)的細(xì)胞干燥，即得含有麻黃堿的原料。
表12麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
表13麻黃細(xì)胞ZHJ-25的培養(yǎng)基組成
實(shí)施例10麻黃細(xì)胞反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)麻黃堿(i)按表14所示培養(yǎng)基的配方配制培養(yǎng)基，將已培養(yǎng)了10-15天的ZHJ-25麻黃細(xì)胞接入已滅好菌的含有1L新配液體培養(yǎng)基的3L三角燒瓶中，在轉(zhuǎn)速為100-120rpm的搖床上培養(yǎng)10-15天后；(ii)將(i)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至有效體積為200升的通氣攪拌生物反應(yīng)器中，其中裝有180升培養(yǎng)液，培養(yǎng)10-15天后；(iii)將(ii)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至有效體積為1立方米的氣升式生物反應(yīng)器中，其中裝有980升滅完菌的培養(yǎng)液繼續(xù)生長(zhǎng)10-15天；(iv)將(iii)培養(yǎng)的麻黃細(xì)胞轉(zhuǎn)移至有效體積為5噸的氣升式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)20-50天，取出培養(yǎng)的細(xì)胞，干燥，即得含有麻黃堿的原料。
權(quán)利要求
1.一種用大規(guī)模培養(yǎng)麻黃細(xì)胞培養(yǎng)的做原料生產(chǎn)麻黃堿的方法，包括以下步驟(1)麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359的獲得(2)配制培養(yǎng)基，其配方如下試劑名稱濃度mmol/L 試劑名稱 濃度mmol/L硝酸鉀 2.0-10.0硫酸銅0.0001-0.001磷酸二氫鈉 0.3-5.0 硫酸鋅0.001-0.01硫酸鎂 0.5-3.5 (EDTA)Fe 0.1-2硼酸鈉 0.001-0.007 動(dòng)力精0.001-0.01硫酸氨 0.5-2.0 吲哚乙酸 0.001-0.01氯化鈣 0.5-5.0 蔗糖 1.0-10.0(％w/v)按比例將各種試劑放入一燒杯，水定容至500毫升，用堿調(diào)pH為5.8，再加入0.7％瓊脂煮沸，分別裝入50毫升三角燒瓶，每只三角燒瓶中裝20毫升，封口膜封口，將其放入壓力滅菌鍋中，121℃滅菌15分鐘，冷卻后作為固體培養(yǎng)基；(3)麻黃堿生產(chǎn)及繼代培養(yǎng)包括三條途徑；將步驟(1)獲得的麻黃細(xì)胞接種到上述培養(yǎng)基中，在25±2℃下培養(yǎng)10-15天，之后再轉(zhuǎn)入新配制的上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-50天后，取出60℃干燥。
2.按權(quán)利要求1所述的用大規(guī)模培養(yǎng)麻黃細(xì)胞-(Ephedra)ZHJ-25 CGMCCNo.0359培養(yǎng)物做原料生產(chǎn)麻黃堿的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基中還包括加入濃度為0.1-20mmol/L的苯丙氨酸。
3.按權(quán)利要求3所述用麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中還包括加入10-50％重量百分比的真菌發(fā)酵液，其濃度為10-50w/v。
4.按權(quán)利要求1-3所述用麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中還包括加入0.6-0.7％重量百分比的瓊脂。
5.按權(quán)利要求1-4所述用麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中還包括加入維生素B0.4-0.5mmol/L。
6.按權(quán)利要求1-5所述用麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中還包括加入煙酸0.078mmol/L。
7.按權(quán)利要求1-6所述用麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法，其特征在于，所述麻黃堿生產(chǎn)及繼代培養(yǎng)的三條途徑是(1)固體培養(yǎng)；(2)懸浮培養(yǎng)；(3)生物反應(yīng)器培養(yǎng)。
8.按權(quán)利要求7所述用麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)是(i)將麻黃細(xì)胞接入上述已滅菌裝有20毫升固體培養(yǎng)基的50毫升三角燒瓶中；(ii)在25±2℃培養(yǎng)10-15天，可轉(zhuǎn)入新配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)；(iii)將細(xì)胞培養(yǎng)20-50天后，取出培養(yǎng)的細(xì)胞，60℃左右干燥，即得含有麻黃堿的原料；重復(fù)步驟(i)和(ii)，即可得到連續(xù)培養(yǎng)的麻黃細(xì)胞。
9.按權(quán)利要求7所述用麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法，其特征在于，所述懸浮培養(yǎng)是(i)將三角燒瓶中生長(zhǎng)10-15天的細(xì)胞轉(zhuǎn)入250毫升和500毫升或3升的三角燒瓶，其中裝有100-1000毫升表2的液體培養(yǎng)基，搖床的轉(zhuǎn)速為100-150rpm，在25±2℃培養(yǎng)13-16天；(ii)將細(xì)胞培養(yǎng)在同樣的條件下，培養(yǎng)20-50天可得含有麻黃堿的原料；重復(fù)步驟(i)，即可得到連續(xù)培養(yǎng)的麻黃細(xì)胞。
10.按權(quán)利要求7所述用麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ-25 CGMCC No.0359方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器培養(yǎng)是(i)利用3升搖瓶進(jìn)行繼代培養(yǎng)的麻黃細(xì)胞轉(zhuǎn)入一級(jí)生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，在25±2℃培養(yǎng)10-15天；(ii)將上述反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)入較前者有效體積大的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，在25±2℃培養(yǎng)20-50天，即可得麻黃細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用大規(guī)模培養(yǎng)麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ－25CGMCCNo.0359培養(yǎng)物作原料生產(chǎn)麻黃堿的方法。本發(fā)明的方法是將麻黃細(xì)胞(Ephedra)ZHJ－25CGMCCNo.0359接種在糖的培養(yǎng)基中通過(guò)三條途徑,在25±2℃下培養(yǎng)20—50天,之后,取出培養(yǎng)物60℃下干燥而得到含有麻黃堿的原料。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單,可工業(yè)化連續(xù)、半連續(xù)生產(chǎn)麻黃堿;所得產(chǎn)物麻黃堿含量穩(wěn)定,而且產(chǎn)率高。
文檔編號(hào)C12P13/00GK1256316SQ9812518
公開(kāi)日2000年6月14日 申請(qǐng)日期1998年12月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月4日
發(fā)明者查麗杭, 焦玉霞, 劉大陸, 朱維型, 張國(guó)政, 唐良紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化工冶金研究所, 新疆托峰藥業(yè)有限責(zé)任公司