本發(fā)明涉及一種pcr板、核酸提取盒及包含這些結(jié)構(gòu)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置，具體講，涉及一種能夠?qū)崟r檢測核酸提取、擴(kuò)增反應(yīng)與擴(kuò)增產(chǎn)物的pcr板、核酸提取盒及包含這些結(jié)構(gòu)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置。

背景技術(shù)：

1、無論何時何地都能夠準(zhǔn)確、快速診斷患者疾病的poc(point?of?care，即時醫(yī)療)診斷技術(shù)是精密醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)基于證據(jù)的非常重要的技術(shù)，備受關(guān)注?；诎Y狀的現(xiàn)場診斷技術(shù)是一種以咳嗽、腹瀉、高燒、生殖器異常等疾病癥狀為標(biāo)準(zhǔn)，一次性快速檢測引發(fā)疾病癥狀的所有感染病原體并確認(rèn)致因病原體，然后開具最佳抗生素和治療劑處方的技術(shù)，其作為未來精密醫(yī)學(xué)的核心新技術(shù)，目前有很多與其相關(guān)的研究正在進(jìn)一步發(fā)展。這種現(xiàn)場診斷技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于，就像現(xiàn)有用于確認(rèn)是否懷孕的驗(yàn)孕試紙，以及可以確認(rèn)血糖值的血糖儀一樣，即使不是專家也可以在現(xiàn)場進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷。目前，分子診斷技術(shù)作為未來醫(yī)學(xué)的核心技術(shù)備受關(guān)注，目前已經(jīng)開發(fā)出了可以同時檢測多種病原體的多重檢測法，利用這些技術(shù)，我們可以準(zhǔn)確掌握感染疾病的病因并開具最佳處方，盡早對疾病進(jìn)行治療，大幅縮短患者的恢復(fù)時間，從而提高醫(yī)療質(zhì)量、節(jié)約醫(yī)療費(fèi)用。

2、但是，目前的分子診斷系統(tǒng)需要三個小時以上才能確認(rèn)結(jié)果，而且還需要技術(shù)熟練的專家操作，因此，為了進(jìn)行現(xiàn)場所需的poc分子診斷，需要開發(fā)一種能夠以全自動方式執(zhí)行復(fù)雜的核酸提取過程和實(shí)時基因擴(kuò)增檢測的自動化小型裝置，并且應(yīng)當(dāng)確保非專業(yè)人員也能夠輕松操作。

3、具有代表性的分子診斷方法有利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr，polymerase?chainreaction，以下簡稱“pcr”)進(jìn)行診斷的方法。自從1985年被凱利·穆利斯發(fā)明以來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)因可以快速、輕松地對特定dna進(jìn)行擴(kuò)增而被廣泛用于分子生物學(xué)和分子診斷等方面。使用pcr/rt-pcr，可以確認(rèn)生物樣本內(nèi)是否存在特定的dna/rna，因此其多被用于診斷病毒等病原性微生物感染。隨著這種pcr/rt-pcr技術(shù)發(fā)展成為實(shí)時定量pcr(realtime?pcr、quantitative?pcr)技術(shù)，在pcr結(jié)束的同時就能知曉結(jié)果，這不僅簡化了檢測過程，大幅縮短了檢測時間，而且還可以準(zhǔn)確地確定病原體數(shù)量，因此被用作監(jiān)測人類免疫缺陷病毒(hiv)、丙型肝炎病毒(hcv)、乙型肝炎病毒(hbv)等治療效果的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法。此外，其還可以檢測與特定疾病相關(guān)的基因表達(dá)模式或基因突變，因此被用作最重要的疾病診斷技術(shù)。

4、為了執(zhí)行這種pcr，需要核酸提取步驟，即從生物樣本內(nèi)除去阻礙pcr反應(yīng)的物質(zhì)，提取純凈的核酸。核酸提取過程由多個步驟組成，在生物樣本及核酸提取操作中需要具備熟練的技術(shù)。人工操作時，可能會因操作人員的失誤造成污染等問題，因此大部分情況下都使用自動化核酸提取設(shè)備進(jìn)行分子診斷。

5、pcr反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的檢測作業(yè)需要配備實(shí)時定量pcr裝置，因此之前主要在大型醫(yī)院或?qū)I(yè)臨床檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行分子診斷。

6、最近，通過研究和開發(fā)，核酸提取、pcr反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物檢測的全過程已經(jīng)實(shí)現(xiàn)自動化，開發(fā)出了即使沒有專業(yè)技術(shù)也能輕松使用pcr的多種自動化系統(tǒng)及利用這些系統(tǒng)的設(shè)備。

7、但是，現(xiàn)有裝置存在價格過于昂貴或處理時間長，以及很難一次性同時進(jìn)行多種檢測的問題。

8、下面介紹一下pcr的基本原理，在95℃的條件下加熱dna雙螺旋結(jié)構(gòu)，使之分離成單鏈，然后將反應(yīng)溶液冷卻至退火溫度，使互補(bǔ)引物在pcr反應(yīng)溶液中待擴(kuò)增部位的兩端選擇性地配對，反復(fù)進(jìn)行dna聚合酶在各個單鏈上依次連接互補(bǔ)的a、g、t、c四種核苷三磷酸形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的反應(yīng)。該反應(yīng)是實(shí)驗(yàn)性地將pcr反應(yīng)溶液反復(fù)進(jìn)行30～45次加熱、冷卻循環(huán)(n)，使特定dna雙螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行2n幾何級數(shù)擴(kuò)增。rt-pcr反應(yīng)通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cdna后，可以通過pcr進(jìn)行擴(kuò)增，從而擴(kuò)展成一種rna檢測方法。

9、下面介紹一下為了將pcr正式應(yīng)用于分子診斷而新開發(fā)的實(shí)時定量pcr的原理，為了對利用pcr反應(yīng)而擴(kuò)增的dna進(jìn)行定量分析，將與dna量成正比產(chǎn)生熒光的物質(zhì)添加到pcr反應(yīng)液中后，測量每個循環(huán)的熒光，找到檢測出臨界熒光值的循環(huán)，由此定量測量初始目標(biāo)核酸濃度。

10、自從pcr被發(fā)明出以來，在各種應(yīng)用技術(shù)開發(fā)的過程中，有大量病原體和疾病相關(guān)基因堿基序列通過基因組計(jì)劃被發(fā)現(xiàn)，并且通過擴(kuò)增這些疾病相關(guān)dna/rna堿基序列進(jìn)行定性、定量診斷的分子診斷技術(shù)得到了快速發(fā)展。由于現(xiàn)有pcr溫度循環(huán)需要兩個小時左右的時間，因此為了能夠進(jìn)行現(xiàn)場診斷，可以更快速、準(zhǔn)確地執(zhí)行pcr的方法被不斷開發(fā)出來(lab?chip，2016，16，3866-3884)。

11、為了在短時間內(nèi)進(jìn)行pcr反應(yīng)，必須迅速改變反應(yīng)溶液的溫度。此外，為了通過精確的pcr反應(yīng)僅擴(kuò)增所需的目標(biāo)，必須將引物設(shè)計(jì)成能夠有針對性地與所需目標(biāo)結(jié)合，并應(yīng)在pcr溫度循環(huán)反應(yīng)中準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)退火溫度。

12、為此，目前已經(jīng)開發(fā)出了與以往實(shí)驗(yàn)室常用的0.2ml和0.5ml反應(yīng)器相比熱容量盡可能小、熱傳遞性盡可能好的微pcr反應(yīng)容器。由于這種微反應(yīng)器使用反應(yīng)溶液少、表面積大，因此熱傳遞速度快，可以實(shí)現(xiàn)快速加熱和冷卻。向硅晶片上大小為17x15mm、厚度為40-80um的薄反應(yīng)槽中加入10ul的pcr溶液后用玻璃板覆蓋，保持較大的表面積(>100mm2/10ul)。但是，使用現(xiàn)有的珀?duì)柼麩釅K，不能顯示一個循環(huán)將時間縮短到約3分鐘(clin.chem.40/9，1815-1818(1994))。

13、為了快速對pcr反應(yīng)器進(jìn)行熱循環(huán)，將pcr反應(yīng)器反復(fù)浸入高溫水槽和低溫水槽中的方式被開發(fā)成了早期的pcr反應(yīng)裝置。(turbo?thermalcycler.bioneer?corp.daejeon)。這種讓反應(yīng)器在不同的溫度區(qū)域進(jìn)行循環(huán)的pcr設(shè)備采用的是空間移動方式，其優(yōu)點(diǎn)是，可通過將反應(yīng)器浸入預(yù)先精確保持溫度的恒溫水槽中快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行pcr反應(yīng)。但是，由于需要多個恒溫水槽，所以設(shè)備龐大，難以維護(hù)。同時，在固定塊中利用珀?duì)柼?，隨著時間改變溫度的時差溫度循環(huán)式pcr設(shè)備目前占主導(dǎo)地位。

14、使用微流路的pcr方式還被開發(fā)成了空間移動溫度循環(huán)方式和時差溫度循環(huán)方式?？臻g移動溫度循環(huán)方式大致可以分為以fifo(first-in-first-out，先進(jìn)先出)的方式連續(xù)流動的開放型方式，以及在不同的溫度區(qū)間進(jìn)行反復(fù)移動的封閉型方式。作為開放型方式，1994年nakano等人開發(fā)出了將毛細(xì)管纏繞在具有不同溫度隔室的圓柱形塊上并讓pcr溶液連續(xù)流入其中的方式。(biosci.biotech.biochem.，58(2)，349-352，1994)。1998年，kopp等人確認(rèn)，以微流路形式反復(fù)流經(jīng)高溫和低溫區(qū)間的微流路式pcr設(shè)備使10ul溶液以4.5s的周期通過20個循環(huán)進(jìn)行pcr(science?2801046-1048，1998)。

15、本發(fā)明的背景技術(shù)在韓國公開專利公報第10-2016-0067872號(2016.06.14公開，發(fā)明名稱：一種用于執(zhí)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的分析單元、分析裝置、所述分析單元的操作方法以及所述分析單元的制造方法)中公開。

16、之前，在韓國注冊專利第10-2105558號中，公開了高速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析板。但是，如果使用公開的分析板，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中，反應(yīng)孔和反應(yīng)孔之間的擴(kuò)增產(chǎn)物可能會混合，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)精度降低。為了解決這些問題，需要一種能夠快速定量、定性分析多個目標(biāo)的改進(jìn)pcr板。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、【發(fā)明所要解決的技術(shù)問題】

2、本發(fā)明就是為解決所述問題而研發(fā)的，本發(fā)明的一個目的在于，提供一種pcr板、核酸提取盒及包含這些結(jié)構(gòu)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置，該裝置可以通過從生物樣本中提取核酸、進(jìn)行pcr反應(yīng)并掃描各種波段的激發(fā)光和相應(yīng)的熒光，以全自動方式進(jìn)行目標(biāo)核酸檢測，并且一次操作就可以檢測多個目標(biāo)，使用簡便，特別是可以在短時間內(nèi)獲得準(zhǔn)確結(jié)果。

3、本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種pcr板、核酸提取盒及包含這些結(jié)構(gòu)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置，該裝置能夠?qū)cr過程所需的溫度調(diào)節(jié)過程與熱變性過程所需的溫度進(jìn)行結(jié)合的過程中所要求的準(zhǔn)確溫度快速地反復(fù)施加到反應(yīng)目標(biāo)上，確保能夠快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行pcr，從而最大限度地提高反應(yīng)的可靠性。

4、【解決技術(shù)的方法】

5、本發(fā)明的pc板，包括：包括主體部，其配備有配備有一個以上反應(yīng)孔；插入部，其從所述主體部延長，插入到核酸提取盒中，配備有配備有注入核酸溶液的注入口；流路流路部，其可以使所述核酸溶液從所述注入口流動到所述反應(yīng)孔；阻斷部，其安裝于所述主體部上，阻斷所述核酸溶液從所述反應(yīng)孔向所述流路流路部逆流。

6、在本發(fā)明中，所述主體部，包括：主體框架部，其配備有配備有一個以上所述反應(yīng)孔；容納部阻斷容納部，其凹陷形成于所述主體框架部上，容納所述阻斷部；連接流路流路部，其將所述阻斷容納部與所述反應(yīng)孔連接起來；存儲部，其凹陷形成于所述主體部上，與所述流路流路部連通，用于供應(yīng)容納所述核酸溶液；流路流路引導(dǎo)部，其與所述存儲部連通，用于引導(dǎo)所述核酸溶液向所述阻斷部一側(cè)流動。

7、在本發(fā)明中，所述連接流路流路部可以配備配備有從所述阻斷部向所述反應(yīng)孔側(cè)形成的狹窄的瓶頸部。

8、在本發(fā)明中，所述容納部阻斷容納部被沿著所述存儲部長度方向形成的隔斷部分分割成多個，且所述阻斷部可以安裝在被分割的各個容納部阻斷容納部上。

9、在本發(fā)明中，所述阻斷部的組成包括彈性變形材料。

10、在本發(fā)明中，所述主體部包括：主體框架部，配備有一個或多個反應(yīng)孔；圓形容納部阻斷容納部，在所述主體框架部形成凹形并與各個反應(yīng)孔相對應(yīng)地布置，用于容納所述圓形阻斷部；以及連接流路流路部，用于連接所述容納部阻斷容納部和所述反應(yīng)孔。

11、在本發(fā)明中，所述阻斷部可以由包含能夠產(chǎn)生彈性變形材料在內(nèi)的材質(zhì)構(gòu)成。

12、在本發(fā)明中，所述反應(yīng)孔上可以通過熱熔方式安裝薄片部。

13、本發(fā)明所述的核酸提取盒，包括：盒蓋部，其配備有配備有盛放dna提取所需溶液的多個隔斷結(jié)構(gòu)的容納部；盒本體部，其通過插入結(jié)構(gòu)與所述盒蓋部結(jié)合，配備有配備有使從容納部引入的溶液與樣本發(fā)生反應(yīng)或進(jìn)行清洗的反應(yīng)容納部。

14、在本發(fā)明中，所述盒蓋部包括橡膠部分，該橡膠部分與所述盒主體部的容納部一側(cè)接觸，其組成包括彈性變形材料。

15、在本發(fā)明中，所述核酸提取盒可以安裝防止所述核酸溶液泄漏的防漏橡膠，其組成包括彈性材料。

16、本發(fā)明所述核酸提取盒組件，包括：核酸提取盒；pcr板，其從所述核酸提取盒中容納核酸溶液并將其收儲在容納有pcr混合干燥物的反應(yīng)孔中。所述核酸提取盒包括：盒蓋部，其配備有配備有盛放dna提取所需溶液的多個隔斷結(jié)構(gòu)的容納部；盒本體部，其通過插入結(jié)構(gòu)與所述盒蓋部結(jié)合，配備有配備有使從所述容納部引入的溶液與樣本發(fā)生反應(yīng)進(jìn)行清洗的反應(yīng)容納部。所述pcr板包括：主體部，其配備有配備有一個以上反應(yīng)孔；插入部，從主體部延伸，插入到核酸提取盒中，配備有配備有注入所述核酸溶液的注入口；流路流路部，可以使所述核酸溶液從所述注入口流動到所述反應(yīng)孔；阻斷部，安裝于所述主體部，阻隔所述核酸溶液從所述反應(yīng)孔向所述流路流路部逆流。

17、在本發(fā)明中，所述盒蓋部包括橡膠部分，該橡膠部分與所述盒主體部的容納部一側(cè)接觸，其組成包括彈性變形材料。

18、在本發(fā)明中，所述核酸提取盒可以安裝防止所述核酸溶液泄漏的防漏橡膠，其組成包括彈性材料。

19、本發(fā)明所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置，包括：核酸提取盒；pcr板，其從所述核酸提取盒容納核酸溶液并將其收儲在容納有pcr混合干燥物的反應(yīng)孔中。所述核酸提取盒包括：盒蓋部，其配備有盛放dna提取所需溶液的多個隔斷結(jié)構(gòu)的容納部；以及盒主體部，以插入結(jié)構(gòu)與所述盒蓋部結(jié)合，配備有用于與樣本發(fā)生反應(yīng)或清潔從容納部引入的溶液的反應(yīng)容納部，所述pcr板包括主體部，其配備有至少一個反應(yīng)孔；插入部，從主體部延伸，插入到核酸提取盒中，配備有注入核酸溶液的注入口；流路流路部，可以使所述核酸溶液從所述注入口流動到所述反應(yīng)孔；以及阻斷部，安裝于所述主體部，阻隔所述核酸溶液從所述反應(yīng)孔向所述流路流路部逆流。

20、在本發(fā)明中，所述盒蓋部包括橡膠部分，該橡膠部分與所述盒主體部的容納部一側(cè)接觸，其組成包括彈性變形材料。

21、在本發(fā)明中，所述核酸提取盒上可以安裝防止所述核酸溶液泄漏的防漏橡膠，其組成包含括彈性材料。

22、【發(fā)明效果】

23、根據(jù)本發(fā)明，可以通過從生物樣本中提取核酸、進(jìn)行pcr反應(yīng)并掃描各種波段的激發(fā)光和相應(yīng)的熒光，實(shí)時自動檢測反應(yīng)產(chǎn)物，并且一次操作就可完成多項(xiàng)檢測，使用簡便，可以在短時間內(nèi)獲得準(zhǔn)確結(jié)果。

24、此外，可以防止pcr混合干燥物在pcr板上通過反應(yīng)孔逆流，從而防止pcr混合干燥物被混合到相鄰的反應(yīng)孔中而產(chǎn)生污染。

25、此外，根據(jù)本發(fā)明，可以將pcr過程所需的溫度調(diào)節(jié)過程中與熱變性步驟結(jié)合的過程中所要求的準(zhǔn)確溫度一次性快速、實(shí)時地施加到反應(yīng)目標(biāo)上，確保能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行pcr，從而最大限度地提高反應(yīng)的可靠性。

26、即，如果采用現(xiàn)有的移動反應(yīng)液提高溫度的溫度控制方式，由于無法均勻地提高溫度，所以不利于pcr反應(yīng)。并且，通過移動反應(yīng)液依次提高溫度的方式，不能使整個反應(yīng)物的溫度實(shí)現(xiàn)均勻化，因而很容易發(fā)生其他反應(yīng)。本發(fā)明可以解決上述問題，通過使加熱塊上設(shè)定的溫度范圍保持在恒溫狀態(tài)，直接對整個反應(yīng)液進(jìn)行加壓以提高溫度，可以非常有效地提高pcr反應(yīng)所需的溫度。

27、此外，為了在使溫度從高溫向低溫變化的過程中最大限度地減少時間延遲，將塊狀加熱塊結(jié)構(gòu)并排間隔配置。為pcr板加壓時，通過改變加熱塊的位置，使具有不同溫度的加熱塊進(jìn)行實(shí)時加壓，從而可以顯著解決溫度變化過程中所需的時間延遲引起的問題。

28、此外，pcr板以插入到核酸提取盒中的插入式結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)，所以核酸提取盒可以通用，各種檢測試劑盒中使用的pcr板存儲在較小的空間內(nèi)，檢測時可以根據(jù)需要插入合適的pcr板進(jìn)行使用。pcr板內(nèi)配備有的一個反應(yīng)孔最多可分析6個熒光值，并且可根據(jù)需要，將pcr板的反應(yīng)孔增加到8個，因此，可以擴(kuò)增并檢測與癥狀相關(guān)的患者生物樣本中可能包含的所有病原菌，提供基于癥狀的多重分子診斷檢測。

29、此外，根據(jù)本發(fā)明，恒溫板被分成具有第一溫度和第二溫度梯度的區(qū)域。當(dāng)通過驅(qū)動模塊對加熱塊加壓時，相應(yīng)地移動具有與加熱塊溫度相對應(yīng)的設(shè)置溫度(第一溫度或第二溫度)的區(qū)域，同時對pcr板的上下表面進(jìn)行接觸加壓，因此，與保持單一溫度的恒溫板方式相比，可以實(shí)現(xiàn)雙倍的效率。

30、此外，本發(fā)明采用移動式恒溫板結(jié)構(gòu)，通過滑動帶進(jìn)行驅(qū)動操作，可以確保產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和移動的可靠性。并且，將目標(biāo)內(nèi)板的加熱時間采用上下面同步的方式，可以縮短檢測時間。