專利名稱：高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物分析方法，具體涉及一種利用反相離子對高效液相色譜分析骨肽、復(fù)方骨肽和全蝎提取物原料及制劑的方法。
背景技術(shù)：
骨肽的主要成分為從健康動物四肢骨中提取的水溶性物質(zhì)，如多肽、蛋白肽、氨基酸、有機鈣、磷、無機鈣、無機鹽、微量元素等。全蝎提取物是從全蝎中提取的水溶性物質(zhì)，其主要成分類型同骨肽類似。復(fù)方骨肽是在骨肽的基礎(chǔ)上加入一定量的全蝎提取物得到的復(fù)方制劑。現(xiàn)在市場上常見的有骨肽注射液(舊稱骨寧注射液)和復(fù)方骨肽注射液。骨肽注射液是由健康動物四肢骨經(jīng)提取制成的滅菌水溶液。復(fù)方骨肽注射液由健康豬或胎牛四肢骨與全蝎經(jīng)提取制成的滅菌水溶液，即復(fù)方骨肽注射液是在骨肽注射液的基礎(chǔ)上加入一定量的全蝎提取物制備而成。臨床上用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生、骨折等疾病。經(jīng)臨床驗證，復(fù)方骨肽的藥效作用遠優(yōu)于骨肽。復(fù)方骨肽注射液現(xiàn)在所使用的檢定方法為用福林酚測定法，從回歸方程中求出多肽含量；按藥典中氮測定法，測定其總氮量(2000年版中國藥典)。由于骨提取物與全蝎提取物成分比較接近，以往的檢定方法無法區(qū)別骨肽和復(fù)方骨肽。
因骨提取物與全蝎提取物的主要成分均為多肽或蛋白肽，且兩種提取物的主要成分非常接近，一般的檢驗方法無法將兩種提取物區(qū)分開來，故需要尋找一種靈敏度高、識別力強的分析方法對復(fù)方骨肽注射液中的骨肽成分和全蝎成分進行有效區(qū)別，即定性分析，并能檢定出二者含量。高效液相色譜法具有靈敏度高、識別力強、操作簡便的特點，對于物質(zhì)的定性定量分析都有較好的效果。有文獻報道利用高效液相色譜分析檢定多肽、氨基酸類物質(zhì)(郭曉奎等神經(jīng)肽注射液氨基酸組成成分及含量測定方法的研究《生物技術(shù)》5[6]34-35，1995)。但是，由于多肽、蛋白肽、氨基酸類物質(zhì)無紫外吸收，使用常用的高效液相色譜法分析方法常常難以基線分離且保留時間短，因而對復(fù)方骨肽的分析仍然沒有理想的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服常用高效液相色譜法分析復(fù)方骨肽時遇到的保留時間短、難以分離，不易紫外檢測的困難，采用反相離子對高效液相色譜法對骨肽、復(fù)方骨肽及復(fù)方骨肽中的全蝎成分進行定性及定量分析，對骨肽及復(fù)方骨肽原料及制劑質(zhì)量進行有效監(jiān)控。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，反相離子對高效液相色譜分析復(fù)方骨肽藥品的方法，色譜條件如下，色譜柱反相柱；柱溫室溫；流速1ml/min(可根據(jù)具體情況進行適當(dāng)調(diào)整)；紫外檢測波長220-310nm中的任一值，也可以根據(jù)具體實施情況選擇其他合理波長；流動相采用加入具有強紫外吸收性質(zhì)的離子對試劑的pH穩(wěn)定體系；該pH穩(wěn)定體系為醋酸-醋酸鹽緩沖體系或磷酸-磷酸鹽緩沖體系，也可以是其他適宜的緩沖溶液體系；所述的離子對試劑是具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物；在上述條件下，測定待測樣品的液相色譜特征曲線；通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。
以上方案中所述的具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物，可以選自芐基三甲基氯化銨、芐基三乙基氯化銨、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸氫鉀、苯甲酸鈉、N，N-二甲基對苯二胺鹽酸鹽中的一種或幾種。
所述的反相柱為C8柱、C18柱或苯基柱。
本發(fā)明采用反相離子對高效液相色譜以紫外吸收檢測樣品、延長了樣品的保留時間，骨肽特征峰保留時間為4.6±0.2min；全蝎特征峰可以達到5.2±0.2min和TR＝38.5±1.0min，可以保證達到分析目的。經(jīng)實驗證明，采用此方法得到了骨肽、復(fù)方骨肽及全蝎提取物的指紋圖譜。可以很好的檢測出復(fù)方骨肽中的骨肽成分和全蝎成分，并通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。本發(fā)明操作簡便，使用方便，注射劑樣品可直接進樣檢測，其他劑型樣品及原料樣品經(jīng)稀釋、過濾等簡單處理后即可進樣檢測，并能快速得到檢測結(jié)果，適合用于對產(chǎn)品進行質(zhì)量監(jiān)控。


圖1為全蝎提取液的高效液相色譜圖，離子對試劑為芐基三甲基氯化銨；紫外檢測波長240nm；色譜柱苯基柱。
圖2為骨肽注射液的高效液相色譜圖，色譜條件同圖1。
圖3為全蝎提取液C8柱高效液相色譜圖。
圖4為骨肽注射液C8柱高效液相色譜圖。
圖5為全蝎提取液C18高效液相色譜圖。
圖6為骨肽注射液C18高效液相色譜圖。
圖7為全蝎提取液的高效液相色譜圖，離子對試劑為芐基三甲基氯化銨；紫外檢測波長230nm；色譜柱苯基柱。
圖8為全蝎提取液的高效液相色譜圖，離子對試劑為芐基三甲基氯化銨；紫外檢測波長252nm；色譜柱苯基柱。
圖9為全蝎提取液的高效液相色譜圖，離子對試劑為芐基三甲基氯化銨；紫外檢測波長275nm；色譜柱苯基柱。
圖10為骨肽注射液的高效液相色譜圖，色譜體系中所使用的流動相為2％甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨10mmol/l；紫外檢測波長262nm。
圖11為全蝎提取液的高效液相色譜圖，色譜條件同圖10。
圖12為骨肽注射液的高效液相色譜圖，色譜體系中所使用的流動相為2％甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨5mmol/l；紫外檢測波長262nm。
圖13為全蝎提取液的高效液相色譜圖，色譜條件同圖12。
圖14為骨肽注射液的高效液相色譜圖，色譜體系中所使用的流動相為2％甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨3mmol/l；紫外檢測波長262nm。
圖15為全蝎提取液的高效液相色譜圖，色譜條件同圖14。
圖16為全蝎提取物定量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖17為復(fù)方骨肽注射液的高效液相色譜圖。
具體實施例方式實施例1離子對試劑——芐基三甲基氯化銨的色譜考察色譜條件流動相pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.015mol/L)含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；流速1ml/min；紫外檢測波長240nm；柱溫室溫。
樣品全蝎提取液、骨肽注射液(由南京健利達科技開發(fā)有限公司提供，批號050603)。
反相柱為C8柱。
取適量全蝎提取液和骨肽注射液，用流動相稀釋后，分別取20μl注入色譜儀，所得色譜圖參見圖1、圖2。
結(jié)論色譜條件下骨肽和全蝎得到了明顯區(qū)分，經(jīng)多次重復(fù)，確定骨肽特征峰保留時間TR＝4.6±0.2min；全蝎特征峰TR＝5.2±0.2min和TR＝38.5±1.0min。
實施例2幾種色譜柱的比較色譜條件色譜柱分別使用Lichrospher C8、Lichrospher C18、LichrospherPhenyl色譜柱，規(guī)格均為4.6mm×300mm，5μm；流動相pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.015mol/L)含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；流速1ml/min；紫外檢測波長240nm；柱溫室溫。
樣品全蝎提取液(批號050603)和骨肽注射液將兩種樣品分別用流動相稀釋一定倍數(shù)后，各取20μl分別注入三種不同的色譜體系，所得色譜圖見附圖1，圖2，圖3，圖4，圖5，圖6。對色譜圖進行分析，見表1。
表1

結(jié)論各種反相柱均能夠分辨全蝎特征峰，但是優(yōu)選Phenyl柱。
實施例3考察不同比例有機溶劑的流動相色譜條件流動相C％(C＝10、5或0)甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；流速1ml/min；色譜柱LichrospherPhenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)，紫外檢測波長262nm；柱溫室溫。
樣品全蝎提取液(批號050603)和骨肽注射液將樣品分別用流動相稀釋后，取20μl注入到色譜儀中，比較所得色譜圖中兩種樣品的區(qū)別。分析結(jié)果見表2。
表2

實施例4紫外檢測波長的考察色譜條件色譜柱Lichrospher Phenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)；流動相pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.015mol/L)含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；紫外檢測波長230nm、240nm、252nm、275nm；柱溫室溫；流速1ml/min。
樣品全蝎提取液(批號050603)取適量樣品用流動相稀釋若干倍，注入20μl到色譜儀中，分別在上述波長下進行檢測，所得色譜圖參見圖1，圖7，圖8，圖9。由圖中可以觀察到，四個波長下均檢測到保留時間約38min的全蝎特征峰，波長為240nm時特征峰較為明顯。
實施例5離子對試劑濃度對檢測的影響色譜條件流動相分別為2％甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨3mmol/l、5mmol/l和10mmol/l；紫外檢測波長262nm；其余同實施例4樣品全蝎提取液(批號050603)和骨肽注射液取樣品適量，分別進樣20μl于上述三種色譜體系中，所得色譜圖參見附圖10，圖11，圖12，圖13，圖14，圖15，對色譜圖進行比較，以考察合適的離子對試劑濃度(見表3)。
表3

結(jié)論芐基三甲基氯化銨濃度為5mmol/l時，檢測靈敏度較好，較為合適。
實施例6流速的選擇流動相為pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液含芐基三甲基氯化銨5mmol/L，色譜柱分別為Lichrospher Phenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)和Lichrospher C18柱(4.6mm×300mm，5μm)時，調(diào)整流速使其分別為0.5、0.8、1.0、1.2ml/min，觀察壓力變化情況。見表4。
表4

實施例7方法學(xué)考察色譜條件色譜柱Lichrospher Phenyl色譜柱(4.6mm×300mm，5μm)；流動相pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；流速1ml/min；紫外檢測波長240nm；柱溫室溫。
樣品生藥濃度為0.04g/ml的全蝎提取液(批號050603)1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定精密量取全蝎提取物溶液0.625，0.85，1.0，1.25，2.5ml分別置于10ml容量瓶中，用流動相定容至刻度，即得到濃度為2.5、3.4、4.0、5.0、10mg/mL的全蝎提取物樣品。依次進樣，每次進樣20μL，每兩次進樣間隔60min，測量特征峰保留時間和峰面積，各濃度樣品分別測三次，取三次峰面積積分平均值。以峰面積為縱坐標(biāo)，樣品進樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖16)，得回歸方程y＝2E+06x-326.75，r＝0.9984，線性范圍2.5-10mg/ml(生藥濃度)。
2、最低檢出限、定量限及精密度分別將樣品用流動相稀釋不同倍數(shù)。在色譜條件穩(wěn)定的情況下分別進樣20μL。分析所得色譜圖，發(fā)現(xiàn)樣品濃度為0.4mg/ml時，特征峰峰高為噪音的3倍左右，故認(rèn)為全蝎提取液最低檢測限是樣品濃度為0.4mg/ml(生藥濃度)；樣品濃度為1.5mg/ml時，特征峰峰高為噪音的10倍左右，故認(rèn)為全蝎提取液定量限是樣品濃度為1.5mg/ml(生藥濃度)；取12mg/ml、8mg/ml、3mg/ml(高、中、低)三種濃度的樣品，于不同的時間進樣，計算日間精密度和日內(nèi)精密度日內(nèi)RSD分別為1.76％、2.08％、1.97％；日間RSD分別為1.85％、1.66％、2.21％。
實施例8全蝎提取液的含量測定色譜條件同實施例7；1、已知濃度的全蝎提取液對標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗證濃度樣品全蝎提取液，濃度為0.08g/ml(生藥濃度)操作過程將樣品用流動相稀釋10倍，進樣三次，對所得色譜圖進行峰面積積分，三次平均峰面積x＝30874帶入實施例7中的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，最后折算出該樣品中全蝎提取物濃度為0.078g/ml。
2、未知濃度的全蝎提取液的含量測定樣品濃度未知的全蝎提取液(批號050601)操作過程將樣品用流動相稀釋5倍，進樣三次，對所得色譜圖進行峰面積積分，特征峰平均保留時間為37.62min，將三次平均峰面積帶入實施例7中的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，最后折算出該樣品中全蝎提取物濃度為0.028g/ml(生藥濃度)。
實施例9對復(fù)方骨肽注射液的質(zhì)量驗證色譜條件同實施例7；樣品5批不同時間(2002-2005年)生產(chǎn)的復(fù)方骨肽注射液(由南京健利達科技開發(fā)有限公司提供)將樣品用流動相稀釋后，各進樣20μl，從得到的色譜圖中均可觀察到全蝎特征峰。其中一樣品所得色譜圖參見圖17。圖17中全蝎特征峰保留時間約39min。將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，折算后，得到該樣品中全蝎濃度為0.006g/ml(生藥濃度)。
實施例10，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用芐基三乙基氯化銨；反相柱為C18柱。
實施例11，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用對羥基苯甲酸；反相柱為苯基柱。
實施例12，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用鄰苯二甲酸氫鉀。
實施例13，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用苯甲酸鈉。
實施例14，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用N，N-二甲基對苯二胺鹽酸鹽。
實施例15，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用芐基三甲基氯化銨與對羥基苯甲酸、實施例16，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用芐基三甲基氯化銨與鄰苯二甲酸氫鉀。
實施例17，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用芐基三甲基氯化銨與苯甲酸鈉。
實施例18，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用芐基三甲基氯化銨與N，N-二甲基對苯二胺鹽酸鹽。
實施例19，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用芐基三乙基氯化銨與對羥基苯甲酸。
實施例20，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用芐基三甲基氯化銨、鄰苯二甲酸氫鉀與苯甲酸鈉。
實施例21，與上述實施例基本相同，但具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物采用對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸氫鉀、苯甲酸鈉與N，N-二甲基對苯二胺鹽酸鹽。
權(quán)利要求
1.一種高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法，色譜條件如下，色譜柱反相柱；柱溫室溫；流速1ml/min；紫外檢測波長220-310nm中的任一值；流動相采用加入具有強紫外吸收性質(zhì)的離子對試劑的pH穩(wěn)定體系；該pH穩(wěn)定體系為醋酸-醋酸鹽緩沖體系或磷酸-磷酸鹽緩沖體系；所述的離子對試劑是具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物；在上述條件下，測定待測樣品的液相色譜特征曲線；通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。
2.一種權(quán)利要求1中所述的高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法，其特征在于，所述的具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物選自芐基三甲基氯化銨、芐基三乙基氯化銨、對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸氫鉀、苯甲酸鈉、N，N-二甲基對苯二胺鹽酸鹽中的一種或幾種。
3.一種權(quán)利要求1或2中所述的高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法，其特征在于，所述的反相柱為C8柱、C18柱或苯基柱。
全文摘要
高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法，色譜條件如下，色譜柱反相柱；柱溫室溫；流速1ml/min；紫外檢測波長220－310nm中的任一值；流動相采用加入具有強紫外吸收性質(zhì)的離子對試劑的pH穩(wěn)定體系醋酸－醋酸鹽或磷酸－磷酸鹽緩沖體系；離子對試劑是具有帶正電荷的陽離子基團和帶負(fù)電荷的陰離子基團的化合物；在上述條件下測定待測樣品的液相色譜特征曲線；通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。本發(fā)明延長了樣品的保留時間，可保證達到分析目的，得到了骨肽、復(fù)方骨肽及全蝎提取物的指紋圖譜。可檢測出復(fù)方骨肽中的骨肽成分和全蝎成分，并通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。
文檔編號B01J20/281GK1908653SQ20061003780
公開日2007年2月7日 申請日期2006年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月16日
發(fā)明者任勇, 王曉潔, 馬學(xué)琴, 朱貫臣, 吉愛寧 申請人:南京師范大學(xué), 南京健利達科技開發(fā)有限公司