專利名稱：溶于復(fù)雜混合物中的不同分子靶的分離和/或分析設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離和/或分析溶于復(fù)雜混合物中的不同分子靶、特別是核酸或蛋白質(zhì)分子靶的設(shè)備。本發(fā)明特別涉及分離或分析分子靶的設(shè)備，其中包括由生物聚合物探針構(gòu)成的芯片或陣列。這樣設(shè)備用于分離和/或檢測(cè)溶于復(fù)雜溶液中的多種分子靶。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方式，設(shè)備包括a.微型柱陣列，其包括放置在同一平面上的N個(gè)行和P個(gè)列的微型柱，每個(gè)微型柱包括一種固定的分子探針型，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，通過探針/靶特異連接，能保留在復(fù)雜混合物中存在的特異分子靶，b.平行于所述微型柱陣列平面并在其上面的平面內(nèi)的第一毛細(xì)管網(wǎng)，所述的第一毛細(xì)管網(wǎng)能將接到所述設(shè)備中的復(fù)雜混合物循環(huán)到如在a中定義的陣列的每個(gè)微型柱中，c.平行于該微型柱陣列平面并在其下面的平面內(nèi)的第二毛細(xì)管網(wǎng)，所述的第二毛細(xì)管網(wǎng)能將洗脫后的分子靶循環(huán)到一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器中，由此回收它們和/或?qū)λ鼈冞M(jìn)行分析，d.如果必要，用于回收和/或分析不同的分子靶的檢測(cè)器，優(yōu)選質(zhì)譜儀。
本發(fā)明還涉及分離和/或檢測(cè)溶于復(fù)雜溶液中的多種分子靶的設(shè)備，所述的設(shè)備包括a.毛細(xì)管網(wǎng)，它能使加入所述設(shè)備的復(fù)雜混合物循環(huán)，b.兩組置于毛細(xì)管網(wǎng)兩側(cè)的電極-官能化電極組，其中這些電極接入由點(diǎn)組成的探針，每種探針通過探針/靶的特異連接能保留在該復(fù)雜混合物存在的特異分子靶，-非官能化電極組。
本發(fā)明還涉及這樣一種設(shè)備尤其在分離和/或分析生物試樣中含有的DNA或RNA分子中的用途。
人們知道可采用質(zhì)譜法分析測(cè)定大分子的質(zhì)量，例如DNA、RNA或蛋白質(zhì)的質(zhì)量。如果采用這種方法分析伴隨有分子分解，還可以測(cè)定它們的序列。不過，對(duì)于具有不同尺寸和序列的分子混合物，采用這種技術(shù)就變得很困難，甚至不可能鑒別這些不同的分子。
可采用其它方法替代質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。
因此，表面等離子體共振(SPR)能夠測(cè)定用具有自由電子金屬(例如金或鉑等)制成的小厚度(xnm)薄片表面上小距離(200nm以下)內(nèi)的累計(jì)物質(zhì)密度。事實(shí)上，在該金屬薄片的其中一個(gè)面上反射波隨在另一面附近物質(zhì)的密度和量成比例地改變。然而，確實(shí)不可能區(qū)分引起反射波改變的不同類分子。此外，采用這種方法，檢測(cè)在生物-芯片上固定靶的靈敏度目前低于使用標(biāo)記分子熒光所達(dá)到的靈敏度。在該金屬表面上探針存在本身因遠(yuǎn)離金屬靶而降低其檢測(cè)靈敏度。動(dòng)力學(xué)測(cè)量靶/探針相互作用時(shí)，在該表面附近存在的自由靶分子使這種測(cè)量走樣。一般而言，由于效能的緣故，采用SPR方法檢測(cè)需要使用比熒光或放射性標(biāo)記法多的材料量。因此，采用SPR檢測(cè)還與一些實(shí)驗(yàn)不相容，特別在診斷領(lǐng)域更是如此。
另外，可以求助于測(cè)量在不同分子狀態(tài)之間存在的阻抗變化。
具有一定序列的單鏈DNA分子的阻抗與相應(yīng)的雙鏈配對(duì)復(fù)合體的不同。這種性質(zhì)用于評(píng)估DNA芯片上的雜交比例，因此可評(píng)估在生物-芯片上生成的探針-靶復(fù)合體數(shù)(ref.)。一般而言，這些阻抗變化可以用于研究分子間的相互作用，例如配體固定在其受體上，但也可以用于研究DNA或蛋白質(zhì)與藥物、離子等之間的相互作用。不過，對(duì)于這些生物芯片，這種檢測(cè)方法受到下述因素制約1)難以制造2000個(gè)點(diǎn)以上的高密度芯片。事實(shí)上，由于制造這些阻抗芯片所使用的電極尺寸和連接物幾何結(jié)構(gòu)，點(diǎn)數(shù)一超過800個(gè)，雜交面積就變得非常大。然而大的雜交面積要求應(yīng)該布滿很大雜交面積的試樣體積，因此需要大量的生物材料，以便達(dá)到這種檢測(cè)的最小濃度。這與例如對(duì)于這些診斷可使用材料不多的實(shí)驗(yàn)有矛盾。
2)所研究分子的構(gòu)象變化(探針和/或靶)會(huì)造成測(cè)量結(jié)果的假改變，導(dǎo)致不能解釋測(cè)量的阻抗變化。例如，由于分子內(nèi)序列或雜交而產(chǎn)生的DNA變形與雜交所引起阻抗的變化為相同的數(shù)量級(jí)。
在現(xiàn)有技術(shù)中采用場(chǎng)效應(yīng)晶體管作為電流放大器，測(cè)量與DNA分子雜交相關(guān)的阻抗變化(ref.)。把探針接到晶體管柵極。這些靶固定后，它們改變了柵極阻抗，這樣引起在(晶體管輸入)電源與晶體管輸出漏極之間的電流改變。
但是，還沒有描述過這類檢測(cè)器的任何網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。使用場(chǎng)效應(yīng)晶體管作為電流放大器這個(gè)事實(shí)制約了為證明與雜交相關(guān)阻抗變化而可使用的交流電流頻率，自此制約了檢測(cè)器的靈敏度(ref.)。此外在上述說明中，這種柵極控制了晶體管中電流通過，其中植入這些探針消除了使用如電極的晶體管不同端子來控制靶運(yùn)動(dòng)，由此引導(dǎo)雜交集中在靶與探針層面上的可能。
由生物聚合物探針組成的陣列(DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片等)能夠定性和定量地分離在混合物中存在的生物聚合物，這在理論上是可行的，不管其數(shù)量、序列和復(fù)雜性。但是，例如核酸網(wǎng)絡(luò)不能絕對(duì)精確地計(jì)算雜交分子數(shù)。此外，采用實(shí)際可用的技術(shù)，檢測(cè)生物芯片上的生物聚合物(微-陣列)是間接的，因此需要一個(gè)對(duì)它們進(jìn)行標(biāo)記的步驟(熒光、放射性等)。如果在生物聚合物中放射性標(biāo)記殘留物和冷殘留物加入效率幾乎相同時(shí)，這與使用熒光標(biāo)記物不同(Martinez等人，《Nucl.Acids.Res.》2003，31，第18頁；Hoen等人，《Nucleic Acids Res.》，2003年3月1日，31(5)，第20頁)。合成加入熒光標(biāo)記物CY3和CY5的DNA分子時(shí)尤其會(huì)遇到這些標(biāo)記問題。由該后一類標(biāo)記得到的立體阻塞物還可能嚴(yán)重地改變反應(yīng)(通常的雜交、抗體-抗原反應(yīng)、靶-配體反應(yīng)等)的動(dòng)力學(xué)和化學(xué)計(jì)算量平衡。采用放射性同位素可克服這些立體阻塞物問題；不過，這些放射性同位素牽涉到放射性廢物的管理。另外，采用放射性方法標(biāo)記分子的檢測(cè)技術(shù)，即實(shí)質(zhì)上放射性的磷成像類檢測(cè)技術(shù)(Bertucci F等人，《Hum Mol Genet.》，1999年9月，8(9)，第1715-22頁；Erratum in，《Hum Mol Genet.》1999年10月，8(11)，第2129頁)，與不同類型的熒光檢測(cè)掃描儀，對(duì)于達(dá)到進(jìn)行測(cè)量的檢測(cè)閾值和再現(xiàn)性，在芯片上待雜交生物材料量方面有一些限制。事實(shí)上，不可能使用含有低細(xì)胞數(shù)(約1000個(gè)細(xì)胞)的試樣通過細(xì)胞檢測(cè)以某些拷貝數(shù)存在的分子，然而，這些細(xì)胞數(shù)量卻與通常的臨床取樣情況相對(duì)應(yīng)。
使用經(jīng)典DNA芯片的另一種選擇在于使用沿整個(gè)毛細(xì)管長度呈環(huán)狀排列的探針使該毛細(xì)管內(nèi)官能化，每個(gè)環(huán)是由對(duì)一種基因特異的探針型構(gòu)成的。較小的毛細(xì)管直徑(約100μm)能夠在理論上減少可分析試樣的體積，因此例如使用較低的標(biāo)記生物材料量就能夠達(dá)到熒光法可檢測(cè)的濃度。然而，與降低反應(yīng)體積相同，在探針環(huán)中每個(gè)進(jìn)行雜交靶的濃度依賴于整個(gè)毛細(xì)管的體積。探針數(shù)增加得越大，毛細(xì)管的長度就應(yīng)該越長，達(dá)到檢測(cè)濃度需要的材料量(例如待分析試樣)就越大(毛細(xì)管的體積與其長度成正比)。使用毛細(xì)管時(shí)，與試樣標(biāo)記相關(guān)的這些問題依然相同。另外，使用大量不同探針生產(chǎn)官能化的毛細(xì)管是棘手的，費(fèi)用也高。
最后，一般而言在該技術(shù)狀況中描述的DNA或蛋白質(zhì)芯片是單次使用，這樣使每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的使用成本非常高。這種使用的獨(dú)特性大大制約了這些技術(shù)在為診斷所作的臨床研究和試驗(yàn)方面的普及。
本發(fā)明提供一種設(shè)備，它能夠分離和/或分析在復(fù)雜混合物中存在的特異分子靶，特別是生物聚合物分子靶，例如RNA、DNA或蛋白質(zhì)分子。本發(fā)明的設(shè)備在大量實(shí)驗(yàn)中是可重復(fù)使用的，還能夠測(cè)量約微微微摩爾(10-18)，甚至zepto摩爾(10-21)的產(chǎn)物濃度。使用有限細(xì)胞數(shù)，例如約千個(gè)，甚至百個(gè)細(xì)胞，這些極限能夠通過細(xì)胞鑒定單拷貝存在的分子。另外，根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，該設(shè)備能夠進(jìn)行對(duì)比分析，因此能夠同時(shí)分析多個(gè)試樣。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，該設(shè)備能夠通過探針直接測(cè)量例如保留在所述陣列每個(gè)微型柱中或在陣列雜交點(diǎn)中的核酸或蛋白質(zhì)序列。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離和/或分析溶于復(fù)雜混合物中的幾種分子靶的設(shè)備，所述的設(shè)備包括a.微型柱陣列，包括放置在同一平面上的N個(gè)行和P個(gè)列的微型柱，每個(gè)微型柱包括固定的分子型探針，它能通過探針/靶特異連接保留在復(fù)雜混合物中存在的特異分子靶，b.在平行于所述微型柱陣列平面并位于其上面的平面中的第一毛細(xì)管網(wǎng)，所述的第一毛細(xì)管網(wǎng)能將加到所述設(shè)備的復(fù)雜混合物循環(huán)到如在a中定義的陣列的每個(gè)微型柱中，c.在平行于該微型柱陣列平面并位于其下面的平面中的第二毛細(xì)管網(wǎng)，所述的第二毛細(xì)管網(wǎng)能將洗脫后的分子靶循環(huán)到一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器中，因此能回收它們和/或?qū)λ鼈冞M(jìn)行分析，d.如果必要，檢測(cè)器，它能回收和/或分析不同的分子靶，優(yōu)選質(zhì)譜儀。
如果必要，電極系統(tǒng)能夠操作、替換在這些網(wǎng)中的靶。
術(shù)語“毛細(xì)管”應(yīng)該理解是允許循環(huán)流體，直徑小于1毫米，優(yōu)選地1-100μm的任何合適管道。
在本發(fā)明的意義上，“分離復(fù)雜混合物中的分子靶”應(yīng)該理解是這種操作，它能夠獲得富含初始復(fù)雜混合物中存在的特異分子或分子靶的不同體積的溶液。這里“富含”應(yīng)該理解是在分離后所得到的溶液中至少50％，優(yōu)選80％，還更優(yōu)選至少90％的分子是這些分子靶。
“分析分子靶”應(yīng)該理解這種操作在于鑒定在待分析復(fù)雜混合物中存在的分子靶(測(cè)定)和/或確定這種分子靶的相對(duì)或絕對(duì)量(定量分析)。
術(shù)語“復(fù)雜混合物”在本發(fā)明的意義上應(yīng)該理解是含有大量不同結(jié)構(gòu)分子的溶液，特別地是含有100種以上具有不同結(jié)構(gòu)分子的混合物。更優(yōu)選地，本發(fā)明的設(shè)備用于分離和/或分析特別在生物源試樣中含有的生物學(xué)分子(或生物分子)。
更具體地，可能涉及從生物組織或液體中采集的試樣，例如血液、血漿、腦脊髓液、尿或唾液?？梢詮膭?dòng)物(特別地哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人)采集試樣。特別可以從健康個(gè)體或患有病理學(xué)疾病的患者采集試樣。該病理學(xué)疾病具體可以是癌癥、神經(jīng)變性病理學(xué)、感染病理學(xué)，特別是病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染病理學(xué)疾病。這種試樣還可以含有組織提取物或細(xì)胞提取物，其來自真核細(xì)胞或原核細(xì)胞、細(xì)菌、蕈類或酵母，特別是培養(yǎng)物中的細(xì)胞或從外部環(huán)境采集的細(xì)胞。還可以從植物中采集獲得這種試樣。還可能涉及從農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)品中進(jìn)行抽取，特別是從烹飪食品中進(jìn)行采集，或從谷粒、水果或糧食中進(jìn)行采集。
這種設(shè)備因此可以用于各種用途，特別是用于藥物診斷或農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量控制，或任何生物學(xué)分析，特別用于生態(tài)學(xué)、考古學(xué)或犯罪學(xué)領(lǐng)域。
本發(fā)明設(shè)備的每個(gè)微型柱包括任何形狀的室，例如管狀室，其直徑優(yōu)選地是2-1000μm，優(yōu)選地20-100μm，長度2-2000μm，優(yōu)選地40-200μm。
每個(gè)室通過第一端與第一毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管連接，通過其相反端與第二毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管連接，因而可能讓在毛細(xì)管網(wǎng)中循環(huán)的流體通過整個(gè)室。
所述設(shè)備通常由置于同一平面中多個(gè)室的N個(gè)行和P個(gè)列的陣列構(gòu)成。這些室相對(duì)于該平面可以有任何的傾斜度，但是由于實(shí)際的原因這些室優(yōu)選地平行或垂直于該陣列平面。由于堵塞的原因，這些室的兩行中的一行可以呈梅花形放置。
特別地，在制造本發(fā)明設(shè)備時(shí)在合適材料表面的厚度內(nèi)可以鑿出或模塑這些室，于是構(gòu)成該陣列的平面，所述材料例如是玻璃、硅、塑料、Kapton、碳、金或任何其它材料。
本發(fā)明設(shè)備的微型柱陣列因此由大量的室構(gòu)成，例如1至1百萬個(gè)室，優(yōu)選地100-100000個(gè)室，因此能分離和/或分析在同一試樣中會(huì)含有的如此之多的特異分子靶。
所述分子探針放置并固定在每個(gè)室中，優(yōu)選地，根據(jù)探針的具體特性放置并固定在每個(gè)室中，于是構(gòu)成每個(gè)都能夠保留特異分子靶的色譜微型柱。
在本發(fā)明的意義上，術(shù)語“固定”表示當(dāng)循環(huán)流通過有這些分子探針的微型柱時(shí)，特別是在電場(chǎng)、磁場(chǎng)存在下，或在預(yù)先注入該設(shè)備毛細(xì)管網(wǎng)中的循環(huán)流的存在下，這些探針保持在這些室中。
該設(shè)備因此由微型柱陣列組成，其中每個(gè)微型柱包括大量(例如106-1010)具有同樣特性的探針，這些探針被固定，并能在適當(dāng)條件下特異地與相應(yīng)分子靶連接。下文用術(shù)語“分子探針”表示這些探針。探針與所述復(fù)雜混合物中含有靶的連接的術(shù)語“特異連接”，表示該探針與特定靶連接，但與其它分子連接不多，更特別地與該復(fù)雜混合物中存在的其它靶連接不多。
優(yōu)選的探針-靶對(duì)，特別是與互補(bǔ)序列雜交的核酸，例如用特定的寡核苷酸探針雜交信使RNA、DNA或cDNA分子，由抗體或其的功能片段組成的探針專門識(shí)別抗原，或任何的受體-配體對(duì)，反之亦然。
本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能將所述的設(shè)備用于分離和/或分析任何類型的分子，當(dāng)它們結(jié)合成為特異識(shí)別的實(shí)體時(shí)，該實(shí)體含有分子探針，所述靶分子于是能特異地與在支持物上固定的所述分子探針連接。
例如借助與一種不能從所述室出來的單元的強(qiáng)相互作用可以達(dá)到將探針固定在每個(gè)室中。這種偶聯(lián)方式例如是這些探針固定在該室內(nèi)壁上，特別是通過共價(jià)鍵或任何其它的強(qiáng)相互作用將這些探針固定在該室內(nèi)壁上。
或者，這些分子探針可以固定在微粒上，該微粒結(jié)構(gòu)是使得它們不可能從其室中逃逸(Huang等人，《分析化學(xué)》(Anal.Chem.)，2002年，74(14)，第3362-3371頁；Ugolin等人，F(xiàn)R0015398，2000年，11月)。所述微粒的平均直徑例如是大于每個(gè)微型柱進(jìn)口或出口毛細(xì)管的直徑。如果這些微粒能經(jīng)受或提供磁吸引力，并且如果所述室的一部分壁能另外提供或經(jīng)受磁吸引力，則通過這些微粒與該室的一部分內(nèi)壁的磁相互作用或許可以將這些微粒保留在該室中。
在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，所述分子探針在每個(gè)室中被固定在凝膠上，因此妨礙所述的分子探針遷移到所述微型柱外。例如通過與構(gòu)成凝膠的分子的強(qiáng)相互作用或共價(jià)鍵保留所述分子探針。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，每個(gè)室填滿了凝膠，而所述分子探針與一些微粒聯(lián)接，該微粒直徑大于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)尺寸，因此允許將這些微粒固定在所述微型柱中，由此固定聯(lián)接所述的分子探針。
可以采用任何合適方法將這些分子探針與這些微粒或與所述室內(nèi)壁聯(lián)接。作為例子，特別可以列舉在同生物素聯(lián)接的分子探針與用抗生物素蛋白官能化的珠之間的生物素-抗生物素蛋白型的非共價(jià)聯(lián)接，例如以“dynal”銷售的這些產(chǎn)品(Dynal全世界經(jīng)銷商，版權(quán)1996，DynalAS-技術(shù)手冊(cè)第二版)。
一般而言，就這些色譜柱所描述的所有聯(lián)接、化學(xué)鍵合、強(qiáng)相互作用類型可能都適合。
特別地，可以將所述探針直接固定在裝在每個(gè)微型柱中的凝膠聚合物上。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，特別地，在所述探針是核酸的情況下，為了使該探針與微粒共價(jià)聯(lián)接，可能的是合成一種非均相聚合物polyX/探針，例如聚-吡咯/核酸。事實(shí)上，在5′端或3′端與吡咯連接的這些核酸分子探針具有與游離吡咯分子聚合的特性，于是生成一種非均相聚合物，因此，這些尺寸足夠大的非均相聚合物可以起到上述微粒的作用。
另外一種選擇是使用在5′端和/或3′端與橋聯(lián)劑連接的核酸探針，例如補(bǔ)骨脂素。探針序列可以呈下述形式補(bǔ)骨脂素5′(Y1)Xn(Y2)3′。Xn代表嚴(yán)格意義的探針，而Y1和Y2是如此選擇的序列，以致這些探針能夠被連接，彼此無須通過互補(bǔ)性來制約。作為實(shí)例，這些聚合探針可以由5′(T)mXn(A)m3′補(bǔ)骨脂素等摩爾混合物組成，其中m＝5。在紫外輻射作用下，這些探針聚合成大分子(聚5′(T)mXn(T)m3補(bǔ)骨脂素3′(A)m(X)n(A)m5′等)，它可以保留在每個(gè)室中。
所有上述的相互作用類型也可能都適合探針直接固定在所述室壁上的情況。特別地，通常利用的相互作用也可能適合固定核酸探針的DNA芯片或固定多肽探針的蛋白質(zhì)芯片(賴氨酸/核酸靜電相互作用、硅烷固定、吡咯在其室表面上的聚合作用、補(bǔ)骨脂素固定等)，如同在珠或室壁上原位合成方法。同樣可考慮使用尼龍或硝基纖維素將這些探針不可逆地固定在微?；蛩鍪冶谏?這時(shí)微?；虮谑怯眠@些材料制成的)。這種固定可以是直接的，或借助橋接進(jìn)行固定，例如在尼龍微粒與分子探針之間的補(bǔ)骨脂素橋。
在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，同源可考慮使用孔直徑足夠小的孔過濾器(例如，直徑小于過濾微粒的直徑)將與微粒聯(lián)接的分子探針機(jī)械保留在該室中。這樣一些過濾器(特氟隆過濾器等)目前使用和銷售。
分子探針在其支持物上固定應(yīng)該強(qiáng)到足以耐受在操作所述靶時(shí)所施加的不同處理與承受所采用的任選電場(chǎng)。
本發(fā)明的設(shè)備包括一個(gè)或兩個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)，它們與能夠控制待分析靶的洗脫和/或遷移的電極連接，采用將所述探針固定在生物芯片支持物上的所述任何化學(xué)方法都可以將這些探針固定在所述電極上。在用ITO(或任何其它透明合金、ATO、ZNO、FTO)制成的電極的情況下，可以實(shí)現(xiàn)具有親水基團(tuán)探針的直接沉積，例如PO3-(參見ref.)，如這些核酸便是這種情況。
需要采用封裝方法將沒有接受探針植入的電極部分分開。例如，可以使用一種聚吡咯薄膜。在吡咯溶液的存在下，將這些植入的電極置于電壓下時(shí)，制造出這種薄膜。這種吡咯在電流作用下自發(fā)地聚合，并離析出電極的自由部分。在植入探針后，這些電極還可以用不會(huì)被所述靶雜交的單一寡核苷酸(polyA例子)進(jìn)行飽和。
本發(fā)明涉及在用ITO制成的電極上通過直接吸附固定核酸聚合物的方法。
所述設(shè)備包括兩個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)時(shí)，允許待分析混合物循環(huán)通過所有的微型柱。相應(yīng)的所述靶特異地保留在每個(gè)微型柱上。然后洗脫該靶，即從與其特異結(jié)合的分子探針上洗脫它們，然后遷移到一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器，同時(shí)到達(dá)在微型柱出口的毛細(xì)管網(wǎng)。
考慮到大量的微型柱，很容易理解到為了順序分析靶，可能有利的是在N*P微型柱陣列的情況下，在每個(gè)微型柱中或在例如一行一行地排列的至少不同的微型柱組中，能夠分別控制洗脫和/或遷移所述的靶，如作為優(yōu)選實(shí)例所描述的。
按照本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的對(duì)于二氧化硅采用酸腐蝕技術(shù)，或?qū)τ谒芰喜捎眉す饧庸し椒?，在諸如二氧化硅、塑料(像有機(jī)玻璃)之類的材料中，例如鑿出或模塑出這些毛細(xì)管網(wǎng)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在合適材料板的厚度內(nèi)鑿出每個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)。所述設(shè)備這時(shí)包括微型柱陣列和兩塊已鑿出這些毛細(xì)管網(wǎng)的板，這些毛細(xì)管網(wǎng)粘接在陣列的每個(gè)面上(Kuo等人，《化分析學(xué)》，2003，75(10)，第2224-2230頁；Kuo等人，《化分析學(xué)》，2003，75(8)，第1861-1867頁)。
在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，如上所述的本發(fā)明設(shè)備的特征在于，它包括一些工具，在陣列的一個(gè)或多個(gè)特定微型柱中，這些工具能夠控制分子靶洗脫和/或在洗脫后將它們保留在這些微型柱中。
“洗脫”應(yīng)該理解是消除在所述靶與所述探針之間已建立的所述特異連接的操作。
在本發(fā)明的意義上，“在特定的微型柱中控制洗脫和/或靶遷移”應(yīng)該理解是，該設(shè)備能夠選擇一些微型柱，其中的靶會(huì)被洗脫或遷移到所述檢測(cè)器中，而其它的靶沒有被洗脫或仍保留在所述微型柱中，盡管或許有液流通過所述的微型柱。
如果使用同樣的分析設(shè)備時(shí)，這時(shí)有可能分別分析從每個(gè)微型柱或微型柱組洗脫的靶，按照這種實(shí)施方式的設(shè)備尤其能夠限制所采用檢測(cè)器的數(shù)量。
在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，當(dāng)所述分子靶是帶電荷的分子，例如核酸時(shí)，有可能通過施加電場(chǎng)控制這些靶的洗脫和/或遷移，例如使用與每個(gè)微型柱接觸并在每個(gè)微型柱出口排列的電極組。在每個(gè)室中的這些電極可以是彼此獨(dú)立的(室與室多路傳送)或是由電極組組成的，因此每一組室形成每個(gè)電位單元。
因此，在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，本發(fā)明的設(shè)備包括第一電極，即室或中間電極，放置在與每個(gè)微型柱接觸，優(yōu)選地在微型柱的中間，以及第二電極，即遠(yuǎn)側(cè)電極，放置在每個(gè)微型柱的出口，因此能控制將保留在一個(gè)或多個(gè)特定微型柱中的分子靶洗脫和/或?qū)⑺鼈冞w移到所述檢測(cè)器或洗脫后將它們保留在這些微型柱中。
設(shè)置這些室電極以便在洗脫后通過電相互作用將一些帶電分子保留在該微型柱中，然后允許它們選擇性遷移。這些室是管狀時(shí)，例如安排所述分子與室的側(cè)壁接觸。
如果所述設(shè)備能洗脫和/或?qū)⒎肿影蟹謩e遷移到檢測(cè)器，所述設(shè)備可以包括一個(gè)合適的毛細(xì)管網(wǎng)，它尤其能把在微型柱出口的分子靶會(huì)聚到有限數(shù)量的檢測(cè)器中，甚至單個(gè)檢測(cè)器中。
另外，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的設(shè)備特征在于通達(dá)微型柱進(jìn)口的第一毛細(xì)管網(wǎng)和通達(dá)微型柱出口的第二毛細(xì)管網(wǎng)，所述第一毛細(xì)管網(wǎng)包括加入復(fù)雜混合物的第一橫向毛細(xì)管，以下稱之上橫向管道，其直徑優(yōu)選地是2-1000μm，其與通達(dá)所述陣列微型柱的所有毛細(xì)管連接，所述第二毛細(xì)管網(wǎng)包括將所述微型柱與所有毛細(xì)管連接的一個(gè)或多個(gè)橫向毛細(xì)管，其稱之下橫向管道，直徑優(yōu)選地是2-1000μm，該下橫管道與一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器連接。
所述下和上橫向管道每個(gè)優(yōu)選地與電極連接，因此在待分析復(fù)雜混合物加入點(diǎn)與所述檢測(cè)器之間能施加一個(gè)電位差，由此還能夠保證帶電分子在整個(gè)設(shè)備中遷移，特別是能夠通過電泳保證在待分析復(fù)雜混合物含有的核酸在整個(gè)設(shè)備中遷移。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)備的特征在于所述微型柱陣列包括安排在同一平面內(nèi)的N個(gè)行和P個(gè)列的微型柱，其特征還在于它包括一些工具，它們能夠控制保留在特定行微型柱上的分子靶的洗脫和/或?qū)⑺鼈冞w移到所述檢測(cè)器和/或在洗脫后將它們保留在所述微型柱上，其特征還在于選擇第二毛細(xì)管網(wǎng)的每個(gè)毛細(xì)管長度，以使在微型柱出口與下橫向管道之間的距離因第二毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管之間的不同而不同，優(yōu)選地從連接一行第一微型柱的毛細(xì)管到連接該行最后微型柱的毛細(xì)管是遞增或遞減的，結(jié)果對(duì)于同一行的每個(gè)微型柱，分子靶通過微型柱出口到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間都是不同的。
作為實(shí)例，為了達(dá)到來自同一行每個(gè)微型柱的靶的不同遷移時(shí)間，將每個(gè)微型柱與下橫向管道連接的毛細(xì)管網(wǎng)可以包括P個(gè)平行毛細(xì)管，每個(gè)毛細(xì)管可將所述陣列中同一行的P個(gè)微型柱與下橫向管道連接起來，并與不同的所述下橫向管道形成角度90°。為了進(jìn)一步延遲標(biāo)記，在室的最后行與橫向管道之間的這些毛細(xì)管部分沿著非線性路徑行走。
能夠通過不同靶的遷移時(shí)間鑒定所述靶來自的微型柱，因此能夠采用在微型柱中的分子探針鑒定上述靶。由此選擇毛細(xì)管的直徑和其中使用的任意凝膠密度，從而并不從大小標(biāo)準(zhǔn)方面辨別這些遷移分子，而遷移時(shí)間只是取決于達(dá)到的途徑。然而，任選地可以選擇凝膠密度，以便通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行色譜分離。分子遷移時(shí)，采用適當(dāng)?shù)哪z可使具有不同尺寸的分子有不同延遲，或使諸如在同一探針上被雜交的具有小的序列多形態(tài)的分子有不同延遲。
優(yōu)選地，下橫向管道以及具有不同距離第二毛細(xì)管網(wǎng)的不同部分都裝滿凝膠。因此，靶快速遷移直到第二毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管不同部分，在此進(jìn)行色譜分離。
為了控制所述設(shè)備微型柱每行的靶的洗脫和/或遷移，同一行的所有P個(gè)微型柱都可以與同一電極連接，本發(fā)明的設(shè)備因此包括N個(gè)行電極(室行電極)，優(yōu)選地在微型柱中間的行電極，和第二組與行電極平行的電極(遠(yuǎn)側(cè)的行電極)，同時(shí)在同一行的微型柱出口將P個(gè)毛細(xì)管連接起來。
于是得到一種室或中間行電極網(wǎng)一種微型柱陣列行電極。除了在每個(gè)室中允許靶的毫微-操作外，這些電極可以催化探針固定，例如與吡咯連接的探針，在電場(chǎng)作用下其固定在每個(gè)電極中。第二組遠(yuǎn)側(cè)的行電極，即室行電極的鏡面電極，安排在微型柱陣列的室的出口。所述行電極對(duì)確定了N*P微型柱陣列的電位單位。所述電極對(duì)能夠向微型柱的每行施加所期望的電位。
根據(jù)所述設(shè)備的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，第一和第二毛細(xì)管網(wǎng)位于平行于微型柱陣列平面的平面中，優(yōu)選地它們分別在由該微型柱陣列構(gòu)成的平面之上和之下，而第一毛細(xì)管網(wǎng)，稱之上毛細(xì)管網(wǎng)，包括N個(gè)平行的毛細(xì)管，每個(gè)毛細(xì)管將上橫向管道與該陣列同一行的P個(gè)微型柱連接起來，而第二毛細(xì)管網(wǎng)，稱之下毛細(xì)管網(wǎng)，包括P個(gè)平行毛細(xì)管，每個(gè)毛細(xì)管將該陣列同一列的N個(gè)微型柱與下橫向管道連接起來，在上下兩個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)之間形成的角度不是0，優(yōu)選地是90°。因此，通過微型柱陣列的每行P個(gè)室將上毛細(xì)管網(wǎng)的每個(gè)毛細(xì)管與該下毛細(xì)管網(wǎng)的所有這些毛細(xì)管連接起來。反之亦然，通過微型柱陣列的每列N個(gè)室將下毛細(xì)管網(wǎng)的每個(gè)毛細(xì)管與該上毛細(xì)管網(wǎng)的所有毛細(xì)管連接起來。
在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，其中包括N*P微型柱的這樣一種陣列，與上橫向管道相反的上毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管末端，優(yōu)選地與該微型柱陣列行的第P個(gè)和最后一個(gè)微型柱最后連接而中止，以及下橫向管道相反的下毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管末端，優(yōu)選地與該微型柱陣列微型柱的列的第N個(gè)和最后一個(gè)室最后連接而中止。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，讓與橫向管道相反的下毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管末端與第二橫向毛細(xì)管(副下橫向管道)連接，這個(gè)管道能在通過所述微型柱陣列的兩個(gè)下、上毛細(xì)管網(wǎng)之間確立流，這樣能夠加速和更精確地控制在下毛細(xì)管網(wǎng)中遷移。事實(shí)上，如果主下橫向管道裝滿一種凝膠以使微毛細(xì)管電泳達(dá)到這個(gè)水平，這時(shí)總有可能在上橫向管道與副下橫向管道之間建立封閉循環(huán)流。
一般而言，這些毛細(xì)管網(wǎng)可以裝填凝膠，例如聚丙烯酰胺或任何其它凝膠，這種凝膠能夠調(diào)節(jié)這些流，分子遷移時(shí)還能夠控制它們擴(kuò)散，特別是毛細(xì)管電泳使用的液體凝膠。
在裝有N*P微型柱陣列的設(shè)備的一個(gè)特別實(shí)施方式中，上和下橫向管道裝有有或沒有螺紋的活塞，因此能夠控制所述流通過的微型柱的行數(shù)。往后移動(dòng)時(shí)，該活塞使所述陣列的微型柱行越來越多。
在制作有槽的空心活塞時(shí)，可能任選地使微型柱的行逐行移動(dòng)。
在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，在無流動(dòng)的雜交期間進(jìn)行靶循環(huán)，同時(shí)在上、下橫向管道的這些電極與相繼的行電極之間建立交變電場(chǎng)。這個(gè)電場(chǎng)能夠有規(guī)律地使這些未雜交靶混合，以使雜交溶液均勻。此外，通過調(diào)節(jié)電場(chǎng)力有可能控制雜交的特異性(Cluzel P，1996，《科學(xué)》(Science)，Vol.2071(5250)，第792-794頁)。
一個(gè)使用疊置雙毛細(xì)管網(wǎng)的較簡單的替代辦法是使用單個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)和行電極對(duì)組，構(gòu)成本發(fā)明的設(shè)備。
所述設(shè)備這時(shí)呈由點(diǎn)組成的探針陣列形式(相應(yīng)于一個(gè)雜交單位)，其中每個(gè)點(diǎn)由分子型探針構(gòu)成，例如核酸聚合物型，其序列對(duì)于一種基因是特異性的(蛋白質(zhì)應(yīng)涉及抗體型或特異配體)。將該陣列點(diǎn)的每個(gè)行放在金或ITO(或任何其它合適的金屬或合金)表面上，同時(shí)規(guī)定了電極的范圍，這時(shí)整個(gè)陣列由對(duì)應(yīng)于行數(shù)n的n個(gè)電極構(gòu)成，每個(gè)行電極包括植入探針的P個(gè)點(diǎn)(參見圖7)。在絕緣材料，例如玻璃、kapton、氧化鋁等上通過薄層鏤蝕這些電極(參見示意圖)。
制作第一組電極的鏡面第二組電極，但是這次該電極不用接入探針，這些電極是所述的非官能化的。兩組電極與P個(gè)平行毛細(xì)管網(wǎng)彼此相對(duì)放置，結(jié)果有一個(gè)電極組在上面，另一個(gè)電極組在下面(圖8和9)。第一官能化電極組具有植入由點(diǎn)組成的探針的電極，每種探針存在于所述復(fù)雜混合物中時(shí)，通過探針/靶特異連接能保留特異性的分子靶。第二電極組具有非官能化的電極。在一個(gè)特別的實(shí)施例中，所述官能化電極組位于所述毛細(xì)管網(wǎng)上面，而所述非官能化電極組位于所述毛細(xì)管網(wǎng)下面。每個(gè)毛細(xì)管與該官能化電極組的n個(gè)電極和該非官能化電極組的n個(gè)電極垂直(圖9、10、11)。該構(gòu)造如此實(shí)現(xiàn)，以致n個(gè)官能化電極的第一點(diǎn)是在該毛細(xì)管網(wǎng)的第一毛細(xì)管中，n個(gè)官能化電極的第二點(diǎn)是在該毛細(xì)管網(wǎng)的第二毛細(xì)管中，依此類推(圖11)。電極對(duì)是由在該毛細(xì)管網(wǎng)上面接入由點(diǎn)組成的探針的電極和在該毛細(xì)管網(wǎng)下面的非官能化電極相對(duì)而成的。這些電極的厚度可以非常小，能夠采用SPR進(jìn)行檢測(cè)。在毛細(xì)管網(wǎng)的每個(gè)末端，這些毛細(xì)管會(huì)聚到一個(gè)圓形容器。該容器包括在與該官能化電極組相同的平面內(nèi)的電極(容器電極)(圖11)。在一個(gè)特別的實(shí)施例中，這個(gè)電極是圓的。在一個(gè)特別的實(shí)施例中，這個(gè)電極處在每個(gè)容器頂部的中心。所述官能化電極組(植入探針的電極)是由兩個(gè)補(bǔ)充連接電極完成的第一彎曲電極位于第一容器電極與第一官能化電極之間，第二彎曲電極位于第二容器電極與最后的官能化電極之間。該連接電極是彎曲的，其曲率如此確定，以致于該連接電極與該容器中心(容器電極)之間的距離在任何電極點(diǎn)都是相同的。
第一補(bǔ)充連接電極位于第一容器電極與第一官能化電極之間，第二補(bǔ)充連接電極位于第二容器電極與最后官能化電極之間，結(jié)果在該連接電極與該容器電極之間的最短距離在任何電極點(diǎn)都是相同的。
上面對(duì)本發(fā)明的設(shè)備作了描述，該設(shè)備包括所述網(wǎng)構(gòu)成單元的雙毛細(xì)管網(wǎng)，該單元例如是毛細(xì)管、電極、檢測(cè)器等，這種描述可適用于制作包括單一網(wǎng)的設(shè)備，前提是其與具有單一網(wǎng)的這個(gè)設(shè)備運(yùn)行相容，如果需要這個(gè)結(jié)構(gòu)還可改動(dòng)。
類似地，對(duì)待分析分子和使用的探針以及它們的制備、使用和檢測(cè)方式所作的描述都可適用于制作包括單一網(wǎng)的設(shè)備，前提是其與具有單一網(wǎng)的這個(gè)設(shè)備運(yùn)行相容，如果需要這個(gè)結(jié)構(gòu)還可改動(dòng)。
包括唯一一個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)的設(shè)備運(yùn)行原理是利用活性雜交(ha)，并可描述如下
1)把待分析試樣(圖12)接到第一容器中。這些分析的分子是核酸時(shí)，在第一連接電極(正)與第一容器電極(負(fù))之間施加一個(gè)電位。在分析蛋白質(zhì)時(shí)，這個(gè)電位可以交替地顛倒。本說明書下面涉及這些核酸的作用。這些待分析分子以等摩爾方式遷移到每個(gè)毛細(xì)管中，并濃縮在所述連接電極上。
2)然后，切斷容器電極與連接電極之間的電位，而在第一官能化電極(+)與連接電極(-)之間施加一個(gè)電位。這時(shí)，每個(gè)毛細(xì)管的這些分子遷移到第一官能化電極，在這里第一電極點(diǎn)的互補(bǔ)靶(通過毛細(xì)管的點(diǎn))可能被雜交(這種電場(chǎng)加速其雜交)。在每個(gè)點(diǎn)的濃度是最大的(它只是取決于毛細(xì)管的數(shù)量，不再取決于管道化總體積)。
3)為了將這些靶限制在點(diǎn)內(nèi)，可以把第二行電極(非官能化的)調(diào)到負(fù)電位；達(dá)到一種電荷分布(-+-)，其中+電荷的中心在每個(gè)毛細(xì)管的第一點(diǎn)上。為了改善這種雜交作用，這些電位可以是不連續(xù)的。無電位的時(shí)間間隔相應(yīng)于松馳時(shí)間，在這個(gè)時(shí)間里這些靶可以無限制地進(jìn)行雜交。為了增加待分析靶的混合，有利于少量存在靶的雜交，在松馳時(shí)間里，在所述毛細(xì)管網(wǎng)上面和下面的第一電極對(duì)之間可以建立間斷的交變電位(這還改善雜交的特異性)。
一旦這些靶在點(diǎn)的第一行水平進(jìn)行雜交，第一行就會(huì)去除這些電位。連接電極位置記為0，接入探針的第一、第二和第三官能化電極的位置分別記為1、2和3時(shí)，施加的電位順序可以如此描述4)第二官能化電極處于正電位，電荷的分布是(0-、1+、2+)(任選地，第三電極處在負(fù)電位)，電荷分布(0-、1+、2+、3-)；5)第一官能化電極處于負(fù)電位，電荷分布是(0-、1-、2+)，任選地(0-、1-、2+、3-)；6)連接電極處于0，電荷分布(1-、2+)，任選地(1-、2+、1-)；7)在官能化電極2與非官能化電極2之間的間斷交變電位。
在點(diǎn)的第一行中所有非雜交探針會(huì)遷移到點(diǎn)的第二行中。全部的遷移、松馳、混合順序(點(diǎn)4-6)逐步應(yīng)用于使在分析試樣中有互補(bǔ)靶的所有行的所有點(diǎn)雜交。一旦到達(dá)第二容器，已遷移到不同毛細(xì)管中的這些靶再進(jìn)行混合。這時(shí)有可能按照一種實(shí)施方案沿著另一方向達(dá)到這些電位順序，以便沿著相反方向通過這個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)。靶在兩個(gè)容器之間來回通過這些毛細(xì)管能夠提高該設(shè)備的檢測(cè)穩(wěn)定性。
根據(jù)前面就具有雙毛細(xì)管網(wǎng)的設(shè)備所描述的，使用具有唯一一個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)的設(shè)備對(duì)這些雜交靶進(jìn)行量化，可考慮有多個(gè)檢測(cè)可能性。關(guān)于SPR·可以直接就這種官能化電極網(wǎng)對(duì)這些靶進(jìn)行量化。為了能進(jìn)行SPR測(cè)量(參見用SPR檢測(cè)章節(jié)說明)，在官能化電極網(wǎng)的每行電極背后安裝呈三棱體狀的棱鏡。
·為了減少檢測(cè)本底噪聲和解決靈敏度的問題，可以對(duì)所述非官能化電極組進(jìn)行SPR測(cè)量，其中與每個(gè)電極毛細(xì)管相反的這個(gè)面同三棱鏡聯(lián)接(參見spr章)。在這個(gè)檢測(cè)方法中，該官能化電極組可以與一種結(jié)構(gòu)聯(lián)接，或每個(gè)點(diǎn)被小室分隔開并限定其范圍(圖13)。每個(gè)室是一個(gè)小槽，其底是由官能化電極構(gòu)成的，并且它是在非官能化電極對(duì)面朝著該毛細(xì)管敞開的(在毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管一側(cè)敞開的室)。這些室間隔避免了其中一個(gè)靶在官能化電極與非官能化電極之間遷移過程中一個(gè)點(diǎn)靶與另個(gè)點(diǎn)靶混合。
在使用有側(cè)邊和單個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)的敞開室的情況下，有可能使橫向管道適合于毛細(xì)管系統(tǒng)和遷移延遲系統(tǒng)(參見如有關(guān)具有雙毛細(xì)管網(wǎng)設(shè)備的下毛細(xì)管網(wǎng)所描述的章節(jié))。在使用單個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)的情況下，有可能取消第二容器，用毛細(xì)管系統(tǒng)的橫向管道和遷移延遲系統(tǒng)取代該容器(圖14)。因此，具有兩個(gè)疊置毛細(xì)管網(wǎng)的這個(gè)系統(tǒng)的所述同樣檢測(cè)類型也可應(yīng)用于簡化系統(tǒng)。
在這種構(gòu)型中，第一連接電極是如此彎曲的，以致在連接電極與容器中心之間的距離在該電極任何點(diǎn)處都是相同的，還在于第二連接電極不是彎曲的。雜交時(shí)，這個(gè)電極用于確定這些探針不可越過的電邊界，然后在檢測(cè)步驟，這個(gè)電極應(yīng)能夠借助由靶電極和連接電極所確定的電位將這些靶引向該延遲系統(tǒng)。
如果所述電極相對(duì)于橫向管道有一個(gè)凸角，則延遲效果被放大。關(guān)于熒光-如果所述靶用一種熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，則有可能用掃描儀在所述官能化電極組上直接讀出這些雜交的靶。同樣地，可以采用熒光與SPR(用SPR的損耗波激發(fā)熒光分子)的聯(lián)用方法。
-所述靶沒有標(biāo)記時(shí)，使用靶或復(fù)合物的熒光配體時(shí)可以評(píng)價(jià)探針/靶復(fù)合物比率。對(duì)于DNA芯片，列舉吖啶類，特別是吖啶橙，它是一種帶正電荷DNA的插入子(intercalant)。吖啶橙能夠有區(qū)別地標(biāo)記單或雙DNA，通過由這些電極系統(tǒng)產(chǎn)生的電場(chǎng)的作用消除其游離分子。借助能夠控制所有帶電荷分子的電極組，可以在雜交或絡(luò)合反應(yīng)過程中進(jìn)行所有的測(cè)量。這個(gè)方法，可以估計(jì)組成該點(diǎn)的探針分子數(shù)和已雜交的靶數(shù)；這兩種測(cè)量能夠確定靶在溶液中的真實(shí)濃度。
為了避免來自電極的干擾熒光，使用ITO類的合金可以制作全部的連接物，這些合金在可見光區(qū)是透明的(氧化銦和氧化錫或任何其它等效合金等)。這些合金是非常親電子的，它們嚴(yán)格能耐受在化學(xué)離析章中所描述的化學(xué)離析方法。
在一種本發(fā)明設(shè)備的特定結(jié)構(gòu)中，這些探針可以放在該官能化電極組的這些電極之間(圖7)。
在使用雙毛細(xì)管網(wǎng)的情況下，本發(fā)明的設(shè)備包括一個(gè)或多個(gè)分開收集所述分子靶和/或分開分析所述分子靶的合適檢測(cè)器，下面稱之這個(gè)或這些檢測(cè)器。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，將所述檢測(cè)器與下橫向管道的出口相連，而下橫向管道連接第二毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管。在本文下面詳細(xì)地描述了一種設(shè)備，它包括檢測(cè)器和連接第二毛細(xì)管網(wǎng)所有毛細(xì)管的下橫向管道。當(dāng)然，其它的變化也是可考慮的，特別地，可以使用多個(gè)檢測(cè)器，將每個(gè)檢測(cè)器與下橫向管道的出口相連，而下橫向管道連接第二毛細(xì)管網(wǎng)的一部分毛細(xì)管。
在第二毛細(xì)管網(wǎng)的出口可以裝配所有的檢測(cè)系統(tǒng)，特別是能夠區(qū)分諸如來自不同試樣的分子靶的所述分子靶所使用的標(biāo)記類型。
作為實(shí)例，如果這些靶可用熒光標(biāo)記，特別是在用熒光探針標(biāo)記后，可以使用分光光度計(jì)進(jìn)行這種檢測(cè)，該分光光度計(jì)能夠激發(fā)或獲得標(biāo)記分子熒光或研究分子的固有熒光。為此，在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，可能的是在下橫向管道出口添加一種在石英晶體或任何其它透明材料中鑿成的毛細(xì)管，該透明材料能夠激發(fā)和獲得這種熒光(例如塑料)。這種熒光通過該石英毛細(xì)管時(shí)被激發(fā)而可閱讀。研究分子的自然熒光可以用于這種檢測(cè)。同樣地，在紅外光譜法和喇曼光譜法中可以使用NaCl或KCl晶體進(jìn)行研究。
或者，如果一些靶是用順磁標(biāo)記物標(biāo)記的，則可利用順磁或電子共振進(jìn)行這些靶的檢測(cè)和量化。
采用SPR進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，遠(yuǎn)側(cè)或內(nèi)行電極是由厚度幾十μm的金(或具有自由電子的其它金屬)箔構(gòu)成。每個(gè)遠(yuǎn)側(cè)電極的外面(與管道相反)是與三棱鏡(玻璃、石英、塑料或任何其他可以適合于該SPR的透明材料)的三個(gè)面拼接的。該三棱鏡是由一種三面體構(gòu)成的，其三個(gè)矩形面中的一個(gè)矩形面是與遠(yuǎn)側(cè)行電極的外面聯(lián)接的，三面體的長度相應(yīng)于該電極的長度(圖15)。
在靶雜交后，在所述微管道回路中進(jìn)行漂洗與除去所有未雜化的靶，而雜化靶保留在每個(gè)室中或每個(gè)點(diǎn)中，以便簡化概念。給該系統(tǒng)施加電壓，以便在每行電極對(duì)中，分別在官能化和非官能化電極概念中，中間電極的電位是正的，而遠(yuǎn)側(cè)電極的電位是負(fù)的。我們?cè)诿枋鰰r(shí)把官能化電極比作中間電極，而把非官能化電極比作遠(yuǎn)側(cè)電極。對(duì)于這些蛋白質(zhì)、抗體或分子受體芯片，這些電位隨研究分子的電荷而改變。把能解開探針-靶復(fù)合體的離液劑加到該介質(zhì)中。將這些探針與靶分開，但依然因中間電極的負(fù)電荷而保留在每個(gè)室或點(diǎn)中(圖16)。在第一電極對(duì)中的電位顛倒過來，例如遠(yuǎn)側(cè)電極的電位是正的，而中間電極的電位是負(fù)的。依賴于電極對(duì)的室或點(diǎn)每行的靶，遷移到該毛細(xì)管網(wǎng)中，進(jìn)入與毛細(xì)管網(wǎng)垂直的遠(yuǎn)側(cè)電極中(兩個(gè)疊置網(wǎng)系統(tǒng)中的下毛細(xì)管網(wǎng))，例如每個(gè)室或點(diǎn)的這些探針再處于不同的毛細(xì)管中。
本發(fā)明還涉及一種SPR分析方法，該方法包括-靶在電極上雜交，-用離液劑去雜交，-通過電位保持靶，
-顛倒電位使這些靶遷移到非官能化電極上，-測(cè)量非官能化電極上的SPR。
讓光在遠(yuǎn)側(cè)電極的外面上反射通過放在每個(gè)電極上的這些三棱鏡進(jìn)行SPR測(cè)量。通過觀測(cè)所測(cè)量的SPR信號(hào)隨著時(shí)間而改變的速度，有可能估算離解常數(shù)。將交變電流施加在一對(duì)行電極之間時(shí)，有可能測(cè)量探針/靶的結(jié)合常數(shù)和離解常數(shù)。在這種特定的情況下，這些實(shí)驗(yàn)中不使用變性劑，從而電場(chǎng)誘發(fā)的局部濃度變化能夠?qū)崿F(xiàn)探針和靶的這些結(jié)合和離解。
施加在電極上的電流可能干擾SPR信號(hào)。為了減少這種干擾，在行電極對(duì)之間施加的電場(chǎng)可以是間斷的。這時(shí)只在電場(chǎng)中斷階段進(jìn)行SPR測(cè)量。我們可以講采用SPR脈沖與電場(chǎng)頻率聯(lián)用測(cè)量，有可能通過分析SPR信號(hào)隨著行電極對(duì)之間電場(chǎng)中斷時(shí)間而變化的速度測(cè)定分子的擴(kuò)散系數(shù)。每對(duì)行電極都重復(fù)進(jìn)行同樣的操作。
由于金屬表面沒有官能化，這些靶可以與該金屬直接接觸，這樣于是增加了檢測(cè)的靈敏度。此外，該電場(chǎng)能夠?qū)⑦@些靶最大地集中于該金屬表面，這樣也提高了檢測(cè)靈敏度。由于SPR檢測(cè)取決于質(zhì)量，所以待檢測(cè)分子越重，這種檢測(cè)就越有效。因此增加分子量能夠降低檢測(cè)限。使用這些用重同位素置換的靶原子能夠增加分子量，于是能夠降低檢測(cè)限。
在相應(yīng)于使用單毛細(xì)管網(wǎng)的可替換辦法的情況下，可能的是采用直接電檢測(cè)法直接測(cè)量固定在靶上的分子阻抗。除了通過電場(chǎng)控制探針和靶的作用外，植入這些芯片中的電極系統(tǒng)還能夠直接測(cè)量固定在靶上的分子阻抗。為了達(dá)到高的點(diǎn)密度，在低于20cm2表面上為103-106，生產(chǎn)一種交叉電極系統(tǒng)。該系統(tǒng)由位于在探針點(diǎn)的陣列下面和上面兩個(gè)不同平面中的兩個(gè)疊置電極組組成。所述非官能化電極組的方向垂直于所述官能化電極組的方向(圖17)。例如在官能化電極與非官能化組的電極上平面投射的每個(gè)交點(diǎn)將這些點(diǎn)植插在該官能化電極組。探針聯(lián)接取決于電極的性質(zhì)和探針分子的性質(zhì)(參見探針植入和電極絕緣章)。在DNA分子的范圍內(nèi)，為了降低因DNA彎曲和分子內(nèi)雜交而產(chǎn)生的測(cè)量偽差，可考慮的是最大地限制分子構(gòu)象，這些偽差會(huì)引起與雜交相同數(shù)量級(jí)的阻抗變化。一種限制DNA的辦法是采用分子梳理將其吸收在電極上。在該電極上這些拉長分子不再可能發(fā)生它們自身的彎曲或雜交，相反地，它們還保持在溶液中與互補(bǔ)序列雜交的能力。另一種解決辦法是在所述官能化電極組與所述非官能化電極組之間繃緊所述探針分子，同時(shí)通過這些末端將該分子固定在電極上。使用探針寡核苷酸，在5′和3′兩個(gè)末端被官能化。在5′端選擇的官能化不同于在3′端選擇的官能化。兩類官能化具有不同的激活和/或催化作用。例如在5′端選擇具有化學(xué)或光激活作用的官能Hs、NH2，在3′端選擇具有電催化的吡咯官能。在官能化電極組與非官能化電極組之間的距離如此選擇，以致這些分子被繃緊，不能改變特定的彎曲或進(jìn)行分子內(nèi)雜交。一種替代辦法是使所述探針的5′末端官能化，使其接在官能化的電極上，還在于在3′(3′附著位點(diǎn))端添加一個(gè)短序列(10-20個(gè)堿基對(duì))。選擇特異性的附著3′位點(diǎn)的序列，以便它不與這些靶雜交。將在附著3′位點(diǎn)的互補(bǔ)序列接在對(duì)面的非官能化電極上。借助化學(xué)鍵通過其5′末端將這些探針與所述官能化電極組聯(lián)接起來，借助在附著位點(diǎn)與接在電極上的互補(bǔ)序列之間形成的10-20對(duì)堿基復(fù)合體，通過3′末端將這些探針與所述非官能化電極聯(lián)接起來。這些探針于是在這兩個(gè)電極之間被繃緊，這樣降低了分子內(nèi)雜交和彎曲。
帶有這些植入的探針的電極芯片，通過靶簡單擴(kuò)散到每個(gè)點(diǎn)中可以被動(dòng)地雜交，例如對(duì)這些實(shí)際生物-芯片進(jìn)行的雜交。然而，優(yōu)選的是按照上述方法的活性雜交。為此目的，一個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)和兩個(gè)與前面章節(jié)所描述的類似容器，放置在官能化與非官能化電極組之間。把兩個(gè)容器電極以及兩個(gè)連接電極接到官能化電極組(參見示意圖)中。一旦該芯片被雜交，根據(jù)每個(gè)點(diǎn)的阻抗變化就能夠測(cè)定固定靶的量。官能化電極與非官能電極的投射(在上平面中)之間的交點(diǎn)是唯一的，相應(yīng)于唯一一個(gè)點(diǎn)。對(duì)由非官能化電極和官能化電極構(gòu)成的任何可能電極對(duì)相繼地施加電位差和電流時(shí)，可測(cè)量點(diǎn)與點(diǎn)的阻抗。
兩組疊置電極之間垂直設(shè)置，在理論上能夠進(jìn)行這種測(cè)量。然而，使用交流電或不連續(xù)電流與一個(gè)電極連接多個(gè)點(diǎn)這個(gè)事實(shí)，會(huì)帶來干擾電容問題，這些問題會(huì)干擾這種測(cè)量。事實(shí)上，這使得正確地測(cè)量電流和電壓變得很困難，甚至變得不可能，從而也難以確定每個(gè)點(diǎn)的阻抗。為了解決這個(gè)問題，需要加進(jìn)能夠確定點(diǎn)與點(diǎn)的電壓和電流的斷路器。為了制作與生物芯片尺寸相容的斷路器，在同一平面中用電極格子代替所述官能化電極組(或所述非官能化電極組)，該格子由絕緣的第一組電極(水平的)，和與第一組電極垂直的第二組電極(垂直的)組成。格子的網(wǎng)孔限定了空間范圍，或按照格子尺寸安排側(cè)邊10-500μm的小電極(點(diǎn)電極)。在每個(gè)格子網(wǎng)孔中放置一個(gè)或兩個(gè)場(chǎng)效應(yīng)晶體管，以致該晶體管的柵極與該格子網(wǎng)孔側(cè)邊的水平電極連接，晶體管的輸入端子(電源)與該格子網(wǎng)孔側(cè)邊的垂直電極連接，而晶體管的輸出端子(漏極)與點(diǎn)電極連接。
簡言之，我們得到一個(gè)格子，其由水平和垂直電極確定的網(wǎng)孔被小的點(diǎn)電極占據(jù)。使用一個(gè)或兩個(gè)場(chǎng)效應(yīng)晶體管將這些點(diǎn)電極與格子網(wǎng)孔四個(gè)側(cè)邊中的兩個(gè)側(cè)邊連接起來(圖17、18)。將這些分子探針接到每個(gè)點(diǎn)電極中。這些非官能化電極組放置在每個(gè)“點(diǎn)電極”列對(duì)面，并且平行于官能化格子的垂直電極。這個(gè)非官能化電極組的每個(gè)電極是與其本體連接的。這個(gè)非官能化電極組可以用與其本體連接的單個(gè)板代替。
在用不連續(xù)電流測(cè)量阻抗的情況下(這種電流總是沿著同一方向流動(dòng))，使用“點(diǎn)電極”的單個(gè)晶體管對(duì)于發(fā)揮斷路器的作用是必不可少的。把這些水平電極置于電壓下時(shí)，所有這些晶體管的柵極都供電，這樣切斷了所有這些晶體管輸入與輸出之間的電流，這些點(diǎn)電極因此被隔開了。切斷唯一一個(gè)水平電極中的電流時(shí)，在對(duì)單個(gè)垂直電極施加電流與不連續(xù)電場(chǎng)時(shí)，只是在兩個(gè)電極交點(diǎn)處的晶體管讓電流在其輸入與輸出之間通過。讓單個(gè)點(diǎn)處于電壓下時(shí)，可以使用其它的點(diǎn)測(cè)量在點(diǎn)電極中的阻抗變化而沒有干擾。
在采用交變電流測(cè)量阻抗的情況下(電流沿著兩個(gè)方向流動(dòng))，不管電流的方向，都應(yīng)該給點(diǎn)電極供電。因此需要在該格子網(wǎng)孔放置兩個(gè)場(chǎng)效應(yīng)晶體管，它們具有相反的特征，即晶體管柵極的電壓是零或負(fù)的時(shí)，讓所述電流對(duì)于第一晶體管沿著一個(gè)方向，對(duì)于第二晶體管沿著另一個(gè)方向在輸入與輸出之間通過。不管電流通過的方向怎樣，都給點(diǎn)電極供電。有利的是添加能讓電流沿著兩個(gè)方向在輸入與輸出之間通過的晶體管，例如“nmos”或“pmos”類型的晶體管，但這些晶體管有附加端子，因此需要通過格子網(wǎng)孔進(jìn)行這種水平電極的連接，這樣制約了小型化。
可能的是進(jìn)行熒光和阻抗的混合檢測(cè)或只是熒光的檢測(cè)(這時(shí)只使用這些電極按照前面活性雜交(ha)的說明進(jìn)行雜交)。為了不妨礙這些探針或靶發(fā)射的熒光，所有的電路和電極都可以用例如ITO的透明合金制成。在用熒光檢測(cè)這些核酸的情況下，用發(fā)色團(tuán)標(biāo)記靶的一種替代變化包括使用這些核酸的熒光插入物。吖啶是良好的候選者，特別是吖啶橙，它與單鏈DNA分子或DNA/DNA復(fù)體結(jié)合時(shí)具有發(fā)出不同熒光的特性。此外，吖啶橙帶正電，這樣能夠使它在電場(chǎng)中移動(dòng)。通過用吖啶標(biāo)記并測(cè)量發(fā)射的熒光可以測(cè)定在每個(gè)點(diǎn)的探針密度，同時(shí)施加不同的電場(chǎng)能夠除去未與DNA探針結(jié)合的吖啶分子。施加電場(chǎng)的順序與ha章所描述的類似，但可以將電場(chǎng)的方向適合于希望被移動(dòng)的分子電荷。一旦把這些靶加到所述芯片上，相對(duì)于DNA/DNA復(fù)合物生成的熒光測(cè)量，通過將它與探針熒光比較能夠測(cè)定每類靶的濃度。這種方法能夠?qū)崿F(xiàn)動(dòng)態(tài)測(cè)量雜交，還能夠測(cè)量這些靶與這些探針之間的離解常數(shù)(kd)和結(jié)合常數(shù)(ka)?？梢詫械膋d和ka測(cè)量結(jié)果與天然序列所得到的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較，這樣就有可能證明多形性。更一般而言，進(jìn)行混合測(cè)量時(shí)，例如使用一種插入物和靶熒光標(biāo)記與發(fā)色團(tuán)，或測(cè)量阻抗和插入物等等時(shí)，有可能證明這種探針與這種靶不配對(duì)。
特別地，在本發(fā)明設(shè)備中使用的檢測(cè)器是一種質(zhì)譜儀。該質(zhì)譜儀能夠同時(shí)為使用者檢測(cè)靶分子數(shù)和這些分子的性質(zhì)(分子量和在某些條件下它們的化學(xué)式)。所述設(shè)備例如可以包括與質(zhì)譜儀的離子化電噴(ElectroSpray Ionisation，ESI)連接的下橫向管道(Kebarle等人，《分析化學(xué)》，1993，65(22)，第972-986頁)。優(yōu)選地，該下橫向管道通過壓電或熱小管與檢測(cè)器連接，該小管允許有規(guī)律的注入電噴(ElectroSpray)中。ESI的所有這些改進(jìn)都是可調(diào)節(jié)的，例如微噴霧(microESI)、毫微噴霧(nanoESI)、微微噴霧(pico ESI)(Smith等，T.Matsuo等人編輯，1995年，John Wiley and son；Baffinslane、Chischester、West Sussex，UK，第41-74頁；Emmett等人，《J.AM Soc.MassSpectrom》，1994年，5，第605-613頁；Valaskovic等人，《分析化學(xué)》，1995年，67(20)，第3802-3805頁)。其它類型的檢測(cè)器，例如在直角加速的飛行時(shí)間里四極子分析儀(aoTOF或QTOF)(Chernushevich等人，第43屆MS和Allied Topics的ASMS會(huì)議會(huì)議錄，1995年，亞特蘭大，喬治亞州；Sanzone，G，《Rev.SCi.Instrum》，1970年，41(5)，第741頁)，是可用于本發(fā)明設(shè)備中的。
這些分子離子的質(zhì)量和電荷數(shù)據(jù)與分子離子數(shù)能夠推導(dǎo)出特異性地保留在一定微型柱中的每類分子靶性質(zhì)與數(shù)量。特別地通過靶的特異性標(biāo)記和在采用MS/MS方法獲得譜的期間分子分解，可以推導(dǎo)出在每個(gè)微型柱中特異性地與探針連接的分子的化學(xué)式(Chernushevich等人，第43屆MS和Allied Topics的ASMS會(huì)議會(huì)議錄，1995年，亞特蘭大，喬治亞州)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，還可能考慮同時(shí)安裝兩套能進(jìn)行熒光分析和電噴的石英毛細(xì)管，采用質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)雙熒光檢測(cè)。同樣地，可以協(xié)同安裝多個(gè)不同類型的檢測(cè)器或分析儀。
根據(jù)本發(fā)明設(shè)備的一個(gè)特別實(shí)施方式，可能的是平行分析不同試樣的不同轉(zhuǎn)錄組。
在該設(shè)備的一個(gè)特別實(shí)施方式中，該設(shè)備包括包括轉(zhuǎn)錄組的代表，集合的核酸為特征的核酸[固定在這些室中或微粒上]。
關(guān)于“轉(zhuǎn)錄組的代表”，應(yīng)該理解包括固定在該室中的核酸，其具有相同或互補(bǔ)的序列，或在嚴(yán)格條件下特異性地與信使RNA雜交，該信使RNA是一定細(xì)胞或全體細(xì)胞的基因組核酸序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并且對(duì)于所述的細(xì)胞或前提細(xì)胞，其比例是與在特定條件下所得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的比例相當(dāng)?shù)摹?br> 下面的實(shí)施例中描述了轉(zhuǎn)錄組的代表性核酸的制備方法。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄組的代表集合核酸被固定在微粒上，而采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺龅奈⒘９潭ㄔ谖⑿椭?。采用具體地在下面實(shí)施例3描述的方法，所述設(shè)備能夠平行地分析不同的轉(zhuǎn)錄組。
本發(fā)明特別地涉及含有固定了轉(zhuǎn)錄組的代表、集合核酸的這樣這些微粒。
本發(fā)明還涉及按照實(shí)施例3中確定的標(biāo)準(zhǔn)選擇的一組核酸分子。在每個(gè)微型柱中含有轉(zhuǎn)錄組的集合代表性核酸的微型柱芯片，特別地可以使用這組核酸分子。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)備的特征在于這些分子探針是肽或多肽，優(yōu)選地連接所述抗原的抗體或片段。
本發(fā)明自然地涉及所述設(shè)備在生物試樣，特別是細(xì)胞提取物的特異RNA和/或DNA分子的檢測(cè)和/或定量分析中的用途，應(yīng)選擇與生物試樣中的RNA或DNA進(jìn)行特異性地雜交的那些分子探針。例如根據(jù)在實(shí)施例4中描述的方法，使用尤其能夠?qū)Ρ确治鲋辽賰煞N生物試樣中的特異RNA和/或DNA分子的這樣一種設(shè)備。
根據(jù)基因選擇適當(dāng)方式的多種探針，例如根據(jù)外顯子選擇特異探針時(shí)，探針量化能夠提供基因拼接形式的特異信號(hào)。
本發(fā)明還涉及溶于復(fù)雜混合物中的分子靶的分離和分析方法，所述的方法包括a.把含有待分離分子靶的復(fù)雜混合物加到例如上述本發(fā)明的設(shè)備中，b.在能將靶特異性連接在微型柱的探針上的適當(dāng)條件下，讓該復(fù)雜混合物循環(huán)通過該設(shè)備微型柱的陣列，c.洗脫特異性保留在微型柱探針上的靶，d.將從微型柱洗脫的靶循環(huán)到檢測(cè)器，e.使用檢測(cè)器回收和/或分析每種靶。
在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及比較分析在兩種生物試樣中含有的至少兩種特異DNA或RNA分子群體的方法，所述的方法包括a.標(biāo)記來自第一試樣的DNA或RNA分子，例如用重同位素標(biāo)記，以便將在第一試樣中含有的標(biāo)記DNA或RNA分子的質(zhì)量與在第二試樣中含有的具有同樣結(jié)構(gòu)、但沒有標(biāo)記的DNA或RNA分子的質(zhì)量區(qū)分開；b.將兩種待比較DNA或RNA群體等摩爾混合；
c.把該等摩爾混合物加到本發(fā)明的適當(dāng)設(shè)備中，該設(shè)備包括由質(zhì)譜儀構(gòu)成的檢測(cè)器；d.在能將靶特異連接在微型柱探針上的適當(dāng)條件下，讓該等摩爾混合物循環(huán)通過該設(shè)備微型柱的陣列；e.洗脫特異性保留在微型柱探針上的靶，f.將從微型柱洗脫的靶循環(huán)到檢測(cè)器，g.使用質(zhì)譜儀檢測(cè)和/或定量分析每種靶。
在這個(gè)方法的一種特定實(shí)施方式中，選擇使用的設(shè)備特別地由如前面描述的行電極對(duì)構(gòu)成，因此能夠控制在微型柱的每行中洗脫和/或洗脫靶的遷移。在這種情況下，該方法的優(yōu)選實(shí)施方式包括下述步驟a.把含有待分離DNA和/或RNA分子的復(fù)雜混合物加到本發(fā)明的適當(dāng)微型柱設(shè)備中，b.在能將靶特異性連接在微型柱探針上的適當(dāng)條件下，優(yōu)選地在封閉的回路中，讓所述復(fù)雜混合物循環(huán)通過該設(shè)備微型柱的陣列；c.如果必要，在開放回路中，讓洗液循環(huán)通過該微型柱陣列，這樣能夠除去未雜交或未特異性雜交的分子，d.在微型柱行電極對(duì)之間施加電位差，室電極為正的，而遠(yuǎn)側(cè)的電極為負(fù)的，在橫向管道電極對(duì)之間施加電位差，下橫向管道為負(fù)的，而上橫向管道為正的，使得在步驟e變性后DNA或RNA分子保留在每個(gè)微型柱，e.在能使探針/靶復(fù)合物變性的條件下，讓變性溶液循環(huán)通過微型柱陣列的一個(gè)或多個(gè)行，因此洗脫DNA或RNA分子，f.將施加在該陣列微型柱行的行電極對(duì)上的電位差顛倒或取消，g.將所述陣列行的微型柱中的變性靶循環(huán)到檢測(cè)器，h.使用檢測(cè)器回收和/或分析每種靶。
通過采用電場(chǎng)，上述方法的優(yōu)選替代辦法能夠?qū)崿F(xiàn)僅僅分子靶的變性和遷移步驟。這樣一種方法的特征在于它包括a.把含有待分離DNA和/或RNA分子的復(fù)雜混合物加到本發(fā)明的適當(dāng)微型柱設(shè)備中，
b.在能將靶特異性連接在微型柱探針上的適當(dāng)條件下，優(yōu)選地在封閉的回路中，如果必要，如上述在橫向管道電極與相繼的行電極之間的交變電場(chǎng)作用下，讓復(fù)雜混合物循環(huán)通過所述設(shè)備的微型柱陣列，c.如果必要，在開放的回路中，讓能除去未雜交或未特異性地雜交分子的洗滌溶液循環(huán)通過所述微型柱陣列，d.下橫向管道與第一容器連接，該容器裝有變性溶液，其含有的負(fù)離子能在電場(chǎng)中遷移，上橫向管道與第二容器連接，該容器裝有變性溶液，其含有同樣的負(fù)離子，e.在下和上橫向管道與遠(yuǎn)側(cè)的行電極上施加負(fù)電位，而在室行電極上施加正電位，結(jié)果所述溶液中的負(fù)離子遷移到帶正電荷的微型柱中，并使分子靶變性，這些如此變性的分子靶因遠(yuǎn)側(cè)行電極的負(fù)電位而被固定在這些微型柱中。
f.在橫向管道電極對(duì)之間施加電位差，在上橫向管道為負(fù)的，而在第二下橫向管道為正的，g.將施加在所述陣列微型柱行的行電極對(duì)上的電位差顛倒或取消，以便通過電泳能夠?qū)⒃撽嚵行械奈⑿椭械淖冃园羞w移到檢測(cè)器，h.使用所述檢測(cè)器回收和/或分析每種靶。
本發(fā)明還涉及一種方法，其中包括a.本發(fā)明設(shè)備的構(gòu)造，其中每個(gè)微型柱裝有轉(zhuǎn)錄組代表的成比例的RNA或DNA靶，b.加入固定在該陣列每個(gè)微型柱中的RNA或DNA靶的特異互補(bǔ)探針化學(xué)計(jì)算量混合物，一種靶的每種特異探針的分子量與其它探針是不相同的，因此在質(zhì)譜儀中彼此是可鑒定的，c.在能將探針特異性連接在這些靶上的適當(dāng)條件下，而靶固定在這些微型柱上，讓探針混合物循環(huán)通過該設(shè)備微型柱的陣列中，d.洗脫微型柱上固定的特異保留的探針，e.讓從微型柱洗脫的探針遷移到由質(zhì)譜儀構(gòu)成的檢測(cè)器，f.使用質(zhì)譜儀分析每種探針。
替代上述方法時(shí)，能夠使用由特異探針組成的探針組，一個(gè)靶的每個(gè)特異探針大小與其它探針是不相同的，和/或每個(gè)特異探針用特異熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，在探針的毛細(xì)管電泳后采用合適的分光光度法進(jìn)行這種檢測(cè)。
本發(fā)明還涉及復(fù)雜混合物中分子靶的分離和定量分析方法，所述方法包括a.把含有待分離分子靶的復(fù)雜混合物加到本發(fā)明的設(shè)備中，該設(shè)備一方面包括一個(gè)能循環(huán)復(fù)雜混合物的毛細(xì)管網(wǎng)，另一方面包括根據(jù)上面描述的兩個(gè)電極組，b.在所述設(shè)備的電極之間施加電位，以便所述靶能夠從毛細(xì)管網(wǎng)末端遷移到其它毛細(xì)管網(wǎng)末端，并且探針能夠雜交這些與其互補(bǔ)的靶，c.原位分析或回收，接著使用檢測(cè)器分析探針中的每個(gè)雜交靶。
本發(fā)明的實(shí)施例和圖都說明了這種方法的實(shí)施。
本發(fā)明還涉及分析轉(zhuǎn)錄組的方法，該方法包括使用a.磁微粒組，在微粒上固定了待分析轉(zhuǎn)錄組的代表性靶的集合，以及b.探針的不同類型組，其中化學(xué)計(jì)算量混合物的所述探針組中每種探針型與靶型是特異性的和互補(bǔ)的。
本發(fā)明涉及一種如此定義的方法，其特征在于化學(xué)計(jì)算量混合物中所述探針組中的每種探針型對(duì)于靶型是特異性的和互補(bǔ)的。
本發(fā)明還涉及如上所述的方法，其特征在于通過其分子量毫無歧義地可鑒定在所述混合物中存在的每種探針型，將下述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合可達(dá)到其鑒定經(jīng)驗(yàn)式、尺寸和用重原子的任選標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及一種如上所述的方法，其特征在于通過其尺寸與熒光標(biāo)記物毫無歧義地確定在該混合物中存在的每種探針型。
如此描述的轉(zhuǎn)錄組分析方法可以轉(zhuǎn)用于分析蛋白質(zhì)組或分析患者的一種或多種基因的缺失或增加。在這些其它分析中，這些探針還可確定所研究靶的代表的存在，并且與其它探針型相比，可毫無歧義地鑒定在該探針組中的每種探針型。
下面的實(shí)施例能夠說明本發(fā)明設(shè)備的某些優(yōu)選實(shí)施方式，更易于理解它們的用途，然而這些實(shí)施例還不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1A是在合適的材料中模塑微型柱的N個(gè)行和P個(gè)列的陣列(1)俯視圖。
圖1B表示通過中間行電極(21)和遠(yuǎn)側(cè)行電極(22)連接的微型柱一行。
圖2表示所述設(shè)備的示意圖，它包括微型柱陣列(2)、上毛細(xì)管網(wǎng)(3)，它與有活塞(6)的上橫向管道(31)連接，下毛細(xì)管網(wǎng)(4)，它與下橫向管道(41)和與檢測(cè)器(5)連接。該設(shè)備還包括副橫向管道(7)，便于在雜交和/或洗滌步驟時(shí)循環(huán)這些流。
圖3是下橫向管道(41)的連接詳圖，它包括下管道電極(42)、壓電(pietzo-électrique)管(43)、ElectroSpray器(44)和檢測(cè)器。
圖4表示使用有活塞的設(shè)備，在帶負(fù)電荷分子靶變性步驟時(shí)電極的極性。金屬活塞(6)蓋的電極帶負(fù)電荷。把變性溶液加在上橫向管道(31)的自由端，這些箭頭表示該流的循環(huán)方向。這些電極在微型柱水平是正的(+)，而在微型柱出口是負(fù)的(-)。
圖5表示在第一行分子靶遷移步驟時(shí)電極的極性。消除了在第一行電極中的電位差。下橫向管道(41)裝滿凝膠。該設(shè)備還包括副橫向管道(7)。
圖6說明在使用裝有在電場(chǎng)中能遷移的離液劑的變性緩沖液容器(8)的設(shè)備內(nèi)，帶電荷分子靶的變性步驟。
圖7說明了官能化與植入探針的電極組實(shí)例。
在薄玻璃板上鏤蝕用金或用ITO制成的電極。
按照在這些電極上或在這些電極之間的情況進(jìn)行探針沉積(點(diǎn)或雜交單元)。在這種方法中，將描述在這些電極上唯一應(yīng)用沉積物。
圖8說明行電極對(duì)的裝配。
將兩個(gè)相對(duì)的鏤蝕電極薄板排列起來可得到這些行電極對(duì)。其中一個(gè)薄板已官能化，另一個(gè)薄板沒有官能化。
圖9說明插在兩組官能化和非官能化電極之間的毛細(xì)管網(wǎng)。
圖10說明官能化電極，它用連接彎曲電極和容器電極完成。
圖11說明在毛細(xì)管網(wǎng)周圍裝配兩組官能化和非官能化電極。
圖12說明施加到電極的電荷順序，以便使一個(gè)電極的這些靶相繼遷移到另一個(gè)電極的這些靶，因此由一個(gè)點(diǎn)遷移到另一個(gè)點(diǎn)。
圖13說明有由這些官能化電極構(gòu)成的底板的半敞開室。
它們向該毛細(xì)管網(wǎng)的這些毛細(xì)管敞開。這些室避免了因擴(kuò)散而使靶分散。
圖14說明只有一個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)的設(shè)備的方案。
除去第二容器，有利于橫向管道和延遲系統(tǒng)。
第二連接電極(V)是直線的。它用于規(guī)定帶電荷靶不可越過靜電的范圍。電極(V)相對(duì)于橫向管道(W)是凸起的時(shí)，這種延遲效果被增強(qiáng)。第二連接電極能夠選擇性地將這些探針移動(dòng)到該橫向管道中。
圖15說明了一種原位SPR檢測(cè)的設(shè)備。
把三棱鏡與未官能化的電極連接起來。
圖16說明了采用SPR檢測(cè)未官能化電極的原理。
1)通過電場(chǎng)把去雜交靶保持在適當(dāng)位置。
2)這些靶借助電場(chǎng)遷移到未官能化的電極。
3)進(jìn)行SPR檢測(cè)。
4)為改進(jìn)檢測(cè)可以交替切斷電流。
圖17說明了一種兩組交叉疊置電極的設(shè)備，以實(shí)現(xiàn)測(cè)量阻抗。
圖18說明了一種代替該官能化電極組的格子，以測(cè)量間斷電流的阻抗。
圖19說明了一種代替該官能化電極組的格子，以測(cè)量交流電流的阻抗。
實(shí)施例1.檢測(cè)在生物試樣中含有的DNA或RNA分子的設(shè)備實(shí)施例。
1.A微型柱陣列微型柱陣列(1)是由直徑50μm、長度100μm的微型柱的N個(gè)行和P個(gè)列構(gòu)成的，沿著玻璃、硅或塑料類材料的厚度鑿出或模塑這些微型柱(圖1A)。這些室垂直于該芯片的主平面。每個(gè)室裝滿聚丙烯酰胺凝膠，所述特異性分子探針固定在微粒上，其微粒直徑大于凝膠網(wǎng)格。用一個(gè)公用電極將該微型柱陣列每行的這些室連接起來，形成一個(gè)室的行電極(21)。這個(gè)電極是由處在室中間的金薄層構(gòu)成的，因此將每個(gè)室分成兩個(gè)半室。第二組電極，中間行電極的鏡面，放置在該微型柱陣列的室出口處，設(shè)置遠(yuǎn)側(cè)的行電極(22)。每個(gè)遠(yuǎn)側(cè)的行電極平行于中間的行電極，形成行電極對(duì)(圖1B)。這些電極對(duì)在室的每個(gè)行高度施加期望的電位。這些遠(yuǎn)側(cè)電極是以與中間電極同樣方式制成的。
1.B層疊置的毛細(xì)管網(wǎng)通過兩個(gè)管道將每個(gè)室與分別位于室平面上與下的層疊置毛細(xì)管網(wǎng)連接起來(參見圖2)上毛細(xì)管網(wǎng)由N個(gè)平行的毛細(xì)管(上毛細(xì)管)(3)構(gòu)成，下毛細(xì)管網(wǎng)由P個(gè)平行的毛細(xì)管(下毛細(xì)管)(4)構(gòu)成，當(dāng)然N/P排列可以在兩層毛細(xì)管之間顛倒。上毛細(xì)管網(wǎng)的相同毛細(xì)管與所述微型柱陣列的行的P個(gè)室連接，而下毛細(xì)管網(wǎng)的相同毛細(xì)管則分別與該微型柱陣列的列的N個(gè)室連接。這些連接都是用上述連接管道實(shí)現(xiàn)的，例如上和下兩個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)的方向應(yīng)該是垂直的。因此，通過該微型柱陣列的P個(gè)室的行，將上毛細(xì)管網(wǎng)的每個(gè)毛細(xì)管與下毛細(xì)管網(wǎng)的所有毛細(xì)管連接起來。相互地，通過該微型柱陣列的N個(gè)室的列，將下毛細(xì)管網(wǎng)的每個(gè)毛細(xì)管與上毛細(xì)管網(wǎng)的所有毛細(xì)管連接起來。
這些毛細(xì)管的直徑是1-100μm。上毛細(xì)管網(wǎng)的所有毛細(xì)管通到直徑2-1000μm的橫向毛細(xì)管(31)(上橫向管道)中。該上橫向管道因此連接了上毛細(xì)管網(wǎng)的所有毛細(xì)管，它垂直于上毛細(xì)管網(wǎng)的方向。與橫向管道相反的上毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管末端，在與該微型柱陣列室的行的第P個(gè)和最后室最后連接時(shí)中斷。下毛細(xì)管網(wǎng)的所有毛細(xì)管通到直徑為2-1000μm的橫向毛細(xì)管(41)(下橫向管道)中。該下橫向管道因此連接了下毛細(xì)管網(wǎng)的所有毛細(xì)管。所述下毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管如此設(shè)置，以致在室列的第一室的連接處與下橫向管道之間的行程是不同毛細(xì)管的不同長度。下毛細(xì)管網(wǎng)的這部分毛細(xì)管稱之延遲。這種延遲讓下橫向管道與下毛細(xì)管網(wǎng)不構(gòu)成90°角度。根據(jù)選擇的角度，這些延遲在這些連續(xù)的下毛細(xì)管之間是增加或減少的。
將與橫向管道相反的下毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管末端與第二橫向毛細(xì)管(7)(第二下橫向管道)連接，因此能夠在兩個(gè)上與下毛細(xì)管網(wǎng)之間建立通過所述室陣列的流。主下橫向管道填滿毛細(xì)管電泳的液體凝膠，以便在這個(gè)水平進(jìn)行毛細(xì)管電泳，這時(shí)可能的是在上橫向管道與第二下橫向管道之間建立一種閉合環(huán)狀流(圖2)。
在上和下橫向管道中安置一些電極。
上橫向管道裝有螺紋或無螺紋的活塞(6)，它可能允許選擇所述流通過室的行數(shù)。向外推移時(shí)，該活塞移動(dòng)的越多，微型柱陣列室的行越多。
1.C檢測(cè)器使用質(zhì)譜儀(5)檢測(cè)在下橫向管道出口的分子。
下橫向管道是與質(zhì)譜儀(圖3)的電離電噴(ESI)(44)鄰接的。它通過壓電小管(43)或熱小管與檢測(cè)器連接，該管允許有規(guī)律注入電噴中。
2.無活塞設(shè)備的實(shí)施例2該實(shí)施例說明本發(fā)明設(shè)備的另一個(gè)實(shí)施方式，該方式適合于分離和分析在生物試樣中含有的核酸分子，還能使保留在這些微型柱上的分子靶變性，并且只是通過施加電場(chǎng)使它們遷移到檢測(cè)器中。
所述微型柱陣列和毛細(xì)管網(wǎng)與實(shí)施例1基本相同，只是有如下差別該設(shè)備在上橫向管道中沒有活塞。另一方面，該下橫向管道和上橫向管道與裝有氫氧化銨(NH4OH)鹽的變性緩沖液容器連接起來。
3.實(shí)施例3，制備裝有轉(zhuǎn)錄組代表性核酸集合的微型柱及其分析轉(zhuǎn)錄組的用途。
本發(fā)明設(shè)備的每個(gè)微型柱，例如像實(shí)施例1或2所描述的微型柱，包括其上固定了待分析轉(zhuǎn)錄組的代表性核酸集合的支持物或微粒(DNA、RNA或寡核苷酸等等)。
為了避免大尺寸polyA(多聚腺嘌呤)尾的存在，使用引物，例如5′(T)19X3′，其中X可以是A、C或G，進(jìn)行待分析信使RNA試樣的逆轉(zhuǎn)錄。因此使用在polyA尾后遇到的與A不同的第一核苷酸開始進(jìn)行這種逆轉(zhuǎn)錄。
為了得到固定在支持物或微粒上的基因組的代表性cDNA試樣，將上述的這些引物預(yù)先固定在所述的支持物或所述的微粒上，再進(jìn)行這種逆轉(zhuǎn)錄。在這種支持物上逆轉(zhuǎn)錄后可以聯(lián)接逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。使用在5′端生物素化的引物5′(T)19X3′時(shí)(還可能利用這些微粒與靶之間的化學(xué)絡(luò)合作用)，通過生物素-抗生物素蛋白偶聯(lián)可以保證這種聯(lián)接。
本發(fā)明涉及一種分離和/或檢測(cè)溶于復(fù)雜混合物中的多個(gè)分子靶的設(shè)備，所述的設(shè)備包括在其上固定待分析轉(zhuǎn)錄組的代表性靶集合的磁微粒組和探針組。
化學(xué)計(jì)算量混合物的探針組中的每種探針型對(duì)于靶型是特效的和互補(bǔ)的。
把含有基因組的代表性cDNA集合的這些微?；蛑С治镌俜诺奖景l(fā)明設(shè)備的微型柱。于是得到微型柱芯片，按照下述方法，它的每個(gè)微型柱都能夠分析一個(gè)轉(zhuǎn)錄組采用該設(shè)備要使用探針組，其中組成該混合物的每類探針對(duì)于固定在這些微型柱上的這些類靶中的一類靶和唯一一類靶是特效的和互補(bǔ)的，從而這些探針形成化學(xué)計(jì)算量混合物。
因此，所述混合物中存在的每種探針型可毫無歧義地用其分子量鑒別。將三個(gè)準(zhǔn)則結(jié)合起來可獲得這種分子量的特異性經(jīng)驗(yàn)式、尺寸和用重原子標(biāo)記可能性。這三個(gè)準(zhǔn)則結(jié)合起來能夠產(chǎn)生極大量的探針。對(duì)于等于M的DNA的聚合物尺寸，例如M＝n+m+l+j，有可能得到大量的經(jīng)驗(yàn)式(AnCmTiGj)，它等于(n+m+l+j)/(n！*m！*l！*j！)。
特別對(duì)于保留在所述支持物或微粒上的靶分子，這些互補(bǔ)探針都被雜交；涉及分離步驟。一旦該系統(tǒng)已漂洗和這些未雜交探針被除去，可控地使在支持物或微粒上的這些雜交探針分子變性。這時(shí)可能對(duì)在含有這些固定靶的支持物或微粒上的每類雜交探針分子進(jìn)行定量分析。
為了減少非特異雜交，在小核苷酸聚合物(X)n的存在下使這些序列雜交，式中X代表A、T、G或C，N為3-7個(gè)核苷酸，生成n個(gè)核苷酸的所有可能序列。
這種方法也可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)。將待研究蛋白質(zhì)混合物固定在支持物或微粒上。這些靶是由抗體或任何其它特異配體組成的，每種探針型的分子量允許毫無歧義地進(jìn)行鑒定。
為了消除具有相同分子量的不同探針型間的不確定性，這些探針可以與改變?cè)撎结樂肿恿康亩栊苑肿勇?lián)接。為了再提高這種檢測(cè)的鑒別能力，在注到質(zhì)譜儀之前進(jìn)行毛細(xì)管色譜分離。這種毛細(xì)管色譜法能夠按照其大小分離這些探針。可用壓電小管將質(zhì)譜儀與毛細(xì)管電泳聯(lián)接起來。
前面實(shí)施方式的另一種選擇是使用熒光標(biāo)記物區(qū)分這些探針。毫無歧義地采用其大小和熒光標(biāo)記物定義每類探針。例如將五種不同的熒光標(biāo)記物與其大小分為20-200堿基的探針結(jié)合時(shí)，這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合能夠達(dá)到復(fù)雜度約千位。當(dāng)然，通過增加這些探針的許可大小范圍和使用熒光標(biāo)記物的數(shù)量，有可能擴(kuò)大探針混合物的復(fù)雜性。
使用一組其上固定待分析轉(zhuǎn)錄組的代表性靶集合的磁微粒和一組如上所述的化學(xué)計(jì)算量探針時(shí)，可以直接在溶液中使用而不采用這種方法。這些磁微粒用于分離這些雜交探針。事實(shí)上，采用由單純磁鐵產(chǎn)生的磁場(chǎng)分離這些雜交微粒。一旦這種系統(tǒng)被漂洗和這些未雜交探針被除去，就可控地使這些雜交探針去雜交，采用上述方法中的一種方法分析洗脫物就能夠確定分析轉(zhuǎn)錄組的組成。
這種方法代替了經(jīng)典的DNA芯片，尤其在研究轉(zhuǎn)錄組和CGH(比較基因組雜交)時(shí)更如此。
4.實(shí)施例4使用如實(shí)施例1描述的微型柱芯片分析RNA試樣。
實(shí)施例1中描述的設(shè)備能夠分析核酸分子混合物?？梢允褂眉?xì)胞RNA單一提取物，但也可以使用兩種不同的提取物進(jìn)行這種分析。
為了采用質(zhì)譜法檢測(cè)分析兩種不同的RNA提取物，合適的是將兩種群體中的至少一個(gè)mRNA群體標(biāo)記。采用加入重同位素的逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行這種標(biāo)記。這些重同位素選自O(shè)18、O17、N15、C13、H2或任何其它可以采用普通形式質(zhì)量區(qū)分的重同位素。將這些重同位素加到參與合成核酸的核苷酸中。第二種待分析mRNA群體反轉(zhuǎn)錄成cDNA而沒有加入重原子，或加入與第一群體不同的重原子。
為了避免與可能分解產(chǎn)物的任何混雜，可用重原子標(biāo)記這些引物5′(T)19X3′，其中X可以取值A(chǔ)、G或C，而這些重原子不同于在采用質(zhì)譜儀檢測(cè)的情況下該分子余下部分任選使用的重原子。采用熒光檢測(cè)時(shí)，使用發(fā)色團(tuán)標(biāo)記這些引物。
在過早的時(shí)間內(nèi)突然停止這種逆轉(zhuǎn)錄，因此所有的cDNA的延長時(shí)間是相同的，以縮小尺寸比例的更易鑒定的分子量得到cDNA分子。這種方法還可以用于制備通常DNA芯片使用的cDNA靶。
一旦得到兩種cDNA群體，將它們等摩爾混合起來(還可能的是處理mRNA/cDNA不均勻混合物)。將這種混合物加到在每個(gè)微型柱中多次循環(huán)的閉合回路中(參見圖2)。在它們通過這些微型柱期間，這些靶與互補(bǔ)探針進(jìn)行雜交。在閉合回路內(nèi)循環(huán)在每次通過微型柱后能夠使這種混合物均化。在進(jìn)入管內(nèi)的阻抗例如能夠調(diào)節(jié)雜交溶液的溫度，而且在雜交循環(huán)過程中還能夠發(fā)生這些熱變化，這樣可以控制雜交特異性。任選地，一種超聲室由于將這些靶cDNA破碎成更小尺寸的分子而能夠使待雜交分子尺寸均勻，由寡核苷酸(20-100pb)構(gòu)成的探針事實(shí)上有利于等效尺寸靶的雜化。
一旦實(shí)現(xiàn)雜化，該回路是開放的，并且大量用除去非雜交或非特異雜交分子的溶液漂洗(洗滌步驟)。
該系統(tǒng)這時(shí)與質(zhì)譜儀的電噴器聯(lián)接起來，在該陣列微型柱的行電極對(duì)之間建立起電位差，在中間處為正電位，而在遠(yuǎn)側(cè)為負(fù)電位。同樣地，在橫向管道的電極處建立起電位差，在上橫向管道為負(fù)電位，而在下橫向管道為正電位。由于電極的極性，這些雜交分子保持在每個(gè)雜交室中。設(shè)置所述活塞使得只能通過該陣列微型柱的第一行的微型柱在上和下兩個(gè)網(wǎng)之間進(jìn)行這種循環(huán)(圖4)。由阻抗控制溫度的變性溶液(例如位于上橫向管道)這時(shí)以層流方式注入，并擴(kuò)散通過最靠近下橫向管道的第一行的微型柱，該活塞阻止進(jìn)入微型柱的其它行。所述變性劑使這些探針-靶配合物變性，所述電場(chǎng)阻止靶擴(kuò)散到室之外。
在抉擇時(shí)也可考慮這種熱變性。在提高每個(gè)微型柱中緩沖液溫度時(shí)，產(chǎn)生了在固定探針與該靶之間形成的復(fù)合體變性，靶重新進(jìn)入溶液，而探針依然固定在該陣列上。
第一行電極對(duì)之間的電場(chǎng)然后反轉(zhuǎn)或簡單截?cái)?，保持橫向管道電極對(duì)之間的電位差(圖5)。第一行每個(gè)微型柱的靶這時(shí)通過下毛細(xì)管網(wǎng)的相應(yīng)毛細(xì)管，通過電泳使這些探針輸送或遷移通過這些毛細(xì)管，直到下橫向管道。不同微型柱的靶隨著下毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管各自延遲而以不同的時(shí)間到達(dá)下橫向管道。事實(shí)上，對(duì)于分析而言，這些不同的靶以不同的時(shí)間到達(dá)與下橫向管道聯(lián)接的檢測(cè)器(ElectroSpray)毛細(xì)管。為了不使來自不同微型柱的靶之間混合，一般而言需要以非常緩慢的層流方式進(jìn)行。使用微型柱的多種探針能夠確定基因片段的任何形式。
5.實(shí)施例5使用如實(shí)施例2所描述的微型柱芯片分析RNA試樣。
在下面的方法中，為了使靶變性和讓它們遷移到質(zhì)譜儀中，不需要讓任何流體在毛細(xì)管中循環(huán)。
在這個(gè)方法中，將使用實(shí)施例2描述的設(shè)備。采用的雜交和漂洗步驟與實(shí)施例4中描述的相同。在雜交和漂洗后，讓上橫向管道與裝有能遷移到緩沖液電場(chǎng)中的離液劑(chaotrope)的緩沖液容器相連，下橫向管道與裝有同樣緩沖液的第二容器連接。上和下橫向管道的電極以及遠(yuǎn)側(cè)的行電極保持在負(fù)電位，而相對(duì)的中間的行電極保持在正電位。離子和離液劑遷移、陽極和陰極、緩沖劑的pH以及電位差都會(huì)引起探針-靶生物聚合物的復(fù)合物的變性(圖6)。
這些探針由于與該陣列強(qiáng)鍵合而依然固定在其陣列上，帶負(fù)電荷的自由靶也依然在帶正電荷的中間行電極中。一旦探針/靶復(fù)合物變性，橫向管道電極之間設(shè)置電位差，對(duì)于上橫向管道的電位為負(fù)的，而對(duì)于下橫向管道的電位為正的，中間電極的電位保持在正的，而遠(yuǎn)側(cè)的保持在負(fù)的，因此這些靶被限制在每個(gè)微型柱的靜電室中，于是停止了任何遷移。
這時(shí)，相繼逐行地使該微型柱陣列行電極之間的電位差置零，因此電泳會(huì)引起在下毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管中的每個(gè)行的靶相繼遷移。這些靶按照其毛細(xì)管各自途徑的距離遷移直到下橫向管道。在下橫向管道出口，進(jìn)行這種分析。
6.實(shí)施例6在每個(gè)微型柱中分離與離析的生物聚合物的微序列化本發(fā)明的方法允許在所述質(zhì)譜儀中分離和分析核酸或蛋白質(zhì)靶的序列化。
所述微序列化是在核酸序列中進(jìn)行隨機(jī)分裂，然后采用質(zhì)譜儀鑒定這些得到的產(chǎn)物。這些隨機(jī)分裂可以是化學(xué)的、物理的、機(jī)械的或酶的。例如，通過由微型柱中固定酶組成的酶混合物的作用可以得到這些酶切物，這個(gè)微型柱例如放置在檢測(cè)毛細(xì)管與下橫向管道之間。這些生物聚合物穿過這個(gè)微型柱時(shí)，它們部分被降解。能夠由分析降解產(chǎn)物推導(dǎo)出這種序列。這些酶例如是核酸的核酸內(nèi)切酶或蛋白質(zhì)的肽鏈內(nèi)切酶，例如它們能夠在這些生物聚合物中得到隨機(jī)酶切物。使用核酸的核酸外切酶或蛋白質(zhì)的肽鏈外切酶有可能部分消化。分析這些反應(yīng)產(chǎn)物能夠得到特異性地保留在每個(gè)微型柱中的生物聚合物序列。使用酸、堿或任何其它化學(xué)產(chǎn)品時(shí)，謹(jǐn)慎化學(xué)降解生物聚合物可產(chǎn)生的化學(xué)分裂。
例如使用能使這些生物聚合物分裂的超聲波、微波或或微-頻率達(dá)到這些機(jī)械降解。最后，通過電子流或通過與生物聚合物相互作用的重原子轟擊可以達(dá)到物理分解。所有這些處理能夠按照可以預(yù)言的組合，通過例如核酸的磷酸酯鍵和蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂使這種生物聚合物打碎。進(jìn)行這些處理只是在統(tǒng)計(jì)上誘發(fā)每個(gè)分子隨機(jī)分裂。為了測(cè)定生物聚合物序列，必需在它們的至少一個(gè)末端有標(biāo)記物。對(duì)所得到的含有這種標(biāo)記物的分解物的所有離子的研究能夠確定這種序列。在生物聚合物中末端標(biāo)記物以天然狀態(tài)存在，或者它是采用人工方法加入的。例如，mRNA的3′末端系統(tǒng)地含有polyA尾。這個(gè)polyA尾可以作為末端標(biāo)記物使用例如5′(T)19X3′之類的引物通過逆轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，其中X可以是A、C或G。于是使用在polyA尾后遇到的與A不同的第一核苷酸開始這種逆轉(zhuǎn)錄。為了避免有任選分解產(chǎn)物的任何散亂性，使用與所述分子其余部分任選使用的重原子不同的重原子標(biāo)記這些5′(T)19X3′引物。由于知道標(biāo)記物的嚴(yán)格質(zhì)量，所以應(yīng)很容易推導(dǎo)出分裂產(chǎn)物，在該序列中殘留物順序。在蛋白質(zhì)的情況下，使用化合物，例如苯基異硫氰酸酯、1-氟-2，4-二硝基苯或densyle氯，標(biāo)記N端的末端能夠測(cè)定序列。還可能在每個(gè)末端對(duì)生物聚合物進(jìn)行雙標(biāo)記，以增加該方法的分辨能力。在配合物的情況下，這些MSMS方法能夠在第二步選擇待分析分子離子，例如像在多嵌合體蛋白質(zhì)的情況下。最后，有可能直接通過分析連續(xù)分解的產(chǎn)物，例如允許這種分析采用MSMS方法，測(cè)定生物聚合物的序列，例如對(duì)于蛋白質(zhì)，借助N端和C端的末端測(cè)定這些序列末端的標(biāo)記物。
7.分析多肽混合物時(shí)使用微型柱芯片以類似于實(shí)施例1或2所描述的方式生產(chǎn)這些設(shè)備。所述陣列每個(gè)微型柱裝有多肽類的特異性抗體。這些抗體對(duì)自然或變性蛋白質(zhì)是特異性的。這些抗體直接固定在室壁上或保留在每個(gè)室中的微粒上。例如對(duì)于核酸，應(yīng)可能使用與吡咯分子結(jié)合的抗體。就核酸所描述的與吡咯結(jié)合的這些探針全部應(yīng)用方法都可應(yīng)用于與吡咯結(jié)合的抗體。使用微型柱網(wǎng)制出一個(gè)封閉回路時(shí)，使細(xì)胞的多肽提取物絡(luò)合。這樣在每個(gè)微型柱中能生成抗原/抗體特異性復(fù)合物。為了洗脫保留在每個(gè)微型柱中的多肽，需要使用只是根據(jù)蛋白質(zhì)大小能使它們遷移的緩沖液。這些緩沖液還能夠破壞這種抗原/抗體復(fù)合物。為此，列舉SDS(十二烷基硫酸鈉)堿緩沖液，它們能夠使所有的蛋白質(zhì)向正極遷移，而不管其等電點(diǎn)。
附圖標(biāo)記說明說明書附圖中標(biāo)記的定義如下A＝彎曲的連接電極(例如有用ITO制成的透明電極的玻璃薄板)B＝官能化行電極(例如有用ITO制成的透明電極的玻璃薄板)C＝容器電極(例如有用ITO制成的透明電極的玻璃薄板)D＝既沒有底層也沒有頂層的毛細(xì)管(例如在kapton中鑿孔)中間平面E＝?jīng)]有頂層而有底層的毛細(xì)管(例如在kapton中鑿孔)中間平面F＝既沒有底層也沒有頂層的容器(例如在kapton中鑿孔)中間平面G＝非官能化行電極(例如有用ITO制成的透明電極的玻璃薄板)H＝非雜交靶I＝官能化電極J＝非官能化電極K＝探針點(diǎn)雜交單位L＝三棱鏡M＝柵極的水平電極N＝電源的垂直電極O＝點(diǎn)電極P＝柵極Q＝電源R＝漏極T＝既沒有底也沒有底層的室S＝電流循環(huán)方向U＝有延遲的毛細(xì)管網(wǎng)V＝用于分析的行電極W＝副橫向管道
權(quán)利要求
1.分離和/或分析溶于復(fù)雜混合物中的不同分子靶的設(shè)備，所述的設(shè)備包括a.微型柱陣列，其包括放置在同一平面上的N個(gè)行和P個(gè)列的微型柱，每個(gè)微型柱包括固定的分子探針型，通過探針/靶特異連接，以保留復(fù)雜混合物中存在的特異分子靶，b.平行于所述微型柱陣列平面、并位于所述微型柱陣列平面之上的平面內(nèi)的第一毛細(xì)管網(wǎng)，所述的第一毛細(xì)管網(wǎng)可將接到該設(shè)備中的復(fù)雜混合物循環(huán)到a中定義的陣列的每個(gè)微型柱中，c.平行于微型柱陣列平面、并位于所述微型柱陣列之下的平面內(nèi)的第二毛細(xì)管網(wǎng)，所述的第二毛細(xì)管網(wǎng)可將洗脫后的所述分子靶循環(huán)到一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器中，以此對(duì)其回收和/或分析，d.如果必要，檢測(cè)器，其回收和/或分析所述不同的分子靶，優(yōu)選其為質(zhì)譜儀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其特征在于它還包括一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器，該檢測(cè)器可回收和/或分析不同的分子靶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的設(shè)備，其中每個(gè)微型柱包括直徑2-1000μm，優(yōu)選為約20-100μm；長度2-2000μm，優(yōu)選為40-200μm的管形室。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的設(shè)備，其中所述微型柱陣列包括在形成陣列平面材料的厚度模塑或鑿出的室。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其中在合適材料板的厚度內(nèi)鑿出每個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于所述陣列是由1至1百萬個(gè)微型柱，優(yōu)選為100-100000個(gè)微型柱構(gòu)成的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其中所述分子探針固定在微型柱的內(nèi)壁上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其中每個(gè)微型柱裝有所述分子探針聯(lián)接的微粒，所述微粒通過適當(dāng)方法保留在每個(gè)室中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的設(shè)備，其中所述分子探針聯(lián)接的微粒的直徑大于每個(gè)微型柱進(jìn)口與出口的毛細(xì)管直徑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于每個(gè)微型柱由裝有凝膠的室構(gòu)成，其中固定了所述分子探針以阻止所述的分子探針遷移到室外。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的設(shè)備，其中所述分子探針與直徑大于凝膠網(wǎng)結(jié)構(gòu)的微粒聯(lián)接以阻止它們遷移到室外。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的設(shè)備，其特征在于它包括過濾器，置于每個(gè)室的進(jìn)口和出口，其特征還在于所述微粒的直徑大于所述過濾器孔的直徑。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于它包括在該陣列的一個(gè)或多個(gè)特異微型柱中能夠控制分子靶洗脫和/或向檢測(cè)器遷移和/或洗脫后將其保留在這些微型柱中的工具。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其特征在于它包括第一電極，即室電極，該電極設(shè)置成與每個(gè)微型柱接觸，優(yōu)選地在所述微型柱的中間；以及第二電極，即遠(yuǎn)側(cè)電極，該電極設(shè)置在每個(gè)微型柱出口，從而能夠控制洗脫保留在一個(gè)或多個(gè)特定微型柱中的分子靶和/或?qū)⑵溥w移到檢測(cè)器或在洗脫后將其保留在所述微型柱中。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的設(shè)備，其特征在于第一毛細(xì)管網(wǎng)包括加入所述復(fù)雜混合物的第一橫向毛細(xì)管，以下面稱之為上橫向管道，其直徑優(yōu)選為2-1000μm，與通到所述陣列微型柱的所有毛細(xì)管連接，其特征還在于第二毛細(xì)管網(wǎng)包括將每個(gè)微型柱與第二橫向毛細(xì)管連接起來的所有毛細(xì)管，第二橫向毛細(xì)管稱之為下橫向管道，它的直徑優(yōu)選為2-1000μm，所述的下橫向管道與電極連接，且所述的上橫向管道與電極連接。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的設(shè)備，其特征在于包括能夠控制洗脫保留在特定行微型柱上的分子靶和/或?qū)⑵溥w移到檢測(cè)器和/或洗脫后將其保留在這些微型柱上的工具，其特征還在于選擇第二毛細(xì)管網(wǎng)的每個(gè)毛細(xì)管長度，以便在所述微型柱出口與下橫向管道之間的距離因第二毛細(xì)管網(wǎng)的毛細(xì)管的不同而不同，優(yōu)選地從連接一行的第一微型柱的毛細(xì)管到連接該行最后微型柱的毛細(xì)管的距離是增加或減少的，因而分子靶從微型柱出口直到檢測(cè)器的通過時(shí)間對(duì)于同樣行的每個(gè)微型柱都是不同的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的設(shè)備，其特征在于將每個(gè)微型柱與下橫向管道連接的毛細(xì)管網(wǎng)包括P個(gè)平行毛細(xì)管，每個(gè)毛細(xì)管將所述陣列同一列的N個(gè)微型柱與下橫向管道連接起來，并與所述的下橫向管道形成不是90°的角度。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的設(shè)備，其特征在于對(duì)于每行，所述設(shè)備包括第一電極，其將同一行的所有P個(gè)微型柱連接起來，于是形成N個(gè)行電極，優(yōu)選地在微型柱中的中間行電極，和第二組平行于行電極的電極，將在同一行微型柱出口的所有P個(gè)毛細(xì)管連接起來，從而能夠控制微型柱每行的靶洗脫和/或遷移。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或17或18所述的設(shè)備，其特征在于第一毛細(xì)管網(wǎng)，稱之上毛細(xì)管網(wǎng)，包括N個(gè)平行的毛細(xì)管，每個(gè)毛細(xì)管將該上橫向毛細(xì)管與所述陣列同一行的P個(gè)微型柱連接起來，其特征在于第二毛細(xì)管網(wǎng)，稱之下毛細(xì)管網(wǎng)，包括P個(gè)平行的毛細(xì)管，每個(gè)毛細(xì)管將所述陣列同一列的N個(gè)微型柱與下橫向毛細(xì)管連接起來，兩個(gè)下和上毛細(xì)管網(wǎng)之間形成的角度不是0，優(yōu)選地是垂直的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的設(shè)備，其特征在于與上毛細(xì)管網(wǎng)連接的橫向管道連接有活塞，能將加入該上橫向管道中的混合物循環(huán)到上毛細(xì)管網(wǎng)的一個(gè)或多個(gè)特定毛細(xì)管中。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于包括由質(zhì)譜儀構(gòu)成的檢測(cè)裝置。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于所述分子探針是核酸，優(yōu)選為寡核苷酸或DNA片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的設(shè)備，其中每個(gè)微型柱的所述分子探針是由一種基因的特異核酸型構(gòu)成的。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的設(shè)備，其特征在于每個(gè)微型柱包括轉(zhuǎn)錄組的代表性核酸的集合。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的設(shè)備，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄組的代表性核酸的集合固定在微粒上，同時(shí)所述的微粒通過適當(dāng)?shù)姆椒ü潭ㄔ谶@些微型柱中。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于這些探針是多肽，優(yōu)選為抗體片段。
27.分離和/或檢測(cè)溶于復(fù)雜混合物中的多種分子靶的設(shè)備，所述的設(shè)備包括a.毛細(xì)管網(wǎng)，使加入該設(shè)備的復(fù)雜混合物循環(huán)，b.兩組電極，置于所述毛細(xì)管網(wǎng)兩側(cè)-官能化電極組，其中這些電極接入了由點(diǎn)組成的探針，使得每種探針通過探針/靶特異連接將所述復(fù)雜混合物中存在的特異分子靶保留，-非官能化的電極組。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的設(shè)備，其特征在于所述官能化電極組位于毛細(xì)管網(wǎng)上面，其特征還在于所述非官能化電極組位于毛細(xì)管網(wǎng)下面。
29.根據(jù)權(quán)利要求27和28所述的設(shè)備，其特征在于還包括在每個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)末端的容器。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的設(shè)備，其特征在于所述容器包括圓形電極。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的設(shè)備，其特征在于在每個(gè)容器中的所述圓形電極位于與所述官能化電極組相同的平面中。
32.根據(jù)權(quán)利要求27-31中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于它還包括在第一容器電極與第一官能化電極之間的第一補(bǔ)充連接電極，以及在第二容器電極與最后官能化電極之間第二補(bǔ)充連接電極，使得在連接電極與容器電極之間的最短距離在任何的電極點(diǎn)都是相同的。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征在于第一連接電極是彎曲的，其特征還在于第二連接電極不是彎曲的，因而雜交時(shí)，該電極用于確定這些探針不可越過的電邊界，然后在檢測(cè)步驟，能夠借助由靶電極和連接電極所確定的電位將這些靶朝向所述延遲系統(tǒng)。
34.分離和/或檢測(cè)溶于復(fù)雜混合物中的多種分子靶的設(shè)備，所述的設(shè)備包括a.磁微粒組，其上固定了待分析轉(zhuǎn)錄組的代表性靶集合，以及b.探針組。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于在使用所述的靶時(shí)，形成化學(xué)計(jì)算量混合物的所述探針組中每種探針型對(duì)于靶類型是特異性的、互補(bǔ)的。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于通過分子量可毫無歧義地鑒定所述混合物中存在的每種探針型，將下述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合可達(dá)到其鑒定經(jīng)驗(yàn)式、尺寸和用重原子的任選標(biāo)記。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于通過其尺寸和熒光標(biāo)記物可毫無歧義地確定在混合物中存在的每種探針型。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備在檢測(cè)和/或定量分析在生物試樣中，特別在細(xì)胞提取物中所含有特異RNA和/或DNA分子中的用途，其中選擇分子探針以使它們與所述生物試樣中的RNA或DNA型進(jìn)行特異性雜交。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的用途，其用于對(duì)比分析兩種生物試樣中的特異RNA和/或DNA分子。
40.在復(fù)雜混合物中分子靶的分離和定量分析方法，所述方法包括a.把含有待分離分子靶的復(fù)雜混合物加入到根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備中，b.在能將所述靶特異連接在微型柱探針上的適當(dāng)條件下，讓所述復(fù)雜混合物循環(huán)通過所述設(shè)備的微型柱陣列，c.洗脫特異保留在所述微型柱探針上的靶，d.將從微型柱洗脫的靶循環(huán)到檢測(cè)器，e.使用所述檢測(cè)器回收和/或分析所述每種靶。
41.兩種生物試樣中所含有的兩種特異DNA或RNA分子群體的對(duì)比分析方法，所述的方法包括a.標(biāo)記來自第一試樣的DNA或RNA分子，例如用重同位素標(biāo)記，從而區(qū)分在第一試樣中含有的標(biāo)記DNA或RNA分子的質(zhì)量與在第二試樣中含有的具有同樣結(jié)構(gòu)，但沒有標(biāo)記的DNA或RNA分子的質(zhì)量；b.形成兩種待對(duì)比DNA或RNA群體的等摩爾混合物；c.把該等摩爾混合物加入到根據(jù)權(quán)利要求14-18中任一權(quán)利要求所述的分離和/或檢測(cè)溶于復(fù)雜混合物中的多個(gè)分子靶的設(shè)備中，該設(shè)備包括由質(zhì)譜儀構(gòu)成的檢測(cè)器；d.在能將所述靶特異連接在微型柱探針上的適當(dāng)條件下，讓所述等摩爾混合物循環(huán)通過所述設(shè)備微型柱的陣列；e.洗脫特異保留在所述微型柱探針上的靶；f.將從微型柱洗脫的靶循環(huán)到所述質(zhì)譜儀；g.如果必要，在下橫向管道中采用毛細(xì)管色譜法分離洗脫靶；h.采用質(zhì)譜儀檢測(cè)和/或定量分析每種標(biāo)記或未標(biāo)記的靶。
42.根據(jù)權(quán)利要求40或41中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于包括a.把含有待分離DNA和/或RNA分子的復(fù)雜混合物加入到根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備中，b.在能將所述靶特異連接在微型柱探針上的適當(dāng)條件下，優(yōu)選地在封閉的回路中，讓所述復(fù)雜混合物循環(huán)通過所述設(shè)備的微型柱陣列，c.如果必要，在開放回路中，讓洗液循環(huán)通過該微型柱陣列，以除去未雜交或未特異性雜交的分子，d.在微型柱行電極對(duì)之間施加電位差，室電極為正，而遠(yuǎn)側(cè)的電極為負(fù)；在橫向管道電極對(duì)之間施加電位差，下橫向管道為負(fù)，而上橫向管道為正，以使在步驟e變性后DNA或RNA分子保留在每個(gè)微型柱，e.在能使探針/靶復(fù)合物變性的條件下，讓變性溶液循環(huán)通過微型柱陣列的一個(gè)或多個(gè)行，以洗脫DNA或RNA分子，f.將施加在所述陣列微型柱行的行極對(duì)上的電位差顛倒或取消，g.從所述陣列行的微型柱洗脫的靶循環(huán)到檢測(cè)器，h.使用檢測(cè)器回收和/或分析每種靶。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于包括a.把含有待分離DNA和/或RNA分子的復(fù)雜混合物加入到根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備中，b.在能將靶特異連接在微型柱探針上的適當(dāng)條件下，優(yōu)選地在封閉的回路中，讓所述復(fù)雜混合物循環(huán)通過所述設(shè)備的微型柱陣列，c.如果必要，在開放的回路中，讓能除去未雜交或未特異性地雜交分子的洗滌溶液循環(huán)通過所述微型柱陣列，d.下橫向管道與第一容器連接，該容器裝有變性溶液，它含有的負(fù)離子能在電場(chǎng)中遷移，上橫向管道與第二容器連接，該容器裝有變性溶液，它含有同樣的負(fù)離子，e.在下和上橫向管道以及遠(yuǎn)側(cè)的行電極上施加負(fù)電位，而在室的行電極上施加正電位，使得所述溶液中的負(fù)離子遷移到帶正電荷的微型柱中，并使所述分子靶變性，f.在橫向管道電極對(duì)之間施加電位差，上橫向管道為負(fù)，而在第二下橫向管道為正，g.將施加在所述陣列微型柱行的行電極對(duì)上的電位差顛倒或取消，以便通過電泳能夠?qū)⒃撽嚵行械奈⑿椭淖冃园羞w移到檢測(cè)器，h.使用所述檢測(cè)器回收和/或分析每種靶。
44.根據(jù)權(quán)利要求42或43中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述的方法包括a.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述設(shè)備的構(gòu)造，其中每個(gè)微型柱裝有代表性比例的轉(zhuǎn)錄組的RNA或DNA靶，b.加入固定在所述陣列每個(gè)微型柱中的RNA或DNA靶的特異互補(bǔ)探針化學(xué)計(jì)算量混合物，每種對(duì)靶特異的探針的分子量與其它探針是不相同的，使得在質(zhì)譜儀中彼此可鑒定，c.在能將所述探針特異連接在所述靶上的適當(dāng)條件下，而所述靶固定在這些微型柱上，讓所述探針混合物循環(huán)通過所述設(shè)備微型柱陣列，d.洗脫在這些微型柱中固定的靶上特異性保留的探針，e.讓從所述微型柱洗脫的探針遷移到由質(zhì)譜儀構(gòu)成的檢測(cè)器中，f.使用質(zhì)譜儀分析每種探針。
45.復(fù)雜混合物中分子靶的分離與定量分析方法，所述的方法包括a.把含有待分離分子靶的復(fù)雜混合物加入到根據(jù)權(quán)利要求27-33中任一權(quán)利要求所述的設(shè)備中，b.在根據(jù)權(quán)利要求27-33中任一權(quán)利要求所述設(shè)備的電極之間施加電位，以便這些靶能夠從一個(gè)毛細(xì)管網(wǎng)末端遷移到其它末端，以及這些與探針互補(bǔ)的靶能夠被雜交，c.使用檢測(cè)器原位分析或回收和分析每個(gè)與探針的雜交靶。
46.分析轉(zhuǎn)錄組的方法，該方法包括使用a.磁微粒組，在其微粒上固定了待分析轉(zhuǎn)錄組的代表性靶集合，以及b.不同類型的探針組，其中在該探針組中每種探針型對(duì)于與所述靶的靶型是特異性的和互補(bǔ)的以生成化學(xué)計(jì)量混合物。
47.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于形成化學(xué)計(jì)量混合物的所述探針組的每種探針型對(duì)于靶型是特異性的、互補(bǔ)的。
48.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于通過分子量可毫無歧義地鑒定在所述混合物中存在的每種探針型，將下述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合可達(dá)到其鑒定經(jīng)驗(yàn)式、尺寸和用重原子的任選標(biāo)記。
49.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于通過其尺寸和熒光標(biāo)記物可毫無歧義地確定在所述混合物中存在的每種探針型。
50.采用直接吸收將核酸聚合物固定在用ITO制成的電極上的方法。
51.SPR的分析方法，包括在電極上靶雜交，采用離液劑去雜交，通過電位保持靶，電位顛倒，使所述靶遷移到非官能化電極上，測(cè)量所述非官能化電極上的SPR。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離和/或分析溶于復(fù)雜混合物中的一些靶分子的設(shè)備，其特征在于其包括a)微型柱陣列，其中每個(gè)微型柱(2)包括固定的分子探針，其通過特定探針/靶連接能保留在該復(fù)雜混合物中含有的特異分子靶，b)第一毛細(xì)管網(wǎng)(3)，將加到本發(fā)明設(shè)備的復(fù)雜混合物循環(huán)到在a)定義的陣列的每個(gè)微型柱中，c)第二毛細(xì)管網(wǎng)(4)，在洗脫后將保留在所述微型柱上的分子靶循環(huán)到進(jìn)行其回收和/或分析的檢測(cè)器(5)中，以及d)如果必要，用于回收和/或分析不同的分子靶的檢測(cè)器(5)，優(yōu)選為質(zhì)譜儀形式。
文檔編號(hào)B01J19/00GK1882839SQ200480034294
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月24日
發(fā)明者尼古拉斯·烏戈林, 西爾維·舍維拉爾, 卡特琳·奧里, 熱羅姆·勒博 申請(qǐng)人:原子能委員會(huì)