一種氣控固相多肽合成微流控芯片裝置及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種氣控固相多肽合成微流控芯片裝置及其應(yīng)用。所述裝置包括合成反應(yīng)微流控芯片、試劑加料池陣列、多路氣體電磁閥和恒壓氣源；所述合成反應(yīng)微流控芯片內(nèi)部設(shè)有流道結(jié)構(gòu)，所述流道結(jié)構(gòu)包括主流道和多條分支流道，所述主流道的接近所述出口處設(shè)有反應(yīng)腔體，每條分支流道的一端與所述主流道連通；所述試劑加料池陣列包括多個(gè)試劑加料池，每個(gè)試劑加料池與所述合成反應(yīng)微流控芯片連通；所述多路氣體電磁閥設(shè)有共同的輸入端與所述恒壓氣源連通，每路氣體電磁閥設(shè)有輸出端與每個(gè)試劑加料池連通；所述恒壓氣源用于向所述多路氣體電磁閥輸出設(shè)定壓力范圍的氣壓。本發(fā)明的裝置能夠用于連續(xù)流動(dòng)的固相多肽合成。
【專利說明】一種氣控固相多肽合成微流控芯片裝置及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽合成【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及固相多肽合成【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種氣控固相多肽合成微流控芯片裝置及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]固相化學(xué)合成是非均相反應(yīng)的重要應(yīng)用，由諾貝爾獎(jiǎng)獲得者M(jìn)errifield創(chuàng)立并在此后得到深入發(fā)展。固相多肽合成是固相化學(xué)合成最廣泛的應(yīng)用之一(J.Am.Chem.Soc.，1963，85，2149-2154.)。
[0003]固相多肽合成方法是將反應(yīng)物連接到帶有活性基團(tuán)的高聚物骨架上，通過流體相引入反應(yīng)物與固載物發(fā)生化學(xué)合成反應(yīng)，并除去雜質(zhì)和副產(chǎn)物，最后采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法將目標(biāo)多肽裂解下來。固相多肽合成不需要復(fù)雜的分離技術(shù)，容易獲得較高的產(chǎn)率，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
[0004]然而，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，對(duì)微量、快速合成的多肽需求越來越大，研究自動(dòng)化的微量多肽合成技術(shù)及其裝置具有重大意義。微量多肽固相合成技術(shù)目前只有少量報(bào)道(Science, 2007，318，1888-1888., Proteomics, 2003，3，2135-2141.;發(fā)明專利申請(qǐng):組裝式化合物陣列芯片及制備方法，03112772.X)，但是這些固相合成往往是靜態(tài)反應(yīng)，不能及時(shí)輸送新鮮反應(yīng)液，而且需要復(fù)雜昂貴的外部設(shè)備和特殊的反應(yīng)試劑。因此，發(fā)展結(jié)構(gòu)簡單、可自動(dòng)化的微量多肽固相合成方法具有十分誘人的前景。
[0005]自從上世紀(jì)九十年代出現(xiàn)微流控芯片技術(shù)以來，該領(lǐng)域已發(fā)展成為當(dāng)今最有活力的科技領(lǐng)域之一(Sens.Actutors, B, 1990，I, 244-248.)。微流控芯片技術(shù)能把化學(xué)和生物實(shí)驗(yàn)室中的前處理、加樣、反應(yīng)、分離、分析及細(xì)胞培養(yǎng)等基本操作單元集成微型化的芯片上來，從而具有比表面積大、傳質(zhì)傳熱速率快、試劑消耗小、環(huán)境友好、易規(guī)?；膳c高通量反應(yīng)等特點(diǎn)，使其在多方面應(yīng)用中都彰顯出優(yōu)越性。
[0006]構(gòu)建化學(xué)微反應(yīng)器是微流控芯片的重要應(yīng)用方向之一(Tetrahedron, 2005，61:2733-2742 ；Chem.Rev.，2007，107，2300-2318.)。采用微流控芯片技術(shù)構(gòu)建多肽固相合成微反應(yīng)器，不但特別適合合成微量多肽，而且合成速度明顯快于常規(guī)合成，并且容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。
[0007]然而，固相多肽合成需要使用二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸(TFA)等強(qiáng)有機(jī)溶劑和揮發(fā)性強(qiáng)酸，因此常規(guī)用于微流控芯片自動(dòng)化控制的普通泵、閥等都難以直接運(yùn)用，需要采取更為巧妙的設(shè)計(jì)方能保證在微流控芯片進(jìn)行自動(dòng)化固相多肽合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種氣控固相多肽合成微流控芯片裝置，用于連續(xù)流動(dòng)的固相多肽合成，使用該裝置能實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)的微流控芯片上固相多肽合成，并可通過并行化實(shí)現(xiàn)高通量的同時(shí)合成。[0009]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0010]一種氣控固相多肽合成微流控芯片裝置，包括合成反應(yīng)微流控芯片、試劑加料池陣列、多路氣體電磁閥和恒壓氣源；
[0011]所述合成反應(yīng)微流控芯片內(nèi)部設(shè)有流道結(jié)構(gòu)，所述流道結(jié)構(gòu)包括主流道，所述主流道兩端分別設(shè)有主進(jìn)樣口和出口，所述出口處設(shè)有過濾結(jié)構(gòu)，所述主流道的接近所述出口處設(shè)有反應(yīng)腔體，所述主流道一側(cè)或兩側(cè)設(shè)有多條分支流道，每條分支流道的一端與所述主流道連通而另一端設(shè)有分支進(jìn)樣口；
[0012]所述試劑加料池陣列包括多個(gè)試劑加料池，每個(gè)試劑加料池設(shè)有輸入端和輸出端，所述輸出端與所述合成反應(yīng)微流控芯片上的一個(gè)分支進(jìn)樣口連通；
[0013]所述多路氣體電磁閥設(shè)有共同的輸入端，每路氣體電磁閥設(shè)有輸出端，所述輸入端與所述恒壓氣源連通，每個(gè)輸出端與每個(gè)試劑加料池的輸入端連通；
[0014]所述恒壓氣源用于向所述多路氣體電磁閥輸出設(shè)定壓力范圍的氣壓。
[0015]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述主流道的兩側(cè)交錯(cuò)設(shè)置多條分支流道，呈梳狀排布，所述分支流道的與所述主流道連接處的橫截面積比所述分支流道其它部分的橫截面積小。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有助于減少來源于不同試劑加料池的不同氨基酸原料間的相互污染。
[0016]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述合成反應(yīng)微流控芯片由玻璃材質(zhì)的蓋片與基片鍵合而成，所述蓋片上設(shè)有凹陷的槽狀結(jié)構(gòu)，所述基片為平整的玻璃片，所述蓋片與基片鍵合后所述槽狀結(jié)構(gòu)被密封形成流道結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)的合成反應(yīng)微流控芯片制備方法簡單，密封性好，穩(wěn)定可靠。
[0017]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述反應(yīng)腔體的橫截面積比所述反應(yīng)腔體兩端的主流道的橫截面積大。由于反應(yīng)腔體的內(nèi)腔空間較大，為反應(yīng)提供較大的空間，因此反應(yīng)能夠充分進(jìn)行；而且反應(yīng)腔體相比兩`端的主流道內(nèi)腔空間的增大降低了液體在反應(yīng)腔體內(nèi)的流速，避免固相多肽合成用載體被液流快速?zèng)_出反應(yīng)腔體，而影響反應(yīng)充分進(jìn)行。
[0018]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述主流道出口處的過濾結(jié)構(gòu)為濾膜，所述濾膜的孔徑小于固相多肽合成用載體的直徑。濾膜能夠有效攔截固相多肽合成用載體，避免被沖出主流道出口，同時(shí)又不影響反應(yīng)廢液的排出。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，還可以采用其它過濾結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)相同的功能。
[0019]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，每路氣體電磁閥的輸出端與每個(gè)試劑加料池的輸入端通過連接管線連通，所述連接管線設(shè)有防止液體回流進(jìn)入氣體電磁閥的單向閥。單向閥只允許連接管線中的氣體從每路氣體電磁閥的輸出端流向每個(gè)試劑加料池的輸入端，而不允許逆向流動(dòng)，因此能夠有效防止液體回流進(jìn)入氣體電磁閥，保證裝置的穩(wěn)定運(yùn)行。
[0020]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述試劑加料池采用聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethene, PTFE)材質(zhì),所述試劑加料池包括池體和池蓋，當(dāng)池蓋打開時(shí)可向池體中加入試劑，當(dāng)池蓋擰緊后密封池體。PTFE材料具有抗酸抗堿、抗各種有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，幾乎不溶于所有的溶劑，為本發(fā)明使用強(qiáng)酸和有機(jī)溶劑提供了保障，保證所述試劑加料池不會(huì)受到本發(fā)明所用的強(qiáng)酸和有機(jī)溶劑的影響而受損。
[0021]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述恒壓氣源包括氣泵、儲(chǔ)氣囊和壓力傳感器；所述壓力傳感器實(shí)時(shí)檢測壓力，當(dāng)壓力低于設(shè)定的閾值下限時(shí)，氣泵開始工作，把氣體泵入儲(chǔ)氣囊；當(dāng)壓力高于設(shè)定的閾值上限時(shí)，氣泵停止工作，使得壓力保持在設(shè)定壓力范圍內(nèi)。恒壓氣源是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，其基本構(gòu)造主要包括上述氣泵、儲(chǔ)氣囊和壓力傳感器，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)已有知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)組裝恒壓氣源，其設(shè)定壓力范圍可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)和具體需要設(shè)置。
[0022]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述合成反應(yīng)微流控芯片上的主進(jìn)樣口、分支進(jìn)樣口和出口均為圓柱體形；所述流道結(jié)構(gòu)的截面為半圓角矩形和/或半圓??；所述主流道和/或分支流道的寬度和/或深度在數(shù)十微米至數(shù)百微米范圍內(nèi)。
[0023]本發(fā)明中，“多路”、“多條”、“多個(gè)”或其類似概念中的“多” 一般是指2個(gè)以上(包括 2 個(gè))，比如 2、4、8、16、24、48 或 64 等。
[0024]本發(fā)明還提供上述方案所述的裝置在多肽固相合成中的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明裝置的多路氣體電磁閥的每一路可以單獨(dú)控制自動(dòng)化開閉，實(shí)現(xiàn)每一輪多肽合成反應(yīng)所需要原料的選擇，實(shí)現(xiàn)整個(gè)多肽固相合成的全自動(dòng)進(jìn)行；本發(fā)明的多路連接方式，使得合成反應(yīng)微流控芯片可以并行使用，實(shí)現(xiàn)多種多肽產(chǎn)物同時(shí)并行合成；利用單一恒壓氣源實(shí)現(xiàn)對(duì)試劑加料池陣列的選擇性氣體輸送，克服現(xiàn)有技術(shù)中液體選擇泵不能耐受固相合成的強(qiáng)有機(jī)溶劑環(huán)境的缺陷，實(shí)現(xiàn)對(duì)微反應(yīng)器的自動(dòng)控制；合成反應(yīng)微流控芯片采用分支流道結(jié)構(gòu)，每個(gè)分支只通過一種氨基酸原料，減小液體的混流和雜質(zhì)的引入，并且可通過設(shè)置單獨(dú)的預(yù)推和預(yù)清洗過程進(jìn)一步排除污染；本發(fā)明在形式上采取連續(xù)流動(dòng)試劑輸入模式，可不斷向所述裝置提供新鮮反應(yīng)液，促進(jìn)反應(yīng)不斷向正方向進(jìn)行；本發(fā)明的裝置可實(shí)現(xiàn)多通道固相多步循環(huán)化學(xué)合成，具有微型化、集成化、高效率、低成本以及環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制作的合成反應(yīng)微流控芯片的蓋片結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制作的合成反應(yīng)微流控芯片的分解結(jié)構(gòu)示意圖。
`[0028]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制作的試劑加料池結(jié)構(gòu)示意圖。
[0029]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制作的氣控固相多肽合成微流控芯片裝置的組裝示意圖。
[0030]圖5為本發(fā)明實(shí)施例2合成的多肽產(chǎn)物的質(zhì)譜結(jié)果圖。
[0031]圖6為本發(fā)明實(shí)施例2合成的多肽產(chǎn)物的液相色譜分析結(jié)果圖。
[0032]附圖標(biāo)記:
[0033]1-主流道，2-主進(jìn)樣口，3-分支流道3，4-分支進(jìn)樣口，5_反應(yīng)腔體，6_出口，7_蓋片，8-基片，9-試劑加料池輸入端接頭，10-試劑加料池輸出端接頭，11-池蓋，12-池體，13-多路氣體電磁閥，14-多路氣體電磁閥輸入端，15-多路氣體電磁閥輸出端，16-試劑加料池，17-第一連接管線，18-第二連接管線，19-合成反應(yīng)微流控芯片。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的氣控固相多肽合成微流控芯片裝置進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選【具體實(shí)施方式】，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。[0035]本發(fā)明的氣控固相多肽合成微流控芯片裝置，包括合成反應(yīng)微流控芯片、試劑加料池陣列、多路氣體電磁閥和恒壓氣源。
[0036]其中，所述合成反應(yīng)微流控芯片為玻璃材質(zhì)，由蓋片與基片兩片玻璃鍵合而成。其中的蓋片上有凹陷的圖形(槽狀結(jié)構(gòu))，基片為平整的玻璃片，蓋片和基片鍵合后得到完整的合成反應(yīng)微流控芯片。當(dāng)蓋片與基片經(jīng)鍵合成為整體后，蓋片上的圖形可被封閉從而成為完整的流道結(jié)構(gòu)。流道結(jié)構(gòu)設(shè)有進(jìn)口和出口，即貫穿于整個(gè)蓋片的小孔，使得合成反應(yīng)微流控芯片從外觀上能看見表面有主進(jìn)樣口、出口和分支進(jìn)樣口，而所述的流道結(jié)構(gòu)則位于合成反應(yīng)微流控芯片內(nèi)部。
[0037]所述合成反應(yīng)微流控芯片內(nèi)部的流道結(jié)構(gòu)包括:一條主流道，主流道兩端分別有主進(jìn)樣口和出口；若干條分支流道，每條分支流道有一個(gè)分支進(jìn)樣口 ；主進(jìn)樣口、出口和分支進(jìn)樣口均鉆有小孔，小孔貫穿整個(gè)蓋片。
[0038]所述主流道一端有一個(gè)主進(jìn)樣口，另一端有一個(gè)出口，主進(jìn)樣口為固相載體和公共試劑(即除氨基酸原料外的其它試劑)的入口，出口為產(chǎn)物及廢液的出口，主流道末端接近出口處有一個(gè)反應(yīng)腔體，其寬度和深度比主流道大，可儲(chǔ)存較多反應(yīng)液及固相載體。
[0039]所述分支流道在主流道的兩側(cè)交錯(cuò)設(shè)置，依次呈梳狀排布，每條分支流道的一端與主流道連通，另一端有分支進(jìn)樣口，每個(gè)分支進(jìn)樣口與一個(gè)對(duì)應(yīng)的試劑加料池的輸出端連通，可通入待合成的多肽序列中的一個(gè)特定氨基酸原料。所述分支流道的與所述主流道連接處的橫截面積比所述分支流道其它部分的橫截面積小，也就是說分支流道與主流道連接處較細(xì)，并且分支流道間交錯(cuò)，從而減少氨基酸原料間的相互污染。
[0040]所述主進(jìn)樣口、出口、分支進(jìn)樣口可以連接管線，主進(jìn)樣口管線中可通過固相載體和公共試劑；分支進(jìn)樣口管線與對(duì)應(yīng)的試劑加料池連接，每個(gè)試劑加料池中儲(chǔ)存一種反應(yīng)原料(氨基酸)；出口處填充濾膜后再連接管線，濾膜孔徑小于固相載體的直徑，濾膜能夠有效攔截固相多肽合成用載體，避免被沖出主流道出口，同時(shí)又不影響反應(yīng)廢液的排出。
[0041]所述合成反應(yīng)微流控芯片中，所述主進(jìn)樣口、分支進(jìn)樣口和出口可均為圓柱體形；所述流道結(jié)構(gòu)的截面可以為半圓角矩形和/或半圓弧；所述主流道和/或分支流道的寬度和/或深度在數(shù)十微米至數(shù)百微米范圍內(nèi)。
[0042]所述多路氣體電磁閥的每一路氣體電磁閥都有一個(gè)輸出端，與一個(gè)對(duì)應(yīng)的試劑加料池的輸入端相連接，氣體電磁閥輸出端的連接管線可加單向閥防止液體回流進(jìn)入電磁閥。所有路氣體電磁閥設(shè)有共同的輸入端，與同一個(gè)公共的恒壓氣源連接。氣體電磁閥打開時(shí)，氣體電磁閥輸入端與氣體電磁閥輸出端連通，從而輸出恒壓氣源產(chǎn)生的恒定壓力；氣體電磁閥關(guān)閉時(shí)，氣體電磁閥輸出端將關(guān)閉，不再輸出壓力。
[0043]所述試劑加料池陣列由多個(gè)試劑加料池組成。所述試劑加料池可以是聚四氟乙烯材質(zhì)，包括池體和池蓋，當(dāng)池蓋打開時(shí)可向池體中加入試劑，當(dāng)池蓋擰緊后密封池體。每個(gè)試劑加料池有一個(gè)輸入端和一個(gè)輸出端，輸入端與對(duì)應(yīng)的氣體電磁閥的輸出端連通，輸出端與合成反應(yīng)微流控芯片上一個(gè)分支進(jìn)樣口連通。當(dāng)打開試劑加料池對(duì)應(yīng)的氣體電磁閥時(shí)，試劑加料池輸入端通入空氣，試劑加料池輸出端可輸出原料溶液至合成反應(yīng)微流控芯片；當(dāng)關(guān)閉試劑加料池對(duì)應(yīng)的氣體電磁閥時(shí)，試劑加料池輸入端將關(guān)閉，試劑加料池的輸出端不再輸出原料，同時(shí)由于試劑加料池中密封有一部分空氣，合成反應(yīng)微流控芯片中的原料溶液不會(huì)倒流入試劑加料池。[0044]所述恒壓氣源包括氣泵、儲(chǔ)氣囊和壓力傳感器，其中壓力傳感器實(shí)時(shí)檢測壓力，當(dāng)壓力低于設(shè)定的閾值下限時(shí)，氣泵開始工作，把氣體泵入儲(chǔ)氣囊；當(dāng)壓力高于設(shè)定的閾值上限時(shí)，氣泵停止工作，使得壓力保持在設(shè)定壓力范圍內(nèi)。恒壓氣源與所有氣體電磁閥的輸入端相連接。恒壓氣源是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，其基本構(gòu)造主要包括上述氣泵、儲(chǔ)氣囊和壓力傳感器，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)已有知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)組裝恒壓氣源，其設(shè)定壓力范圍可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)和具體需要設(shè)置。
[0045]所述恒壓氣源與多路氣體電磁閥共同構(gòu)成微量氣體輸送裝置，通過電路板和軟件控制該微量氣體輸送裝置工作，實(shí)現(xiàn)對(duì)試劑加料池陣列的自動(dòng)化控制，從而控制合成反應(yīng)微流控芯片。通過電路板和軟件控制微量氣體輸送裝置的技術(shù)屬于現(xiàn)有技術(shù)，并且在自動(dòng)化領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以參考現(xiàn)有技術(shù)的做法實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明通過電路板和軟件控制該微量氣體輸送裝置工作，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)8-64路或更多路的氣體電磁閥自動(dòng)控制，液體泵出量可為數(shù)十至數(shù)百微升。
[0046]本發(fā)明的合成反應(yīng)微流控芯片可以按照現(xiàn)有技術(shù)制作，一種通行的玻璃材質(zhì)微流控芯片的制作方法包括如下步驟:
[0047](I)將準(zhǔn)備在蓋片上制作的圖形通過高分辨率打印機(jī)制成膠片掩膜；
[0048](2)將勻膠鉻版和掩膜放入紫外光刻機(jī)，曝光后在光刻膠上得到掩膜圖案；
[0049](3)將所述曝光后的勻膠鉻版在質(zhì)量百分含量為0.7-0.8%的NaOH水溶液中顯影，使得待刻蝕為流道的部分光刻膠被洗掉，其余部分被光刻膠保護(hù)；
[0050](4)將所述顯影后的勻膠鉻版置于去鉻液中進(jìn)行去鉻；
[0051](5)將所述去鉻后的勻膠鉻版置于玻璃刻蝕液中進(jìn)行刻蝕后，再用質(zhì)量百分含量為2%-4%的NaOH水溶液和所述去鉻液去除殘存的光膠層和鉻層得到所述蓋片；
`[0052]( 6 )在所述蓋片的主進(jìn)樣口、出口和分支進(jìn)樣口的位置打孔；然后將基片和蓋片進(jìn)行清洗后置于濃硫酸中浸泡過夜或在煮沸的濃硫酸中浸泡2-4小時(shí)；
[0053](7)對(duì)齊基片和蓋片，使兩者貼合，然后在真空烘箱中除去水分使得基片和蓋片緊密貼合，達(dá)到預(yù)鍵合效果；所述預(yù)鍵合的溫度為120-150°C，時(shí)間為1-2小時(shí)；
[0054](8)將所述預(yù)鍵合的芯片置于馬弗爐中進(jìn)行程序升溫鍵合即得所述合成反應(yīng)微流控芯片。
[0055]上述的制作方法中，所述勻膠鉻版曝光時(shí)間可為4-6秒；所述去鉻液可由硝酸鈰銨、冰醋酸和水組成，所述去鉻液中硝酸鈰銨的質(zhì)量-體積濃度可為0.2g/mL，所述去鉻液中冰醋酸的體積百分含量可為3.5% ;所述刻蝕液可由質(zhì)量百分含量為40%的氫氟酸水溶液、質(zhì)量百分含量為65%的硝酸水溶液和水組成,所述氫氟酸水溶液、硝酸水溶液和水的體積比可為1:0.7:3.3。
[0056]上述的制作方法中，步驟(6)中將基片和蓋片進(jìn)行清洗的溶劑可依次為加有洗滌劑的去離子水，乙醇，丙酮，由氨水、質(zhì)量百分含量為20%的過氧化氫水溶液和水的體積比為1:1:5組成的混合溶劑，以及由鹽酸、質(zhì)量百分含量為20%的過氧化氫水溶液和水的體積比為1:1:6組成的混合溶劑。
[0057]將合成反應(yīng)微流控芯片、試劑加料池陣列、多路氣體電磁閥和恒壓氣源相連通即得所述氣控固相多肽合成微流控芯片裝置。試劑加料池輸出端通過連接管線與合成反應(yīng)微流控芯片的分支進(jìn)樣口連通，該連接管線可用橡膠塞或密封膠進(jìn)行密封。橡膠塞材質(zhì)可為丁腈橡膠或氟橡膠，密封膠可為環(huán)氧膠，所用固化溫度可為80-120°C，固化時(shí)間可為30-60分鐘。氣體電磁閥輸出端與試劑加料池輸入端也通過連接管線連通，該部分連接管線中可加入單向閥防止液體回流進(jìn)入電磁閥。
[0058]本發(fā)明還提供上述裝置在多肽固相合成中的應(yīng)用。具體操作步驟如下:通過合成反應(yīng)微流控芯片的主進(jìn)樣口注入多肽合成所需的固相載體，載體微球滯留在反應(yīng)腔體中；合成多肽所需的氨基酸原料除第一個(gè)氨基酸預(yù)先已修飾到固相載體外，其余的氨基酸原料依次從分支流道通入，并經(jīng)一段時(shí)間的連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)進(jìn)行合成，每輪合成之前，通過合成反應(yīng)微流控芯片的主進(jìn)樣口進(jìn)行脫保護(hù)，每輪合成之后通過主進(jìn)樣口進(jìn)行清洗，除去多余的氨基酸原料；所有氨基酸原料均從試劑加料池由恒定氣壓驅(qū)動(dòng)流入；氣壓由恒壓氣源提供，通過選擇性打開多路氣體電磁閥的某一路，把所對(duì)應(yīng)的試劑加料池中的氨基酸原料泵入合成反應(yīng)微流控芯片，其余試劑加料池由于輸入端對(duì)應(yīng)的氣體電磁閥關(guān)閉，不能把其中的原料注入合成反應(yīng)微流控芯片，同時(shí)試劑加料池中存在一段封閉的氣體，保證合成反應(yīng)微流控芯片中的原料不會(huì)倒流入這些試劑加料池。經(jīng)過若干輪合成反應(yīng)，在合成反應(yīng)微流控芯片中獲得目標(biāo)多肽產(chǎn)物。最后可以通過裂解試劑的方式在合成反應(yīng)微流控芯片原位裂解目標(biāo)多肽產(chǎn)物，并在合成反應(yīng)微流控芯片出口處收集目標(biāo)多肽產(chǎn)物。
[0059]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。
[0060]實(shí)施例1、氣控固相多肽合成微流控芯片裝置的制作
[0061](1)合成反應(yīng)微流控芯片的制作
[0062]合成反應(yīng)微流控芯片的制作過程包括:曝光、顯影、去鉻、玻璃濕法腐蝕、去光膠去鉻和鍵合等步驟，具體如下:
[0063]將設(shè)計(jì)好的合成反應(yīng)微流控芯片蓋片的圖形通過高分辨率打印機(jī)制成膠片掩膜；將該膠片掩膜和勻膠鉻版(鉻型=LRC ;鉻厚:145nm ;膠厚:570nm)放在紫外光刻機(jī)中，曝光時(shí)間為5秒；曝光后的鉻版在質(zhì)量百分含量為0.7%的NaOH水溶液中顯影，掩膜上的圖形被復(fù)制到光膠層上；室溫下將顯影后的勻膠鉻版放入到去鉻液(該去鉻液中硝酸鈰銨的質(zhì)量-體積濃度為0.2g/mL，冰醋酸的體積百分含量為3.5%)中除去裸露的鉻層；將去鉻后的鉻版置于刻蝕液(該刻蝕液由質(zhì)量百分含量為40%的氫氟酸水溶液、質(zhì)量百分含量為65%的硝酸水溶液和水組成，所述氫氟酸水溶液、硝酸水溶液和水的體積比為1:0.7:3.3)中，刻蝕時(shí)間為2小時(shí)；用質(zhì)量百分含量為2%的NaOH水溶液和上述去鉻液去除殘存的光膠層及鉻層，即獲得所述合成反應(yīng)微流控芯片的蓋片，在蓋片上的進(jìn)樣口和出口處相對(duì)應(yīng)的位置用微型臺(tái)式鉆床打孔，孔直徑1.8mm。另截取與蓋片同樣大小的玻璃片，即基片。將基片和蓋片在下列溶液中依次超聲清洗15分鐘:加有洗滌劑的去離子水、乙醇、丙酮、RCA-1 (由氨水、質(zhì)量百分含量為20%的過氧化氫水溶液和水的體積比為1:1:5組成的混合溶劑)和RCA-2(由鹽酸、質(zhì)量百分含量為20%的過氧化氫水溶液和水的體積比為1:1:6組成的混合溶劑)，將清洗后的基片和蓋片置入濃硫酸中浸泡過夜；用去離子水沖洗基片和蓋片并在流動(dòng)的去離子水中將基片與蓋片緊緊貼合，置于真空烘箱中進(jìn)行真空預(yù)鍵合，預(yù)鍵合溫度為150°C，預(yù)鍵合時(shí)間為I小時(shí)；將預(yù)鍵合好的芯片置于馬弗爐中程序升溫鍵合，升溫程序?yàn)?10分鐘從室溫升到130°C，在130°C保溫70分鐘，110分鐘從130°C升溫到600°C，在600°C保溫470分鐘，最后得到合成反應(yīng)微流控芯片。
[0064]上述蓋片的詳細(xì)結(jié)構(gòu)如圖1所示。圖1中:主流道1，是反應(yīng)原料、固相載體和公共試劑等進(jìn)入芯片的主通道；在主流道I的起始端有主進(jìn)樣口 2，是固相載體、脫保護(hù)試劑、裂解試劑等進(jìn)入主流道I的入口 ；分支流道3，與主流道I連接，每條分支流道3可以通過一種特定的反應(yīng)原料(氨基酸);在在分支流道3的起始端有分支進(jìn)樣口 4，氨基酸原料按加入多肽的順序依次從不同的分支進(jìn)樣口 4加入；在主流道I的末端接近出口處有一個(gè)反應(yīng)腔體5，固相載體存儲(chǔ)在反應(yīng)腔體5中，合成反應(yīng)也在反應(yīng)腔體5中進(jìn)行；在主流道I的末端有出口 6，出口 6處設(shè)有濾膜，可以防止固相載體流出芯片，廢液從出口 6排出，目標(biāo)多肽產(chǎn)物經(jīng)裂解后也從出口 6排出。
[0065]上述制作的合成反應(yīng)微流控芯片的分解結(jié)構(gòu)如圖2所示，蓋片7與基片8鍵合成為整體，即合成反應(yīng)微流控芯片。
[0066](2)試劑加料池的制作
[0067]試劑加料池可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技能采用機(jī)械加工方法制作，單個(gè)試劑加料池結(jié)構(gòu)如圖3所示。圖3中:試劑加料池有一個(gè)試劑加料池輸入端接頭9，該接頭可通過連接管線與氣體電磁閥輸出端連接；試劑加料池有一個(gè)試劑加料池輸出端接頭10，該接頭可通過連接管線與合成反應(yīng)微流控芯片的分支進(jìn)樣口 4連接；試劑加料池主體部分包括試劑加料池密封蓋，即池蓋11和試劑加料池池體12。試劑加料池材質(zhì)為聚四氟乙烯，該試劑加料池主腔體為圓柱形，腔體加工螺紋，制作與之配套的密封蓋；密封蓋上設(shè)置雙孔，孔徑為1.2mm，分別插入不銹鋼針。試劑加料池輸出端與合成反應(yīng)微流控芯片的分支進(jìn)樣口4相連,試劑加料池輸入端與氣體電磁閥輸出端相連。
[0068](3)微量氣體輸送裝置的制作
[0069]微量氣體輸送裝置由恒壓氣源和多路氣體電磁閥組成。其中恒壓氣源由氣泵、儲(chǔ)氣囊和氣壓傳感器及相應(yīng)管路構(gòu)成，其中氣壓`傳感器可為電阻應(yīng)變式氣壓傳感器，可以從市場上購得(例如西安永紅傳感器有限公司生產(chǎn)的YHT3系列傳感器)，儲(chǔ)氣囊為機(jī)加工，管路為常規(guī)管線。多路氣體電磁閥選用市售八聯(lián)裝微量氣體電磁閥，例如日本SMC公司生產(chǎn)的聯(lián)裝氣體電磁閥，根據(jù)需要還可以對(duì)其進(jìn)行并聯(lián)，獲得最多64路的氣體電磁閥。恒壓氣源提供范圍恒定的輸出氣壓，其輸出端連接多路氣體電磁閥輸入端。多路氣體電磁閥輸出端連接上述的試劑加料池。恒壓氣源和多路氣體電磁閥均通過電路控制，控制電路板通過CAN總線與USB接口 CAN盒連接，并可由上位計(jì)算機(jī)控制。
[0070](4)將上述制作的合成反應(yīng)微流控芯片、試劑加料池和微量氣體輸送裝置順序連通后即得到本發(fā)明的氣控固相多肽合成微流控芯片裝置。組裝后的氣控固相多肽合成微流控芯片裝置的整體結(jié)構(gòu)如圖4所示。圖4中:所述裝置包括多路氣體電磁閥13 ;所述多路氣體電磁閥13有一個(gè)多路氣體電磁閥輸入端14,與恒壓氣源的輸出端相連接(不意圖中未畫出);所述多路氣體電磁閥13的每一路均有一個(gè)多路氣體電磁閥輸出端15。所述裝置還包括試劑加料池16 (實(shí)際使用試劑加料池組成的陣列，示意圖中僅畫出一個(gè)試劑加料池)，試劑加料池16中儲(chǔ)存多肽合成原料(氨基酸)；所述多路氣體電磁閥輸出端15與試劑加料池16的輸入端之間通過第一連接管線17(示意圖中僅畫出一條，實(shí)際上每一多路氣體電磁閥輸出端15與每一試劑加料池16的輸入端之間都有第一連接管線17)連通；試劑加料池陣列中的每一試劑加料池16與合成反應(yīng)微流控芯片19中每一分支進(jìn)樣口 4之間通過第二連接管線18 (示意圖中僅畫出一條)連通。
[0071]使用本發(fā)明的氣控固相多肽合成微流控芯片裝置時(shí)，首先在對(duì)應(yīng)的試劑加料池16中灌裝氨基酸原料并密封，然后打開各器件的電源，在上位計(jì)算機(jī)上運(yùn)行配套開發(fā)的軟件，即可完成氣體通路選擇，定量氣體輸送，液體連續(xù)注射及液路切換、清洗等過程。
[0072]實(shí)施例2、利用實(shí)施例1制作的裝置進(jìn)行固相多肽合成
[0073]固相載體選取商品化的王樹脂，根據(jù)要合成的多肽序列，預(yù)先在樹脂上連接多肽C端的氨基酸。本實(shí)施例準(zhǔn)備合成的多肽序列為Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu。本例使用市售的Fmoc-Leu修飾的固相肽合成載體作為固相載體，利用實(shí)施例1制作的氣控固相多肽合成微流控芯片裝置合成該多肽。
[0074]具體合成步驟如下:
[0075]a、該步驟為手動(dòng)操作步驟，裝入合成載體。使用注射器從主進(jìn)樣口灌入分散于N’ N- 二甲基甲酰胺(DMF)中的Fmoc-Leu修飾的固相肽合成載體(樹脂)至反應(yīng)腔體中，固相肽合成載體干重約5mg ;載體被束縛在反應(yīng)腔體，DMF溶液從出口排出。
[0076]b、本步驟將裝配整個(gè)裝置，準(zhǔn)備下一步驟合成時(shí)使用。將C端第二至五位氨基酸試劑Fmoc-Phe等分別與苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)混合，加入活化試劑(摩爾濃度為0.4mol/L的N-甲基嗎啡啉的DMF溶液)配成氨基酸偶聯(lián)試劑，加入相應(yīng)試劑加料池，與對(duì)應(yīng)的分支進(jìn)樣口連接；清洗溶劑、脫保護(hù)試劑也分別對(duì)應(yīng)試劑加料池，通過三通接口與主進(jìn)樣口連接；裝配整個(gè)合成裝置，并在控制軟件中設(shè)定以后各步驟的運(yùn)行時(shí)間。
[0077]C、脫保護(hù):軟件控制打開脫保護(hù)試劑加料池對(duì)應(yīng)的氣體電磁閥，恒壓氣源開始往相應(yīng)加料池中送氣，脫保護(hù)試劑(質(zhì)量百分含量為20%的六氫吡啶的DMF溶液)注入合成反應(yīng)微流控芯片，脫保護(hù)時(shí)間為5分鐘。
[0078]d、洗滌樹脂:打開DMF溶劑試劑加料池對(duì)應(yīng)的電磁閥；恒壓氣源開始往相應(yīng)試劑加料池中送氣，注入DMF洗滌樹脂，除去殘余的脫保護(hù)試劑及反應(yīng)后雜質(zhì)，洗滌時(shí)間為6分鐘。
[0079]e、氨基酸偶聯(lián):打開C端第二位氨基酸Phe偶聯(lián)試劑加料池對(duì)應(yīng)的氣體電磁閥；恒壓氣源開始往相應(yīng)試劑加料池中送氣，將上述氨基酸偶聯(lián)試劑引入到反應(yīng)腔體中，開始連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)，偶聯(lián)時(shí)間為20分鐘。
[0080]f、按照d步驟洗滌樹脂一次。
[0081]g、依次重復(fù)步驟c、d、e和f共3次，其中，步驟e中的氨基酸試劑依次為氨基酸試劑 Fmoc-Gly、Fmoc-Gly 和 Fmoc-Tyr,得到目標(biāo)序列。
[0082]h、目標(biāo)序列合成結(jié)束之后，注入脫保護(hù)試劑，使N端氨基酸的保護(hù)基團(tuán)脫除，并注入DMF洗滌樹脂。
[0083]1、溶劑置換:使用注射泵從主進(jìn)樣口先后注入二氯甲烷、甲醇置換樹脂中殘留的DMF溶劑；置換時(shí)間分別為3分鐘。
[0084]j、原位裂解:使用注射泵從主進(jìn)樣口注入裂解試劑(質(zhì)量百分含量為97.5%的三氟乙酸(TFA)的水溶液)，裂解時(shí)間為30分鐘；在合成反應(yīng)微流控芯片出口處收集裂解產(chǎn)物即得目標(biāo)多肽。
[0085]k、分析鑒定:從合成反應(yīng)微流控芯片收集的裂解產(chǎn)物，用乙醚沉淀，然后收集固體洗滌抽干。使用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜驗(yàn)證產(chǎn)物正確性(圖5);使用反相液相色譜分析檢測產(chǎn)物純度(圖6)。
[0086]利用本發(fā)明裝置的五肽合成反應(yīng)在三小時(shí)內(nèi)可完成，相比常規(guī)多肽合成數(shù)十小時(shí)的反應(yīng)周期，反應(yīng)效率大大提高。裝置在安裝完成后，可設(shè)定軟件運(yùn)行參數(shù)，并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化多肽合成。裝置采用氣體驅(qū)動(dòng)反應(yīng)流體，易于進(jìn)行并行化操作，從而實(shí)現(xiàn)較高通量的自動(dòng)化多肽合成。本裝置還能夠?qū)崿F(xiàn)半自動(dòng)化的原位裂解，常規(guī)的多肽合成儀器均不具備此功能。
[0087] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之 內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種氣控固相多肽合成微流控芯片裝置，包括合成反應(yīng)微流控芯片、試劑加料池陣列、多路氣體電磁閥和恒壓氣源； 所述合成反應(yīng)微流控芯片內(nèi)部設(shè)有流道結(jié)構(gòu)，所述流道結(jié)構(gòu)包括主流道，所述主流道兩端分別設(shè)有主進(jìn)樣口和出口，所述出口處設(shè)有過濾結(jié)構(gòu)，所述主流道的接近所述出口處設(shè)有反應(yīng)腔體，所述主流道一側(cè)或兩側(cè)設(shè)有多條分支流道，每條分支流道的一端與所述主流道連通而另一端設(shè)有分支進(jìn)樣口； 所述試劑加料池陣列包括多個(gè)試劑加料池，每個(gè)試劑加料池設(shè)有輸入端和輸出端，所述輸出端與所述合成反應(yīng)微流控芯片上的一個(gè)分支進(jìn)樣口連通； 所述多路氣體電磁閥設(shè)有共同的輸入端，每路氣體電磁閥設(shè)有輸出端，所述輸入端與所述恒壓氣源連通，每個(gè)輸出端與每個(gè)試劑加料池的輸入端連通； 所述恒壓氣源用于向所述多路氣體電磁閥輸出設(shè)定壓力范圍的氣壓。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述主流道的兩側(cè)交錯(cuò)設(shè)置多條分支流道，呈梳狀排布，所述分支流道的與所述主流道連接處的橫截面積比所述分支流道其它部分的橫截面積小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述合成反應(yīng)微流控芯片由玻璃材質(zhì)的蓋片與基片鍵合而成，所述蓋片上設(shè)有凹陷的槽狀結(jié)構(gòu)，所述基片為平整的玻璃片，所述蓋片與基片鍵合后所述槽狀結(jié)構(gòu)被密封形成流道結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述反應(yīng)腔體的橫截面積比所述反應(yīng)腔體兩端的主流道的橫截 面積大。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述主流道出口處的過濾結(jié)構(gòu)為濾膜，所述濾膜的孔徑小于固相多肽合成用載體的直徑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，每路氣體電磁閥的輸出端與每個(gè)試劑加料池的輸入端通過連接管線連通，所述連接管線設(shè)有防止液體回流進(jìn)入氣體電磁閥的單向閥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述試劑加料池采用聚四氟乙烯材質(zhì)，所述試劑加料池包括池體和池蓋，當(dāng)池蓋打開時(shí)可向池體中加入試劑，當(dāng)池蓋擰緊后密封池體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述恒壓氣源包括氣泵、儲(chǔ)氣囊和壓力傳感器；所述壓力傳感器實(shí)時(shí)檢測壓力，當(dāng)壓力低于設(shè)定的閾值下限時(shí)，氣泵開始工作，把氣體泵入儲(chǔ)氣囊；當(dāng)壓力高于設(shè)定的閾值上限時(shí)，氣泵停止工作，使得壓力保持在設(shè)定壓力范圍內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述合成反應(yīng)微流控芯片上的主進(jìn)樣口、分支進(jìn)樣口和出口均為圓柱體形；所述流道結(jié)構(gòu)的截面為半圓角矩形和/或半圓弧；所述主流道和/或分支流道的寬度和/或深度在數(shù)十微米至數(shù)百微米范圍內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的裝置在多肽固相合成中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】B01J19/00GK103755777SQ201410020454
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】鄭暉, 王蔚芝, 胡志遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:國家納米科學(xué)中心