專利名稱：提高蛹蟲草固體培養(yǎng)基中蟲草菌素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌發(fā)酵工程，具體而言涉及蛹蟲草固體培養(yǎng)高產(chǎn)醫(yī)藥原料 蟲草菌素。
背景技術(shù)：
蟲草菌素的分子式為C10H13N503，分子量251,堿性，針狀或片狀結(jié)晶， 熔點230°C~23rC，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，蒽酮 反應(yīng)陽性，紫外光最大吸收波長為259nm 。蟲草菌素的結(jié)構(gòu)式如下
Cordycepin (3'-deoxyadenosine)
蛹蟲草產(chǎn)生的蟲草菌素具有多種生物學(xué)活性，比如抑菌作用，抗腫瘤 作用，抑制人體免疫缺陷病毒HIVI型病毒的作用，減肥作用，免疫調(diào)節(jié)作 用和明顯降血糖、降血脂作用。其中，降血脂方面的效果尤為明顯，與巿售 的非諾貝特(法國力博福尼制藥公司生產(chǎn))效果相當(dāng)或優(yōu)于非諾貝特；在治 療白血病方面也在美國由FDA批準(zhǔn)進(jìn)入了臨床研究(1997年11月美國癌癥 研究所，2008年7月美國OncoVista公司)。
目前蛹蟲草已實現(xiàn)了大規(guī)模固體培養(yǎng)，但蟲草子實體中蟲草菌素含量占 培養(yǎng)物中總的蟲草菌素的量較低(約30%)。要充分利用這一有價值的資源就必須尋求提高蟲草菌素產(chǎn)量的有效途徑，也即提高培養(yǎng)基中蟲草菌素的單 位產(chǎn)量。據(jù)報道，人工蛹蟲草培養(yǎng)基中蟲草菌素的含量偏低，僅為0.2%左 右。故提高培養(yǎng)基中蟲草菌素的含量具有重要的意義。
近年來，人們漸漸關(guān)注提高蟲草菌素含量的技術(shù)，涉及蟲草菌素的專利
申請有01124109.8號"發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)蟲草素的方法(液體培養(yǎng))"、 200810068734. 8號"紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲草子實體和蟲草素產(chǎn)量的方法"、 200310101650. 7號"3'-脫氧腺苷在制備降血脂藥物中的應(yīng)用"等。然而，
目前關(guān)于蛹蟲草固體發(fā)酵的專利主要集中在子實體生產(chǎn)工藝研究方面，很少
涉及固體培養(yǎng)基大規(guī)模生產(chǎn)蟲草菌素的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高蛹蟲草固體培養(yǎng)基中蟲草菌素含量的 方法，從而大幅度提高其中蟲草菌素的含量。 發(fā)明人指出，蛹蟲草傳統(tǒng)固體發(fā)酵的方法是
1. 菌種活化
(1) 配PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g,水煮30min，用4層紗布過濾，取濾液， 葡萄糖20g，瓊脂15 20g,加水至1000mL;
(2) 將配好的PDA培養(yǎng)基分裝到試管，包扎，12rC滅菌30mim;
(3) 滅好菌的試管培養(yǎng)基凝固前擺斜面，冷卻；
(4) 將原始菌種從4'C冰箱中取出，室溫下在超凈搡作臺上無菌接種；
(5) 接種蛹蟲草的斜面置26'C下黑暗恒溫培養(yǎng)；
(6) 3~5天后，等菌種長滿斜面，用無菌水洗斜面制成孢子懸液(在超凈 搡作臺上無菌操作)。
2. 液體菌種制作
將蛹蟲草孢子懸液稀釋到合適濃度，然后將孢子懸液接入液體母種培養(yǎng)基中，于20。C 28。C下?lián)u床以150r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4d。
上述液體母種培養(yǎng)基的配方為蛋白胨2%,蔗糖2%， MgS04'7H20 0.05 %， KH2P04 0.1 %,水1000mL， pH自然；裝液量為100mL/500mL三角瓶。
1蛹蟲草培養(yǎng)
350ml無色玻璃罐頭瓶中裝入20g大米，按l: 1. 6的料水比加入32mL 營養(yǎng)液；用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口， 12rC， 30min條件下高壓滅菌， 冷卻后，接種蛹蟲草液體菌種，置25'C下黑暗恒溫培養(yǎng)10d;從ll天起每 天散射光光照不少于10h，溫度保持25匸，相對濕度提高至80%左右；蛹蟲 草子座長出后，每天散射光光照不少于15h,且增大光照強度，保持溫度22 'C左右，空氣濕度85%左右；待蛹蟲草培養(yǎng)50天后，除去少量橙黃色的子實 體，檢測干燥后的培養(yǎng)基中蟲草菌素的含量。
發(fā)明人指出，蟲草菌素的檢測方法如下蟲草菌素含量通過HPLC檢測， HPLC測定用PC2000型HPLC分析儀(Scientific systems Inc., PA, USA); 色譜柱釆用K醒asil C18 (4. 6 mm x 250 mm, 5 Mm particle size, Scientific systems Inc., PA， USA);紫夕卜檢測儀(model: Labal 1 iance 525, Scientific systems Inc., PA， USA);檢測波長為254nm;柱溫30°C;流動相為10mMKH2PO4 溶于甲醇/雙蒸水(15:85),流速為lmL/min;進(jìn)樣量為2(^L。先精密稱取干 樣品0. 2g置于具塞試管中，加入雙蒸水l(kL,超聲處理30min,然后在5000g 下離心15min，最后經(jīng)0.45 Mm濾膜過濾除雜后檢測其中蟲草菌素的含量。 若測定前樣品經(jīng)過稀釋，則乘以稀釋倍數(shù)。
本發(fā)明的方法是在蛹蟲草傳統(tǒng)固體發(fā)酵的基礎(chǔ)上，通過改變培養(yǎng)基顆粒 度和營養(yǎng)液工藝優(yōu)化來實現(xiàn)的。具體來說，取大米顆粒度為20目和14目按照 1 : 2的質(zhì)量比配合作為培養(yǎng)基基質(zhì)；釆用葡萄糖3%，蛋白胨3.5%， K2HP04 0.05%, MgS04 , 7H20 0.05 %, VB, (2mg/L)，水1000mL, pH自然的配方配制營養(yǎng)液，按照前述的傳統(tǒng)固體發(fā)酵方法對蛹蟲草進(jìn)行培養(yǎng)，蛹蟲草子座長出
后，增加光照強度和時間；最有利于固體培養(yǎng)基中蟲草菌素的高產(chǎn)。
本發(fā)明所使用的菌株為蛹蟲草菌株(6bnZ/ce/w肌7/"r")的無性型 蛹草擬青霉(; aec/7咖.「c" PM-71菌株，此菌株已于2008年4月17
曰在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記入冊編 號CGMCCNo. 2459;地址北京巿朝陽區(qū)大屯路(中國科學(xué)院微生物研究所)。 上述大米顆粒度組合是分別以整米、10目米、14目米、20目米、40目 米以及它們的兩兩組合(按照不同的質(zhì)量比組合)為培養(yǎng)基基質(zhì)，基質(zhì)營 養(yǎng)液按l : 1.6質(zhì)量比配比，加入營養(yǎng)液；滅菌后接種蛹蟲草培養(yǎng)50d,收獲
培養(yǎng)基，對蟲草菌素含量測定而優(yōu)選出來的。
上述營養(yǎng)液的配方是將固體培養(yǎng)基營養(yǎng)液單因子優(yōu)化得到的最佳碳源 (葡萄糖)、氮源(蛋白胨)、無機鹽(UlP04和MgS04 '7H20)和生長因子(VB,) 按照五因素、四水平進(jìn)行正交實驗優(yōu)選出來的。
上述方法中，蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于15h，增加光 照強度至3500LX。
經(jīng)過對培養(yǎng)基生產(chǎn)蟲草菌素的最佳工藝進(jìn)行驗證，證明此工藝使培養(yǎng)基 中蟲草菌素的含量達(dá)到0.76%，比優(yōu)化前的0.26%提高了 192.31%。
.本發(fā)明的提高蛹蟲草固體培養(yǎng)基中蟲草菌素含量的方法，可以大幅度提 高培養(yǎng)基中蟲草菌素的含量，對提高蛹蟲草固體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素的效率具
有重要意義；本發(fā)明具有方便快捷的優(yōu)點，適用于蛹蟲草固體發(fā)酵大規(guī)模生
產(chǎn)蟲草菌素。
具體實施例方式
實施例1:在IO個容積為350ml、內(nèi)徑為6. 2cm、高度為15cm的圓柱形 無色玻璃瓶中分別裝入20目的大米和l4目的大米組合(按照1 : 2的質(zhì)量比配比)，按1 : 1. 6的料水比加入32mL營養(yǎng)液(釆用葡萄糖3 %,蛋白胨3. 5 %, K肌O. 05%, MgS04 . 7H20 0.05 %， VB! (2mg/L)，水lOOOrnL， pH自然的配 方配制而成的營養(yǎng)液)，用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口后121°C, 30min高 壓滅菌，冷卻后接種蛹蟲草(CGMCCNo.2459 )液體母種，置25'C下黑暗恒溫 培養(yǎng)10夭。從第11天起每天散射光光照不少于10h,溫度保持25'C,相對 濕度提高至80%左右；蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于15h,且 增加光照強度至3500LX,溫度保持22。C左右，空氣濕度85%左右；待蛹蟲草 培養(yǎng)50天后，除去少量橙黃色的子實體，檢測千燥后的培養(yǎng)基中蟲草菌素的 含量。
實施例2:在IO個容積為350ml、內(nèi)徑為6. 2cm、高度為15cm的圓柱形 無色玻璃瓶中分別裝入20目的大米和14目的大米組合(按照1 : 2的質(zhì)量比 配比)，按1 : 1. 6的料水比加入40mL營養(yǎng)液(釆用葡萄糖3%，蛋白胨3.5%， K2HPO40. 05%， MgS04 . 7H20 0.05 %， VB, (2mg/L)，水lOOOmL, pH自然的配 方配制而成的營養(yǎng)液)，用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口后12rC, 30min高 壓滅菌，冷卻后接種蛹蟲草(CGMCCNo.2459 )液體母種，置25。C下黑暗恒溫 培養(yǎng)10天。從第11天起每天散射光光照不少于10h，溫度保持25。C,相對 濕度提高至80%左右；蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于15h，且增 加光照強度至3500LX,溫度保持22i:左右，空氣濕度85%左右。待蛹蟲草培 養(yǎng)"天后，除去少量橙黃色的子實體，檢測干燥后的培養(yǎng)基中蟲草菌素的含 量。
權(quán)利要求
1. 提高蛹蟲草固體培養(yǎng)基中蟲草菌素含量的方法，該方法包括菌種活化、液體菌種制作、蛹蟲草培養(yǎng)3個步驟，其特征在于該方法中取大米粒度為20目和14目按照1∶2的質(zhì)量比配比作為培養(yǎng)基基質(zhì)；采用葡萄糖3％，蛋白胨3.5％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，2mg/L VB1，水1000mL，pH自然的配方配制營養(yǎng)液，按照傳統(tǒng)的固體發(fā)酵方法對蛹蟲草進(jìn)行培養(yǎng)。
2.按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的蛹蟲草培養(yǎng)過程中， 所使用的菌株為蛹蟲草的無性型蛹草擬青霉CGMCCNo.2459菌株。
3. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的蛹蟲草培養(yǎng)過程中， 蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于15h,所用光照強度為3500LX。
全文摘要
本發(fā)明公開了提高蛹蟲草固體培養(yǎng)基中蟲草菌素含量的方法，該方法包括菌種活化、液體菌種制作、蛹蟲草培養(yǎng)3個步驟，其特征在于該方法中取大米粒度為20目和14目按照1∶2的質(zhì)量比配合作為培養(yǎng)基；采用葡萄糖3％，蛋白胨3.5％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，2mg/L VB₁，水1000mL的配方配制營養(yǎng)液，按照傳統(tǒng)的固體發(fā)酵方法對蛹蟲草進(jìn)行培養(yǎng)，蛹蟲草子座長出后，增加光照強度和時間。本發(fā)明的提高蛹蟲草固體培養(yǎng)基中蟲草菌素含量的方法，可以大幅度提高培養(yǎng)基中蟲草菌素的含量(達(dá)到0.76％以上)。對提高蛹蟲草固體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素的產(chǎn)量和效率具有重要意義；本發(fā)明具有方便快捷的優(yōu)點，適用于蛹蟲草固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)蟲草菌素。
文檔編號C12P19/40GK101440389SQ200810068949
公開日2009年5月27日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者勁 何, 康冀川, 文庭池, 雷幫星 申請人:貴州大學(xué)