專利名稱：包括固定在盤表面上的俘獲分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過與固定在盤表面上的俘獲分子鍵聯(lián)來檢測和/或量化目標分子的方法。
本發(fā)明還涉及一種其表面上固定有不可分割的俘獲分子的盤和該盤的制造方法，以及此盤或包括此盤的診斷和/或讀取裝置。
目標分子(如從微生物上獲取的核苷酸序列)的完整的檢測方法需要下列籌備------樣品的制備；------凈化分子的放大；------上述分子與最好是定位在固體支撐物上的“俘獲”分子(即序列或受納體)鍵聯(lián)；------貼標簽；和------對從標簽上獲取的信息的分析。
因此，存在一種對能夠執(zhí)行這些步驟的幾種(或全部)、尤其是分析獲取的信息，并能夠在大量的復雜分子或待檢微生物中識別特殊分子的簡化的自動裝置和方法的需求。
對鍵聯(lián)到確定小表面上的分子微型化的搜索及其位置的識別導致使用微電子電路，用于設計成DNA片的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)(美國專利US5632 957；US5 605 662和WO94/22889)。
分析大量生物分子的另一種方法是生物芯片。這些生物分子可以通過直接合成生物芯片表面上的俘獲分子形成(WO97/29212)，也可以通過在它們的合成或離解之后固定這些俘獲分子來形成(WO98/28444)。上述這些技術(shù)的一個缺點是使用復雜和昂貴的設備讀取非常低的信號。另外，當必需進行量化檢驗時這些設備包括用于識別疵點位置和信號集成的特殊軟件。
電子裝置可以控制類似俘獲的寡核苷酸或抗體的實體特定結(jié)合到特定的微位置的輸運和連接，以便把可自尋址裝置切成薄片。為了定位分子，可以給一個微電極充正電以把寡核苷酸吸附到其表面。與目標分子如DNA或抗原結(jié)合之后，利用外熒光(epifluorescent)型顯微探測系統(tǒng)進行檢測，對目標分子結(jié)合到其上的微電極進行定位。
上述技術(shù)已被應用于附著到基板的DNA鍵聯(lián)蛋白，從而在形成微電路的基板上形成一個網(wǎng)絡(美國專利US5，561，071)。
但是，在可利用的俘獲分子的數(shù)量上還有限制，這是由于在裝置的每個微電極上必需一個一個地固定這些俘獲分子這一事實。其它的限制是由于發(fā)射信號的分散在分辨來自相鄰電極的信號時的分辨率。最后，在處理之前必需分析和解釋發(fā)射信號。
因此，必須在一種固體支撐物上提供數(shù)量增大的“俘獲分子”，從而能夠識別和/或量化特定的目標分子、目標微生物或他們的一部分。但傳統(tǒng)的檢測支撐物和裝置不是很容易地適于這種應用，因為他們受所包括的“俘獲分子”數(shù)以及信號和樣品的特性或再現(xiàn)性之間的差異限制(見美國專利US5 567 294)。另外，讀取機器也過于復雜和昂貴。
專利文件WO98/01533描述了一種可分割的信號元件，該元件包括一個有基底附著端(可以是密集盤)和信號響應端(可以連接到金屬珠粒，尤其是金珠粒)的可分割隔離物，和一個適于鍵聯(lián)到選定的分析物的第一位置上的第一側(cè)面元件以及適于鍵聯(lián)到選定的分析物的第二位置上的第二側(cè)面元件。
但是，這種復雜并昂貴的檢測方法和裝置在各種復雜的分析中會呈現(xiàn)各種假陽性或假陰性，這會對可分割的信號元件引起各種干擾。
本發(fā)明涉及一種如權(quán)利要求中所述的檢測和/或量化目標分子的方法。
本發(fā)明還涉及一種如權(quán)利要求中所述的在其表面固定不可分割的俘獲分子的盤，此盤可用在根據(jù)本發(fā)明的檢測和/或量化方法中。
本發(fā)明的另一個方面涉及上述盤的制備方法，包括上述盤的診斷工具，包括上述盤的診斷和讀取裝置或能夠讀取并分析出現(xiàn)在本發(fā)明的盤上的數(shù)據(jù)的診斷和讀取裝置。
“盤”的技術(shù)特點“盤”一詞意指一種平面固體支撐物(通常以盤的形式)，它包括一個孔，盤能繞位于孔中心的軸(A)旋轉(zhuǎn)，由包括一個或多個聚合物層的剛性材料制造并可被一層或多層(如金屬或鋁薄層)覆蓋，從而能夠穿透或反射光束，尤其是激光束，此光束用于檢測并讀取盤上預存儲的數(shù)據(jù)(見

圖1)。
制備上述聚合物和金屬層的結(jié)構(gòu)以便使得激光束只能透射和反射選定的層。例如，該盤包括一個允許透射激光束的上層，而激光束只被較內(nèi)部的第二金屬層反射。
“盤”的定義包括任何固體支撐物，如CD或包括可由CD讀取裝置讀取(通過激光束的透射和反射)的數(shù)據(jù)的DVD。
“可由CD讀取裝置讀取的數(shù)據(jù)”指寄存的數(shù)據(jù)(即關(guān)于固體支撐物特定區(qū)域的俘獲分子的特性)或用于作為目標和俘獲分子鍵聯(lián)結(jié)果的信號的處理的數(shù)據(jù)。
這種密集盤的一個或多個區(qū)用于以標準的讀取/寫入數(shù)字技術(shù)進行的數(shù)據(jù)處理(CD軌道；見圖3至5和7)。用于處理和分析的特定數(shù)據(jù)利用數(shù)字記錄裝置記錄在密集盤上。在另外的優(yōu)選實施例中，盤上的只讀存儲器(ROM)包括密集盤信息，指令，試驗協(xié)議，可由操作盤的用戶訪問的數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計方法以及俘獲分子和目標分子之間的鍵聯(lián)位置和結(jié)果的記錄。
另外，該盤可以包含電子電路，包含用于盤函數(shù)坐標的微處理器和聯(lián)系盤操縱和/或讀取裝置或其他裝置通訊的裝置。盤最好包括檢測器和傳感器，或這些裝置的元件以及各種檢測電路的能量源(如向電化學系統(tǒng)供電的電源，用于頻譜系統(tǒng)的電磁輻射源)，或便于利用這些檢測器、傳感器、驅(qū)動器產(chǎn)生數(shù)據(jù)和操縱的材料，如光學透明材料，利用電磁(激光、紅外廣、射頻、微波)、電或其他裝置間接進行盤與播放/讀取裝置的通訊和數(shù)據(jù)處理裝置；設計用于控制盤上的程序和處理的電路，控制包括系統(tǒng)診斷、樣品記錄和樣品數(shù)據(jù)的分析。這些以只在制造時被編程的ASICs或ROM，F(xiàn)GPA’sEPROM閃速存儲器(UV可除去的EPROM)或可編程的IC陣列、或類似的可由用戶通過平臺操作裝置或其他裝置編程的陣列的形式設置。包含在本發(fā)明組件中的還有CPU和微處理器單元，以及用匯編語言或通過盤通訊的可編程的高級語言工作的相關(guān)的RAM，和間接與其他裝置通訊的組件，包括與遠程顯示器或數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)連通的傳真/調(diào)制解調(diào)器。
根據(jù)本發(fā)明的盤的一個優(yōu)越的方面在于嵌入盤材料中的預寄存數(shù)據(jù)圖案的顯微陣列的密度。這是一種利用激光束檢測反射盤表面壓痕的光學存儲。把數(shù)據(jù)壓縮成微小的程度并將其精確地讀出的這種能力給予本發(fā)明的盤一種確定的特性和儲存大量數(shù)據(jù)的能力(對于視頻數(shù)據(jù)，一個密集盤的儲存量大約為650MB的數(shù)據(jù))。
根據(jù)本發(fā)明的盤適于將各種激光束透射和反射到不同的聚合物或金屬層上。
例如，用于發(fā)射激光束和反射激光束的lecture的激光器可以優(yōu)越地包括設置在盤和光度計之間的全息光柵。
盤一般的厚度為1.2mm，直徑為4.72英寸，但也存在更小的支撐體并適于特殊的應用(如把俘獲分子和目標分子之間的鍵聯(lián)放入到陪氏培養(yǎng)皿)，并且盤的厚度可根據(jù)本發(fā)明使用的檢測方法和俘獲分子的技術(shù)需要而定。
盤可以結(jié)合到凹槽中由激光束進行l(wèi)ecture。在上述凹槽中結(jié)合“寄存”數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)之后可以被解析并有利地轉(zhuǎn)變成數(shù)字數(shù)據(jù)。上述的寄存數(shù)據(jù)最好是二進制信息的形式。這些凹槽也最好包括固定的非分割的俘獲分子。
通過其密集和窄小的聚焦光束，激光器提供一種在迅速旋轉(zhuǎn)的盤表面進行上千條細小壓痕的信息的檢測和寄存的方法。所述檢測方法不產(chǎn)生摩擦，因為檢測是基于反射光中的相移的測量。此技術(shù)允許檢測相當?shù)臄?shù)據(jù)壓縮，因為仔細聚焦的激光束能夠以光速對盤表面的極細微的變化進行響應。
從典型的自然光源或人工光源中發(fā)出的光包括甚至當光子從同樣頻率的光束中產(chǎn)生時以隨機波圖案移動的光子。這類光束被認做非相干光，意味著光波在所有的方向上傳播。相比之下，與激光有關(guān)的光是優(yōu)秀的相干光。
當能源進入激活介質(zhì)中時產(chǎn)生激光束。位于激活介質(zhì)每個側(cè)面上的一對反射鏡用于引導撞擊到它的一部分輻射。激活介質(zhì)可由氣體混合物(如氦和氖)或晶體中的離子(如在典型地用于密集盤驅(qū)動和記錄器中的砷化鎵激光器中發(fā)現(xiàn)的)。用于激勵光的材料和能源決定產(chǎn)生的光束的強度和密度。用在CD設備中的激光器通常的功率非常低。
CD驅(qū)動激光射向旋轉(zhuǎn)盤，反射光穿過透鏡并照射到光電二極管(見圖3至圖5)。盤表面上的數(shù)據(jù)以凹點(盤中的凹痕)和平臺(盤的表面)或盤軌道的形式被編碼。
耦接到光電二極管的邏輯計時電路可以寄存光傳播的距離(光入射到盤表面)和光傳播的距離(光入射到盤表面的凹痕)之差。該差值備檢測為光束的相位差。
至于所有的數(shù)字編碼信息，由連續(xù)的凹點和平臺構(gòu)成的圖案-----被光電二極管轉(zhuǎn)換為1和0的電子串-----能夠代表更多復雜的模擬等價物，比如對于當前的情形，目標分子和俘獲分子之間的鍵聯(lián)水平。這些出現(xiàn)在本發(fā)明盤表面上的凹點表示的信息是“俘獲分子”和“目標分子”之間鍵聯(lián)的結(jié)果。
在其表面固定了俘獲分子的盤可包括一個由有機化合物制成的保護層，該保護層能夠或提高對俘獲分子的保護和穩(wěn)定性，俘獲分子例如是一個蛋白質(zhì)的和/或糖類化合物制成的層，如白蛋白、雙糖(如海藻糖等)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員把這一層的成分用于特殊的俘獲分子。如果需要，可采用這些成分，以使激光束毫無困難地讀遍上述層并檢測目標分子和俘獲分子之間的鍵聯(lián)或鍵聯(lián)的結(jié)果。如果需要，在俘獲分子和目標分子的鍵聯(lián)之前或之后可以省去上述層。
為了只通過盤上的一系列凹點進行成功地通訊，需要計算機處理和一些已可得到的高技術(shù)手段。激光器讀取機構(gòu)沒有一個點觸擊到盤表面；所有的數(shù)據(jù)最好通過激光的反射傳輸。在標準的音頻CD中，當激光束被平臺反射時需要花費一定的時間返回，但如果被凹點收到并反射，則需要更長的傳播時間。凹點的深度被加工成激光波長的1/4。如果從凹點反射的光束取消了來自平臺的光束，則可獲得信號傳遞。信號傳遞(通過信號的開始和結(jié)束發(fā)出信號)表示二進制1。如果沒有信號傳遞，則表示二進制0。
市場上CD驅(qū)動器的一個特點在于讀取這些凹點并以900Kb/sec的速度輸送數(shù)據(jù)，使得這種激光反射器技術(shù)特別適合于讀取的不僅是寄存的凹點，而且是鍵聯(lián)的結(jié)果。
為了在讀取數(shù)據(jù)圖案時保持同步，CD驅(qū)動器利用通常在硬盤驅(qū)動器中存在的自計時機構(gòu)，也被稱作運行長度限定(Run LengthLimited)。因為數(shù)據(jù)存在于螺紋軌道上的有限分區(qū)中，每個數(shù)據(jù)分區(qū)延伸大約300nm，所以CD微控制器可通過使盤的旋轉(zhuǎn)速度和轉(zhuǎn)換的發(fā)生同步而產(chǎn)生規(guī)律的時鐘信號。雖然很多形式的數(shù)據(jù)存儲器使用8位序列儲存數(shù)據(jù)字節(jié)，但標準的CD需要14位圖案來避免產(chǎn)生將阻礙存儲數(shù)據(jù)解碼的1和0的合并。存儲器的這種改變的形式稱作EFM(八-十四調(diào)制)。稱作合并位的附加的3位用作14位部分之間的分隔器，造成一個17位的圖案表示數(shù)據(jù)的單個8位字節(jié)。
數(shù)據(jù)在位水平的另一種重要的劃分是幀，它包括588位。幀包含一個位集它們中的一些表示數(shù)據(jù)，另一些使得激光能夠與盤的旋轉(zhuǎn)同步，還有一些對CD設備中的誤差校準功能有用。這個位集中只有24個17位單元(408位全部)可以轉(zhuǎn)換成8位字節(jié)。需要很多附加位輸送包含在兩打數(shù)據(jù)字節(jié)中的信息。
根據(jù)本發(fā)明的盤可以是任意一種“外部”形狀的形式。如上所述，上述盤的形式最好是圓形或橢圓，但它外部的形式也可以是六角形、八角形，或是能夠使盤沿中心軸(A)旋轉(zhuǎn)的正方形或三角形。
根據(jù)本發(fā)明的盤可對應于CD-ROM XA、CD-DVD、音頻CD、CD-ROM、CD-I、可記錄的CD和光電或視頻CD(CD-ROM和CD-I橋)標準。根據(jù)數(shù)據(jù)存儲器的類型、精確度以及信息量，上述CD標準可以不同。
根據(jù)本發(fā)明的盤的特定區(qū)域可用于讀出作為目標分子和俘獲分子鍵聯(lián)結(jié)果的反應。這些特定的區(qū)域是本發(fā)明盤表面的一部分，或是第二種材料固定其上的盤的一個區(qū)域，它的表面上包括俘獲分子。這些區(qū)域可以是盤中的一個空隙。第二種材料是一條塑料帶，其上已進行了目標分子和俘獲分子的鍵聯(lián)，并且之后為了特定的讀取而固定到盤上。
優(yōu)越之處在于每個帶可以負載幾種不同的俘獲分子，這些俘獲分子將與待分析的相同的或不同的樣品發(fā)生特定的反應。之后，可以分別地或同時地讀出同一盤上的信號。一個傳統(tǒng)的盤，如密集盤，可以處理這種帶在20條以上。
最利于制造和操作本發(fā)明密集盤的優(yōu)選實施例具有在一個或多個預存格式之內(nèi)的尺度-3寸密集盤(CD)，具有大約3.8cm的半徑和1mm的厚度；-5寸CD，具有大約6cm的半徑和1mm的厚度；-8寸CDV(市場上稱為“激光視盤”)，具有10cm的半徑和2mm的厚度；和-12寸CDＶ盤，具有15cm的半徑和2mm的厚度。
存儲在磁帶上的數(shù)據(jù)壽命是6到12年。對可記錄密集盤壽命的估算通常提議一個百年的存儲數(shù)據(jù)。
根據(jù)本發(fā)明的特定盤的壽命較短，并且通常受金屬撞擊和固定在固體表面的俘獲分子變性的限制。儲存在CD中的數(shù)據(jù)可以以硬盤驅(qū)動器的熟悉的同心圓環(huán)(稱作軌道)或類似過去唱片的連續(xù)螺紋的形式存在。
密集盤的一個特點以及它的編碼信息是尋軌系統(tǒng)。在市場上可得到的CD記錄機中存在不同的系統(tǒng)，以便控制其中在盤的徑向上光學讀取器的運動，并搜索存在于CD上的高達20000條不同徑向軌道中的一條。上述技術(shù)很適于讀取作為目標分子和俘獲分子之間鍵聯(lián)結(jié)果的信號。信號的讀取和預寄存信息的讀取可以由同一裝置執(zhí)行，也可以由兩個不同的讀取裝置執(zhí)行，可以是相同的激光束讀取裝置或兩種激光束讀取裝置。
徑向?qū)ぼ壍男Ｕ?通過光束識別俘獲分子上的鍵聯(lián))利用特殊的系統(tǒng)執(zhí)行，如同出版物《CD-ROM手冊》(Chris ShermanEditor，Intertext Publication，McGraw Hill Inc.)第二版中所述。為了定位激光器的讀取頭，CD驅(qū)動器還采用特殊的裝置伺服機構(gòu)。
最好盤在由塑料、硅、石英、金屬或陶瓷和/或微通道制成的平臺上組合微制作機構(gòu)和/或光學控制元件，如WO97/21090中所述。為了本發(fā)明的目的，“微制作”指能夠在亞微米尺度上產(chǎn)生這些結(jié)構(gòu)的方法。這些方法包括但不局限于那些為本領(lǐng)域技術(shù)任意所熟悉的光刻、蝕刻、膠黏或其它毫微或微技術(shù)方法。
在下列的公開物中給出了關(guān)于CD固體支撐物的另外描述CD－ROM手冊(第二版)(Chris Sherman Editor，IntertextPublication，McGraw-Hill Inc.)，完全可記錄的CD指南(Lee Purcell&David Martin，Sybex Editions)，數(shù)字視盤和密集盤技術(shù)(第二版)(Luc Bart，Luc Theunissen and Guido Vergult，Sony Service CenterEurope，ED.BH Newnes)。
“目標”分子和“俘獲”分子“目標”分子和“俘獲”分子可以是任意一種生物和化學化合物，彼此之間可以產(chǎn)生鍵聯(lián)(或凝固)，鍵聯(lián)或鍵聯(lián)的結(jié)果可由讀取裝置檢測，最好利用光束尤其是激光束檢測。
最好目標分子存在于從包含血液、尿、腦脊髓液、血漿、唾液、精液、羊水、空氣、水、土壤或分解的生物物質(zhì)等組合物中選取的一種樣品中。
上述“目標分子”和不可分割的“俘獲分子”最好是從包含核酸、抗體、糖類、脂類、縮氨酸、蛋白質(zhì)、植物血凝素、催化劑、受體、受體的興奮劑或抗興奮劑、熒光團、色基、螯合物、半抗原、離子、具有不同手性結(jié)構(gòu)的分子、由組合化學或其它功能化的宏觀結(jié)構(gòu)獲得的新合成的化學大分子、部分或其組合等等一組物質(zhì)中選擇的合成或自然分子。
“不可分割的俘獲分子”是指那些不包括和不需要一種可分割間隔的分子，能夠或允許進行對目標分子和俘獲分子之間鍵聯(lián)的檢測，如專利文件WO98/01533中所述。根據(jù)本發(fā)明，目標分子和俘獲分子之間簡單的鍵聯(lián)之后能形成先前不存在的并且可由利用光束尤其是激光束的讀取裝置直接或非直接檢測的信號，無需俘獲分子的任何特定的分割。
為了獲得對目標分子的監(jiān)測、研究和病理的、治療的、毒性的特征行為和/或其它改進的特點，最好對根據(jù)本發(fā)明的目標分子或不可分割的俘獲分子進行檢測和/或量化。
抗原/抗體鍵聯(lián)使得能夠進行抗原或抗體檢測并用于根據(jù)RIA或ELISA檢測法的診斷測試。配位體/受體主要在藥理學研究以篩選新分子(興奮劑、抗興奮劑或受體的反興奮劑)方面得以開發(fā)。通過對大量基因序列了解的增多以及放大、雜交、分離和提純技術(shù)的提高，核苷酸序列的檢測也已得到高度發(fā)展(如見J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Molecular cloninglaboratorymanual，2nd Ed.Cold Spring，Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，1989)。
關(guān)于核苷酸序列的第一種通行的檢測和放大法包括聚合酶鏈鍵聯(lián)(PCR)(US Patent 4，683，195和4，683，202)或其它的放大，如連接酶鏈鍵聯(lián)(LCR)(Wu and Wallace，1989，Genomics 4560-569)，基于放大系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄(Kwohetal.1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，861173-1177)或循環(huán)探子鍵聯(lián)(CPR)(Duck et al.，1990，Biotechniques 9142-147和美國專利US5，011，769)。
核苷酸序列在俘獲探子上雜交(或通過單個的或夾層雜交)之后通過上述檢測和/或量化信號可獲得核苷酸序列的檢測、量化和記錄，并帶有給出檢測信號的其中一個序列的標志以及可由本發(fā)明的讀取裝置記錄的變化。
對DNA序列可以有多種檢測方法(通過它自身在260nm處的吸收或通過它在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡存在時的熒光探測)。利用結(jié)合到核苷酸序列中的輻射標簽32p能夠使探測變得敏感，但由于更加嚴格的安全限制立法的要求，在常規(guī)檢驗時不主張這樣。
另外，核苷酸序列可以通過分子(例如，可直接探測到的熒光素、若丹明、釕或鑭系螯合物)加標簽或以鍵聯(lián)酶配對的形式加標簽。通過利用生物素或半抗原和配對酶給抗生蛋白鏈菌素或?qū)目贵w加標簽。優(yōu)越的是根據(jù)本發(fā)明的鍵聯(lián)產(chǎn)物可獲得不通的信號。例如，利用TMB(N-四甲聯(lián)苯胺)或5溴基-4氯-3-吲哚-磷酸鹽作為基底，過氧化物酶和堿性磷酸酶可給出一種彩色物質(zhì)。利用魯米諾或AMPPD(3-(2，-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4(3’-磷酸氧基)1，2二氧乙烷)作為基底可得到發(fā)光。
DAB(二氨基聯(lián)苯胺)通過過氧物酶催化鍵聯(lián)的氧化之后可以轉(zhuǎn)變成不可溶物質(zhì)。丙酮酸激酶也可用于由熒光素酶轉(zhuǎn)變的ATP產(chǎn)物，以獲得探測光(生物發(fā)光探測法)。
類似于等離子體基元表面共振或光學波導的新技術(shù)可用于無標簽目標分子鍵聯(lián)以及隨后的的鍵聯(lián)運動(Gotoh and all.1995，DNARes.2285-293，StimPson等1995年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，6379-6383)。
密集盤表面上不可分割的俘獲分子的固定不可分割的俘獲分子最好以特定的間隔固定在CD上，以便可由光束探測裝置或其他裝置在每種鍵聯(lián)之間進行特定的識別，而其中鍵聯(lián)是在特定的不可分割的俘獲分子與其目標分子之間發(fā)生。為了特定的探測，俘獲分子最好位于不包括任何凹槽或預寄存信息的盤的特定區(qū)域，從而避免任何關(guān)于預寄存信息信號所導致的錯誤正片。
密集盤外表面上不可分割的俘獲分子的位置可利用培育的微刻和/或微電機技術(shù)通過傳統(tǒng)的物理方法尋址，把不可分割的俘獲分子保持在將要被固定的特定位置上。另一種方法通過利用光可催化的化學基團得到，能夠把不可分割的俘獲分子固定到特殊處理的位置上，如外表面的用光束或選擇的離子束或選擇的等離子體處理的一部分上(見專利文獻WO96/15223)。
本發(fā)明密集盤的外表面還包含能使盤被基于激光的CD讀取器讀出的數(shù)據(jù)(信息通常儲存成位于盤凹槽中的一系列凹點，并且需要把不可分割的俘獲分子放置在盤的表面)。這可通過被占用的凹點的出現(xiàn)或等同于盤凹槽中凹點的伸出的壓痕而獲得。表面上不可分割的俘獲分子的地址(定位)最好利用這些數(shù)據(jù)，并如果用相同的激光源讀取CD信息，利用作為整個裝置一部分的激光束得到。
利用基于共價或非共價鍵聯(lián)的傳統(tǒng)的方法獲得不可分割的俘獲分子在盤上的固定。優(yōu)選實施例是在分子一個末端的共價固定，它能夠使存在于表面上的不可分割的俘獲分子穩(wěn)定的固定并勻質(zhì)以與目標分子鍵聯(lián)。
光敏化學基團類似可固定在任何一個分子末端的疊氨基-硝苯基，利用類似磺基瑚鉑酸酯6-(4’-疊氮基-2’-硝基苯胺己酸(Pierce，Rockford，IL，USA)的異二官能劑承載。這種光敏基團只在光照如激光照射的地方反應(Dontha，N.等1997年，Anal.Chem.692619-2625)，并且通過這種方式，特殊探子的固定可以在盤上更好的實施。其他的化學固定存在于類似通過二亞胺碳或熱聚物中的吸收而在胺上核苷酸的5’-磷酸鹽端基固定。聚合表面可以羧化和氨化，以便能夠通過有機化學物質(zhì)中的公知鍵聯(lián)而固定大多數(shù)生物分子(Zammatteo等1996年，Anal.Biochem.23685-94)。
對俘獲探子物理定位的一種特別的方法是從盤的旋轉(zhuǎn)中產(chǎn)生向心力。液體經(jīng)出口凹點發(fā)出進入該盤，然后位通道護運直到鍵聯(lián)腔室(見國際專利申請WO97/21090)。
不可分割的“俘獲分子”和“目標分子”之間的鍵聯(lián)目標分子在其不可分割的俘獲分子上的鍵聯(lián)在標準的并且可再現(xiàn)的條件下獲得，這兩個條件對于核苷酸雜交(雜交最好在標準精確的條件下進行，如Sambrook等$$9.31-9.58在《MoleculaCloning》A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York(1989))公知，對于抗原/抗體鍵聯(lián)，對于受體/配位體鍵聯(lián)或其他分子間如蛋白/核苷酸或化學的/化學分子的識別公知。
上述分子最好包括(通過自然地或變形)一種化學官能團(伯胺，琉基，醛醇縮合等)，一種公共序列(核酸)，一種抗原決定基(抗體)，一種興奮劑或配位基以便能夠鍵聯(lián)。
目標分子與其不可分割的俘獲分子之間的鍵聯(lián)可依據(jù)分子的特定親和力，依據(jù)每個分子的變構(gòu)特性，依據(jù)他們的電離環(huán)境，依據(jù)分子的電離電荷以及目標分子與其不可分割的目標分子之間的共價反應。上述條件最好是一種已經(jīng)在文獻中對鍵聯(lián)的每種類型做過描述的一種，并能夠為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所使用以便避免正的或負的錯誤探測。
可讀出上述鍵聯(lián)的光學探測系統(tǒng)最好包括一個光電二極管，能夠探測小的光束并根據(jù)一個方向軸移動，從而覆蓋盤的半徑(見圖4)。與盤旋轉(zhuǎn)相結(jié)合，聚焦的光電探測器掃描盤的整個表面并檢定存在于盤上任何位置的目標分子。優(yōu)選的探測裝置是市場上可得到的用于音樂、視頻或軟盤CD的CD讀取器的光電二極管(見圖5)。
可以伺服控制光電系統(tǒng)以便停留在對探測面的聚焦。如果提供一個第二光學探測系統(tǒng)用于探測信號，則業(yè)可以伺服控制或連接到另一個上進行控制，或者也可以接收來自第一個數(shù)據(jù)的信號以調(diào)節(jié)對盤的聚焦及尋軌。從盤表面上的連續(xù)讀出而接收到的數(shù)據(jù)可以儲存在計算機中，如果需要再重新格式化并分析一確定光點位置。
一旦目標分子與其不可分割的俘獲分子之間的鍵聯(lián)能夠形成一個光度信號，即可獲得光度信號。鍵聯(lián)(目標分子與其不可分割的俘獲分子之間的鍵聯(lián))的探測和/或量化基于利用激光束反射變化的CD二進制探測系統(tǒng)的原理。當在一個凹槽中探測到一個凹點時，可獲得激光反射的擾動。
根據(jù)本發(fā)明的第一實施例，上述凹點是目標分子和不可分割的俘獲分子之間鍵聯(lián)結(jié)果的一個沉淀物。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例，通過對密集盤的一層或幾層的誘蝕也可得到激光反射的擾動。例如，目標分子和不可分割的俘獲分子之間的鍵聯(lián)會引起該層有限的改動，在該層中形成一個壓痕(見圖3)。層中的這種壓痕通常稱作“筑堤”或“凸起”，但也統(tǒng)一為負凹點(見文獻《Recordable CD Guide》，Lee Purcell&DavidMartin，Sybex Editions)。這些擾動將由激光束作為不同于平地的凹點探測。目標分子和不可分割的俘獲分子之間的鍵聯(lián)也可以通過當只發(fā)生鍵聯(lián)時而得到的光發(fā)射探測并量化。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例，目標分子和不可分割的俘獲分子之間的鍵聯(lián)能夠使通過化學、生物、熒光燈和/或電致發(fā)光系統(tǒng)產(chǎn)生光發(fā)射，或產(chǎn)生可被特定的讀取裝置7探測的磁和/或電場的一種或其它的分子固定(見圖1和圖4)。
這些系統(tǒng)可基于能夠或增強光發(fā)射和光探測的特種酶(過氧化物酶、堿性磷酸酶、丙酮酸激酶等)的使用。
一旦目標分子被俘獲，就可以使用一個帶標簽的目標分子6或一個第二帶標簽的反應分子。此帶標簽的分子可以是一個鍵聯(lián)對的第一元素，如利用輔酶1或帶半抗原標志的探子的夾層雜交實驗中的核酸2，以及類似地使用帶標簽的反應分子的抗體/抗原夾層鍵聯(lián)中的核酸2。在沖洗步驟之后，輔酶1或半抗原可以與酶配位抗生蛋白鏈菌素或被認做鍵聯(lián)對的第二元素的抗體。可以使用諸如過氧化物酶、堿性磷酸酶、丙酮酸激酶或其它脫氫酶的酶。
要得到不可溶的產(chǎn)物，須為酶選擇特殊的基底。例如，氧化物酶存在時DAB可以被氧化并形成一種不可溶的產(chǎn)物。這種產(chǎn)物沉淀在不可分割的俘獲分子上，并且沉淀將在盤被(激)光照射的盤面上形成把子或凸起。當照射沉淀時反射光強度變低并可得到反射的擾動。通過光敏探測裝置把擾動分解成盤表面上的凹點。
如果通過透過盤的透明部分探測，則集塵的呈現(xiàn)則表示一種可以計算的吸收。
當使用膠態(tài)金屬光金時可獲得另一種不可溶物質(zhì)，例如鍵聯(lián)到抗生蛋白鏈菌素3。當?shù)玫芥I聯(lián)時膠態(tài)金催化銀(Ag)4還原成Ag集塵。與通常存在于盤5中的金或鋁層相比，銀沉淀也可以減少(激)光反射，并且如果沒有其它的金屬存在，也反射一些光。這種不透光的集塵也可以通過在盤的透射實驗中光的吸收探測(見圖2和圖6)。
還可以使用承載鍵聯(lián)分子(第二鍵聯(lián)對)的微粒，其中此鍵聯(lián)分子可以識別連接到目標分子的第一鍵聯(lián)對。這些微粒將位于獲得目標分子及其不可分割的俘獲分子鍵聯(lián)處的盤的表面。這些微粒將衍射激光束并產(chǎn)生激光束反射的擾動。這些反射中的擾動將由光敏探測器探測并分解成盤表面上的凹點。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，通過給目標分子(帶有一個熒光分子)貼標簽而得到探測。激光束將掃描密集盤的表面并分解記錄的熒光?？梢垣@得很多與目標分子相關(guān)的熒光分子，如熒光素、藻紅素、諾丹明或鑭系螯合物，這些很容易被貼到核酸、抗體或微粒上作標簽以用于直接或間接地標識目標分子。
記錄的信號既可以作為一個二進制信號也可以作為一個吸收值讀出。二進制信號作為一個電子計算機數(shù)據(jù)被快速處理并被適當?shù)能浖治?。該軟件將把此信息轉(zhuǎn)換成能夠分析獲得的探測結(jié)構(gòu)并量化目標分子及其不可分割的俘獲分子之間的鍵聯(lián)。
根據(jù)本發(fā)明的盤最好包括附加的凹點，凹點最好處于鄰近不可分割的俘獲分子的凹槽中，它給出關(guān)于上述鄰近的不可分割的俘獲分子的類型、數(shù)量和特性的信息。
根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施例，本發(fā)明的盤承載一個固定的低聚核苷酸俘獲探子，從而能夠?qū)ο嗤腆w支撐物上(根據(jù)本發(fā)明的盤的表面)的核苷酸序列進行探測、放大和可能的量化。在另一種執(zhí)行形式中，盤包括固定的PCR底層，以便得到放大的產(chǎn)物以及放大物在盤外表面上的固定，因而能夠?qū)ζ溥M行探測(根據(jù)Rasmussen等于1991年在Anal.Biochem.198138-205所描述的方法)。
根據(jù)本發(fā)明的盤用于診斷工具，用于通過關(guān)于化學或生物化合物的前期處理能夠自動地講解化學或生物化合物樣品制備的診斷和讀取裝置(如核苷酸序列的基于放大)。
上述裝置最好是一種合并多個步驟或分步驟于一個集成系統(tǒng)如自動核酸診斷系統(tǒng)的系統(tǒng)，能夠在一種樣品中執(zhí)行提純核酸序列、進行可能的放大、診斷以及可能的量化的步驟。
以下列非限定性的實例對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行描述。
例1CD上的探測本實驗的目的在于通過直接在CD支撐物邊界的俘獲探子上進行雜交而探測特定的DNA。探測通過比色而實現(xiàn)。俘獲探子限制在氨化聚碳酸酯CD上，然后對補足的生物素DNA進行雜交，并用抗生蛋白鏈菌素-過氧化酶進行正向雜交。
1.聚碳酸酯CD的氨化CD首先通過在室溫下1N的NaOH溶液中培育30分鐘而羧化。用水沖洗3分鐘后，羧化的CD在包含1mg/ml二亞胺碳水溶液和1mM的N-美塞卜朗1-3二胺的0.1M、PH值為6的MES緩沖液中室溫下培育2小時。在PH值為6的0.1M的MES緩沖液中沖洗3次并用水沖洗3次后，用37℃的溫度對氨化CDs干燥30分鐘。
2.俘獲探子在氨化CD上的固定制備兩種溶液，一種包含CMV俘獲探子，另一種包含HIV俘獲探子。這些溶液是PH值為7.5的0.01M的MeIM緩沖液，包含濃度為2μg/ml的變性DNA俘獲探子(CMV或HIV)和濃度1.6mg/ml的二亞胺碳。
3×20μl的這種溶液標在兩個氨化CD上，并在潮濕的環(huán)境下在50℃下對這些CD培育5小時。用0.4N的NaOH+0.25％de Tween在50℃下沖洗3次5分鐘，這些CD被用水沖洗3次并在37℃下干燥30分鐘。
3.在CDs上的CMV生物素DNA的雜交兩個CD在0.2N的NaOH中培育5分鐘用于對俘獲探子變性，然后用PH值7.5的帶有0.15M的NaCL的馬來酸0.1M沖洗。然后在包含變性的DNA的100μg/ml橙紅色精液、SSC 4X、黃蠟煤5X和變性的CMV生物素DNA的濃度為70ng/ml、溫度為2小時的雜交溶液中培育2小時。在雜交步驟之后，用包含15mM的NaCl和0.3％的Tween的0.01M的馬來酸緩沖液沖洗3次。
然后用包含0.15M的NaCl、0.1％的奶粉和1μg/ml的抗生蛋白鏈菌素-過氧化酶的0.1M的馬來酸在室溫下培育45分鐘。共軛培育之后，用包含15mM的NaCl和0.3％的Tween的0.01M的馬來酸緩沖液在室溫下沖洗3次。
4.雜交DNA的探測然后在TMB溶液(Medgenix)中培育第一CD 10分鐘。培育后的1分鐘后對此CD拍照，觀察發(fā)生正向雜交的藍色外觀(圖4)。可以得到CD透射光的吸收。
例2用微波發(fā)射探測器探測CD上的DNADNA俘獲探子標注在CD表面上并與目標DNA雜交，與例1一致。為了探測生物素雜交的DNA，用包含0.15mM的NaCl、0.1％的奶粉和1μg/ml的抗生蛋白鏈菌素-膠態(tài)金(Sigma，St-Louis，USA)的0.1M的馬來酸緩沖液在室溫下培育45分鐘。還在由相同體積的溶液A和B制成的溶液中培養(yǎng)CD 30分鐘，以便在發(fā)射正向雜交的地方有銀集塵。因銀的特性，用金層還原CD以使得激光CD播放器能夠讀出寫在CD上的信息并讀出干擾(圖2和圖)。
例3通過光吸收探測CD上的蛋白使用的CD中凹點上被局部地印刷了數(shù)據(jù)，并且這部分用金覆蓋。俘獲分子的固定在CD的周邊、直接在塑料表面進行。
1.CD的羧化第一CDs在1N的NaOH溶液中于室溫下培養(yǎng)30分鐘然后用水淋洗3次并在37℃時干燥30分鐘。
2.在CDs上抗體的固定三種不同類型的抗體固定在羧化的CD上抗牛血清清蛋白的抗體，抗熒光素的抗體(用于負控制)和抗抗生蛋白鏈菌素的抗體(用于正控制)。
三種不同溶液的20μl的PH為8.2的0.02M的NaCl的硼酸鹽緩沖液包含1mg/ml的二亞胺碳(Acros)，并且三種不同抗體的一種類型以10μg/ml在三種不同類型的CD上形成斑點。這些斑點以4℃通宵培養(yǎng)，然后用包含0.1％的酷蛋白0.1M且PH為9.2的甘氨酸緩沖液淋洗10分鐘，然后用包含0.1％的非離子活性劑0.1M且PH為9.2的甘氨酸緩沖液淋洗兩次5分鐘，最后用0.1M且PH為9.2的甘氨酸緩沖液淋洗兩次。CDs在30分鐘內(nèi)以37℃干燥。
3.通過ELISA技術(shù)在CD上檢測抗牛血清清蛋白CDs在室溫下用三種固化在表面上的抗體和包含0.1％的酷蛋白以PBS的10μg/ml的血清清蛋白溶液培養(yǎng)。并且培養(yǎng)90分鐘。CDs用0.1％的非離子活性劑20淋洗3次，然后用0.1％酷蛋白的抗血清清蛋白的生物素抗體以PBS20μg/ml培養(yǎng)45分鐘。然后用包含PBS0.1％的非離子活性劑20淋洗3次，再后CDs在包含PBS0.1％的酷蛋白溶液或1μg/ml的抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶中培養(yǎng)45分鐘。CDs用包含PBS0.1％的非離子活性劑20淋洗3次。為了檢測，抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶被固化的CD處以TMB溶液培養(yǎng)并在2、4和6分鐘后用照相機照相以觀察在抗BAS和抗抗生蛋白鏈菌素的抗體斑點處有蘭色出現(xiàn)。
試驗4用激光探測器探測CD上蛋白質(zhì)已在試驗3中證實清蛋白在CD表面上形成斑點并與抗體反應。成對用于與生物素抗體抗反應的是抗生蛋白鏈菌素-金。它在包含PBS0.1％的酷蛋白溶液以濃度1μg/ml培養(yǎng)45分鐘。抗生蛋白鏈菌素-金用于銀還原的中心?！般y增強”(Sigma)在室溫下使用15分鐘?？稍诳笲SA和抗抗生蛋白鏈菌素的抗體斑點處見到銀沉淀。由于沉淀和直徑大約為1μm沉淀的尺寸，故可觀測到光吸收的變化?？砂l(fā)現(xiàn)凹點被激光束反射(圖5)。
試驗5在CD上磁探測DNA或蛋白質(zhì)在CD機座上探測混雜DNA或蛋白質(zhì)可通過磁過程探測。粘合在DNA或抗體上的生物素可認為與鐵流質(zhì)(Immunicon，HungtintonValley，PA，美國)結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素。根據(jù)鐵流質(zhì)的亞鐵原子核大小，此配對為磁性或順磁的，并且可在磁場中探測到(圖7)。
權(quán)利要求
1．一種在樣品、尤其在生物樣品中探測和/或量化目標分子的存在的方法，包括步驟--允許所述目標分子與固定在固體支撐物表面的俘獲分子之間的鍵聯(lián)，該固定支撐物是一個包括寄存數(shù)據(jù)的盤，鍵聯(lián)導致一個信號，--利用通過俘獲分子的分割不能獲得上述信號這一附帶條件對上述信號進行探測和/或量化。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于俘獲分子和目標分子是核苷酸分子。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于俘獲分子和目標分子分別是抗原或抗體。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于俘獲分子和目標分子分別是受體或受體的配位體。
5．如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于通過光束，尤其是激光束或電磁場的變化的反射、吸收或衍射得到信號的探測和/或量化。
6．如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于在由光束激發(fā)結(jié)合的目標分子和俘獲之后，通過熒光發(fā)射得到信號的探測和/或量化。
7．如前述權(quán)利要求1至4的任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于通過光束、輻射或磁場的直接發(fā)射得到信號的探測和/或量化，其中光束、輻射或磁場的直接發(fā)射是目標分子及其俘獲分子之間鍵聯(lián)的結(jié)果。
8．如前述6或7的所述的方法，其特征在于光束的發(fā)射通過一個選自包含具有化學、生物、熒光、輻射和/或電致發(fā)光或輻射的分子的一個組中選取的鍵聯(lián)分子產(chǎn)生。
9．如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于目標分子和俘獲分子之間的鍵聯(lián)在盤表面的一層或多層的侵蝕和/或盤的表面產(chǎn)生集塵，尤其是不透明的或磁性的集塵比如膠態(tài)金屬試劑的沉積，尤其是銀集塵。
10．如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于目標分子和不可分割的俘獲分子之間的鍵聯(lián)能夠使得用于信號探測和/或量化的一個或多個分子固定，其中信號導致于所述鍵聯(lián)。
11．如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于其它的分子是微?；虼判灶w粒。
12．如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于當盤在其軸(A)上旋轉(zhuǎn)時獲得信號。
13．如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于盤上的寄存數(shù)據(jù)是二進制數(shù)據(jù)，最好是凹槽二進制數(shù)據(jù)。
14．如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于盤是一種密集盤。
15．如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于寄存數(shù)據(jù)使得能夠處理并解釋俘獲分子和目標分子之間的鍵聯(lián)導致的信號。
16．如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于盤包括相連并且處于射流接觸的微通道。
17．一種包括寄存數(shù)據(jù)的盤，其特征在于其還包括固定在其表面的一個不可分割的俘獲分子，該分子能夠與待探測和/或量化的目標分子鍵聯(lián)。
18．如權(quán)利要求17所述的盤，其特征在于目標分子和/或不可分割的俘獲分子選自包括核酸分子、尤其是核苷酸分子序列、抗原、抗體、受體、受體的配位體、縮氨酸或蛋白分子、脂類、糖類、半抗原、熒光團、色基、催化劑、通過組合化學或其化合獲得的新大分子的組。
19．如權(quán)利要求17或18所述的盤，其特征在于盤的寄存數(shù)據(jù)是二進制數(shù)據(jù)，尤其是凹槽二進制數(shù)據(jù)。
20．如權(quán)利要求17或18所述的盤，其特征在于盤是密集盤。
21．如權(quán)利要求17至21任一所述的盤，其特征在于盤包括相連并且處于射流接觸的微通道。
22．如權(quán)利要求17至21任一所述的盤的制備方法，包括在包含預寄存數(shù)據(jù)的盤表面上通過光催化所述俘獲分子而固定不可分割的俘獲分子的步驟。
23．如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于通過俘獲分子的末端與盤表面層的共價連接而得到不可分割的俘獲分子。
24．如權(quán)利要求22或23所述的方法，其特征在于盤表面由最好是由有機化合物制成的保護層復原，能夠或增進不可分割的俘獲分子的保護和穩(wěn)定，和/或?qū)δ繕朔肿蛹捌洳豢煞指畹姆@分子之間鍵聯(lián)的保護、穩(wěn)定和/或探測。
25．一種診斷工具，包括根據(jù)權(quán)利要求17至21任何之一的盤，和能夠使得目標分子和俘獲分子鍵聯(lián)的試劑以及能夠探測作為鍵聯(lián)結(jié)果的信號的試劑。
26．一種探測和/或讀取裝置，能夠探測和/或量化信號，而該信號是樣品中出現(xiàn)的目標分子及其俘獲分子之間鍵聯(lián)的結(jié)果，它包括根據(jù)權(quán)利要求17至21任意一個的盤或根據(jù)權(quán)利要求25的工具，以及探測和/或量化上述信號的裝置。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的探測和/或讀取裝置，是一種讀取密集盤的裝置。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的探測和/或讀取裝置，其特征在于包括用于讀取盤上寄存數(shù)據(jù)的第一讀取頭和用于探測和/或量化作為目標分子及其俘獲分子之間鍵聯(lián)結(jié)果的信號的第二讀取頭。
29．根據(jù)權(quán)利要求26至28任一所述的探測和/或讀取裝置，包括用于在集成探測和/或讀取裝置內(nèi)進行目標分子的提純、目標分子的具體分割、目標分子的可能的遺傳放大的附加裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過與固定在包括寄存數(shù)據(jù)的盤表面上的不可分割的俘獲分子鍵聯(lián)來檢測和/或量化目標分子的方法。本發(fā)明還涉及一種其表面上固定有不可分割的俘獲分子的盤和該盤的制造方法,以及此盤或包括此盤的診斷和/或讀取裝置。
文檔編號B01J19/00GK1285917SQ98812804
公開日2001年2月28日 申請日期1998年12月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月30日
發(fā)明者喬斯·勒馬克勒 申請人:喬斯·勒馬克勒