用于借助氣溶膠潤(rùn)濕試樣的設(shè)備和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于借助于氣溶膠潤(rùn)濕試樣的設(shè)備，所述試樣優(yōu)選為生物試樣，例如細(xì)胞試樣，尤其在空氣液體邊界層上的細(xì)胞試樣。本發(fā)明也還涉及一種用于借助氣溶膠潤(rùn)濕試樣的相應(yīng)的方法。試樣尤其是細(xì)胞并且優(yōu)選是上皮細(xì)胞，尤其優(yōu)選是肺細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002]通常必需的是，將試樣、例如細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中例如為了活性物質(zhì)篩選而暴露于物質(zhì)并且尤其暴露于藥物活性物質(zhì)，或者例如為了毒性研究而暴露于有毒物質(zhì)。
[0003]通常，對(duì)此執(zhí)行在活體外的細(xì)胞試驗(yàn)。在此，在所謂浸沒(méi)細(xì)胞培養(yǎng)條件(submerseZellkulturbedingungen)下對(duì)細(xì)胞的試樣添加活性物質(zhì)或毒理學(xué)活性的材料。在這種浸沒(méi)細(xì)胞培養(yǎng)條件中，細(xì)胞完全地由細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋并且測(cè)試物質(zhì)、例如藥物活性物質(zhì)或有毒物質(zhì)直接移液至細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0004]對(duì)于上皮細(xì)胞，即對(duì)本體向外限界的細(xì)胞，例如肺上皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞或視網(wǎng)膜細(xì)胞，所述情況當(dāng)然是不現(xiàn)實(shí)的，因?yàn)楸倔w中的上皮細(xì)胞典型地形成空氣液體邊界層(LFG)。也就是說(shuō)，在上皮細(xì)胞的一側(cè)上存在空氣或普通的氣體并且在另一側(cè)上存在間質(zhì)的組織或普通的液體。
[0005]對(duì)于在這種細(xì)胞上的研究和實(shí)驗(yàn)，這種細(xì)胞完全浸沒(méi)到細(xì)胞培養(yǎng)基中是生理學(xué)上不現(xiàn)實(shí)的。但是同時(shí)，對(duì)這種細(xì)胞的研究或?qū)嶒?yàn)通常是令人感興趣的。這尤其適用于借助于吸入式給料的材料的活性和毒性研究，例如適用于處理可氣溶膠化的材料尤其納米材料的工作場(chǎng)所安全的研究或吸入式治療。
[0006]例如使用LFG的研究，以便分析承載氣溶膠的物質(zhì)(例如活性物質(zhì)、毒素、納米顆粒)對(duì)細(xì)胞的影響。在此，尤其對(duì)細(xì)胞的影響優(yōu)先的是:所述影響存在于空氣/體液接觸面，即例如肺的上皮細(xì)胞、皮膚或視網(wǎng)膜上。在吸入式治療中，將氣溶膠化的活性物質(zhì)有針對(duì)性地施加到肺上皮上，以便治療肺病或身體組織的疾病。此外，肺也提供用于處理多種有毒的或潛在有毒的材料、即例如在工作場(chǎng)所處的環(huán)境精細(xì)粉塵或納米材料的最重要的途徑。
[0007]為了能夠在盡可能生理學(xué)的條件下檢查這種上皮細(xì)胞，研發(fā)了不同的模擬這種LFG氛圍的方法。尤其借助于插入式細(xì)胞培養(yǎng)小室(Transwell-1nserts)也能夠在標(biāo)準(zhǔn)化的微滴定板中培養(yǎng)在LFG上的細(xì)胞。在LFG上的上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基本上是生理學(xué)上現(xiàn)實(shí)的進(jìn)而在物質(zhì)的作用方面也許比上文所描述的液體細(xì)胞培養(yǎng)更具效力。
[0008]因此，存在下述基本需求:為對(duì)這種LFG細(xì)胞培養(yǎng)的研究和試驗(yàn)提供適合的系統(tǒng)，借助于所述系統(tǒng)能夠?qū)⒉牧暇傻匾孕〉膶雍穸?例如大約10-100 μπι)涂覆到LFG細(xì)胞培養(yǎng)上。這種材料典型地包括液態(tài)的氣溶膠化的活性物質(zhì)，但是也能夠包括干的物質(zhì)。尤其對(duì)于借助于部分地非常昂貴的活性物質(zhì)的制藥學(xué)的研究而言，氣溶膠化的活性物質(zhì)到LFG細(xì)胞上的均勻的分布和高的沉積效率是有利的。因?yàn)橹两駷橹辜葲](méi)有設(shè)立適合的設(shè)備也沒(méi)有相應(yīng)的方法，將LFG細(xì)胞培養(yǎng)用于制藥學(xué)的研究和實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在還是相對(duì)受限制的。
[0009]已經(jīng)存在一些針對(duì)借助于氣溶膠化的材料鋪蓋在LFG上的(肺)細(xì)胞的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)能夠基于用于下述工藝要求的解決方案劃分為不同的類(lèi)別。一方面提出氣溶膠化的物質(zhì)到細(xì)胞的運(yùn)輸?shù)囊?運(yùn)輸)和另一方面提出氣溶膠到細(xì)胞上的沉積的任務(wù)(沉積)。
[0010]根據(jù)DE 102009016364A1的系統(tǒng)，氣溶膠通過(guò)空氣流運(yùn)送到細(xì)胞(運(yùn)輸:空氣流動(dòng))并且借助于擴(kuò)散和/或沉降(根據(jù)氣溶膠的尺寸和質(zhì)量)沉著到細(xì)胞上。
[0011]此外已知的是，使用用于氣溶膠運(yùn)輸?shù)目諝饬鲃?dòng)，其中通過(guò)靜電的淀積來(lái)進(jìn)行沉積。在此，首先靜電地為氣溶膠充電然后在電場(chǎng)中電泳地沉著到細(xì)胞上。
[0012]還已知的是，從相對(duì)小的距離通過(guò)直接的“噴灑(Ansprayen) ”來(lái)施加細(xì)胞。在此，通過(guò)氣溶膠的產(chǎn)生以高的速度(例如借助于高壓噴嘴或快速的載體空氣流)進(jìn)行運(yùn)輸并且通過(guò)慣性壓緊進(jìn)行到細(xì)胞上的沉積。這種類(lèi)型的系統(tǒng)通常具有如下缺點(diǎn):不確保氣溶膠均勻地分布到細(xì)胞上或者運(yùn)行在技術(shù)上是極其耗費(fèi)的。
[0013]通常，已知的系統(tǒng)僅能用于毒理學(xué)重要的干氣溶膠，然而不能用于制藥學(xué)的液體氣溶膠。此外，能使用的顆粒大小通常是受限制的，例如限制為小于I μπι。如用于吸入式治療的、例如大于I μπι的較大的氣溶膠通常是不可行的。
[0014]已知的系統(tǒng)中的多種也具有對(duì)于含水的溶液的非常小的、例如大約0.1 μ g/cm3/h或大約0.lnl/cm2/h的活性物質(zhì)沉積速率(Paur等著的Journal of Aerosol Science42(2011)，第668-692頁(yè)及其中表格3)，進(jìn)而需要非常長(zhǎng)的、幾小時(shí)至幾天的暴露時(shí)間，以便產(chǎn)生可測(cè)量的細(xì)胞生物學(xué)的響應(yīng)(Antwort)。相應(yīng)的方法和儀器是成本極其高且時(shí)間極其長(zhǎng)的并且還使借助于僅能夠培養(yǎng)大約7天的細(xì)胞的工作變得困難。操作以及質(zhì)量控制也是耗費(fèi)的。已知系統(tǒng)的(細(xì)胞)沉積效率(氣溶膠發(fā)生器中的沉著到細(xì)胞上的投入材料的百分比份額)通常大大低于100%，例如低于1%，這有時(shí)歸因于氣溶膠在細(xì)胞上的小的沉積效率和在氣溶膠發(fā)生器中和在輸送管路中的物質(zhì)損失(殘留)。此外，靜電的沉積系統(tǒng)證實(shí)為不利的，因?yàn)椴豢杀苊獾某潆婋娏髂軌蚓哂袑?duì)細(xì)胞響應(yīng)的扭曲的影響。此外，已知的系統(tǒng)中的一些的缺點(diǎn)在于，其允許材料在細(xì)胞上的不均勻的分布或相同分布。因此，在細(xì)胞上的類(lèi)似的且可復(fù)現(xiàn)的劑量測(cè)定是不可行的。由于不可控的條件，僅能困難地確定可靠的劑量作用關(guān)系。最后，通過(guò)慣性壓緊沉著材料的解決方案是不利的，因?yàn)榧?xì)胞有時(shí)承受氣溶膠的高的流入速度。
[0015]對(duì)大多數(shù)已知的系統(tǒng)的共同之處是:借助于持續(xù)的空氣流將氣溶膠載入到暴露腔室中，這以相應(yīng)的工藝上的耗費(fèi)為前提。對(duì)于這種系統(tǒng)示例的是:空氣液體界面細(xì)胞暴露系統(tǒng)(Air-Liquid-1nterface Cell Exposure System)，簡(jiǎn)稱(chēng)ALICE (在Lenz，A.G., E.Karg, B.Lentner, V.Dittrich, C.Brandenberger, B.Rothen-Rutishauser, H.Schulz,G.A.Ferron 和0.Schmid 著的 A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposureand applicat1n to zinc oxide nanoparticles, Particle and Fibre Toxicology6(32)，第1-17頁(yè)，2009中描述)。氣溶膠云霧借助于外部的空氣流從一側(cè)運(yùn)輸?shù)奖┞肚皇抑?，在那氣溶膠云霧向下下落，形成漩渦并且構(gòu)成煙霧，所述煙霧沉淀到細(xì)胞上進(jìn)而將所述細(xì)胞用物質(zhì)潤(rùn)濕。在暴露腔室的另一側(cè)上又抽出排空氣溶膠的空氣。所述系統(tǒng)具有大約7%的相對(duì)小的細(xì)胞沉積效率并且要求相對(duì)大的空間(大約Im3)進(jìn)而不能在無(wú)菌臺(tái)的條件下運(yùn)行。此外，所述系統(tǒng)技術(shù)上非常復(fù)雜地構(gòu)成進(jìn)而是在運(yùn)行中是更耗費(fèi)的。此外，所述系統(tǒng)需要空氣加濕器、栗和空氣流量計(jì)以產(chǎn)生外部的空氣流以及小滴收集器，以便避免在暴露過(guò)程中的干擾。此外，霧化器側(cè)向地設(shè)置在暴露腔室旁邊并且該系統(tǒng)借助于外部的空氣流、尤其即不以無(wú)空氣流的方式運(yùn)行。
[0016]無(wú)空氣流運(yùn)行的另一方法由F.Blank 在 Blank F，Rothen-RutishauserBM, Schurch S，Gehr P:An optimized in vitro model of the respiratory tract wallto study particle cell interact1ns.Journal of Aerosol Medicine-Deposit1nClearance and Effects in the Lung, 19 (3):第 392-405 頁(yè)，2006 中介紹。在所述方法中，通過(guò)直接的噴灑來(lái)潤(rùn)濕試樣，其中噴霧器定位在試樣上方12cm處。系統(tǒng)產(chǎn)生氣溶膠噴霧并且借助于慣性壓緊將氣溶膠沉著在試樣上。沉淀作用和云霧效應(yīng)未被利用或能可被利用。此外，系統(tǒng)是開(kāi)放的(沒(méi)有側(cè)壁或蓋區(qū)域)并且通過(guò)在此提供的方法實(shí)現(xiàn)未標(biāo)記的、但是可能相對(duì)小的沉積效率。此外，這種噴灑具有在與產(chǎn)生的位置具有非常小的距離處之后已經(jīng)不均勻的小滴分布。因此，這種方法不適合于提供物質(zhì)在設(shè)置在10cm2或更大的面積之上的試樣上的均勻分布。此外，不保證試樣潤(rùn)濕的可復(fù)現(xiàn)性，因?yàn)樗褂玫撵F化器(微噴霧器，Penn-Century公司，美國(guó))手動(dòng)地運(yùn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]因此本發(fā)明的第一目的是提出一種替選的且優(yōu)選改進(jìn)的設(shè)備或一種改進(jìn)的方法。所述設(shè)備或所述方法尤其應(yīng)削弱或解決上述問(wèn)題。
[0018]因此，換言之，本發(fā)明的目的是，提供用于快速地、簡(jiǎn)單地、均勻地和/或可復(fù)現(xiàn)地將物質(zhì)或氣溶膠(尤其液態(tài)或固態(tài)的物質(zhì))施加到試樣上、尤其到LFG細(xì)胞培養(yǎng)上的一種設(shè)備或一種方法。此外，所述設(shè)備或所述方法應(yīng)適合于以高的沉積速率(每單位細(xì)胞覆蓋面積每單位時(shí)間的氣溶膠量)涂覆氣溶膠。
[0019]同樣本發(fā)明的目的是，有效地、可簡(jiǎn)單操作地且劑量學(xué)精確地構(gòu)成所述設(shè)備或所述方法。優(yōu)選地，方法本身應(yīng)不引起在細(xì)胞中或在組織切片上的生物學(xué)效應(yīng)。
[0020]所述目的由根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)，尤其如所附的權(quán)利要求、下面的方面和/或進(jìn)一步的說(shuō)明所描述。特別地，本發(fā)明涉及一種用于試樣的氣溶膠暴露的新型的系統(tǒng)(設(shè)備、方法和應(yīng)用)。所述試樣能夠是生物學(xué)的試樣，例如是細(xì)胞。所述細(xì)胞能夠以單個(gè)細(xì)胞的形式、作為細(xì)胞復(fù)合物(直至器官)、組織切片和/或培養(yǎng)細(xì)胞，例如作為培養(yǎng)細(xì)胞的層(Rasen)存在。尤其，這能夠是在空氣液體邊界層(LFG)上的細(xì)胞。但是此外，所述試樣也能夠是例如由金屬、塑料和/或玻璃構(gòu)成的材料試樣。
[0021]根據(jù)第一方面，本發(fā)明包括一種用于借助于氣溶膠潤(rùn)濕至少一個(gè)試樣的設(shè)備。在此，氣溶膠理解為物質(zhì)與氣體、例如空氣的混合物。物質(zhì)能夠以液態(tài)或固態(tài)形式、例如作為小滴或粉塵存在。因此，換言之，氣溶膠是由固態(tài)的和/或液態(tài)的懸浮小粒和氣體構(gòu)成的混合物。設(shè)備包括優(yōu)選基本上豎直的側(cè)壁以及底部區(qū)域。底部區(qū)域在標(biāo)準(zhǔn)使用中、尤其在重力方向觀察設(shè)置在設(shè)備的下部區(qū)域中。所述底部區(qū)域優(yōu)選由側(cè)壁、尤其側(cè)向地限界。底部區(qū)域優(yōu)選為了容納用于試樣的定位的定位設(shè)備或?yàn)榱伺c用于試樣的定位的定位設(shè)備共同作用而進(jìn)行匹配或具有這種定位設(shè)備。設(shè)備還包括蓋區(qū)域，所述蓋區(qū)域與底部區(qū)域豎直地相對(duì)置(上部)，并且所述蓋區(qū)域優(yōu)選由豎直的側(cè)壁、尤其側(cè)向地限界。蓋區(qū)域優(yōu)選為了容納蓋或頂或?yàn)榱伺c蓋或頂共同作用而進(jìn)行匹配或具有這種蓋或頂。設(shè)備形成氣溶膠暴露腔室。術(shù)語(yǔ)暴露腔室尤其理解為通過(guò)設(shè)備限定的空間并且所述暴露腔室尤其由側(cè)壁、底部區(qū)域和蓋區(qū)域與周?chē)h(huán)境隔開(kāi)。所述暴露腔室還包括用于氣溶膠生成的設(shè)備和/或構(gòu)成為用于與用于氣溶膠生成的設(shè)備共同作用，所述設(shè)備也稱(chēng)作氣溶膠化設(shè)備，其優(yōu)選是用于產(chǎn)生液態(tài)氣溶膠的霧化設(shè)備。用于氣溶膠生成的設(shè)備是能夠根據(jù)成形和應(yīng)用產(chǎn)生煙霧、云霧或者小滴氣溶膠的設(shè)備。在此，氣溶膠化設(shè)備優(yōu)選設(shè)置在蓋區(qū)域附近并且尤其設(shè)置在蓋區(qū)域或蓋中、其之上或其之下，優(yōu)選在任何情況下在俯視圖中都設(shè)置在側(cè)壁之內(nèi)或側(cè)壁之間。在此，設(shè)備和/或氣溶膠化設(shè)備匹配成，使得氣溶膠能夠沿朝底部區(qū)域的方向釋放。氣溶膠化設(shè)備設(shè)置在底部區(qū)域之上或能夠在那里設(shè)置為，使得氣溶膠設(shè)備在豎直的俯視圖中至少部分地覆蓋底部區(qū)域并且優(yōu)選大致居中地相對(duì)于所述底部區(qū)域設(shè)置。設(shè)備優(yōu)選具有適合于定位和/或固定氣溶膠化設(shè)備的機(jī)構(gòu)。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備能夠用物質(zhì)潤(rùn)濕試樣。
[0022]定位設(shè)備尤其允許至少一個(gè)試樣、尤其細(xì)胞試樣并且優(yōu)選上皮細(xì)胞適當(dāng)?shù)貎?yōu)選設(shè)置在LFG上。在此，定位設(shè)備優(yōu)選板狀地構(gòu)成并且優(yōu)選具有用于試樣或試樣保持件的一個(gè)或多個(gè)凹部。對(duì)于定位設(shè)備優(yōu)選的實(shí)例是微量滴定板。其他實(shí)例是皮氏培養(yǎng)皿或載玻片。定位設(shè)備的凹部?jī)?yōu)選構(gòu)成為用于容納細(xì)胞的培養(yǎng)基以及定位輔助、尤其插入式細(xì)胞培養(yǎng)小室，借助于其輔助能夠?qū)⒓?xì)胞設(shè)置在LF