本申請(qǐng)要求2014年10月3日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.62/059,262和2014年4月10日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列No.61/977,754的權(quán)益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物寄生蟲載量的診斷，并且更特別地涉及定量糞便中寄生蟲卵數(shù)量的方法。

背景

甚至在最樂觀的情況下，預(yù)計(jì)全球人口也計(jì)劃持續(xù)大幅增長(zhǎng)至21世紀(jì)(UN，2004)，對(duì)單獨(dú)的肉類生產(chǎn)的需求在1999至2050年之間翻倍(Steinfeld等，2006)。滿足這種需求的一個(gè)主要障礙是內(nèi)蠕蟲寄生蟲對(duì)動(dòng)物的感染，所述蠕蟲寄生蟲基本上普遍存在于全球所有農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物中。

蠕蟲寄生蟲是蠕蟲樣動(dòng)物的多源群，包括分類群絳蟲類(cestodes)、線蟲類(nematodes)、吸蟲類(trematodes)和單殖吸蟲類(monogeneans)。許多蠕蟲寄生蟲通過消化系統(tǒng)，首先通過攝入被寄生蟲或其卵污染的物質(zhì)來傳播。在其生命周期過程中，這樣的寄生蟲可以移動(dòng)至身體的其他部分，且返回消化道產(chǎn)更多的卵，其隨后在糞便中被排泄，以提供新感染的來源。

蠕蟲感染引起動(dòng)物，包括人類中相當(dāng)高的發(fā)病率，并且在農(nóng)業(yè)牲畜的情況中，由于降低的增重、產(chǎn)奶和繁殖引起的降低的生產(chǎn)力，導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性的經(jīng)濟(jì)損失。盡管嚴(yán)重的感染會(huì)導(dǎo)致死亡，但是攜帶內(nèi)寄生蟲的反芻動(dòng)物，即使在亞臨床水平下，通過各種形式-包括貧血、降低的繁殖適度和哺乳期以及食物利用的降低-呈現(xiàn)顯著的生產(chǎn)力損失，導(dǎo)致降低的生長(zhǎng)和差的身體狀況(Piedrafita等，2010；Perry和Randolph，1999；Hoglund等，2001；Reinhardt等，2006)。在美國(guó)，牲畜生產(chǎn)力的年損失估算每年為三十億美元(Bagley等，2014)。在發(fā)展中國(guó)家-在那里獸醫(yī)護(hù)理、驅(qū)蟲藥和系統(tǒng)化的抗蠕蟲農(nóng)場(chǎng)策略較少利用或較少?gòu)V泛實(shí)施，并且在那里食物存儲(chǔ)更有可能并且更嚴(yán)重-預(yù)期損失實(shí)質(zhì)上更大。在農(nóng)業(yè)上重要的非反芻動(dòng)物，包括家禽(Permin等，1999)和豬(Nansen和Roepstorff，1999)中，以及其他經(jīng)濟(jì)上重要的食草動(dòng)物中，如馬(Duncan，1985)中，蠕蟲感染也是個(gè)問題。在馬的情況中，寄生蟲感染還會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物身體活動(dòng)能力的降低。然而，內(nèi)寄生蟲感染不限于農(nóng)業(yè)牲畜，并且對(duì)于陪伴安慰動(dòng)物，如貓和狗也是個(gè)問題。貓和狗的感染會(huì)導(dǎo)致稱為人畜共患傳染病的現(xiàn)象，導(dǎo)致最常感染幼兒的鉤蟲和蛔蟲³¹。

寄生蠕蟲感染在人類中也是廣泛分布的。例如，旋盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus)引起人的盤尾絲蟲病(也稱為河盲癥)。據(jù)報(bào)道全世界約17至25百萬人受到了旋盤尾絲蟲的感染，大約一百萬人失去了一定程度的視力。Brugia filariids可以感染人和其他動(dòng)物，引起包括絲蟲病(包括淋巴絲蟲病)、象皮病和熱帶嗜酸粒細(xì)胞增多癥的疾病。血吸蟲病是由血吸蟲屬種的血吸蟲引起的人的血管寄生蟲病。血吸蟲病是感染超過全世界十億人的許多蠕蟲病之一。這些疾病包括蛔蟲病、鞭蟲病、蟯蟲病、絲蟲病、旋毛蟲病、盤尾絲蟲病、片吸蟲病和囊蟲病。作為由于寄生蟲引起的發(fā)病率和患病的主要誘因，血吸蟲病僅次于瘧疾，位列第二。

綜合以上問題，對(duì)常用驅(qū)蟲藥的抗性(抗蠕蟲抗性)是全球性的并且是牲畜生產(chǎn)中與日俱增的問題(Kaplan，2004)。多藥抗性是綿羊和山羊操作中的常見現(xiàn)象(da Cruz等，2010)，報(bào)道了全部抗蠕蟲失敗的幾個(gè)情況(Cezar等，2010；Howell等，2008)。相似地，已經(jīng)證明了馬寄生蟲對(duì)目前市場(chǎng)上可用的所有類別的驅(qū)蟲藥是抗性的并且絕大部分的馬操作面臨對(duì)至少一種藥物的抗性(Peregrine等，2014)。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了牛寄生蟲對(duì)幾類常用的抗蠕蟲產(chǎn)品的抗性逐漸提高(Gasbarre等，2009；Waghorn等，2006；Jackson等，2006)。

此外，這種抗性似乎以顯著快于新的驅(qū)蟲藥產(chǎn)品研發(fā)和推出的速率在發(fā)展：北美從20世紀(jì)80年代早期開始，就沒有推出過新的抗蠕蟲藥類別用于大型動(dòng)物。出于這些原因，世界獸醫(yī)組織正促進(jìn)對(duì)作為動(dòng)物護(hù)理關(guān)鍵方面的寄生蟲感染和藥物抗性存在的監(jiān)控(Wood等，1995)。

在獸醫(yī)領(lǐng)域中，有時(shí)候通過呈現(xiàn)的臨床癥狀來診斷蠕蟲感染。獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)踐中的首要工具是糞便卵計(jì)數(shù)(FEC)，這保持相對(duì)不變了幾乎一個(gè)世紀(jì)^4,11，并且通常，依賴于密度大于卵自身的糖和/或鹽介質(zhì)中的卵漂浮，接著通過顯微鏡檢查和人工計(jì)數(shù)。目前使用的有兩種FEC方法。

第一種并且可能是最普遍使用的卵計(jì)數(shù)程序是McMaster載玻片計(jì)數(shù)法，最初由Gordon和Whitlock在1939年用綿羊糞便研發(fā)出來的。在這種方法中，將糞便物質(zhì)懸浮于密度大于寄生蟲卵自身的糖和/或鹽(SS)溶液中，并且放置在特別針對(duì)該目的制作的顯微鏡載玻片中(McMaster載玻片計(jì)數(shù)法)。卵漂浮至表面(由此將其與密度更大的糞便殘?jiān)蛛x，以有助于觀察)并且通過受過訓(xùn)練的個(gè)體使用40-100×放大倍數(shù)的顯微鏡進(jìn)行人工計(jì)數(shù)。

第二種通常使用的卵計(jì)數(shù)程序是Wisconsin方法及其衍生方法。對(duì)于這些方法，通常在離心力的影響下，但也可以通過重力，直接將卵漂浮在放置在漂浮介質(zhì)的表面彎月面上的蓋玻片上?？梢酝ㄟ^取樣更多的糞便懸浮液，通過將其放入試管中形成彎月面來提高靈敏度。用蓋玻片蓋在彎月面上，并隨后接受水平轉(zhuǎn)子中的離心(Rossanigo和Gruner，1991；Egwang和Slocombe，1981)。然后如前通過顯微鏡計(jì)數(shù)粘附于蓋玻片上的卵。

盡管McMaster-型測(cè)定操作比較簡(jiǎn)單，但涉及的高稀釋度和小的取樣導(dǎo)致測(cè)定與Wisconsin型測(cè)試相比具有較高的可變性和較低的靈敏度。相反，由于由離心力場(chǎng)產(chǎn)生的提高的漂浮以及它們?cè)试S的較大的樣品體積，Wisconsin測(cè)試回收更多的卵，但技術(shù)上的要求略多并且需要獲得離心機(jī)，這對(duì)于許多獸醫(yī)實(shí)踐在和在該領(lǐng)域中是不可行的。

不幸地，這兩種技術(shù)不僅耗時(shí)，而且需要使用專門的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(即，顯微鏡，使用或不用離心機(jī))，這對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)的獸醫(yī)是很少可利用的，對(duì)于動(dòng)物的主人更少。此外，大部分動(dòng)物的主人不具有所需的訓(xùn)練來可靠地檢驗(yàn)這樣的樣品(例如，外行可能容易將卵與其他糞便顆粒(如花粉顆粒)混淆)。通常，收集樣品并送至獸醫(yī)辦公室用于分析或送至第三方分析實(shí)驗(yàn)室，導(dǎo)致增加的成本和/或診斷時(shí)間的延誤。或者，動(dòng)物的主人可以通過各種商業(yè)服務(wù)將糞便直接運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，但通常需要等待48小時(shí)出結(jié)果。這，結(jié)合測(cè)試的耗時(shí)性質(zhì)以及處理和檢查每個(gè)樣品的受訓(xùn)人員的需求，以及伴隨的對(duì)成本的影響，導(dǎo)致較少動(dòng)物的主人針對(duì)寄生蟲的存在和抗性的產(chǎn)生定期測(cè)試他們的牲畜。

除了時(shí)間和設(shè)備問題之外，目前的卵計(jì)數(shù)方法還會(huì)遇到各種技術(shù)缺陷。例如，卵技術(shù)可變性限制了目前的卵技術(shù)方法的有效性。已經(jīng)估算馬卵計(jì)數(shù)在重復(fù)計(jì)數(shù)之間的差異為+/-50％(部分是由于主觀的分析間可變性，而部分是因?yàn)橛捎谛〉娜芋w積引起的統(tǒng)計(jì)學(xué)原因)。因此，糞便卵計(jì)數(shù)降低中的真實(shí)變化和偶然可變性之間的描繪確實(shí)是個(gè)挑戰(zhàn)(Vidyashankar等，2012)。盡管可以通過更好的分析者訓(xùn)練、進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)或使用具有較低檢測(cè)極限的方法來降低可變性，但所有這些解決方法都帶來了增加的訓(xùn)練或處理時(shí)間的成本。另一個(gè)缺陷是卵損失率。樣品中特定百分比的卵保持包裹在糞便殘?jiān)胁⑶覜]有使其進(jìn)入漂浮步驟。根據(jù)技術(shù)和操作者，發(fā)現(xiàn)卵損失率在30至60％之間變化(Vidyashankar等，2012)。重要地，檢測(cè)極限，通過給定技術(shù)課檢測(cè)的最低卵計(jì)數(shù)，給已知的方法提供了限制。其通常在1-50個(gè)卵/克(EPG)的范圍內(nèi)。McMaster技術(shù)(參見圖1)通常具有25至50EPG的檢測(cè)極限，使其非常難以檢測(cè)低的卵計(jì)數(shù)水平，這對(duì)于抗性測(cè)試特別重要(Vidyashankar等，2012)。

因此，用抗蠕蟲藥的預(yù)防性治療已經(jīng)變成工業(yè)中的標(biāo)準(zhǔn)。不幸地，并且與抗生素的過度用藥類似，正在上升的抗藥性線蟲的頻率是所有物種中漸增的全球關(guān)注問題，特別是小的反芻動(dòng)物(Kaplan，2004；Wolstenholme等，2004；Sutherland和Leathwick，2011；Jackson和Coop，2000；Roepstorff等，1987；Coles等，2003；Cernanska等，2006；Kornele等，2014)。獸醫(yī)和管理機(jī)構(gòu)目前都正式地認(rèn)為這是快速增長(zhǎng)的問題并且已經(jīng)發(fā)布了指導(dǎo)來(1)幫助監(jiān)控這樣的抗性的增長(zhǎng)，和(2)嘗試通過降低目前的處方和非處方抗蠕蟲藥的無差別使用來限制其(Wood等，1995；EMEA，2006；FDA，2014)。

不幸地，通過觀察糞便卵計(jì)數(shù)降低(FECR)的針對(duì)抗性產(chǎn)生的監(jiān)控涉及使用卵漂浮方法，具有上述的缺陷⁸。因此，這些方法不可能被廣泛使用。為了強(qiáng)調(diào)這種推測(cè)，最近的肯塔基州純種農(nóng)場(chǎng)調(diào)查顯示出大部分調(diào)查對(duì)象認(rèn)識(shí)到并且關(guān)注抗藥性寄生蟲現(xiàn)象；然而，超過70％的仍然是預(yù)防性地驅(qū)蟲(Robert等，2014)。此外，來自USDA的研究已經(jīng)顯示出50-70％的牛農(nóng)場(chǎng)主同意內(nèi)寄生蟲對(duì)其操作具有顯著的經(jīng)濟(jì)影響(USDA，2011b)；然而，僅有0.7％針對(duì)這個(gè)問題利用任何類型的實(shí)驗(yàn)室測(cè)試(USDA，2010)?？傊?，糞便卵計(jì)數(shù)的不便利性似乎代表了廣泛采用針對(duì)性更強(qiáng)的方法來處理和控制寄生蟲感染的顯著障礙。

盡管歐洲的管理部門已經(jīng)認(rèn)識(shí)到抗藥性菌株出現(xiàn)的威脅并開始限制其可利用性，但在美國(guó)，這些藥物中的許多目前仍然是作為非處方藥開放給公眾。因此，獸醫(yī)專業(yè)協(xié)會(huì)已經(jīng)推薦使用糞便卵計(jì)數(shù)降低測(cè)試(FECR)。FECR依賴于系統(tǒng)地評(píng)價(jià)寄生蟲負(fù)荷，使用卵計(jì)數(shù)作為用抗蠕蟲藥治療前后的寄生蟲負(fù)荷的替代標(biāo)記?？梢酝ㄟ^治療后卵計(jì)數(shù)的低于預(yù)期的下降來檢測(cè)抗藥性的產(chǎn)生，促進(jìn)適當(dāng)控制的響應(yīng)來減少抗性菌株通過群體的增殖。因此，糞便卵計(jì)數(shù)變得越來越重要，盡管在提高這種臨床上重要的診斷工具中獲得了令人驚訝地非常小的進(jìn)步。

盡管幾乎過了一個(gè)世紀(jì)以及其他領(lǐng)域中精密復(fù)雜的現(xiàn)代化分析方法的發(fā)展，卵計(jì)數(shù)的實(shí)施保持相對(duì)不變，大部分的創(chuàng)新限于漂浮介質(zhì)中的改進(jìn)或從較大糞便樣品收集卵的方法。例如，擴(kuò)大了漂浮室的體積來提高靈敏度^14,15,18，或已經(jīng)研發(fā)了可替換的漂浮溶液^14,17。

一些工作者已經(jīng)使用如聚合酶鏈反應(yīng)(Demeler等，2013；Learmount等，2009)和流式細(xì)胞術(shù)(Colditz等，2002)這樣的方法，努力研發(fā)更精密復(fù)雜的嘗試來檢測(cè)或定量糞便中的卵。然而，這樣精密復(fù)雜的技術(shù)，是昂貴的并且進(jìn)行所述技術(shù)需要設(shè)備，因此對(duì)于作為除了研究目的以外的其他目的的工具，使其更不實(shí)際。

盡管一些努力已經(jīng)針對(duì)發(fā)現(xiàn)卵表面探針來幫助檢測(cè)，但這些努力限于篩選各種凝集素，以確定這些凝集素可以結(jié)合的卵的種。一旦確定，這些蛋白質(zhì)可以用作種特異性標(biāo)記，用于檢測(cè)(但不能定量)某些種或?qū)俚拇嬖?Palmer和McCombe，1996；Hillrichs等，2012；Colditz等，2002)。然而，因?yàn)榭偟穆延?jì)數(shù)仍然是用于作出臨床決定和用于監(jiān)控抗蠕蟲藥抗性的標(biāo)準(zhǔn)，因此仍然要鑒定所有蠕蟲卵通用的標(biāo)記。這樣普遍存在并且在實(shí)驗(yàn)上已處理的標(biāo)記的鑒定將打開利用其來研發(fā)計(jì)數(shù)總糞便卵載量的快速定量方法的可能性，并且因此取代漂浮方法及其相關(guān)的缺點(diǎn)。

不幸地，進(jìn)行了很少的工作來闡明臨床上相關(guān)的卵表面的組成，并且所進(jìn)行的很少工作產(chǎn)生了很少具體的信息(Wharton，1983；Quiles等，2006)。

寄生原蟲感染還引起各種醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上重要的疾病，范圍從人類中的瘧疾和間質(zhì)性漿細(xì)胞肺炎到鳥類、魚和哺乳動(dòng)物中的各種球蟲病。許多疾病對(duì)宿主是致命的并且引起畜牧業(yè)中相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。球蟲病是影響包括牛、綿羊、山羊、兔子、豬、雞、火雞、貓和狗的動(dòng)物腸道的原生動(dòng)物寄生蟲病。感興趣的寄生蟲包括，但不限于，等孢球蟲(Isospora sp.)(狗和貓)；巨型艾美球蟲(Eimeria maxima)、堆型艾美球蟲(E.acervulina)、布氏艾美球蟲(E.brunetti)、毒害艾美球蟲(E.necatrix)和柔嫩艾美球蟲(E.tenella)(雞)；珠雞艾美球蟲(E.meleagridis)、E.gallopavonis、E.adenoeides和分散艾美球蟲(E.dispersa)(火雞)；牛艾美球蟲(E.bovis)(牛)；綿羊艾美球蟲(E.ovina)(綿羊)；豬艾美球蟲(E.porci)(豬)和斯氏艾美球蟲(E.stiedai)(兔子)。球蟲病是許多牲畜種中經(jīng)濟(jì)上最重要的疾病之一。該疾病的特征在于腹瀉、瘦弱、失去食欲和體重以及不同水平的死亡率。在牲畜動(dòng)物中，部分由于通過腸道壁的營(yíng)養(yǎng)素的吸收障礙引起的增重降低引起了經(jīng)濟(jì)損失。此外，與蠕蟲感染一樣，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于檢測(cè)原生動(dòng)物卵囊依賴于費(fèi)時(shí)的方法。

盡管許多寄生蟲在胃腸道中度過其生命周期的一部分并在糞便中排出，但許多其他寄生蟲感染宿主動(dòng)物的膀胱和腎臟。Pearsonema plica和Dioctophyme renale是兩種這樣的已知感染狗的膀胱和腎臟的寄生蟲。在尿樣中檢測(cè)出了兩個(gè)屬的卵。血吸蟲病種可以感染尿道或腸，可以在動(dòng)物的尿液或糞便中發(fā)現(xiàn)其卵。

如可以看到的，盡管已經(jīng)研發(fā)了許多現(xiàn)代方法，但這些測(cè)試沒有被廣泛采用并且人工卵計(jì)數(shù)仍然是最廣泛利用的和常用的監(jiān)控腸寄生蟲感染(即，蠕蟲和原生動(dòng)物寄生蟲感染)的方法。因此，需要一種簡(jiǎn)單、精確和劃算的用于定量糞便中的寄生蟲卵數(shù)量的方法，其可以由獸醫(yī)在現(xiàn)場(chǎng)或由動(dòng)物的主人自己來進(jìn)行。

概述

本發(fā)明是基于使用N-乙?；?D-葡糖胺(GlcNac)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，GlcNac結(jié)合蛋白)及其片段用于檢測(cè)環(huán)境樣品(例如，糞便樣品)中的蠕蟲卵?！皺z測(cè)”是指鑒定待檢測(cè)目標(biāo)的存在、不存在或含量。本發(fā)明提供了簡(jiǎn)單的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，其允許獸醫(yī)和動(dòng)物的主人來診斷蠕蟲寄生蟲感染和/或寄生原生動(dòng)物感染的水平，由此允許它們更適當(dāng)?shù)睾陀行У蒯槍?duì)其特定需求制定治療和預(yù)防策略。這種測(cè)試還可以用于更多控制的實(shí)驗(yàn)室情況。這個(gè)說明書列出了脫離顯微鏡的寄生蟲卵計(jì)數(shù)的一般原則，這是他們煩惱了幾乎一個(gè)世紀(jì)的問題，并且描述了使用現(xiàn)代生化技術(shù)實(shí)現(xiàn)這一目的的特異性測(cè)定法。

本文中公開的方法給予了目前的卵計(jì)數(shù)方案更多改進(jìn)，即，所述方法將能夠(1)增加樣品處理量和消除主觀性，由此降低或消除這些變化來源；(2)任選消除了漂浮步驟，這至少部分地減輕了卵損失率的問題；和(3)通過過濾濃縮糞便樣品，其很大程度上提高了靈敏度。此外，該技術(shù)能夠使測(cè)試在現(xiàn)場(chǎng)快速進(jìn)行，由此消除將糞便運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室和在那里處理一次時(shí)間的時(shí)間-和不便利-成本。最后，該技術(shù)能很好地適合已建立的獸醫(yī)實(shí)踐，因?yàn)榭侳EC(與寄生蟲種無關(guān))是最常用的告知臨床治療決定的度量標(biāo)準(zhǔn)(Coles等，2006；Nielsen等，2010)。

因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)環(huán)境樣品中(例如，糞便樣品、尿樣、水樣、廢水或污水樣品或土壤樣品中)存在或不存在蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊的方法。在一些方面中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)環(huán)境樣品中存在或不存在蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊的方法，該方法包括獲得包含懸浮于樣品緩沖液中的環(huán)境樣品的溶液，使糞便溶液流過兩個(gè)或更多個(gè)(例如，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、二十個(gè)或五十個(gè))孔徑遞減的濾器，數(shù)量和孔徑由從其獲得糞便的動(dòng)物物種和待檢測(cè)的卵和/或卵囊的類型來決定。

在一些方面中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)糞便樣品中存在或不存在蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊的方法，該方法包括獲得包含懸浮于樣品緩沖液中的糞便樣品的糞便溶液，使糞便溶液流過兩個(gè)或更多個(gè)(例如，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、二十個(gè)或五十個(gè))孔徑遞減的濾器，數(shù)量和孔徑由從其獲得糞便的動(dòng)物物種和待檢測(cè)的卵和/或卵囊的類型來決定。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)”和“至少一個(gè)”可互換使用并且表示一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、二十個(gè)、五十個(gè)等“一個(gè)或多個(gè)”或“至少一個(gè)”所指的項(xiàng)目。術(shù)語(yǔ)“兩個(gè)或更多個(gè)”表示至少兩個(gè)，更合適地，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、二十個(gè)、五十個(gè)等“兩個(gè)或更多個(gè)”所指的項(xiàng)目。

因此，在一個(gè)方面中，使包含環(huán)境樣品的溶液(例如，包含糞便樣品的糞便溶液)流過具有約85微米至約350微米，約100微米至約300微米，約125微米至約250微米，或約150微米至約200微米孔徑的第一濾膜，形成第一濾液，使第一濾液流過具有約1至約10微米，5微米至約45微米，約10微米至約45微米，約15微米至約45微米，約20微米至約45微米，約25微米至約40微米，或約30微米至約35微米孔徑的第二濾膜，使第二濾膜上捕獲的蠕蟲卵接觸與可檢測(cè)部分綴合的N-乙?；?D-葡糖胺結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其片段，如，例如，凝集素、幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)或其他N-乙?；?D-葡糖胺結(jié)合蛋白或其片段，以及基于可檢測(cè)部分，例如，可檢測(cè)部分的信號(hào)強(qiáng)度，檢測(cè)糞便樣品中存在或不存在蠕蟲卵。

如本說明書中使用的術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”和“第三”只是以其相對(duì)含義。將理解，除非另外指出，使用那些術(shù)語(yǔ)僅作為一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案描述中方便的情況。術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”和“第三”僅用于區(qū)分一個(gè)元件與另一個(gè)元件，并且所公開技術(shù)的權(quán)利范圍不應(yīng)當(dāng)受到這些術(shù)語(yǔ)的限制。例如，第一元件可以指定為第二元件，并且相似地，第二元件可以指定為第一元件。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)環(huán)境樣品(例如，糞便樣品)中存在或不存在蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊的方法，包括獲得包含懸浮于樣品緩沖液中的環(huán)境樣品的溶液(例如，包含糞便樣品的糞便溶液)，使糞便溶液流過具有約85微米至約350微米，約100微米至約300微米，約125微米至約250微米，或約150微米至約200微米孔徑的第一濾膜，形成第一濾液，使第一濾液流過具有約1至約10微米，5微米至約45微米，約10微米至約45微米，約15微米至約45微米，約20微米至約45微米，約25微米至約40微米，或約30微米至約35微米孔徑的第二濾膜，使第二濾膜上捕獲的樣品接觸包含在熒光激發(fā)光下發(fā)出熒光的幾丁質(zhì)結(jié)合染料的第一種試劑，用熒光激發(fā)光照射第二濾膜上捕獲的樣品；并且基于熒光強(qiáng)度或熒光顆粒的數(shù)量檢查樣品的熒光，以確定樣品中存在或不存在蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊。

在再另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)環(huán)境樣品(例如，糞便樣品)中存在或不存在蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊的方法，包括獲得包含懸浮于樣品緩沖液中的環(huán)境樣品的溶液(例如，包含糞便樣品的糞便溶液)，使糞便溶液流過具有約85微米至約350微米，約100微米至約300微米，約125微米至約250微米，或約150微米至約200微米孔徑的第一濾膜，形成第一濾液，使第一濾液流過具有約1至約10微米，5微米至約45微米，約10微米至約45微米，約15微米至約45微米，約20微米至約45微米，約25微米至約40微米，或約30微米至約35微米孔徑的第二濾膜，使第二濾膜上捕獲的蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊接觸包含凝集素或CBD或N-乙?；?D-葡糖胺結(jié)合蛋白或其片段的第一種試劑，形成第一種試劑樣品，將第一種試劑樣品接觸包含特異性地結(jié)合凝集素或CBD的抗體的第二種試劑，其中抗體與可檢測(cè)部分綴合，并且基于可檢測(cè)部分，確定樣品中存在或不存在蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊。

在一些實(shí)施方案中，環(huán)境樣品是糞便樣品。獲得糞便溶液的步驟可以包括將糞便樣品懸浮于樣品緩沖液中，形成第一糞便溶液，并使第一糞便溶液流過具有約400微米至約800微米，約425微米至約750微米，約450微米至約700微米，約500微米至約650微米，或約550微米至約600微米孔徑的整批濾膜，以提供糞便溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，整批濾膜具有約400微米至約450微米的孔徑，第一濾膜具有約85微米至約120微米的孔徑和第二濾膜具有約20微米至約40微米的孔徑。第一糞便溶液流過整批濾膜用來從其除去較大的顆粒和殘?jiān)?，使得更有效地濾過第一和第二濾膜。

在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使溶液流過第二濾膜后，將第二濾膜上捕獲的蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊懸浮于液體樣品緩沖液中。

根據(jù)再一個(gè)方面，本文中公開的方法進(jìn)一步包括在接觸步驟前，用氧化劑或漂白液處理樣品(例如，環(huán)境樣品)。因此，在一些實(shí)施方案中，接觸步驟前，用漂白液處理樣品。

在一些實(shí)施方案中，GlcNac結(jié)合結(jié)構(gòu)域是選自凝集素、幾丁質(zhì)酶或幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，或其片段的GlcNac結(jié)合蛋白。更特別地，凝集素可以是能夠結(jié)合N-乙酰基-D-葡糖胺的任何凝集素，包括，選自麥胚凝集素(WGA)、大豆凝集素(SBA)、桑橙(Maclura pomifera)凝集素(MPL)、紅花紫荊凝集素(BPL)、曼陀羅凝集素(DSL)、番茄凝集素(LEL)、馬鈴薯凝集素(STL)和四棱豆-II(PTL-II)的凝集素。在一個(gè)實(shí)施方案中，凝集素是麥胚凝集素(WGA)。

在一些實(shí)施方案中，GlcNac結(jié)合蛋白與固體支持物，如磁性或非磁性珠子，或與膜，如硝基纖維素或聚偏氟乙烯綴合，所述膜可以用于捕獲和濃縮卵，結(jié)合或替代過濾。

在一些實(shí)施方案中，GlcNac結(jié)合蛋白與選自半抗原、酶、抗體表位、抗原、熒光團(tuán)、放射性同位素、納米顆粒、結(jié)合對(duì)的成員和金屬螯合物的可檢測(cè)部分綴合。例如，可檢測(cè)標(biāo)記可以是結(jié)合對(duì)的第一成員，其中結(jié)合對(duì)選自生物素/鏈霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/captavidin、表位/抗體、蛋白A/免疫球蛋白、蛋白G/免疫球蛋白、蛋白L/免疫球蛋白、GST/谷胱甘肽、His-標(biāo)記物/金屬(例如，鎳、鈷或銅)、抗原/抗體、FLAG/M1抗體、麥芽糖結(jié)合蛋白/麥芽糖、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白/鈣調(diào)蛋白、酶-酶底物和受體-配體結(jié)合對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分是結(jié)合對(duì)的第一成員。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)的第一成員與N-乙酰基-D-葡糖胺結(jié)合蛋白綴合，而結(jié)合對(duì)的第二成員固定于固體支持物上。

在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分是結(jié)合對(duì)的第一成員；并且結(jié)合對(duì)的第二成員與酶、抗體表位、抗原、熒光團(tuán)、放射性同位素、納米顆粒、第二結(jié)合對(duì)的成員和金屬螯合物綴合。

在再另一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分是結(jié)合對(duì)的第一成員，其中結(jié)合對(duì)的第一成員是生物素和結(jié)合對(duì)的第二成員選自鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和capravidin，并且結(jié)合對(duì)的第二成員與酶綴合。

在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分是選自綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素、5-異硫氰酸熒光素(FITC)、花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Bodipy染料(Invitrogen)和/或Alexa Fluor染料(Invitrogen)、丹酰、丹酰氯(DNS-C1)、5-(碘代乙酰胺)熒光素(5-IAF)、6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧-1,3-重氮-4-基氯化物(NBD-Cl)、溴化乙錠、螢蟲黃、羅丹明染料(5-羧基羅丹明6G氫氯化物、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、羅丹明-B-異硫氰酸酯(RITC(羅丹明-B-異硫氰酸酯)、羅丹明800)；四甲基羅丹明5-(和6-)異硫氰酸酯(TRITC))、Texas紅^TM、磺酰氯、萘亞甲基胺磺酸(包括但不限于1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)和6-(對(duì)-甲苯氨基)萘-2-磺酸(TNS))、蒽羰基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、熒光素-磷脂酰乙醇胺、Texas紅-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰膽堿、芴基-磷脂酰膽堿、部花青540、萘苯乙烯、3,3'二丙基硫雜二羰菁(diS-C3-(5))、4-(對(duì)-二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶(二-5-ASP)、Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羥基琥珀酰亞胺、Cy-7-異硫氰酸酯、IR-125、噻唑橙、天青B、尼羅藍(lán)、鋁酞菁、噁嗪1,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst33342、TOTO、吖啶橙、乙錠均二聚物、N(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉(MQAE)、Fura-2、鈣綠、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、phytofiuors和暈苯。

在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分是催化顏色變化的酶，包括選自堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、脲酶和β-內(nèi)酰胺酶和葡萄糖氧化酶的酶。

在一些實(shí)施方案中，GlcNac結(jié)合蛋白是麥胚凝集素和可檢測(cè)部分是熒光素。

可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的儀器和設(shè)備來測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度，包括，例如，便攜式或臺(tái)式熒光計(jì)(例如，手持熒光計(jì))或便攜式或桌式比色計(jì)(例如，手持比色計(jì))?？梢酝ㄟ^目視檢查來確定可檢測(cè)部分的信號(hào)強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，使用適用于觀察選定的可檢測(cè)部分的成像裝置來測(cè)定可檢測(cè)部分的信號(hào)強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，成像裝置是數(shù)碼相機(jī)、移動(dòng)電話、智能電話、便攜式計(jì)算機(jī)、計(jì)算機(jī)或掃描儀。

在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)糞便樣品中的蠕蟲卵進(jìn)行計(jì)數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使用顯微鏡進(jìn)行糞便樣品中蠕蟲卵的計(jì)數(shù)。

在一些實(shí)施方案中，使第二濾膜上捕獲的樣品接觸包含幾丁質(zhì)結(jié)合染料的第一試劑，所述染料在熒光激發(fā)光下發(fā)出熒光，其中在熒光激發(fā)光下發(fā)出熒光的幾丁質(zhì)結(jié)合染料選自calcofluor white、Uvitex 3B(聯(lián)苯乙烯聯(lián)苯熒光增白劑)、Rylux BA、Rylux BSU(1,4-苯二磺酸-2,2'-[亞乙基二基雙[(3-磺基-4,1-亞苯)亞氨基[6-雙(2-羥乙基)氨基]-1,3,5-三六鈉鹽)(Ostacolor，Pardubice，Czech Republic)和Blankophor(4,4'-雙{(4-苯胺基)-6-嗎啉代-1,3,5-三嗪-2-基)氨基}二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開內(nèi)容提供了用于檢測(cè)環(huán)境樣品中存在或不存在蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊的方法，該方法包括獲得包含懸浮于樣品緩沖液中的環(huán)境樣品的溶液，使溶液流過具有約85微米至約350微米孔徑的第一濾膜，形成第一濾液；使第一濾液流過具有約5微米至約45微米孔徑的第二濾膜；使第二濾膜上捕獲的蠕蟲卵接觸與可檢測(cè)部分綴合的N-乙?；?D-葡糖胺結(jié)合蛋白或其片段；和基于可檢測(cè)部分的信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)環(huán)境樣品中存在或不存在蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開內(nèi)容提供了用于檢測(cè)環(huán)境樣品中存在或不存在蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊的方法，該方法包括：獲得包含懸浮于樣品緩沖液中的環(huán)境樣品的溶液，使溶液流過具有約85微米至約350微米孔徑的第一濾膜，形成第一濾液；使第一濾液流過具有約5微米至約45微米孔徑的第二濾膜；使第二濾膜上捕獲的樣品接觸包含在熒光激發(fā)光下發(fā)出熒光的幾丁質(zhì)結(jié)合染料的第一種試劑；用熒光激發(fā)光照射通過第二濾膜捕獲的樣品；和基于熒光強(qiáng)度或熒光顆粒的數(shù)量分析樣品的熒光，以確定環(huán)境樣品中存在或不存在蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開內(nèi)容提供了用于檢測(cè)環(huán)境樣品中存在或不存在蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊的方法，該方法包括：獲得包含懸浮于樣品緩沖液中的環(huán)境樣品的溶液，使溶液流過具有約85微米至約350微米孔徑的第一濾膜，形成第一濾液；使第一濾液流過具有約5微米至約45微米孔徑的第二濾膜；使第二濾膜上捕獲的蠕蟲卵接觸包含N-乙酰基-D-葡糖胺結(jié)合蛋白或其片段的第一種試劑，形成第一種試劑樣品；使第一種試劑樣品接觸包含特異性地結(jié)合N-乙?；?D-葡糖胺結(jié)合蛋白的抗體的第二種試劑，其中抗體與可檢測(cè)部分綴合；和基于可檢測(cè)部分的強(qiáng)度確定糞便樣品中存在或不存在蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊。

在一些實(shí)施方案中，環(huán)境樣品是糞便樣品。因此，獲得溶液包括將糞便樣品懸浮于樣品緩沖液中，形成第一糞便溶液；以及使第一糞便溶液流過具有約400微米至約800微米孔徑的整批濾膜，獲得包含糞便樣品的溶液。

除非另外限定，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。本文中描述的方法和材料用于本發(fā)明中；也可以使用其他合適的本領(lǐng)域已知的方法和材料。材料、方法和實(shí)施例只是說明性的而沒有打算用來限制。本文中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利、序列、數(shù)據(jù)庫(kù)條目和其他參考文獻(xiàn)將其全部并入作為參考。在沖突的情況中，將以本發(fā)明的說明書為準(zhǔn)，包括定義。

從以下的詳述和附圖，以及從權(quán)利要求，將清楚本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)。

附圖描述

專利或申請(qǐng)文件含有至少一幅有顏色的圖。此具有彩色附圖的專利或?qū)＠暾?qǐng)公開的拷貝一經(jīng)請(qǐng)求并支付必要的費(fèi)用將由專利局提供。

圖1是示意圖，顯示了根據(jù)本發(fā)明的使用用于卵捕獲的磁珠檢測(cè)糞便樣品中存在或不存在蠕蟲卵的方法。

圖2是示意圖，顯示了根據(jù)本發(fā)明的使用多步驟過濾方法檢測(cè)糞便樣品中存在或不存在蠕蟲卵的方法。

圖3A至3D是照片，顯示了漂白前后的樣品(圖A＝未漂白的；圖B＝漂白4分鐘后的樣品；圖C＝漂白6分鐘后的樣品；和圖D＝漂白8分鐘后的樣品)。

圖4顯示了用FITC標(biāo)記的麥胚凝集素(WGA)獲得的幾丁質(zhì)特異性蠕蟲卵染色。

圖5A至5J顯示了用綴合熒光素的CBD的蠕蟲卵的染色。(以相襯(A-E)或熒光模式(F-J)使樣品成像)。條＝200微米。

圖6證明了通過綴合熒光素的CBD染色的來自牛糞便的各種蠕蟲卵和原生動(dòng)物卵囊。條＝200微米。

圖7證明了卵陽(yáng)性和卵陰性糞便中卵的比色檢測(cè)。

圖8A和8B證明了來自馬糞便的CBD染色的卵的成像。在相襯(A)和熒光模式(B)中在40×放大倍數(shù)下產(chǎn)生了McMaster網(wǎng)格的合成圖像。插頁(yè)顯示了包括真菌孢子(箭頭)的代表性區(qū)域的放大。條＝1.5mm。

圖9A-9D顯示了CBD-熒光素染色的卵的圖像。用8MP iPhone 5s(A、B)或16MP Olympus PE2 Pen相機(jī)(C、D)將卵成像。圖像原始顯示(A，C)或處理除去背景后顯示(B、D)。條(A)＝1mm，條(B)＝0.5mm。

圖10顯示了用Olympus消費(fèi)者級(jí)別相機(jī)和手機(jī)相機(jī)成像的自動(dòng)化計(jì)數(shù)的傳統(tǒng)McMaster計(jì)數(shù)的校正。在每種情況的四個(gè)獨(dú)立測(cè)試中評(píng)價(jià)了三個(gè)糞便樣品并且將結(jié)果平均。

圖11顯示了通常自動(dòng)化測(cè)試呈現(xiàn)出低于傳統(tǒng)McMaster方法的可變性。顯示了帶有標(biāo)準(zhǔn)偏差的來自圖10的結(jié)果(n＝4)。

圖12顯示了用于捕獲根據(jù)圖1或2中所述的方法制備的樣品的圖像的測(cè)試儀器的頂?shù)染嘁晥D。

圖13顯示了圖12裝置的底視圖。

圖14顯示了具有連接的樣品室的圖12裝置的底等距視圖。

圖15顯示了圖14中顯示的裝置和樣品室的一部分的橫截面。

詳述

以下公開內(nèi)容描述了用于檢測(cè)環(huán)境樣品中(例如，糞便樣品、尿樣、水樣、廢水或污水樣品或土壤樣品中)存在或不存在蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊的新方法。為了易于審查，提供了用于檢測(cè)糞便樣品中存在或不存在蠕蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊的示例性方法和試劑盒，用于說明性的目的并且不是用來限制本發(fā)明的范圍，其由所附權(quán)利要求的范圍來限定。

盡管幾丁質(zhì)已經(jīng)被描述為一些蠕蟲卵和原生動(dòng)物卵囊的組分，但一般從不知道其是這些卵的通用組分。至少一部分，本發(fā)明是基于發(fā)明人以下的發(fā)現(xiàn)：幾丁質(zhì)可以作為大部分(如果不是全部)蠕蟲寄生蟲卵(參見，例如，圖5)和/或原生動(dòng)物卵囊的通用標(biāo)記并且因此形成測(cè)定總寄生蟲載量的測(cè)試的基礎(chǔ)。幾丁質(zhì)是結(jié)構(gòu)上與纖維素相似的線性聚合物，但全部由β1-4連接的N-乙?；咸前?GlcNAc)單體組成，而不是葡萄糖(Rudall和Kenchington，1973)。除了纖維素，其是自然界中最大量的生物聚合物，陸地和水生節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼的主要成分以及真菌和(較少程度的)酵母的細(xì)胞壁的關(guān)鍵組分。幾丁質(zhì)作為生物基質(zhì)的結(jié)構(gòu)組分的通用作用和大部分蠕蟲卵的表面的相似出現(xiàn)，表明其可以是用于寄生蟲卵的普遍標(biāo)記。

幾丁質(zhì)的存在不僅可以用各種識(shí)別凝集素和各種小分子熒光團(tuán)的GlcNAc來半特異性地探測(cè)，而且可以使用由其各自的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)組成的各種幾丁質(zhì)酶的平截形式來更嚴(yán)格地探測(cè)(Hardt和Laine，2004；Hashimoto等，2000；Gao等，2002；Arakane等，2003；Chu等，2001；Kolbe等，1998；Zeltins和Schrempf，1995)。因此，發(fā)明人假設(shè)可以(1)通過比色，通過將酶報(bào)道分子連接于GlcNAc結(jié)合蛋白，在添加合適底物時(shí)產(chǎn)生信號(hào)；或(2)通過熒光，通過將GlcNAc結(jié)合蛋白與合適的熒光團(tuán)綴合來完成來自糞便樣品的蠕蟲卵的檢測(cè)。

盡管CBD和凝集素對(duì)幾丁質(zhì)和含有糖結(jié)構(gòu)的GlcNAc呈現(xiàn)出較高的結(jié)合親和力，但它們也可以結(jié)合其他碳水化合物聚合物，特別是纖維素，其是食草動(dòng)物和雜食動(dòng)物糞便的主要成分。文獻(xiàn)中可用的數(shù)據(jù)是變化的并且有時(shí)候是矛盾的^26-30，使得不清楚這樣的蛋白質(zhì)是否能夠區(qū)分卵和大量剩余的糞便。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的蛋白質(zhì)確實(shí)可以用于在這個(gè)背景材料上檢測(cè)卵并且因此形成對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法的基礎(chǔ)。

本文中提供了用于檢測(cè)環(huán)境樣品中存在或不存在蠕蟲寄生蟲卵或原生動(dòng)物卵囊的方法和相關(guān)硬件。值得注意的是，本文中提供的方法利用了過濾方法，包括使環(huán)境樣品流過具有約85微米至約350微米，約100微米至約300微米，約125微米至約250微米，或約150微米至約200微米孔徑的第一濾膜，形成第一濾液；使第一濾液流過具有約1至約10微米，5微米至約45微米，約10微米至約45微米，約15微米至約45微米，約20微米至約45微米，約25微米至約40微米，或約30微米至約35微米孔徑的第二濾膜；使第二濾膜上捕獲的蠕蟲卵和原生動(dòng)物卵囊接觸結(jié)合幾丁質(zhì)或N-乙?；?D-葡糖胺的試劑；并通過定量或定性地觀察結(jié)合幾丁質(zhì)或N-乙?；?D-葡糖胺的試劑結(jié)合環(huán)境樣品中的蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊的程度來檢測(cè)環(huán)境樣品中存在或不存在蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊。環(huán)境樣品可以是任何懷疑含有蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊的樣品，包括，例如，糞便樣品、水樣、廢水或污水樣品或土壤樣品。

本發(fā)明公開內(nèi)容還提供了用于對(duì)樣品中的蠕蟲寄生蟲卵和/或原生動(dòng)物卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法和相關(guān)硬件。所公開的方法遠(yuǎn)離了使用顯微鏡的卵計(jì)數(shù)方法，其中所述使用顯微鏡的方法困擾了一個(gè)世紀(jì)或更長(zhǎng)時(shí)間，并且所公開的方法描述了使用現(xiàn)代生化技術(shù)的特定方法。

可以通過兩步法，卵捕獲和卵檢測(cè)，在動(dòng)物糞便在水或其他合適的液體(包括緩沖液)中的懸浮液中檢測(cè)卵。在一個(gè)步驟中，作為將其與糞便殘?jiān)蛛x的方式，將卵捕獲在固體基質(zhì)上?；|(zhì)可以是二維或三維的，并且自身可以以例如珠子或顆粒的形式共同懸浮于液體中。

通過用如可以與卵表面相互作用的蛋白質(zhì)、碳水化合物或激活的化學(xué)基團(tuán)這樣的分子覆蓋基質(zhì)來促進(jìn)卵捕獲。如果需要，可以通過用化學(xué)品預(yù)處理糞便懸浮液來暴露或激活卵上可以促進(jìn)捕獲的化學(xué)基團(tuán)，從而促進(jìn)捕獲。這樣的化學(xué)品包括，但不限于，漂白劑、表面活性劑、氧化劑、促溶劑和酶。

捕獲可以是特異性的，使用作為非限制性實(shí)例的對(duì)抗只識(shí)別所有寄生蟲卵或某些分類群或特定種的寄生蟲卵上的卵成分(例如，GlcNac)或凝集素的抗體?；蛘?，捕獲可以是非特異性的，并且提供了一種從顆粒糞便殘?jiān)灰欢ㄊ撬屑S便組分中分離卵的方式。作為非限制性實(shí)例，在交聯(lián)劑，如碳二亞胺、醛等的存在下，通過化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，如N-乙基-馬來酰亞胺酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯、胺來實(shí)現(xiàn)這種捕獲?；蛘撸梢酝ㄟ^識(shí)別寄生蟲卵，并且識(shí)別糞便的其他成分的大分子，如蛋白質(zhì)或碳水化合物來實(shí)現(xiàn)這種捕獲。

基質(zhì)上的捕獲不需要依賴于特定的化學(xué)品來結(jié)合卵并且也可以通過物理方法來實(shí)現(xiàn)，例如，過濾，其中可以通過過濾(作為非限制性實(shí)例，100微米濾器)將卵與大的糞便顆粒分離。然后使含有卵的濾液通過較小的濾器(例如，10-40微米μm)來捕獲卵，同時(shí)除去較小的顆粒，包括孢子和真菌(如果檢測(cè)劑也可以結(jié)合這些細(xì)胞，其可能影響卵的檢測(cè))。然后可以按照別處所述的檢測(cè)和定量濾器上捕獲的卵?；蛘?，可以不使用固體基質(zhì)，從糞便捕獲和分離卵。例如，可以通過慢速離心除去大的糞便顆粒，并且通過較快旋轉(zhuǎn)(其無論如何太慢以致不能沉淀較小顆粒和酵母或真菌)從上清液收獲卵。其他物理方法，如擴(kuò)散、電泳、色譜或密度分離，也可以用于在檢測(cè)前分離卵。

卵檢測(cè)的方法取決于捕獲是特異性的還是非特異性的。如果捕獲步驟是特異性的，那么檢測(cè)方法的選擇就不太嚴(yán)格，因?yàn)橐呀?jīng)除去了雜質(zhì)糞便成分(例如，使用覆蓋了CBD的磁珠捕獲卵，并且隨后使用結(jié)合幾丁質(zhì)和其他糖聚合物(如纖維素)的用于檢測(cè)的熒光染料，例如，cacofluor白)。如果捕獲是非特異性的或半特異性的，并且還捕獲了非卵成分，那么檢測(cè)必須足夠特異性來區(qū)分卵和雜質(zhì)?？赡艿姆窍拗菩詸z測(cè)方法包括：目視檢查；連接并隨后光學(xué)檢測(cè)卵自身特異性的分子，如抗體、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、凝集素或其他蛋白質(zhì)，所有都綴合合適的報(bào)道分子，如熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、酶、有色微粒、量子點(diǎn)或膠體金屬。用于檢測(cè)一般細(xì)胞組分的化學(xué)方法也可以使用，并且這些包括是用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測(cè)試檢測(cè)蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)和核酸的方法。另外，從卵中釋放后，也可以使用卵DNA或RNA與特異性探針的雜交，或這樣的核酸通過PCR的擴(kuò)增。物理方法也可以用于提供檢測(cè)中的特異性(如果需要，在卵從基質(zhì)釋放后)，并且這樣的方法的非限制性實(shí)例包括離心、過濾、漂浮或顆粒計(jì)數(shù)(例如，使用如庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器、細(xì)胞分選器或粒徑分析儀這樣的設(shè)備)。在一些情況中，其中基質(zhì)是顆?；蛑樽拥男问剑梢酝ㄟ^珠子/顆粒自身的檢測(cè)來間接地檢測(cè)卵。用于這個(gè)目的的珠子/顆粒可以任選用合適的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)來標(biāo)記，以促進(jìn)檢測(cè)。據(jù)了解對(duì)于本文件的目的，短語(yǔ)“檢測(cè)試劑”包括實(shí)現(xiàn)檢測(cè)需要的所有組分。例如，由結(jié)合酶的抗體組成的檢測(cè)劑也根據(jù)定義進(jìn)一步包括合適的酶底物、緩沖劑和實(shí)現(xiàn)檢測(cè)需要的顏色變化需要的其他試劑。

可以使用仍然結(jié)合固體基質(zhì)的卵來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，或卵從基質(zhì)釋放后進(jìn)行檢測(cè)，并且檢測(cè)試劑的結(jié)合可以在捕獲前或捕獲后進(jìn)行。在一些情況中，可以通過用化學(xué)品處理卵來暴露或釋放可以被檢測(cè)到的成分，從而促進(jìn)檢測(cè)。這樣的化學(xué)品的非限制性實(shí)例包括表面活性劑、氧化劑、螯合劑和酶。

通過選擇合適的捕獲試劑和檢測(cè)試劑，卵計(jì)數(shù)可以將檢測(cè)樣品中的所有卵或來自整個(gè)門的不同分類群的卵轉(zhuǎn)向物種水平。這可以通過使用單種用于捕獲和檢測(cè)的試劑，或通過在捕獲和檢測(cè)步驟之一或兩者中使用多種試劑來實(shí)現(xiàn)。通過從不同的種類/物種分離卵，并且綴合合適的試劑，可以在單個(gè)測(cè)試中分解各種類別或物種的寄生蟲卵的豐度。

還可以通過加入能夠結(jié)合卵的多價(jià)分子，在溶液中誘導(dǎo)卵聚集，來促進(jìn)卵的捕獲。絮凝的卵可以從糞便懸浮液直接結(jié)合基質(zhì)或通過物理技術(shù)(如離心或漂浮)的分離后結(jié)合。

捕獲和檢測(cè)還可以同時(shí)進(jìn)行，例如，通過檢測(cè)卵結(jié)合已經(jīng)連接碳-納米纖維網(wǎng)絡(luò)的卵特異性抗體時(shí)的電壓變化，或通過光學(xué)方法，如表面等離子體共振或折射。

在一種情況中，可以在沒有卵的捕獲的情況下來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，其中通過熒光團(tuán)各向異性或偏振的變化來檢測(cè)用熒光團(tuán)標(biāo)記的卵特異性分子(如抗體或凝集素)。

因此，在一些方面中，本發(fā)明公開內(nèi)容提供了用于檢測(cè)環(huán)境樣品(例如，糞便樣品)中存在或不存在含幾丁質(zhì)的寄生蟲蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊的新方法。本文中公開的方法提供了可以快速并在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的方法。更重要地，本文中公開的方法能夠檢測(cè)以快速、成本效益的方式檢測(cè)來自寄生蟲蠕蟲的主要分類群(例如，絳蟲、線蟲、吸蟲和單殖吸蟲)的每一個(gè)的蠕蟲卵。感染動(dòng)物的蠕蟲寄生蟲的常見屬包括，例如，血矛線蟲屬(Haemonchus)、毛圓線蟲屬(Trichostrongylus)、胃線蟲屬(Ostertagia)、細(xì)頸線蟲屬(Nematodirus)、古柏線蟲屬(Cooperia)、蛔蟲屬(Ascaris)、仰口線蟲屬(Bunostomum)、結(jié)節(jié)線蟲屬(Oesophagostomum)、夏氏線蟲屬(Chabertia)、鞭蟲屬(Trichuris)、圓線蟲屬(Strongylus)、毛線屬(Trichonema)、網(wǎng)尾線蟲屬(Dictyocaulus)、毛細(xì)線蟲屬(Capillaria)、Pearsonema、異刺線蟲屬(Heterakis)、弓蛔蟲屬(Toxocara)、Ascardia、尖尾線蟲屬(Oxyuris)、Ancyclostoma、鉤蟲屬(Uncinaria)、弓蛔線蟲屬(Toxascaris)和Parascaris Ancylostoma、板口線蟲屬(Necator)、旋毛蟲屬(Trichinella)、毛細(xì)線蟲屬(Capillaria)、膨結(jié)線蟲屬(Dioctophyme)、艾美蟲屬(Eimeria)、球蟲屬(Coccidia)、傘滑刃線蟲屬(Bursaphelenchus)、胃線蟲屬(Ostertagia)、長(zhǎng)刺線蟲屬(Mecistocirrus)、Trychostrongylus、鞭蟲屬(Trichuris)、Bunostoinuin、Oesophagostomurn、夏氏線蟲屬(Chabertia)、夏氏線蟲屬(Chabertia)、鉤口線蟲屬(Ancylostoma)、并殖線蟲屬(Paragonimus)、貝利蛔線蟲屬(Baylisascaris)、滑刃線蟲屬(Aphelenchoides)、根結(jié)線蟲屬(Meliodogyne)、異皮線蟲屬(Heterodera)、球異皮線蟲屬(Globodera)、Nacobbus、短體線蟲屬(Pratylenchus)、莖線蟲屬(Ditylenchus)、劍線蟲屬(Xiphinema)、Longidorus、輪胎蟲屬(Trichodorus)、細(xì)頸線蟲屬(Nematodirus)和蟯蟲屬(Enterobius)。

本發(fā)明的方法可以用于人和/或獸醫(yī)使用以及用于環(huán)境測(cè)試領(lǐng)域中。

在一個(gè)方面中，本發(fā)明的方法提供了從哺乳動(dòng)物(例如，動(dòng)物或人受試者)獲得包括糞便樣品(例如，大便樣品)的生物樣品。例如，糞便樣品可以獲自馬、奶牛、豬、山羊、綿羊、美洲鴕、鹿、狗、貓、鳥或人的哺乳動(dòng)物糞便樣品?！矮@得”意思是收集、購(gòu)買或另外獲取糞便樣品。

在一些方面中，本文中公開的新方法包括使懷疑含有蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊的樣品接觸GlcNAc結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其片段。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“N-乙?；?D-葡糖胺(GlcNac)結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指包括天然或遺傳修飾的N-乙?；?D-葡糖胺(GlcNac)結(jié)合蛋白、對(duì)N-乙酰基-D-葡糖胺具有特異性的結(jié)合親和力的無機(jī)分子和有機(jī)分子，包括其任何片段、衍生物或類似物。

如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“N-乙?；?D-葡糖胺(GlcNac)結(jié)合蛋白”是指對(duì)N-乙?；?D-葡糖胺具有特異性的結(jié)合親和力的任何分子，包括天然或遺傳修飾的蛋白質(zhì)、肽或抗體，包括其任何片段、衍生物或類似物。示例性GlcNac結(jié)合蛋白包括，例如，凝集素、幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白或幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。

在一些實(shí)施方案中，本文中公開的新方法包括使懷疑含有蠕蟲卵或原生動(dòng)物卵囊的樣品接觸幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白或其片段。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白”是指對(duì)幾丁質(zhì)具有特異性的結(jié)合親和力的任何分子，包括天然或遺傳修飾的蛋白質(zhì)、肽、抗體。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白包括，例如，N-乙?；?D-葡糖胺(GlcNac)結(jié)合蛋白、幾丁質(zhì)酶和蛋白質(zhì)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。

如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“凝集素”是指與糖類(即，碳水化合物)特異性地相互作用的任何分子，包括蛋白質(zhì)，天然或遺傳修飾的。盡管本文中的實(shí)施例涉及天然植物凝集素，但本文中的術(shù)語(yǔ)“凝集素”是指來自任何物種的具有所需碳水化合物結(jié)合特異性的凝集素，所述物種包括但不限于，植物、動(dòng)物、昆蟲和微生物。植物凝集素的實(shí)例包括，但不限于，豆科凝集素家族，如ConA，大豆凝集素和小扁豆凝集素。植物凝集素的其他實(shí)例是凝集素的稻科和茄科家族。動(dòng)物凝集素的實(shí)例包括，但不限于，主要群體S-型凝集素、C-型凝集素、對(duì)-型凝集素和I-型凝集素的任何已知凝集素。

在一些實(shí)施方案中，凝集素選自麥胚凝集素(WGA)、大豆凝集素(SBA)、桑橙凝集素(MPL)、紅花紫荊凝集素(BPL)、曼陀羅凝集素(DSL)、番茄凝集素(LEL)、馬鈴薯凝集素(STL)和四棱豆-II(PTL-II)。

如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“CBD”是指與幾丁質(zhì)特異性地相互作用的任何分子，包括蛋白質(zhì)，天然或遺傳修飾的。CBD是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以源自幾丁質(zhì)酶或源自節(jié)肢動(dòng)物的表皮蛋白，并且在商業(yè)上可以從多個(gè)來源購(gòu)得，包括由New England Biolabs供應(yīng)的IMPACT^TM試劑盒。

術(shù)語(yǔ)“幾丁質(zhì)酶”通常描述底物幾丁質(zhì)特異性的酶。許多不同類型的幾丁質(zhì)酶是天然產(chǎn)生的。例如，幾丁質(zhì)酶可以在微生物中找到，如沙雷氏均屬(Serratia)、弧菌屬(Vibrio)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。

本發(fā)明公開內(nèi)容提供了與一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)部分綴合的N-乙酰基-D-葡糖胺結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括N-乙?；?D-葡糖胺結(jié)合蛋白。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”和“可檢測(cè)部分”可互換并且應(yīng)當(dāng)是指可以連接于(例如，綴合于)結(jié)合蛋白以由此使得結(jié)合蛋白可以通過儀器或方法來檢測(cè)的部分。

適用于所公開發(fā)明實(shí)施中的可檢測(cè)部分的非限制性實(shí)例包括，例如，半抗原、酶、發(fā)色團(tuán)、抗體表位、抗原、熒光團(tuán)、反射性同位素、納米顆粒、結(jié)合對(duì)的成員、發(fā)光化合物和金屬螯合物。

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“熒光標(biāo)記”和“熒光團(tuán)”可互換使用并且是指底物被不同波長(zhǎng)(激發(fā)波長(zhǎng))照射時(shí)在某一個(gè)波長(zhǎng)(發(fā)射波長(zhǎng))下發(fā)射電磁能量的任何物質(zhì)，并且打算包括能夠與樣品中的目標(biāo)分析物特異性地相互作用或反應(yīng)的化學(xué)或生化分子或其片段，以提供一個(gè)或多個(gè)光學(xué)信號(hào)。

用于本文中提供的方法中的代表性熒光團(tuán)包括，例如，綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素、5-異硫氰酸熒光素(FITC)、花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Bodipy染料(Invitrogen)和/或Alexa Fluor染料(Invitrogen)、丹酰、丹酰氯(DNS-C1)、5-(碘代乙酰胺)熒光素(5-IAF)、6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧-1,3-重氮-4-基氯化物(NBD-Cl)、溴化乙錠、螢蟲黃、羅丹明染料(5-羧基羅丹明6G氫氯化物、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、羅丹明-B-異硫氰酸酯(RITC(羅丹明-B-異硫氰酸酯)、羅丹明800)；四甲基羅丹明5-(和6-)異硫氰酸酯(TRITC))、Texas紅^TM、磺酰氯、萘亞甲基胺磺酸(包括但不限于1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)和6-(對(duì)-甲苯氨基)萘-2-磺酸(TNS))、蒽羰基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、熒光素-磷脂酰乙醇胺、Texas紅-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰膽堿、芴基-磷脂酰膽堿、部花青540、萘苯乙烯、3,3'二丙基硫雜二羰菁(diS-C3-(5))、4-(對(duì)-二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶(二-5-ASP)、Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羥基琥珀酰亞胺、Cy-7-異硫氰酸酯、IR-125、噻唑橙、天青B、尼羅藍(lán)、鋁酞菁、噁嗪1,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙錠均二聚物、N(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉(MQAE)、Fura-2、鈣綠、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、phytofiuors、暈苯和金屬-配體復(fù)合物。

用于本文中提供的方法中的半抗原包括，例如，地高辛、谷胱甘肽和生物素。

用于本文中提供的方法中的酶包括，例如，堿性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶(HRP)、大豆過氧化物酶(SBP)、脲酶、β-內(nèi)酰胺酶和葡萄糖氧化酶。

在一些實(shí)施方案中，GlcNac結(jié)合蛋白是抗體。抗幾丁質(zhì)(例如，抗-GlcNac抗體)已經(jīng)公開于US5004699中，那些抗體可以用于檢測(cè)真菌和酵母(US5004699)。

可檢測(cè)部分可以是結(jié)合對(duì)的特定成員(第一成員或第二成員)。用于本文中提供的方法中的結(jié)合對(duì)包括，例如，生物素/鏈霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/captavidin、表位/抗體、蛋白A/免疫球蛋白、蛋白G/免疫球蛋白、蛋白L/免疫球蛋白、GST/谷胱甘肽、His-標(biāo)記物/金屬(例如，鎳、鈷或銅)、抗原/抗體、FLAG/M1抗體、麥芽糖結(jié)合蛋白/麥芽糖、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白/鈣調(diào)蛋白、酶-酶底物和受體-配體結(jié)合對(duì)。在一些實(shí)施方案中，GlcNac結(jié)合蛋白與結(jié)合對(duì)的第一成員(例如，生物素、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、captavid、抗體、抗原、蛋白A、蛋白G、蛋白L、GST、His-Tag、FLAG、MBP、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白、酶、受體或配體)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，GlcNac結(jié)合蛋白是麥胚凝集素且可檢測(cè)部分是熒光素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GlcNac結(jié)合蛋白是含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白且可檢測(cè)部分是熒光素。

在一些方面中，本文中提供的方法使用直接結(jié)合幾丁質(zhì)的染料，并且暴露于熒光激發(fā)光時(shí)發(fā)出熒光，如U.S.6,440,388中公開的染料。結(jié)合或綴合幾丁質(zhì)并且在紫外光或可見光中發(fā)出熒光的染料的非限制性實(shí)例包括calcofluor白、Uvitex 3B(聯(lián)苯乙烯聯(lián)苯熒光增白劑)、Rylux BA、Rylux BSU(1,4-苯二磺酸-2,2'-[亞乙基二基雙[(3-磺基-4,1-亞苯)亞氨基[6-雙(2-羥乙基)氨基]-1,3,5-三六鈉鹽)(Ostacolor，Pardubice，Czech Republic)和Blankophor(4,4'-雙{(4-苯胺基)-6-嗎啉代-1,3,5-三嗪-2-基)氨基}二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉)。

在一些實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)的第一成員與GlcNac結(jié)合蛋白綴合且結(jié)合對(duì)的第二成員固定于固體支持物上。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)的第一成員與GlcNac結(jié)合蛋白綴合且結(jié)合對(duì)的第二成員與酶、抗體表位、抗原、熒光團(tuán)、放射性同位素、納米顆粒、第二結(jié)合對(duì)的成員和金屬螯合物綴合。例如，結(jié)合對(duì)的第一成員可以是生物素，而結(jié)合對(duì)的第二成員可以是鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或capravidin，而結(jié)合對(duì)的第二成員與酶(例如，堿性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶(HRP)、脲酶、大豆過氧化物酶(SBP)、β-內(nèi)酰胺酶或葡萄糖氧化酶)綴合。

在一些情況中，幾丁質(zhì)(例如，GlcNac)可以被多糖莢膜或蠕蟲卵中發(fā)現(xiàn)的其他類型的大分子包衣部分或全部地阻隔。然而，幾丁質(zhì)是非常強(qiáng)壯的，因此，在幾丁質(zhì)檢測(cè)前，可以使用蛋白酶或多糖(如，葡聚糖酶或甘露聚糖酶)的酶消化可以用于滲透或除去阻隔層?；蛘?，可以使用極端處理，如在漂白溶液(1％NaOCl、0.5M NaOH，或具有或高或低濃度的單獨(dú)化學(xué)品的相似組合物)，如US2007/0099234中所述的)中漂白來除去遮蓋層。因此，在一些實(shí)施方案中，本文中提供的方法進(jìn)一步包括，在使蠕蟲卵接觸GlcNac結(jié)合蛋白之前，用漂白劑或其他外殼暴露溶液處理樣品的步驟。

根據(jù)本文中提供的方法，可以通過兩步法：卵捕獲和卵檢測(cè)，在水或其他的合適液體(包括緩沖液)中的動(dòng)物糞便的懸浮液中檢測(cè)寄生蟲卵。

在一些方面中，本文中所述的方法包括通過過濾捕獲卵，該方法包括提供包含懸浮于樣品緩沖液中的糞便樣品的糞便溶液，使糞便溶液流過第一濾膜，形成第一濾液，并使第一濾液流過第二濾膜，以在第二濾膜上捕獲蠕蟲卵。

在一個(gè)方面中，該方法包括獲得包含懸浮于樣品緩沖液中的糞便樣品的糞便溶液，使糞便溶液流過第一濾膜，形成第一濾液，并使第一濾液流過第二濾膜，其中蠕蟲卵捕獲在第二濾膜上。該方法進(jìn)一步包括使第二濾膜上捕獲的蠕蟲卵接觸與可檢測(cè)部分綴合的GlcNac結(jié)合蛋白，并且基于可檢測(cè)部分的信號(hào)強(qiáng)度來檢測(cè)糞便樣品中存在或不存在蠕蟲卵。

在一個(gè)方面中，本文中提供的方法包括使糞便溶液流過第一濾膜(例如，過濾器)。使糞便溶液流過第一濾膜允許將卵與糞便顆粒分離。因此，第一濾膜包含允許卵自由通過過濾器的孔徑(例如，具有至少80微米的孔徑)并且還捕獲糞便顆粒。

因此，本文中提供的方法包括使用第一過濾裝置。通常選擇第一過濾裝置的孔徑，使得孔足夠大，允許蠕蟲卵和原生動(dòng)物卵囊自由通過，同時(shí)足夠小，以從糞便溶液捕獲細(xì)顆粒(例如，小于約450微米，小于約425微米，或小于約400微米)。在一些實(shí)施方案中，第一過濾裝置的第一濾膜包含約85微米至約350微米，約100微米至約300微米，約125微米至約250微米，約150微米至約200微米，或約85微米，約90微米，約95微米，約100微米，約120微米，約125微米，約150微米，約175微米，約200微米，約250微米，約300微米，約350微米或至多約400微米的孔徑。

在一個(gè)方面中，本文中提供的方法包括使糞便溶液流過第二濾膜(例如，過濾器)。因此，第二濾膜包含允許流體自由通過過濾器并且還捕獲卵或卵囊的孔徑(例如，具有80微米或更小的孔徑)。

因此，本文中提供的方法包括使用第二過濾裝置。通常選擇第二過濾裝置的孔徑，使得孔足夠大，允許流體和細(xì)顆粒自由通過，同時(shí)是限定大小的(即，足夠小)，以從糞便溶液捕獲蠕蟲卵。寄生蟲蠕蟲卵的特征性大小和直徑為約20微米至80微米。因此，為了從糞便溶液捕獲蠕蟲卵，第二過濾裝置的第二濾膜包含約5至約45微米，10至約45微米，15至約45微米，約20微米至約45微米，約25微米至約40微米，約30微米至約35微米，或約5微米，約10微米，約15微米，約20微米，約25微米，約30微米，約35微米，約40微米，或約45微米的孔徑。因?yàn)樵S多原生動(dòng)物卵囊比蠕蟲卵小，還可以使用更小的孔過濾器，例如，約0.1至約10微米或約5至約20微米。

糞便樣品中的無關(guān)糞便殘?jiān)淖钌倩瘜?duì)于一致的糞便卵計(jì)數(shù)是有益的，并且通常，必須在糞便適于接觸GlcNac結(jié)合蛋白之前，從糞便樣品中濾掉大的顆粒。因此，本文中公開的方法任選包括使用整批過濾裝置來除去較大的顆粒和殘?jiān)?。通常選擇整批過濾裝置的孔徑，使得孔足夠大，允許蠕蟲卵和原生動(dòng)物卵囊自由通過，同時(shí)足夠小，以從糞便材料捕獲大的顆粒(例如，大于或等于400微米的顆粒)和殘?jiān)＠?，整批過濾裝置的濾膜包含約400微米至約800微米，約425微米至約750微米，約450微米至約700微米，約500微米至約650微米，或約550微米至約600微米的孔徑。在一些實(shí)施方案中，整批過濾裝置可以直接連接用于收集糞便樣品的容器(例如，收集容器)。在一些實(shí)施方案中，整批過濾裝置具有約400微米至約450微米的孔徑，第二濾膜具有約85微米至約120微米的孔徑，和第二濾膜具有約20微米至約30微米的孔徑。

如本領(lǐng)域已知的，存在許多方式使一定體積的液體(例如，溶液)流濾膜，如重力流動(dòng)、壓力或借助泵。

本發(fā)明的方法通過用合適的報(bào)道分子(例如，可檢測(cè)部分)標(biāo)記幾丁質(zhì)，使得可以觀察含幾丁質(zhì)的寄生蟲蟲卵和原生動(dòng)物卵囊。通過合適的報(bào)道分子(例如，可檢測(cè)部分)結(jié)合幾丁質(zhì)后，可以(1)通過與色卡比較，通過使用廉價(jià)的單波長(zhǎng)比色計(jì)或熒光計(jì)，或使用照相機(jī)、手機(jī)、平板電腦或其他數(shù)字成像裝置拍照后通過數(shù)字化定量顏色，或(2)在熒光幾丁質(zhì)-結(jié)合衍生物的情況中，通過在使用配備了合適光學(xué)的手機(jī)或其他照相機(jī)的合適照射下，結(jié)合自動(dòng)化成像系統(tǒng)，將樣品成像，從而通過觀察完成卵的定量。

用形成可檢測(cè)光響應(yīng)的光波長(zhǎng)照射可檢測(cè)部分，并且用檢測(cè)光響應(yīng)的裝置觀察。照射時(shí)，如通過紫外或可見波長(zhǎng)照射，熒光化合物，包括結(jié)合GlcNac結(jié)合蛋白或特異性結(jié)合對(duì)成員的那些，呈現(xiàn)強(qiáng)烈的可見吸收以及熒光發(fā)射。用于照射本發(fā)明的熒光化合物的選定設(shè)備包括，但不限于，有利地，用于照射熒光化合物的設(shè)備包括便攜式照射燈(例如，手持式紫外照射燈)。這些照射源任選整合至便攜式激光掃描儀、熒光微平板閱讀器、熒光凝膠成像儀、標(biāo)準(zhǔn)或迷你熒光計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)或迷你比色計(jì)或色譜檢測(cè)器。在檢測(cè)之前，通過經(jīng)由防止一些或全部激發(fā)光通過的光濾波器，減少或除去過量的激發(fā)光。這種熒光發(fā)射任選通過目視檢查來檢測(cè)，或通過使用以下的任一種成像裝置來檢測(cè)：光學(xué)相機(jī)、移動(dòng)電話、智能電話、平板電腦、便攜式計(jì)算機(jī)、計(jì)算機(jī)和掃描儀。

本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)糞便樣品中存在或不存在蠕蟲卵和原生動(dòng)物卵囊的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒可以采用各種形式。通常，試劑盒將包括適用于檢測(cè)樣品中的蠕蟲卵的試劑。任選地，試劑盒可以含有一種或多種對(duì)照樣品。

本發(fā)明的試劑盒任選包含收集容器，其中可以放置一定量的糞便樣品并通過合適的緩沖液稀釋。然后可以將容器密封并且將糞便樣品和緩沖液振蕩或均質(zhì)，以產(chǎn)生均勻混合的糞便溶液。緩沖液可以是普通自來水或合適的緩沖或漂浮介質(zhì)。收集容器可以是用于糞便收集的一次性容器或可再使用的容器。

收集容器可以是例如常規(guī)加蓋試管的形式，具有刻度，其表明放置在試管內(nèi)部的原始大便樣本的體積，以及待加入的稀釋液體的量。

在一些實(shí)施方案中，收集容器連接整批過濾裝置。

試劑盒還可以包含用于收集糞便樣品的構(gòu)造，如用于大便收集的一次性容器等，以及挖取設(shè)備，例如，小勺形狀的，以挑取確定量的糞便材料。挖取設(shè)備(勺)可以是容器蓋的整體部分。

在一些實(shí)施方案中，如本文中所述的，本發(fā)明的試劑盒包含第一過濾裝置，任選第二過濾裝置和任選整批過濾裝置。

本發(fā)明的試劑盒包含含有GlcNAc結(jié)合蛋白的試劑(例如，試劑溶液)。GlcNac結(jié)合蛋白可以是如本文中所述的凝集素或CBD。任選地，GlcNac結(jié)合蛋白與可檢測(cè)部分綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑含有能夠直接結(jié)合或綴合于幾丁質(zhì)并且暴露于光時(shí)發(fā)射熒光的染料，以及發(fā)射能夠從結(jié)合幾丁質(zhì)的染料發(fā)射熒光的波長(zhǎng)的光源。

試劑盒可以包括用于檢測(cè)可檢測(cè)部分的便攜式系統(tǒng)，如熒光計(jì)、比色計(jì)、分光光度計(jì)或其他成像裝置。試劑盒還可以包括設(shè)計(jì)用于支撐樣品和檢測(cè)可檢測(cè)部分的便攜式系統(tǒng)的支架。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含支撐或含有成像裝置的支架。

試劑盒的一些部分(例如，檢測(cè)裝置或過濾系統(tǒng)的可重復(fù)使用的部分)可以與試劑盒的其他部分(單次使用的過濾器模塊的檢測(cè)試劑)分開銷售。

本發(fā)明的試劑盒可以用于人和/或獸醫(yī)使用。

以上列出的一般原則可以用于設(shè)計(jì)大量用于檢測(cè)糞便懸浮液中的寄生蟲卵的存在和豐度的系統(tǒng)。為了說明的目的，以下是使用這些原則可以產(chǎn)生的幾種卵計(jì)數(shù)測(cè)定法的一些非限制性實(shí)例。提供這些實(shí)施例只是用于說明許多其中可以實(shí)施本發(fā)明的不同模式中的一些的目的，而不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是對(duì)整個(gè)發(fā)明的描述。

應(yīng)當(dāng)注意的是寄生蟲卵的成功檢測(cè)和定量需要從整批的糞便樣品分離(和理想地濃縮)卵的方法，以及隨后檢測(cè)所述卵的方法。如果分離方法還導(dǎo)致可能的其他糞便成分的共同分離，并且檢測(cè)方法不能區(qū)分，則該測(cè)定法將不是特異性的。例如，Zhang和McReynold²³公開了使用來自各種幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)檢測(cè)生物樣品中的幾丁質(zhì)，用于診斷目的。然而，由于許多生物體，例如，酵母、其他真菌、線蟲(及其卵)全部含有幾丁質(zhì)，因此僅僅檢測(cè)幾丁質(zhì)不能被認(rèn)為是這些生物體中的任一種的確鑿診斷。相似地，Winters²⁴公開了使用抗幾丁質(zhì)抗體來檢測(cè)生物樣品中的幾丁質(zhì)，作為用于診斷酵母和真菌存在的方法。然而，Winters沒有預(yù)見檢測(cè)蠕蟲或其卵中的幾丁質(zhì)的可能性，并且因此所公開的測(cè)定法不能被認(rèn)為對(duì)于酵母或真菌是特異性的，也不能被認(rèn)為對(duì)于蠕蟲或其卵是特異性的，除非可以排除存在這些組之一的可能性。在動(dòng)物糞便(并且特別是針對(duì)食草動(dòng)物)的情況中，酵母和真菌細(xì)胞(和孢子)以及昆蟲片段的存在是可能的，并且因此單獨(dú)的幾丁質(zhì)存在不能明確地認(rèn)為是寄生蟲卵存在的診斷，在其他含幾丁質(zhì)生物體的潛在變化背景的存在下，寄生蟲卵的定量也不可能認(rèn)為是可靠的。

還提出了各種凝集素可以用于區(qū)分不同物種的寄生蟲及其卵。然而，公知大部分凝集素是半特異性的，因?yàn)樗鼈冏R(shí)別可以存在于各種生物體中的糖結(jié)構(gòu)。因此，盡管凝集素結(jié)合可以區(qū)分反應(yīng)性和非反應(yīng)性物種，但作為一般原則，單獨(dú)的凝集素結(jié)合不能提供寄生蟲感染的確鑿診斷，除非所有其他可能的污染生物體已經(jīng)顯示出是結(jié)合陰性的。

在一些實(shí)施方案中，將糞便樣品懸浮于水或合適的緩沖液，如但不限于，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，并接觸覆蓋了能夠結(jié)合寄生蟲卵的試劑(例如，GlcNac結(jié)合蛋白)的珠子。試劑可以只是這些卵特異性的，或是目標(biāo)分類群的卵特異性的，或是卵和糞便的其他成分都特異性的。特異性試劑包括，例如，針對(duì)特定的目標(biāo)生物體產(chǎn)生的或識(shí)別多個(gè)生物體群的單克隆抗體，或針對(duì)多個(gè)群或單個(gè)生物體產(chǎn)生的多克隆抗體，或多個(gè)單克隆抗體和/或多克隆抗體的混合物。非特異性試劑包括蛋白質(zhì)，如CBD或凝集素或其混合物，單獨(dú)的或與抗體組合。在CBD的情況中，可以通過在高于7的升高pH下和/或在高鹽濃度下(例如，但不限于0.5M NaCl)應(yīng)用CBD來增強(qiáng)結(jié)合。對(duì)于本發(fā)明的目的，據(jù)了解CBD不僅是指來自任何物種的單個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而且是指通過化學(xué)綴合或通過另兩個(gè)具有或沒有非CBD間插序列的CBD的串聯(lián)重復(fù)的遺傳融合的表達(dá)產(chǎn)生的多個(gè)CBD。還據(jù)了解CBD不必須是自然界中發(fā)現(xiàn)的天然序列，而且還可以是能夠結(jié)合幾丁質(zhì)的人工肽序列，或CBD的突變變體，其與天然序列相比具有相同或不同的結(jié)合親和力。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液還可以任選含有有助于暴露卵上所需目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的試劑，并且包括，但不限于，表面活性劑(如Tween-20、十二烷基硫酸鈉和Triton X-100)、氧化劑(如次氯酸鈉、N-氯甲苯磺?；０坊蜻^氧化氫)、促溶劑(如脲或鹽酸胍)、酶(如蛋白酶、糖苷酶或脂酶)或漂白劑。

結(jié)合時(shí)，將加載了卵(和可能的其他糞便成分)的珠子與糞便的剩余部分通過物理分離，例如，通過過濾(使用具有足以截留珠子及其負(fù)載物但不截留其他糞便殘?jiān)目讖降倪^濾器)，或通過離心。或者，珠子可以用鐵包埋，并且可以通過施加磁場(chǎng)，將這樣的順磁性或磁性珠子(其可以容易地在商業(yè)上購(gòu)得)與糞便懸浮液的剩余部分分離。

珠子分離時(shí)，將珠子懸浮于小體積(例如100μl)緩沖液中并且使用顯微鏡通過光學(xué)檢查。盡管這種方法沒有免去目視檢查的不便利性，但其允許從糞便分離和計(jì)數(shù)大量的卵?，F(xiàn)有的方法只取樣幾克糞便樣品的1/25至1/200，導(dǎo)致低靈敏度和高可變性。這種方法通過消除這樣的子取樣消除了這兩個(gè)問題。

在一個(gè)方面中，如圖1中所繪，按照實(shí)施例1中所述的，使用磁珠分離卵。在一個(gè)實(shí)施方案中，附著于珠子上的捕獲試劑是CBD，其通過6個(gè)組氨酸殘基的序列在其N-或C-端可逆地附著于磁珠上，所述組氨酸殘基序列結(jié)合到珠子表面上的鎳原子上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CBD與載體，如麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合，其用于可逆地使CBD附著于覆蓋了麥芽糖的珠子上。在這些實(shí)施方案中，可以通過添加作為非限制性實(shí)例的組氨酸、咪唑或麥芽糖，使CBD脫離珠子。

在分離卵和除去糞便殘?jiān)鼤r(shí)，通過添加合適的洗脫劑(例如，組氨酸(或咪唑)或麥芽糖的溶液)，從珠子釋放結(jié)合的材料。然后將珠子再次附著于磁鐵上并且使含有釋放的卵和糞便材料的溶液通過過濾器。這個(gè)步驟的目的是將也可以結(jié)合CBD的真菌和酵母細(xì)胞與卵分離。選擇過濾器的孔徑，使得允許較小(5-40μm)的酵母和真菌細(xì)胞通過，同時(shí)截留較大的卵細(xì)胞(50-100μm)，由此提供在這樣的系統(tǒng)中單獨(dú)的CBD沒有提供的特異性。吸出溶液時(shí)，只有卵(帶有結(jié)合的CBD)和珠子(其通過磁鐵粘附到試管的側(cè)面)保留在測(cè)試室中。

由于溶液的吸出除去了洗脫分子(例如，組氨酸(或咪唑)或麥芽糖)，所以添加新鮮的緩沖液和除去磁鐵允許卵通過附著的CBD再次結(jié)合珠子。由于珠子因其鐵含量是棕色的，所以在除去未結(jié)合卵的珠子后，珠子自身可以用于定量存在的卵的數(shù)量。由于珠子自身比卵小得多(商業(yè)上可購(gòu)得的珠子大小范圍為0.2至5微米)，所以通過第二次經(jīng)過相同的過濾器來除去未結(jié)合的珠子(盡管也可以使用不同的試管和新鮮的過濾器)。

然后將截留的、卵結(jié)合的珠子重新懸浮于新鮮緩沖液中并且通過將懸浮液導(dǎo)入檢測(cè)室中來定量。室的基部含有將卵-珠子復(fù)合物吸引至小的表面積中的小磁鐵。這個(gè)檢測(cè)室的目的是濃縮卵/珠子復(fù)合物，以鑒別珠子顏色并允許與標(biāo)準(zhǔn)化色卡相比來視覺測(cè)定顏色強(qiáng)度，從而定量樣品中存在的珠子的數(shù)量(并因此定量卵的數(shù)量)?；蛘?，可以通過光學(xué)傳感器將該區(qū)域成像，以獲得更準(zhǔn)確的顏色強(qiáng)度的讀出。

任選使用分光光度計(jì)或單波長(zhǎng)比色計(jì)來測(cè)量卵/珠子懸浮液的濁度，從而通過光學(xué)測(cè)定珠子的數(shù)量(并且因此測(cè)定卵的數(shù)量)。

在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)量其散射光的能力，在最初從珠子釋放時(shí)，對(duì)卵進(jìn)行定量。酵母和真菌，如果存在，可以通過選擇合適的用于檢測(cè)的光的波長(zhǎng)，或通過使用粒徑分析儀，基于其較小的大小，與卵區(qū)分開來。

在其他實(shí)施方案中，捕獲試劑不必須是CBD，并且作為非限制性實(shí)例，可以是抗體(單克隆或多克隆的)或凝集素(或凝集素的混合物)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，若捕獲試劑只對(duì)寄生蟲卵是特異性的，或只對(duì)臨床感興趣的卵的子集是特異性的，則只使用一個(gè)吸出步驟(沒有使用洗脫劑)來除去未結(jié)合的珠子并且隨后如上所述幫助卵/珠子復(fù)合物的定量。

在再另一個(gè)實(shí)施方案中，如果捕獲試劑還結(jié)合酵母和/或真菌并且如果結(jié)合珠子的酵母和/或真菌細(xì)胞沒有形成足夠大的以被過濾器(其孔徑足夠小，以截留卵/珠子聚集物/復(fù)合物)截留的聚集物或復(fù)合物，或如果酵母和/或真菌載荷沒有在該測(cè)試中產(chǎn)生臨床上有意義的背景，那么只使用一個(gè)吸出步驟(沒有使用洗脫劑)來除去未結(jié)合的珠子和酵母/真菌(如果存在)并且隨后如上所述幫助卵/珠子復(fù)合物的定量。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過利用作為非限制性實(shí)例的蛋白質(zhì)測(cè)定法、碳水化合物測(cè)定法的顯色反應(yīng)，或通過使其他識(shí)別分子，如抗體、凝集素或CBD附著于卵上來實(shí)現(xiàn)結(jié)合的卵的檢測(cè)。在后一種情況中，將分子與報(bào)告基團(tuán)綴合，所述報(bào)告基團(tuán)如發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、有色微珠、量子點(diǎn)、膠態(tài)金屬或顯色酶(例如，HRP或AP)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，并且在卵特異性捕獲的情況中，可以使用如別處詳述的那些方法捕獲卵并洗滌珠子后立即進(jìn)行檢測(cè)，并且不需要過濾步驟。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，在卵特異性捕獲的情況中，可以使用顆粒計(jì)數(shù)裝置，如庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器、細(xì)胞分選器或粒徑分析儀，進(jìn)行卵的檢測(cè)，使用或未用從珠子的釋放。

在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，用試劑處理卵/珠子復(fù)合物，以釋放用于化學(xué)檢測(cè)的成分。這樣的試劑包括，但不限于，蛋白酶、糖苷酶(包括幾丁質(zhì)酶)、表面活性劑、促溶劑和氧化劑。

本文中公開的方法允許在現(xiàn)場(chǎng)由獸醫(yī)或由動(dòng)物的主人自身定量糞便卵載荷，因?yàn)椴恍枰嘿F的、專門化的設(shè)備或訓(xùn)練(磁鐵、珠子、單波長(zhǎng)比色計(jì)全部可以廉價(jià)制造并且不需要專門化的訓(xùn)練來操作)。

在一個(gè)方面中，本文中公開的方法包括使用結(jié)合到固體表面上的捕獲試劑(如抗體、凝集素或CBD)，所述固體表面如二維條狀材料，盡管實(shí)際形狀可以按照需要而改變。條帶可以由任何相容的材料組成，所述材料包括但不限于，塑料(如聚乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯)或其他聚合物(如纖維素、磷酸纖維素或聚偏二氟乙烯)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的許多反應(yīng)性化學(xué)品之一并根據(jù)表面化學(xué)的性質(zhì)，使捕獲試劑結(jié)合到表面上。能夠使蛋白質(zhì)結(jié)合到這樣表面上的可能的、非限制性分子包括辛二酸二琥珀酰亞胺酯、己二亞氨二甲酯、琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯或N-羥基琥珀酰亞胺。捕獲試劑不需要施用于整個(gè)表面并且可以定位于特定區(qū)域，如點(diǎn)或條帶。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲試劑以上述方式可逆地附著于表面上。

然后將表面接觸糞便懸浮液，以允許卵結(jié)合并隨后洗滌除去糞便雜質(zhì)。然后將條帶接觸含有檢測(cè)試劑的溶液。檢測(cè)試劑可以再次是與合適的報(bào)道分子綴合的能夠結(jié)合卵的任一種分子，包括抗體、凝集素或CBD。報(bào)道分子需要能夠在表面上產(chǎn)生可見信號(hào)并且包括發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、酶、膠態(tài)金屬、量子點(diǎn)或有色微粒。在酶的情況中，將表面洗滌并隨后接觸合適的底物，其產(chǎn)物必須是不溶的，以便沉積在表面上，用于觀察。此類系統(tǒng)的兩個(gè)非限制性實(shí)例為：酶是辣根過氧化物酶，且底物是4-氯-1-萘酚或3,3’-二氨基聯(lián)苯胺，或酶是堿性磷酸酶，且底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽和硝基四氮唑藍(lán)。

顏色沉積時(shí)，其與基底上捕獲的卵的數(shù)量成比例，通過與校準(zhǔn)的色卡的視覺比較或通過使用如比色計(jì)或密度計(jì)這樣的裝置來定量卵的數(shù)量。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用底物進(jìn)行了固定的卵的酶檢測(cè)，底物的可溶性有色產(chǎn)物釋放至溶液中，以產(chǎn)生隨后可以通過光學(xué)檢測(cè)的顏色變化。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，并且在其中捕獲試劑可逆地結(jié)合到表面上的情況中，結(jié)合和洗滌后釋放卵/捕獲試劑，并隨后在溶液中檢測(cè)。

如在其他實(shí)施方案中，任選在任一階段通過以上已經(jīng)公開的試劑來處理卵，以暴露位點(diǎn)或釋放檢測(cè)分子，所述位點(diǎn)或檢測(cè)分子是捕獲或檢測(cè)所必需的。

在一些方面中，本文中公開的方法采用用于例如消費(fèi)者家庭懷孕測(cè)試中的相似形式的側(cè)流格式。將含有樣品室的裝置的一端放入溶液中，或?qū)⑷芤旱臉悠贩峙渲猎O(shè)備的室中。所述室含有檢測(cè)劑，如，但不限于，與如有色微粒、量子點(diǎn)或膠態(tài)金屬這樣的檢測(cè)劑綴合的抗體、凝集素或CBD。

進(jìn)入室時(shí)，樣品(包括現(xiàn)在結(jié)合檢測(cè)試劑的卵)在固體基質(zhì)(如紙或其他燒結(jié)的聚合物)上通過毛細(xì)管作用形成條帶。將此條帶的一部分用與上述那些相似的捕獲試劑覆蓋，允許將卵和相關(guān)的有色檢測(cè)試劑固定。

通過卵/試劑復(fù)合物的粘附在覆蓋了捕獲試劑的條帶區(qū)域上產(chǎn)生顏色是糞便中存在的卵的數(shù)量的診斷。可以通過與校準(zhǔn)的色卡比較，或通過使用電荷耦合裝置或相似裝置將顏色成像接著進(jìn)行合適的信號(hào)處理，目測(cè)確定數(shù)量。

為了最大化卵的捕獲，理想地捕獲試劑是卵最特異性的，同時(shí)檢測(cè)試劑可以是識(shí)別力較低的，盡管反過來也是可以的。如在別處所述的其他實(shí)施方案中，針對(duì)捕獲和檢測(cè)試劑的主要標(biāo)準(zhǔn)是與其兩者的結(jié)合對(duì)除了寄生蟲卵或寄生蟲卵的子集以外的所有糞便組分是互斥的。

如在其他實(shí)施方案中，可以任選通過以上已經(jīng)公開的試劑處理卵，以暴露位點(diǎn)或釋放分子，所述位點(diǎn)或分子是捕獲或檢測(cè)所必需的。

在一些實(shí)施方案中，條帶含有兩個(gè)或更多個(gè)被各自對(duì)不同物種的分類群具有特異性的捕獲試劑覆蓋的區(qū)域。在這種情況中，許多相當(dāng)于不同種類寄生蟲卵的數(shù)量的色區(qū)出現(xiàn)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品室包含多種檢測(cè)試劑，每種可識(shí)別來自不同物種或分類群的卵。然后將標(biāo)記的卵捕獲在單個(gè)區(qū)域中并且通過將該區(qū)域成像并隨后通過計(jì)算將每種有色試劑的相對(duì)貢獻(xiàn)(并且因此重建卵類型/數(shù)量)重建成待檢測(cè)的最終顏色來測(cè)定每種類型的卵的量。

在施用裝置之前或施用于裝置之前，可以將檢測(cè)試劑與糞便懸浮液直接混合，并且因此沒有存儲(chǔ)在裝置的樣品室中。

如在其他實(shí)施方案中，可以任選在任一個(gè)階段通過以上已經(jīng)公開的試劑處理卵，以暴露位點(diǎn)或釋放分子，所述位點(diǎn)或分子是捕獲或檢測(cè)所必需的。

在一些方面中，所述方法包括用其自身使用上述方法固定在透明表面上的合適捕獲試劑來捕獲卵。透明表面可以采用任何容器的形式，包括，但不限于，試管、比色皿、含有一個(gè)或多個(gè)孔的盤或板。

在希望除去糞便殘?jiān)鼤r(shí)，加入以以上所述的一種或多種方式標(biāo)記的檢測(cè)試劑。目測(cè)結(jié)合的檢測(cè)試劑的顏色(或通過檢測(cè)試劑的酶活性產(chǎn)生的顏色)并與校準(zhǔn)的色卡進(jìn)行比較，或通過使用如比色計(jì)、微平板讀出器、分光光度計(jì)或熒光計(jì)這樣的裝置來測(cè)量。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，不存在檢測(cè)試劑并且通過測(cè)量卵結(jié)合時(shí)透明表面的折射率的變化，或通過其他光學(xué)方法，如表面等離子體共振或折射法來確定卵的結(jié)合。

如在其他實(shí)施方案中，可以任選在任一個(gè)階段通過以上已經(jīng)公開的試劑處理卵，以暴露位點(diǎn)或釋放分子，所述位點(diǎn)或分子是捕獲或檢測(cè)所需的。

在這個(gè)實(shí)施方案中，并且為了說明的目的，其實(shí)例描繪于圖2中，使用物理方法-即過濾，捕獲卵并與酵母和真菌分離。將卵在合適的容器中均質(zhì)并隨后通過具有有助于卵通過的孔徑(例如，約85微米至約350微米)的第一濾膜。還可以選擇孔徑來除去較大的糞便殘?jiān)⒁虼藥椭吻鍢悠凡⒁虼私档驮谠摲椒ㄖ蟮牟襟E中阻塞過濾器的可能性。

然后將濾液放入第二容器中并且通過第二濾膜，其孔徑足夠小以截留蠕蟲卵(例如，約20微米至約45微米)，但允許較小的顆粒通過和去除，包括酵母和真菌細(xì)胞。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使樣品通過多個(gè)過濾器或按序減小的孔徑，以逐漸除去較大的顆粒，同時(shí)在到達(dá)截留卵的最后一個(gè)過濾器前截留卵。

通過過濾器捕獲卵時(shí)，加入卵結(jié)合/檢測(cè)試劑，以結(jié)合卵。結(jié)合試劑可以包括，但不限于，GlcNac結(jié)合蛋白(例如，抗體、凝集素或CBD)。檢測(cè)試劑可以包括，但不限于，酶、發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、有色微球體或納米球體、量子點(diǎn)或膠態(tài)金屬。結(jié)合試劑可以與捕獲試劑直接化學(xué)耦合，形成單分子實(shí)體(例如，使用本領(lǐng)域公知的蛋白交聯(lián)化學(xué)的卵特異性抗體或CBD與酶的化學(xué)耦合，如辣根過氧化酶)，或可以通過非共價(jià)(例如，靜電或疏水性)相互作用來結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合試劑包括His6標(biāo)記物并且檢測(cè)試劑含有連接的金屬，如鎳、銅或鈷，以促進(jìn)相互作用。如果結(jié)合試劑和檢測(cè)試劑不是共價(jià)結(jié)合的，那么在加入卵樣品之前，將其預(yù)先混合來促進(jìn)其相互作用，可以分開添加，以允許它們?cè)诼训拇嬖谙掳l(fā)生相互作用。

在酶檢測(cè)試劑的情況中，酶可以任選作為結(jié)合試劑和酶兩者的基因融合體來產(chǎn)生，以形成單個(gè)分子實(shí)體。一個(gè)非限制性實(shí)例可以是CBD與堿性磷酸酶基因的融合子，以產(chǎn)生可以結(jié)合并用于檢測(cè)卵的CBD-AP融合蛋白。在這樣的情況中，可以制得編碼多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(包括相同結(jié)構(gòu)域或多個(gè)不同結(jié)構(gòu)域的重復(fù)片段)和多個(gè)酶結(jié)構(gòu)域(包括相同結(jié)構(gòu)域或多個(gè)不同結(jié)構(gòu)域的重復(fù)片段)的構(gòu)建體，以調(diào)節(jié)試劑的結(jié)合親和力和檢測(cè)靈敏度。

用檢測(cè)試劑孵育時(shí)，將樣品再次過濾，以除去未結(jié)合的試劑，同時(shí)截留卵，并且任選洗滌，以確保未結(jié)合試劑的完全去除。

然后可以在原位定量卵的數(shù)量，或從容器中取出卵/試劑混合物后定量。在發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)和其他可以直接通過光學(xué)定量的檢測(cè)試劑的情況中，在檢測(cè)前，首先使用例如酸、堿、促溶劑、表面活性劑或鹽，將其從珠子洗脫。這樣的釋放后，在檢測(cè)前，任選可以通過過濾，將試劑與卵分離。

在酶檢測(cè)系統(tǒng)的情況中，表示存在卵的數(shù)量的有色反應(yīng)產(chǎn)物可以是可溶或不溶的。在可溶性產(chǎn)物的情況中，可以在容器中原位測(cè)定其光學(xué)強(qiáng)度，或從容器中取出后，或過濾除去卵和任何殘余的糞便顆粒后，進(jìn)行測(cè)定?？梢酝ㄟ^測(cè)量懸浮液的濁度相似地檢測(cè)不溶性產(chǎn)物，或可以另外通過其孔徑足夠小以截留產(chǎn)物的膜，接著對(duì)過濾器的表面進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。

實(shí)施例

在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述了本發(fā)明，其沒有限制權(quán)利要求中所述的本發(fā)明的范圍。

以上列出的一般原則可以用于設(shè)計(jì)大量用于檢測(cè)糞便懸浮液或環(huán)境樣品中寄生蟲卵和原生動(dòng)物卵囊的存在或豐度的系統(tǒng)。為了說明的目的，以下列出了可以使用這些原則產(chǎn)生的幾種卵計(jì)數(shù)測(cè)定法的各種非限制性實(shí)例。這些實(shí)施例只是提供用于說明其中可以實(shí)施本發(fā)明的許多不同模式中的一些的目的而不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是對(duì)整個(gè)發(fā)明的描述。

實(shí)施例1

這個(gè)實(shí)施例研究了具有90微米和27微米孔徑的Pluriselect過濾器(Pluriselect PluriCell Strainer)是否適用于a)過濾掉不需要的糞便殘?jiān)?，和b)捕獲和可能濃縮圓線蟲卵。

首先使用McMaster方法估算馬糞便樣品的糞便卵計(jì)數(shù)。將五克糞便懸浮于45ml漂浮介質(zhì)(37.5％葡萄糖/25％氯化鈉)中。將懸浮液在具有內(nèi)置篩網(wǎng)(大約0.5mm孔徑)的Fill Flotac容器中混合。裝滿兩個(gè)計(jì)數(shù)室(等于檢測(cè)的1.0ml懸浮液)。這產(chǎn)生了每克10個(gè)卵(EPG)的倍增因數(shù)。

然后，使10ml漂浮介質(zhì)懸浮液通過具有90微米孔徑的第一過濾器過濾。McMaster的一個(gè)計(jì)數(shù)室(0.5ml)裝滿濾液，并檢查卵的存在。這表示大約20EPG的倍增因數(shù)。

然后使流過樣品通過具有27微米的第二過濾器。再一次，在McMaster室中檢查0.5ml(大約20EPG的倍增因數(shù))。將27微米過濾器上收集的材料重懸浮于1ml漂浮介質(zhì)中并且加載于一個(gè)McMaster室(0.5ml)中，并計(jì)數(shù)。如果將濾液重懸浮于精確的0.5ml中，這里的倍增因數(shù)將為約2EPG。

表1

*約200μl懸浮液仍然在移液管中并且沒有加載至室中，因此真實(shí)的卵產(chǎn)量毫無疑問更高-可能高于600EPG。

實(shí)施例2

將五克糞便懸浮于45ml漂浮介質(zhì)中，形成糞便溶液。將懸浮液在具有內(nèi)置篩網(wǎng)(大約0.5mm孔徑)的Fill Flotac容器中混合。使10ml糞便溶液通過具有90微米孔徑的第一過濾器(PluriselectCell Strainer)過濾。然后使流過樣品通過具有27微米的第二過濾器(PluriselectCell Strainer)，用于在27微米過濾器上的捕獲。將材料在27μ過濾器表面上漂白(1％次氯酸鹽溶液)，然后回收。對(duì)未漂白的樣品和漂白4、6和8分鐘的樣品捕獲圖像。圖3A至3D是顯示漂白前后的樣品的照片(圖A＝未漂白的；圖B＝漂白4分鐘后的樣品；圖C＝漂白6分鐘后的樣品；和圖D＝漂白8分鐘后的樣品)。在第一張圖(圖A)中，正常的未漂白的卵顯示為深色橢圓形物體。在后面的圖(圖B-D)中，漂白的卵顯示為半透明的。其他顯著和非預(yù)期的作用是顯著減少了殘?jiān)?，可能是由于纖維素氧化引起的，這進(jìn)一步有助于光學(xué)測(cè)量。

實(shí)施例3

將五克糞便懸浮于45ml漂浮介質(zhì)中，形成糞便溶液。將懸浮液在具有內(nèi)置篩網(wǎng)(大約0.5mm孔徑)的Fill Flotac容器中混合。使10ml糞便溶液通過具有90微米孔徑的第一過濾器(PluriselectCell Strainer)過濾。然后使流過樣品通過具有27微米的第二過濾器(PluriselectCell Strainer)，用于在27微米過濾器上的捕獲。將材料在27μ過濾器表面上漂白(1％次氯酸鹽溶液)5分鐘。然后使漂白的卵接觸含有阻斷劑(Carboblock，Vector labs)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中含有不同稀釋度的麥胚凝集素-FITC(5mg/ml，Vector Labs)的試劑溶液(圖4)。WGA孵育時(shí)間為15分鐘。將卵懸浮液置于蓋玻片下并通過熒光顯微鏡檢查。

實(shí)施例4

通過將六個(gè)組氨酸殘基克隆至pTXB1質(zhì)粒(New England Biolabs)中來產(chǎn)生CBD。這產(chǎn)生了由N-末端His標(biāo)記物接著是內(nèi)含肽內(nèi)切酶以及隨后是C末端的環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus ciruclans)的CBD的融合蛋白。這種蛋白在大腸桿菌中通過細(xì)胞質(zhì)表達(dá)并且在鎳螯合物柱上純化。然后根據(jù)制造商的說明使用NHS-熒光素(Pierce)來標(biāo)記CBD(使用PBS作為綴合緩沖液，在室溫下持續(xù)60分鐘)。脫鹽后，這產(chǎn)生了6.7mg/ml CBD溶液，每個(gè)CBD具有1.5至2個(gè)熒光素分子。通過過濾、漂白處理糞便樣品并用1:100稀釋的熒光CBD染色，然后使用相襯(圖5A-E)或熒光模式(圖5F-J)在顯微鏡上成像。顯示了含有來自成年馬的圓線蟲(A，F(xiàn))、來自小馬駒的蛔蟲(B，G)和來自山羊的毛圓線蟲(C，H)、來自奶牛的毛圓線蟲和鞭蟲卵(D，I)和來自貓的弓蛔蟲卵(E，J)的樣品。這證明了來自環(huán)狀芽孢桿菌的CBD結(jié)合多個(gè)不同物種中的幾個(gè)重要類別的寄生蟲的卵。圖6顯示了來自圖5中所示的牛樣品(D和I)的各種圓線蟲、鞭蟲卵和球蟲卵囊的疊化剪輯(montage)。來自這些完全不同的屬的卵被染色的事實(shí)證明了幾丁質(zhì)作為用于多種蠕蟲寄生蟲卵和原生動(dòng)物卵囊的通用標(biāo)志物。此外，盡管存在大量來自糞便的無關(guān)糞便殘?jiān)?，這些卵和卵囊被明確染色的事實(shí)證明了，盡管之前報(bào)道了與纖維素的交叉反應(yīng)，CBD確實(shí)能夠區(qū)分這些糞便成分。

實(shí)施例5

使馬糞便漿液通過90微米過濾器(PluriselectCell Strainer)，并且隨后在27微米過濾器(PluriselectCell Strainer)上捕獲，并用1％次氯酸鹽漂白2分鐘。用PBS洗滌后，使過濾器上的卵接觸Carboblock/PBS中1:1000稀釋的5mg/ml WGA-生物素綴合物(Vector Labs)15分鐘。用PBS再次洗滌卵并隨后接觸Carboblock/PBS中1:500稀釋的5mg/ml鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物(Vector Labs)15分鐘。用PBS最終洗滌后，使卵接觸100mM碳酸氫鈉pH10中的5mM對(duì)-硝基苯酚磷酸鹽溶液。在室溫下7分鐘后，將樣品拍照并用分光光度計(jì)測(cè)量。

在這個(gè)實(shí)施例中，發(fā)明人區(qū)分了卵陽(yáng)性馬糞便(800個(gè)卵/克)和卵陰性糞便(圖7)。WGA-AP的量顯示出在測(cè)試的兩個(gè)濃度下都飽和了，表明可以通過降低其濃度進(jìn)一步提高信噪比。

實(shí)施例6

圖8A和8B顯示了在落射熒光顯微鏡上40×獲取的馬糞便的漂浮、CBD染色的卵的McMaster網(wǎng)格的20個(gè)圖像的合成。按照實(shí)施例4中所述的，處理卵并用CBD染色。樣品的檢查顯示出少量通過過濾未除去的真菌孢子的存在(圖7B，插入箭頭)。熒光圖像簡(jiǎn)單數(shù)字處理除去背景后(水平和閾值濾波)，發(fā)明人能夠通過使用獲自國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)的開源免費(fèi)軟件Image J來定量卵的數(shù)量。該軟件允許使用者通過大小和形狀來分析顆粒，由此提供計(jì)算方法來區(qū)分卵和孢子(其更小且更圓)。通過眼睛計(jì)數(shù)獲得了104個(gè)卵計(jì)數(shù)和19個(gè)孢子，而Image J軟件檢測(cè)到107個(gè)卵和16個(gè)孢子。為了模擬將通過消費(fèi)者級(jí)別的相機(jī)或手機(jī)產(chǎn)生的圖像，將圖像從4800×4800像素縮減到1350×1350-等于使用整個(gè)McMaster室(不只是圖像中的網(wǎng)格)填充8萬像素傳感器的較短尺寸。在這種情況中，Image J軟件計(jì)數(shù)了103個(gè)卵和20個(gè)孢子。這些數(shù)據(jù)表明因此原則上可以將基于幾丁質(zhì)的標(biāo)記結(jié)合這種成像方法來準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)糞便樣品中的卵。

發(fā)明人進(jìn)一步表明了可以使用消費(fèi)者級(jí)別的相機(jī)(配備有微距鏡頭的Olympus E-PM2)和配備有微距鏡頭(Olliclip 7x)手機(jī)(Apple iPhone 5s)來獲取這樣的圖像(圖9A-D)。用使用藍(lán)色LED照明和廉價(jià)的橙色Perspex板作為發(fā)射濾波器的簡(jiǎn)單電泳凝膠熒光成像系統(tǒng)(PrepOne Sapphire，EmbiTec)來獲取這些圖像。這些數(shù)據(jù)證明了用于觀察熒光染色的卵的廉價(jià)成像系統(tǒng)的構(gòu)建是可能的。

實(shí)施例7

發(fā)明人已經(jīng)使用以上的成像系統(tǒng)證明了自動(dòng)化卵計(jì)數(shù)與通過標(biāo)準(zhǔn)McMasters方法獲得的計(jì)數(shù)直接相關(guān)。通過McMaster方法或通過實(shí)施例6中描述的方法(n＝4)來定量三個(gè)馬糞便樣品并且用Olympus E-PM2和iPhone 5s來成像。McMasters計(jì)數(shù)相對(duì)于自動(dòng)化計(jì)數(shù)的繪圖顯示出兩種相機(jī)進(jìn)行地同樣好(圖10)并且自動(dòng)化計(jì)數(shù)與傳統(tǒng)卵計(jì)數(shù)成比例。此外，盡管50％輸入自動(dòng)化測(cè)試中的卵在處理過程中丟失(斜率～0.5)的事實(shí)，但分析了十倍多糞便的事實(shí)表示自動(dòng)化測(cè)試仍然比McMasters靈敏5倍。此外，在大部分情況中，如通過標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)價(jià)的自動(dòng)化方法的變化性仍然優(yōu)于McMaster(圖11)。

在一些方面中，可以使用便攜式測(cè)試儀器結(jié)合數(shù)字相機(jī)或智能電話來實(shí)施本文中提供的方法。非限制性實(shí)例的測(cè)試儀器100顯示于圖12-15中。測(cè)試儀器100包括支架110，其包括具有相機(jī)支架122的上表面120。支架110支撐具有光源132的測(cè)試電路板134、包括具有集成發(fā)射濾波器的鏡頭支架140的相機(jī)室130和具有容納樣品的檢測(cè)室的測(cè)試支架150。如上所述，排列測(cè)試儀器100的元件，使得放置在相機(jī)支架122中的相機(jī)可以經(jīng)由相機(jī)室130在光學(xué)上接近放置在測(cè)試支架150中的并通過用于圖像捕獲的光源132照射的樣品。

如圖12中所示，測(cè)試儀器100的各個(gè)元件可連接支架110。支架110具有通常是平的上表面和四個(gè)支撐腿112。支撐腿112將上表面升高離開桌子、工作臺(tái)或其他工作表面。支撐腿112通過位于上表面120下面的降低支架110重量并允許使用者操作測(cè)試儀器100的各個(gè)部分(例如，如圖14和15中所示的測(cè)試支架150)的截口(cut-out)114分開。

上表面120具有通常放置在上表面120中間的大的矩形凹口或盲孔，相機(jī)支架122。相機(jī)支架122構(gòu)造成與測(cè)試儀器100一起保持和排列便攜式相機(jī)，如數(shù)碼相機(jī)或具有照相能力的智能電話。相機(jī)支架122具有光學(xué)進(jìn)口124，其允許智能電話的相機(jī)通過上表面120和從放置在上表面120下面的測(cè)試支架150(如圖14和15中所示的)檢測(cè)照射。使用者使用位于上表面120一端的抓取口126來放置相機(jī)支架122中的智能電話。

參考圖13，測(cè)試儀器100的底視圖顯示了固定于支架100的相機(jī)室130。在圖13的底視圖中，相機(jī)室130顯示出圍繞鏡頭支架140，光源132和一部分測(cè)試電路134。連接支架100底表面的是電路蓋128。如在圖15中可最佳看到的，電路蓋128覆蓋了測(cè)試電路板134，其放置在支架110底表面鄰近。電路蓋128將測(cè)試電路板134保持在合適位置并且與上面的智能電話和測(cè)試電路板134下面的測(cè)試支架150在光學(xué)上成一直線。將電路蓋通過螺旋軸套安裝在支架110的底表面，所述螺旋軸套與蓋在一直線上(未顯示)。

光源132位于測(cè)試電路板134之中或之上。如以上所述，光源132可以是藍(lán)色LED。LED 132排列在測(cè)試電路板134的底表面上，使得LED照射相機(jī)室130和以下的測(cè)試支架150中的樣品。圖12中顯示了四個(gè)LED 132；然而，可以使用更多或更少的LED。例如，可以排列一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)LED圍繞鏡頭支架和集成發(fā)射濾光器140，或可以使用五個(gè)或更多個(gè)LED。

如圖14中所示，測(cè)試支架150連接底部并且將測(cè)試支架150形成螺紋，使得含有新樣品的測(cè)試支架150可以快速且容易地旋進(jìn)測(cè)試儀器100上的位置中。還考慮了可以通過咬合(snap fitting)(一種快速釋放機(jī)制)、磁耦合或任何本領(lǐng)域已知的能夠耦合相機(jī)室130和測(cè)試支架150的其他合適裝置，將相機(jī)室130和測(cè)試支架150在機(jī)械上耦合在一起。如上所述，測(cè)試支架150可以包括一個(gè)或多個(gè)用于分離和粘附樣品中的卵的過濾器。樣品中存在的卵可以結(jié)合測(cè)試支架150內(nèi)的過濾器之一，并且在光學(xué)上可接近光源134和相機(jī)室130。

完全裝配的測(cè)試儀器100顯示于圖15中。盡管沒有顯示，放置在相機(jī)支架122中的數(shù)碼相機(jī)將具有經(jīng)由連接上表面120的光學(xué)進(jìn)口124的鏡頭和鏡頭支架140通過測(cè)試儀器100的通暢的光學(xué)進(jìn)口。如上所述，測(cè)試電路板134的底表面上的光源132(圖15中未顯示)照射靜置在測(cè)試支架150中下部的樣品并且允許獲取數(shù)據(jù)。

在一些實(shí)施中，支架110優(yōu)選由輕質(zhì)材料制成，例如，模壓或擠壓塑料，或輕質(zhì)金屬，如鋁。盡管圖12-14中顯示的實(shí)施包括四條腿112和四個(gè)截口114，但更多或更少的腿和截口是可能的。例如，支架110可以包括上表面120任一端由上表面120每側(cè)的一個(gè)截口分開的兩個(gè)寬的支撐腿?；蛘撸Ъ?10可以不包括腿，替代的是圍繞上表面120周邊的單個(gè)實(shí)體升高的支撐物，并且不含截口。其他實(shí)施也是可能的。

相機(jī)室130形成螺紋，以允許容易地連接測(cè)試支架150。在一些實(shí)施方案中，可以提供室蓋，其旋在相機(jī)室130上并且在樣品和測(cè)試支架150不在適當(dāng)位置時(shí)保護(hù)鏡頭和具有集成發(fā)射濾波器的鏡頭支架140以及測(cè)試電路板134。

在一些實(shí)施中，測(cè)試電路板134還可以支撐用于光源132的電源，例如，一個(gè)或多個(gè)電池。

其他實(shí)施方案

應(yīng)當(dāng)理解盡管已經(jīng)結(jié)合其詳述描述了本發(fā)明，但是之前的描述旨在用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明是通過所附權(quán)利要求的范圍來限定的。其他方面、優(yōu)點(diǎn)和改變?cè)谝韵聶?quán)利要求的范圍內(nèi)。

參考文獻(xiàn)列表

(1)Bagley C,Healey MC,Hansen D.Internal Parasites in Cattle.Beef Cattle Handbook.Iowa State University；2014.

(2)Reinemeyer CR.Controlling Strongyle Parasites of Horses:A Mandate for Change.AAEP Proc 2009；55:352-360.

(3)Goater TM,Goater CP,Esch GW.Parasitism:The Diversity and Ecology of Animal Parasites.Second ed.Cambridge:Cambridge University Press,2014.

(4)Stoll NR.On Methods of counting Nematode Ova in Sheep Dung.Parasitology 1930；22:116-136.

(5)Christie J,Schwan EV,Bodenstein LL,Sommerville JE,van der Merwe LL.The sensitivity of direct faecal examination,direct faecal flotation,modified centrifugal faecal flotation and centrifugal sedimentation/flotation in the diagnosis of canine spirocercosis.J S Afr Vet Assoc 2011；82:71-75.

(6)James CE,Hudson AL,Davey MW.Drug resistance mechanisms in helminths:is it survival of the fittest？Trends Parasitol 2009；25:328-335.

(7)Brady HA,Nichols WT.Drug resistance in equine parasites:an emerging global problem.J Equine Vet Sci 2009；29:285-295.

(8)Nielsen MK,Mittel L,Grice A,Erskine M,Graves E,Vaala W et al.AAEP Parasite Control Guidelines.2013.American Association of Equine Practioners.

(9)Nicholls J,Obendorf DL.Application of a composite faecal egg count procedure in diagnostic parasitology.Vet Parasitol 1994；52:337-342.

(10)Rossanigo CE,Gruner L.Accuracy of two methods for counting eggs of sheep nematode parasites.Vet Parasitol 1991；39:115-121.

(11)Gordon HM,Whitlock HV.A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces.J Counc Sci Ind Res 1939；12:52.

(12)Egwang TG,Slocombe JO.Evaluation of the Cornell-Wisconsin centrifugal flotation technique for recovering trichostrongylid eggs from bovine feces.Can J Comp Med 1982；46:133-137.

(13)Presland SL,Morgan ER,Coles GC.Counting nematode eggs in equine faecal samples.Vet Rec 2005；156:208-210.

(14)Cringoli G,Rinaldi L,Veneziano V,Capelli G,Scala A.The influence of flotation solution,sample dilution and the choice of McMaster slide area(volume)on the reliability of the McMaster technique in estimating the faecal egg counts of gas trointestinal strongyles and Dicrocoelium dendriticum in sheep.Vet Parasitol 2004；123:121-131.

(15)Cringoli G.FLOTAC,a novel apparatus for a multivalent faecal egg count technique.Parassitologia 2006；48:381-384.

(16)Skotarek SL,Colwell DD,Goater CP.Evaluation of diagnostic techniques for Anoplocephala perfoliata in horses from Alberta,Canada.Vet Parasitol 2010；172:249-255.

(17)Vadlejch J,Petrtyl M,Zaichenko I et al.Which McMaster egg counting technique is the most reliable？Parasitol Res 2011；109:1387-1394.

(18)Levecke B,Rinaldi L,Charlier J et al.The bias,accuracy and precision of faecal egg count reduction test results in cattle using McMaster,Cornell-Wiscons in and FLOTAC egg counting methods.Vet Parasitol 2012；188:194-199.

(19)Egwang TG,Slocombe JO.Efficiency and sensitivity of techniques for recovering nematode eggs from bovine feces.Can J Comp Med 1981；45:243-248.

(20)Kania SA,Reinemeyer CR.Anoplocephala perfoliata coproantigen detection:a preliminary study.Vet Parasitol 2005；127:115-119.

(21)Andersen UV,Howe DK,Dangoudoubiyam S et al.SvSXP:a Strongylus vulgaris antigen with potential for prepatent diagnosis.Parasit Vectors 2013；6:84.

(22)Nielsen MK,Vidyashankar AN,Gravatte HS,Bellaw J,Lyons ET,Andersen UV.Development of Strongylus vulgaris-specific serum antibodies in naturally infected foals.Vet Parasitol 2014；200:265-270.

(23)Zhang Y,McReynolds L,inventors.Specific detection of chitin using chitin binding domain.patent US 2007/0099234.2007.

(24)U.S.Patent Nol 5,004,699 to Mark A Winters.Method to detect fungi and yeasts.

(25)Hillrichs K,Schnieder T,Forbes AB,Simcock DC,Pedley KC,Simpson HV.Use of fluorescent lectin binding to distinguish Teladorsagia circumcincta and Haemonchus contortus eggs,third-stage larvae and adult worms.Parasitol Res 2012；110:449-458.

(26)Chu,H.H.,Hoang,V.,Hofemeister,J.,and Schrempf,H.(2001).A Bacillus amyloliquefaciens ChbB protein binds beta-and alpha-chitin and has homologues in related strains.Microbiology 147,1793-1803.

(27)Hashimoto,M.,Ikegami,T.,Seino,S.,Ohuchi,N.,Fukada,H.,Sugiyama,J.,Shirakawa,M.,and Watanabe,T.(2000).Expression and characterization of the chitin-binding domain of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12.J.Bacteriol.182,3045-3054.

(28)Montgomery,M.T.,Welschmeyer,N.A.,and Kirchman,D.L.(1990).A simple assay for chitin:application to sediment trap samples from the subarctic Pacific.Mar.Ecol.Prog.Ser.64,301-308.

(29)Reinemeyer,C.R.(2009).Controlling Strongyle Parasites of Horses:A Mandate for Change.AAEP Proc 55,352-360.

(30)Watanabe,T.,Ito,Y.,Yamada,T.,Hashimoto,M.,Sekine,S.,and Tanaka,H.(1994).The roles of the C-terminal domain and type III domains of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12 in chitin degradation.J.Bacteriol.176,4465-4472.

(31)Scott DW and Horn RT(1987)Zoonotic dermatoses of dogs and cats.Vet Clin North Am Small Anim Pract.Jan；17(1):117-44

(32)Steinfeld等,(2006)(2006).Livestock's Long Shadow.Environmental Issues and Options.(Rome,Italy:FAO).

(33)Piedrafita等,(2010).Increased production through parasite control:can ancient breeds of sheep teach us new lessons？Trends Parasitol.26,568-573.

(34)Perry和Randolph,(1999).Improving the assessment of the economic impact of parasitic diseases and of their control in production animals.Vet.Parasitol.84,145-168.

(35)Hoglund等,(2001).A field survey on the status of internal parasites in calves on organic dairy farms in southwestern Sweden.Vet.Parasitol.99,113-128.

(36)Reinhardt等，(2006).A fenbendazole oral drench in addition to an ivermectin pour-on reduces parasite burden and improves feedlot and carcass performance of finishing heifers compared with endectocides alone.J.Anim Sci.84,2243-2250.

(37)Permin等,(1999).Prevalence of gastrointestinal helminths in different poultry production systems.Br.Poult.Sci.40,439-443.

(38)Nansen和Roepstorff,(1987).Resistance of Oesophagostomum spp.in pigs to pyrantel citrate.Vet.Parasitol.24,229-239.

(39)Duncan，(1985).Internal parasites of the horse and their control.Equine Vet.J.17,79-82.

(40)Kaplan RM,(2004).Drug resistance in nematodes of veterinary importance:a status report.Trends Parasitol.20,477-481.

(42)da Cruz等,(2010).Anthelmintic efficacy and management practices in sheep farms from the state of Rio de Janeiro,Brazil.Vet.Parasitol.170,340-343.

(43)Cezar等,(2010).Multiple resistance of gastrointestinal nematodes to nine different drugs in a sheep flock in southern Brazil.Vet.Parasitol.173,157-160.

(44)Howell等,(2008).Prevalence of anthelmintic resistance on sheep and goat farms in the southeastern United States.J.Am.Vet.Med.Assoc.233,1913-1919.

(45)Peregrine等,(2014).Anthelmintic resistance in important parasites of horses:does it really matter？Vet.Parasitol.201,1-8.

(46)Gasbarre等,(2009).Further characterization of a cattle nematode population with demonstrated resistance to current anthelmintics.Vet.Parasitol.166,275-280.；

(47)Waghorn等,(2006).Prevalence of anthelmintic resistance on 62 beef cattle farms in the North Island of New Zealand.N.Z.Vet.J.54,278-282.

(48)Jackson等,(2006).Anthelmintic resistance and management of nematode parasites on beef cattle-rearing farms in the North Island of New Zealand.N.Z.Vet.J.54,289-296.

(49)Wood等,(1995).World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology(W.A.A.V.P.)second edition of guidelines for evaluating the efficacy of anthelmintics in ruminants(bovine,ovine,caprine).Vet.Parasitol.58,181-213.

(50)Vidyashankar等，(2012).Statistical and biological considerations in evaluating drug efficacy in equine strongyle parasites using fecal egg count data.Vet.Parasitol.185,45-56.

(51)Wolstenholme等,(2004).Drug resistance in veterinary helminths.Trends Parasitol.20,469-476.

(52)Sutherland和Leathwick,(2011).Anthelmintic resistance in nematode parasites of cattle:a global issue？Trends Parasitol.27,176-181.

(53)Jackson和Coop,(2000).The development of anthelmintic resistance in sheep nematodes.Parasitology 120 Suppl,S95-107.

(54)Roepstorff等,(1987).Resistance of Oesophagostomum spp.in pigs to pyrantel citrate.Vet.Parasitol.24,229-239.

(55)Coles等,(2003).Anthelmintic resistance and use of anthelmintics in horses.Vet.Rec.153,636.

(56)Cernanska等,(2006).A survey on anthelmintic resistance in nematode parasites of sheep in the Slovak Republic.Vet.Parasitol.135,39-45.

(57)Kornele等,(2014).Antiparasitic resistance and grazing livestock in the United States.J.Am.Vet.Med.Assoc.244,1020-1022.

(58)Robert等,(2014).Attitudes towards implementation of surveillance-based parasite control on Kentucky Thoroughbred farms-current strategies,awareness,and willingness-to-pay.Equine Vet.J.In Press.

(59)Demeler等,(2013).Discrimination of gastrointestinal nematode eggs from crude fecal egg preparations by inhibitor-resistant conventional and real-time PCR.PLoS.One.8,e61285

(60)Learmount等,(2009).Development and validation of real-time PCR methods for diagnosis of Teladorsagia circumcincta and Haemonchus contortus in sheep.Vet.Parasitol.166,268-274.

(70)Colditz等,2002 Use of lectin binding characteristics to identify gastrointestinal parasite eggs in faeces,Volume 105,Issue 3,2 May 2002,Pages 219-227.

(71)Palmer和McCombe,(1996).Lectin staining of trichostrongylid nematode eggs of sheep:rapid identification of Haemonchus contortus eggs with peanut agglutinin.Int.J.Parasitol.26,447-450.

(72)Hillrichs等,(2012).Use of fluorescent lectin binding to distinguish Teladorsagia circumcincta and Haemonchus contortus eggs,third-stage larvae and adult worms.Parasitol Res 110,449-458.

(73)Wharton,(1983).The production andfunctional morphology of helminth egg-shells.Parasitology 86(Pt 4),85-97.

(74)Quiles等，(2006).In situ characterisation of a microorganism surface by Raman microspectroscopy:the shell of Ascaris eggs.Anal.Bioanal.Chem.386,249-255.

(75)Coles等,(2006).The detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance.Vet.Parasitol.136,167-185.

(76)Nielsen等,(2010).Analysis of multiyear studies in horses in Kentucky to ascertain whether counts of eggs and larvae per gram of feces are reliable indicators of numbers of strongyles and ascarids present.Vet.Parasitol.174,77-84.

(77)Rudall和Kenchington,(1973).The Chitin System.Biological Rev.48,597-633.

(78)Hardt和Laine,(2004).Mutation of active site residues in the chitin-binding domain ChBDChiA1 from chitinase A1 of Bacillus circulans alters substrate specificity:use of a green fluorescent protein binding assay.Arch.Biochem.Biophys.426,286-297.

(79)Hashimoto等,(2000).Expression and characterization of the chitin-binding domain of chitinases A1 from Bacillus circulans WL-12.J.Bacteriol.182,3045-3054.

(80)Gao等,(2002)Characterisation and developmental expression of a chitinase gene in Heterodera glycines.Int.J.Parasitol.32,1293-1300.

(81)Arakane等,(2003).Properties of catalytic,linker and chitin-binding domains of insect chitinase.Insect Biochem.Mol.Biol.33,631-648.

(82)Chu等,(2001).A Bacillus amyloliquefaciens ChbB protein binds beta-and alpha-chitin and has homologues in related strains.Microbiology 147,1793-1803.

(83)Kolbe等,(1998).The Streptomyces reticuli alpha-chitin-binding protein CHB2 and its gene.Microbiology 144(Pt 5),1291-1297.

(84)Zeltins和Schrempf，(1995).Visualization of alpha-chitin with a specific chitin-binding protein(CHB1)from Streptomyces olivaceoviridis.Anal.Biochem.231,287-294.