專利名稱：作為選擇性吸附IG的色譜吸附劑的[1,2,4]三唑并[I,5-a]嘧啶衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分子的色譜分離領(lǐng)域。進(jìn)一步涉及一種包含選擇性吸附Ig G的新型配體的色譜吸附劑，以及生產(chǎn)所述色譜吸附劑的方法和該吸附劑在親 和層析中的用途。 發(fā)明背景單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展為科學(xué)和醫(yī)學(xué)進(jìn)行研究、診斷和治療提供了 巨大的機(jī)遇。單克隆抗體，例如用于體外和體內(nèi)診斷以及人類疾病免疫 治療。目前，大多數(shù)正在開發(fā)的生物工程學(xué)衍生藥物都是以G型單克隆 抗體為基礎(chǔ)的。IgG通常根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在細(xì)胞表達(dá)體系中大批量地生產(chǎn)。應(yīng)用最廣泛 的生產(chǎn)方法包括通過色譜法提純，由于該方法對(duì)化合物的通用性和靈敏 性，經(jīng)常是生物分子的優(yōu)選提純方法。在親和層析領(lǐng)域，有多個(gè)專利和專利申請(qǐng)涉及蛋白A， 一種作為配 體的結(jié)合IgG的細(xì)菌金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)。例如， PCT/SE83/00297 (Pharmacia Biotech AB)揭示了重組體型的蛋白A，其 中在該蛋白A分子中添加一個(gè)半胱氨酸殘基，以改善其與隨后作親和配 體使用的分離基質(zhì)的偶聯(lián)。此外，美國專利6,197,927 (轉(zhuǎn)讓給Genentech 公司)揭示了葡萄球菌蛋白A的Z結(jié)構(gòu)域變體，具有與野生型Z結(jié)構(gòu)域 相當(dāng)?shù)腎gG結(jié)合能力，但具有顯著減小的尺寸。而且，蛋白A己被證明 對(duì)蛋白酶敏感。另外，基于蛋白A的親和配體已知在酸性和堿性條件下 不穩(wěn)定，這就可能會(huì)在純化過程中產(chǎn)生不希望的配體滲漏，而導(dǎo)致產(chǎn)品 污染并損害純化系統(tǒng)的性能。在現(xiàn)有技術(shù)中，許多專利申請(qǐng)描述了小分子配體具有對(duì)IgG的親和力。WO 2004039765 (Amersham Biosciences AB)描述了基于苯脲骨架的小分子作為含K型輕鏈的IgG和Fab片段的層析親和配體的用途。US 6610630 (轉(zhuǎn)讓給Ciphergen Biosystems公司)描述了 2-巰基咪唑 及其衍生物附著于作為擬生物親和層析培養(yǎng)基的固體載體，以便選擇性 吸附IgG的用途。US 6117996 (轉(zhuǎn)讓給NovoNordiskA/S)描述了三嗪型結(jié)構(gòu)的制備方 法及其在提純多種蛋白質(zhì)材料中的用途。US 20030166002 (Chang等)描述了在含有適合與樹脂結(jié)合的接頭 的三嗪結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上合成和篩選活性化合物。EP 1500431 (Millipore UK， Ltd, UK)涉及一種培養(yǎng)基，包含固體載 體和吸附在其上的選自2-氨基苯并咪唑和2-氨基甲基苯并咪唑的一種或 多種親和層析配體。本發(fā)明的親和配體用于IgG的提純。盡管存在與IgG結(jié)合的蛋白A的替代物，但仍然需要一種新型的更 有優(yōu)越性質(zhì)的IgG結(jié)合配體。這種新的配體將不具備前述缺陷，并優(yōu)選 還具有比迄今建議的配體更優(yōu)選的結(jié)合特性。 發(fā)明概述本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種基于與嘌呤相關(guān)的結(jié)構(gòu)的小有機(jī)分子，當(dāng)其附著于色譜樹 脂時(shí)，會(huì)與IgG發(fā)生普通的結(jié)合。該有機(jī)分子也可以作為IgG純〗M程的親和配體。第一方面，本發(fā)明涉及一種用于選擇性吸附IgG的色譜吸附劑，包含以下化學(xué)式及其對(duì)應(yīng)的烯醇式， 其中X表示O、 S或NH;R'表示H、 C"垸基、C"烷氧基、C"烷氧基-C"烷基、Ar、 -C(O)NHR3、 -C(0)-R3或鹵素；W表示H、 C,.3烷基或鹵素；R3表示H、 C"烷基、C"烷氧基、Cw烷氧基-C"垸基或Ar; n表示0、 1、 2或3; Y表示載體；At表示Qho芳基，該基團(tuán)任選地被選自羥基、氰基、鹵素、硝基、Cw 烷基和垸氧基的一個(gè)或多個(gè)取代。本文所用術(shù)語"鹵素"包括氟、氯、溴、碘。除非另作說明，本文所定義的烷基以及烷氧基和烷氧烷基的垸基部分，可 以為直鏈的，或當(dāng)碳原子數(shù)足夠時(shí)(即最少為3)可以為支鏈的和/或環(huán)狀的。 此外，當(dāng)碳原子數(shù)足夠時(shí)(即最少為4)，該基團(tuán)還可以為部分環(huán)狀的/非環(huán)狀 的。所述烷基，以及烷氧基和烷氧基烷基的烷基部分可以為飽和的，或當(dāng)碳 原子數(shù)足夠時(shí)(即最少為2)，可以為不飽和的。除非另作說明，該基團(tuán)還可 以被一個(gè)或多個(gè)鹵素，特別是氟原子取代。為了避免引起疑問，垸氧基通過烷氧基中的氧原子與該分子的其它基團(tuán)連接。在該方面中，本發(fā)明的化合物可顯示出互變異構(gòu)現(xiàn)象。所有互變異構(gòu)體及 其混合物被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在上述結(jié)構(gòu)式中，載體Y選自纖維素、淀粉、右旋糖酐、瓊脂、瓊脂糖、 聚丙烯酰胺、聚(甲基)丙烯酸酯、聚乙烯基親水聚合物、聚苯乙烯和聚砜、 二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、多糖-合成的聚合物、多糖-礦物結(jié)構(gòu) 或合成的聚合物-礦物結(jié)構(gòu)。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案中，在上述結(jié)構(gòu)式中，W表示H， n表示O, X 表示NH， Y表示瓊脂糖。任選地，在上述結(jié)構(gòu)式中，X和Y之間含有間隔分子，例如六亞甲基二 胺或氨基己酸。在更優(yōu)選的方案中，R'表示H， n表示O, X表示NH， Y表示HP-瓊脂糖，如果存在間隔分子則是六亞甲基二胺。載體材料Y是任何形狀的色譜載體材料，可以是珠子、不規(guī)則形狀粒子、 纖維、膜、扁平結(jié)構(gòu)或多孔礦物材料形式。第二方面，本發(fā)明涉及一種制備上述色譜吸附劑的方法，包括以下步驟a) 提供色譜載體材料Y;和b) 在所述載體材料的表面偶聯(lián)一種配體，以產(chǎn)生下述結(jié)構(gòu)式的吸附劑及其對(duì)應(yīng)的烯醇式， 其中<formula>formula see original document page 7</formula>X表示O、 S或NH;R'表示H、 C,v烷基、C^烷氧基、Cw烷氧基-dv烷基、Ar、 -C(O)NHR3、 -C(0)-RS或鹵素；W表示H、 Cw烷基或鹵素；R3表示H、 C"烷基、C"烷氧基、C"烷氧基-C"烷基或Ar;n表示0、 1、 2或3:Y表示載體。&表示<:6.1()芳基，該基團(tuán)任選地被一個(gè)或多個(gè)選自羥基、氰基、鹵素、硝基、Cw烷基和烷氧基的取代基取代；載體Y被X取代，X-NH2或SH或OH。優(yōu)選，載體Y是含胺的基質(zhì)。該載體還可以為含硫醇的基質(zhì)或含羥基的基質(zhì)更優(yōu)選地，載體Y是采用六亞甲基二胺延伸的表氯醇活化的HP-瓊脂糖。 第三方面，本發(fā)明涉及上述吸附劑用于在親和層析中分離物質(zhì)的用途。優(yōu) 選的用途是用于分離IgG、其片段和/或包括IgG或其片段的復(fù)合物。所述IgG 可以為單克隆IgG、多克隆IgG或重組的IgG或其片段。所述復(fù)合物可以是涉 及IgG的免疫復(fù)合物或融合蛋白。該吸附劑可用于分離IgG的全部亞類及其片 段。分離出來的IgG可以用于治療、診斷、研究與開發(fā)目的或用于例如色譜法 的親和處理。計(jì)算機(jī)技術(shù)被用于識(shí)別IgG Fc部分上的合適的保守且普通的結(jié)合的裂縫。隨后，對(duì)市售物質(zhì)進(jìn)行實(shí)質(zhì)篩選，以便鑒定出該裂縫的潛在結(jié)合劑。對(duì)潛在的結(jié)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行排序，并通過基于STD-NMR和細(xì)胞質(zhì)基因組表面共振(SPR) 分析的體外方法測(cè)定結(jié)合和選擇性。該方法鑒定出一種具有感興趣的色譜特性 的結(jié)構(gòu)。將已鑒定的結(jié)合結(jié)構(gòu)連接到色譜樹脂上，評(píng)價(jià)對(duì)IgG的結(jié)合力。發(fā)現(xiàn) 該配體顯示了對(duì)IgG的普通的結(jié)合。IgG的普通的結(jié)合表示結(jié)合所有的IgG亞類，艮P、 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4。 附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示在本發(fā)明的吸附劑上注入多克隆IgG的洗脫蛋白圖譜。虛皿示 洗脫液中的pH值。 發(fā)明詳述現(xiàn)在，通過與計(jì)算機(jī)(in silico)和濕式實(shí)驗(yàn)相關(guān)聯(lián)，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步地描述。識(shí)別適合的IeG結(jié)合位點(diǎn)艦利用具有代碼ldn2的蛋白質(zhì) 庫(pdb)結(jié)構(gòu)，j頓分子模型技術(shù) 篩選蛋白表面，識(shí)別出人IgG的Fc片段上的一個(gè)裂縫為小有機(jī)分子的假定目標(biāo) 停靠位點(diǎn)(Delano等，2000)。識(shí)別出兩個(gè)與對(duì)稱性相關(guān)的槽，其由該與對(duì)稱性相關(guān)的分子間界面處的深 層裂縫產(chǎn)生。在這些裂縫表面上包含極性基團(tuán)而使其更加親水。這兩個(gè)與對(duì)稱 性相關(guān)的裂縫均可用作(相等的)^ 以篩選位點(diǎn)。該識(shí)別位點(diǎn)在獲自人源的IgG 家族成員之間基本上是保守的。 ?？磕M將來自數(shù)據(jù)庫的用于虛擬篩選的化合物?？康揭谚b定的裂縫內(nèi)，產(chǎn)生總共119個(gè)不同的化合物,鑒定上述化合物為推定的結(jié)合劑。由于具有較高的^f,率， 用于?？磕M的蛋白結(jié)構(gòu)是1.65A的與Z34C絡(luò)合的Fc結(jié)構(gòu)(pdb代碼116x; Idusogie等。2000)。該二聚體是采用程序O由晶體學(xué)對(duì)稱性產(chǎn)生的(Jones等。 1991)。旨分子都保存了最有序構(gòu)象及其FlexX值(Rarey等。1996)。 停靠分子(配體分子)的選擇目測(cè)結(jié)合自由能估值比-20千焦/摩爾更負(fù)的育g產(chǎn)生?？繕?gòu)象的所有化合物， 針對(duì)與裂縫表面的互補(bǔ)性就疏L水性、氫鍵模式、電荷和構(gòu)象方面來說。此外， 剛性則被認(rèn)為是優(yōu)點(diǎn)，而短接觸和有張力的幾何學(xué)被認(rèn)為是不利的。潛在配體的NMR和SPR篩選m戯以篩選，提出了 166個(gè)化合物作為將要被識(shí)別的裂縫的潛在結(jié)合劑。 在進(jìn)一步的AX選擇之后(以假定的穩(wěn)定性、反應(yīng)性和可用性為基礎(chǔ))，對(duì)化合 物排序進(jìn)行i力驗(yàn)。在進(jìn)入該篩選程序前，最終得到69個(gè)化合物，并給它們分配 各自的內(nèi)部識(shí)別號(hào)。該篩選程序以體外篩選為基礎(chǔ)，利用兩種獨(dú)立的溶液分析技術(shù)，依靠飽和 度差異轉(zhuǎn)移核磁共振(STDNMR)和表面等離子體振子共振(SPR)法。在NMR篩選中，測(cè)試了 69種物質(zhì)對(duì)兩種不同的單克隆抗體(MABs)和 市售Fc片段的親和力。Mii測(cè)i煩a-淀粉酶的親和力來研究非特異性蛋白結(jié) 合。將對(duì)全部三個(gè)IgG相關(guān)蛋白都具有親和力，但對(duì)a-淀粉酶沒有親和力的蛋 白歸屬為對(duì)IgG-Fc部分的親和配體的潛在^i^物。在SPR篩選中，對(duì)53個(gè)化合物(不溶性物質(zhì)除夕卜)進(jìn)行了對(duì)單克隆抗體和 市售Fc片段的親和力測(cè)試。對(duì)不同分子量進(jìn)4亍校正，并以占理論的最大反應(yīng)的 百分比表示。為了選擇用于進(jìn)一步研究的潛在候選物，將SPR數(shù)據(jù)以這樣的方式排列， 以便將對(duì)Fc片段和IgG的反應(yīng)都大于10 %的所有物質(zhì)都選作潛在候選物。 這些化合物可以與M核磁共振篩選而指示的物質(zhì)相比。結(jié)果，大多數(shù)SPR衍 生的采集數(shù)都因?qū) -淀粉酶的非特異性結(jié)合而在NMR篩選中被拒絕。用兩個(gè) 方法選出了一種作為潛在親和fl^^物的化合物；化合物I，如下。為了使親和配體候選物最佳化，在溶液中對(duì)圍繞化合物I的其它結(jié)構(gòu)(市售 化合物)進(jìn)行研究。對(duì)這些化合物進(jìn)行如前面所述的相應(yīng)SPR和NMR親和性 分析。但這次僅在NMR篩選中使用Fc-片段，而SPR分析就用相應(yīng)的測(cè)試蛋白作為第一選擇。選定的結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)是NMR陽性的，并且如SPR所指示的，migG分子具 有高級(jí)親和力，并且至少對(duì)Fc片段具有中級(jí)親和力。排除了對(duì)HSA顯示出非特異性結(jié)合的化合物。這種選擇在最終候選物，化合物n中出現(xiàn)。該化合物還具有直接通過(酯保護(hù)的)羧酸官能團(tuán)偶聯(lián)的化學(xué)性質(zhì)的潛能。Hn從文庫中命中的化合物，配體n是酮式。在溶液中篩選并且與凝膠偶聯(lián)的 配體以酮式和烯醇式間的平衡,在。酮和烯醇式之間的關(guān)系受許多參數(shù)，如溶解度、濃度和溫度的影響。其所 有的互變異構(gòu)體和混合物都被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。吸附劑A 吸附劑A色譜吸附劑的生產(chǎn)現(xiàn)以實(shí)例描述本發(fā)明吸附劑的制備，但并非限制的方式。偶聯(lián)試劑和載體 的選擇可以在較寬柳艮制內(nèi)改變并為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。選擇的配體(化合物n)與色譜基質(zhì)(載體)的偶聯(lián)已識(shí)別的候選化合物n是市售的，并可用于偶聯(lián)?；衔飊通過其羧酸宮能團(tuán)與含胺基質(zhì)或載體連接，使用任何常規(guī)的酰胺形成劑，例如0-(7-氮苯并三唑-l-基)-MMAT，A^-四甲基脲鎩六氟磷酸鹽(HATU)、 N，N，-二環(huán) 己基碳化二亞胺(DCC)、從(3-二甲基氨基丙基)-7V'-乙基碳化二亞胺 (EDC)、 l-羥基苯并三唑(HOBt)、酰氯形成劑或其組合在合適的堿存在下， 所述合適堿例如是二異丙基乙胺、三乙基胺或碳酸鉀。所用載體是采用 六亞甲基二胺延伸的表氯醇活化的HP-瓊脂糖珠。該偶聯(lián)物將化合物II的 酯官能團(tuán)轉(zhuǎn)變成酰胺官能團(tuán)，這將會(huì)使來自溶液中測(cè)定的酯功能的空間 和電子變化最小化。吸附劑A包括酮類或烯醇式，或酮類和烯醇式的混合物，如吸附劑A的上 述平衡公式所描寫的。使用標(biāo)準(zhǔn)MASNMR法測(cè)定偶聯(lián)結(jié)果為7 u mol/mL。使用吸附劑A的色譜法將0,5mL吸附劑A加至Tricom5/20柱內(nèi)，并用0.1M醋酸鹽，0.137M氯化 鈉，pH5.0平衡。將多克隆IgG (Gammanorm) OmL緩沖液中有l(wèi)mg)注射到吸附劑A柱 內(nèi)，用0.1M醋酸鹽，0.137M氯化鈉，pH5.0，作為偶聯(lián)緩沖液。在圖1中在lmL處的峰值g注射的蛋白質(zhì)繞過該柱。觀察到多克隆IgG 的普通的結(jié)合。將56^65Q/。的多克隆IgG用18mLPBS， pH7.4洗脫。ilil計(jì)算收 集餾分中的蛋白質(zhì)濃度，并通過積分計(jì)算洗脫峰面積和通過峰面積之間的比率 來確定回收率。在CEP過程中，在23ml頂點(diǎn)處將乘除的結(jié)合的蛋白質(zhì)釋放出來。在另一個(gè)緩沖液系統(tǒng)中(0.1M HAC， 50mM磷酸酯，pH5.0)動(dòng)態(tài)結(jié)合力 是24mg/mL。圖1的結(jié)果表明本發(fā)明的吸附劑可用于IgG的普通的結(jié)合。參考文獻(xiàn)DeLano, W. L., Ultsch, M. H.， De Vos, A. M., Wells,丄A.: Convergent Solutions to Binding at a Protein-Protein Interface Science 287 pp. 1279(2000).Idusogie, E. E.， Presta, L. G.， Santoro-Gazzano, H., Totpal, K., Wong, P. Y., Ultsch, M, Meng, Y. G， Mullke汀in, M. G.: Mapping of the Cl Binding Site on Rituxan, a Chimeric Antibody with a Human Iggl Fc J.Immunol. 164 pp. 4178 (2000).Jones TA, Zou JY，和 Cowan SW. 1991. Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these methods. Acta Crystallogr. A 47: 110-119.Rarey M, Kramer B. Lengauer T和Kleve G 1996. a fst flexible docking method using an incremental construction algorithm.丄Mol. Biol. 261: 470-489.Carredano E, Baumann H, Gronberg A, Norrman N， Glad G, Zou J-Y, Ersoy O， Steensma E, Axen A. 2004. A novel and conserved pocket of human -Fab fragments: Design, synthesis, and verification of directed affinity ligands. Protein. Sci. 13 (6): 1476-1488.
權(quán)利要求
1.一種用于選擇性地吸附IgG的色譜吸附劑，包含如下化學(xué)式及其對(duì)應(yīng)的烯醇式，其中X表示O、S或NH；R1表示H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、Ar、-C(O)NHR3、-C(O)-R3或鹵素；R2表示H、C1-3烷基或鹵素；R3表示H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基或Ar；n表示0、1、2或3；Y表示載體；Ar表示C6-10芳基，其任選地被一個(gè)或多個(gè)選自羥基、氰基、鹵素、硝基、C1-6烷基和烷氧基的取代基取代。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其中載體Y選自纖維素、淀粉、右旋 糖酐、瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、聚(甲基)丙烯酸酯、聚乙烯基親水聚合物、 聚苯乙烯和聚砜、二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、多糖-合成聚合物、多糖-礦物結(jié)構(gòu)或合成的聚合物-礦物結(jié)構(gòu)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的吸附劑，其中R表示H， n表示O, X表示NH,并且Y表示瓊脂糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 、 2或3所述的吸附劑，其在X和Y之間包括一個(gè)間隔分子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的吸附劑，其中R表示H, n表示0， X表示 NH， Y表示HP-瓊脂糖，并且六亞甲基二胺作為間隔分子。
6. 根據(jù)上述一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的吸附劑，其中載體材料Y呈珠子、不規(guī)則形狀的粒子、纖維、膜、扁平結(jié)構(gòu)或多孔礦物材料的形式。
7.—種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-6中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的色譜吸附劑的方法，包括以下步驟a) 提供色譜載體材料Y;以及b) 在該載體材料表面上偶聯(lián)一種配體，以生產(chǎn)下式的吸附劑及其對(duì)應(yīng)的烯醇式， 其中X表示O、 S或NH;R'表示H、 C"烷基、C"烷氧基、C"烷氧基-Cw烷基、Ar、 -C(O)NHR3、 《(0)-113或鹵素；Fe表示H、 Cw烷基或鹵素；R3表示H、 C^烷基、C"烷氧基、C"垸氧基-C"烷基或Ar; n表示0、 1、 2或3;Y表示載體；Ar表示Cg芳基，其任選地被一個(gè)或多個(gè)選自羥基、氰基、囟素、硝基、 烷基和垸氧基的取代基取代。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中載體Y為具有胺的基質(zhì)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中載體Y是采用六亞甲基二胺延伸的表氯 醇活化的HP-瓊脂糖。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-6的吸附劑用于通過親和層析分離物質(zhì)的用途。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，用于分離IgG、其片段和/或涉及IgG 或其片段的復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于選擇性地吸附IgG的色譜吸附劑，其包括化學(xué)式(I)及其對(duì)應(yīng)的烯醇式，其中X表示O、S或NH；R¹表示H、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基-C_1-6烷基、Ar、-C(O)NHR³、-C(O)-R³或鹵素；R²表示H、C_1-3烷基或鹵素；R³表示H、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基-C_1-6烷基或Ar；n表示0、1、2或3；Y表示載體。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)所述吸附劑的方法，以及該吸附劑用于通過親和層析分離物質(zhì)的用途。
文檔編號(hào)B01J20/289GK101248075SQ200680024428
公開日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日
發(fā)明者A·格朗伯格, A·阿克塞恩, E·卡雷達(dá)諾, M·阿爾特曼, 鄒瑾瑜 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司