專利名稱：色譜固定相的再生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及色譜純化領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及再生色譜固定相的方法。
背景技術(shù)：
多肽日益被用作治療屬于所有主要治療范圍內(nèi)的疾病的藥物。通過(guò)長(zhǎng)期胰島素服用治療糖尿病已經(jīng)實(shí)施了80年以上，而且多肽在生長(zhǎng)障礙和癌方面的治療應(yīng)用也實(shí)踐了很多年。大規(guī)模生產(chǎn)對(duì)治療應(yīng)用來(lái)說(shuō)純度足夠高的多肽的經(jīng)濟(jì)方法對(duì)于另外的基于多肽的療法達(dá)到大規(guī)模的商品化和對(duì)于現(xiàn)有療法被更廣泛地應(yīng)用來(lái)說(shuō)具有關(guān)鍵性的作用。
從混合物純化多肽是治療用多肽的整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中常用數(shù)次的多步方法。反相高壓液相色譜(RP-HPLC)是工業(yè)上高分離度地分離多肽的優(yōu)選方法，而且證明了該方法對(duì)于大規(guī)模純化很多多肽可通用。
由于治療用的多肽需要高度純化以免在對(duì)患者施用時(shí)引起不利事件，在生產(chǎn)工藝中應(yīng)用幾步色譜純化步驟是很常見的。生產(chǎn)廠中色譜柱的固定相昂貴，所以將它們用于數(shù)次色譜循環(huán)。然而，色譜固定相的性能隨時(shí)間而降低，即，通過(guò)柱的壓力降抑制性地增大，而且分離系數(shù)受損。這歸因于沉積物的逐漸積累。已有人建議通過(guò)包括堿性緩沖液(J.Chrom.461，1989，45-61)，例如pH7.4和高濃度的有機(jī)改性劑的再生方法來(lái)克服該問(wèn)題。
Brange等(J.Pharm.Sci.86(1997)517-525)公開了將胰島素纖絲溶于酸和溶于堿。
多年來(lái)，通過(guò)用堿性溶液再生色譜固定相來(lái)減輕該問(wèn)題，例如0.1摩爾氫氧化鈉(vide Liliedahl，“致力于肽的基于二氧化硅的HPLC純化的十二年”，Tides 2000，2000年5月10日，Las Vegas，USA)。該再生方法可將用于純化胰島素的二氧化硅的使用壽命增大至100～600次循環(huán)。但是，二氧化硅物質(zhì)暴露于苛性堿條件下時(shí)不穩(wěn)定，特別是取代的二氧化硅物質(zhì)可能不適合通過(guò)堿性溶液再生。純化藥物例如治療用多肽的經(jīng)濟(jì)適用的方法必定包括不破壞色譜固定相的再生方法。
WO 00/61493中公開了再生多種來(lái)源的粒狀物質(zhì)(粘土、砂、二氧化硅等)的一般而復(fù)雜的方法。它是一種5步法，它包括將所述物質(zhì)與a)有機(jī)物質(zhì)的提取劑，b)氧化劑接觸，隨后與c)酸溶液接觸，d)將物料加熱以及e)回收所述物質(zhì)。該方法繁瑣而不適合在色譜純化工廠實(shí)施。
本領(lǐng)域需要再生色譜固定相的更有效方法以便延長(zhǎng)這些昂貴的原料的使用壽命和防止通過(guò)色譜柱的壓力降升高。尤其需要適合在生產(chǎn)廠就地再生色譜固定相的再生方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了再生色譜固定相的方法，其中，將所述色譜固定相與含有至少一種有機(jī)酸和少于約75％w/w的水的再生溶液接觸。本發(fā)明另一方面提供了再生色譜固定相的方法，其中，將所述色譜固定相與含有至少一種有機(jī)酸和少于約1％w/w的水的再生溶液接觸。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是甲酸。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述再生溶液含有少于0.5％的水，優(yōu)選少于0.1％的水，更優(yōu)選少于0.02％的水，而最優(yōu)選少于0.001％的水。
本發(fā)明另一方面涉及再生色譜固定相的方法，其中，將所述色譜固定相與含有至少一種有機(jī)酸，一種有機(jī)溶劑和少于約1％w/w的水的再生溶液接觸。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是乙醇。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是2-丙醇。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是乙腈。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、1-丙醇和己二醇。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述再生溶液含有少于0.5％的水，優(yōu)選少于0.1％的水，更優(yōu)選少于0.02％的水，而最優(yōu)選少于0.001％的水。
本發(fā)明另一方面涉及已通過(guò)本發(fā)明的方法再生了的色譜固定相。
本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的多肽產(chǎn)品。
本發(fā)明又一方面涉及通過(guò)一種方法生產(chǎn)的多肽產(chǎn)品，所述方法包括利用所述方法再生色譜固定相。
本發(fā)明又一方面涉及自動(dòng)色譜設(shè)備，它包括用于實(shí)施所述再生方法的管道和控制系統(tǒng)。
本發(fā)明又一方面涉及通過(guò)使用已利用所述方法再生了的色譜固定相純化多肽而制備的藥物組合物。
附圖簡(jiǎn)述附圖中進(jìn)一步闡釋了本發(fā)明，其中

圖1表示共焦原理。
圖2表示Source 30Q與用Thioflavin T染色的胰島素纖絲的2D圖。
圖3表示測(cè)定Source 30Q上的纖絲面積的原理。淺色區(qū)表示來(lái)自Source 30Q顆粒上的胰島素纖絲的綠光。
圖4A-B表示色譜純化III的制備色譜圖(圖4A，上圖，用甲酸再生之前，以及圖4B(下圖)，用甲酸再生以后)。
定義下面是本說(shuō)明書中應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)的詳細(xì)定義。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“色譜固定相”表示可溶性相(soluble phase)從上面流過(guò)的固定相，即，色譜基體。通常將色譜固定相放在色譜柱內(nèi)。色譜固定相的實(shí)例有取代的二氧化硅，例如C-4二氧化硅，C-12二氧化硅和C-18二氧化硅，以及聚合材料，例如聚苯乙烯、Source 30Q和Sepharose。色譜固定相的其它實(shí)例有膜、整塊的材料和濾料。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“色譜洗脫劑”表示用于洗脫步驟的溶液，所述洗脫中，被純化的多肽通常從色譜固定相被釋放到洗脫劑中。在色譜法的常規(guī)方式中，一次完全的循環(huán)(cyclus)包括a)用平衡緩沖液平衡而使柱呈準(zhǔn)備好進(jìn)行循環(huán)的狀態(tài)，b)包含產(chǎn)品的樣品的應(yīng)用，c)任選的洗滌步驟，其中，洗滌帶有結(jié)合的產(chǎn)品的色譜固定相，d)洗脫，此時(shí)產(chǎn)品對(duì)色譜固定相的親合力減小了，所以產(chǎn)品隨色譜柱洗出液離開色譜柱，以及e)任選的再生，此時(shí)試圖用再生溶液除去色譜固定相的殘留雜質(zhì)。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“平衡緩沖液”表示用于平衡步驟的溶液，所述平衡步驟中使色譜柱作好色譜循環(huán)的準(zhǔn)備。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“再生溶液”表示用于再生色譜固定相的溶液。再生的目的是在幾次色譜循環(huán)期間保持令人滿意的色譜分離性能。通常，關(guān)鍵的性能相關(guān)的參數(shù)是通過(guò)色譜柱的壓力降和分離系數(shù)。一個(gè)再生步驟可能包括，將色譜固定相與一種再生溶液或與一種以上的再生溶液接觸。在后一種情況下，術(shù)語(yǔ)“再生溶液”包括各再生溶液中的每一種以及由它們得到的混合物。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“混合物”表示含有至少兩種組分的物質(zhì)組合物。色譜柱洗出液是一種混合物，它含有洗脫劑中的化學(xué)品以及已從色譜柱脫離的產(chǎn)品?；旌衔锏牧硪粋€(gè)實(shí)例是化學(xué)品在溶劑中的溶液，例如鹽水?；旌衔锏挠忠粋€(gè)實(shí)例是水與水混溶性有機(jī)溶劑?；旌衔锏挠忠粋€(gè)實(shí)例是多肽在溶劑例如水或有機(jī)溶劑中的溶液或懸浮液。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“分離多肽”表示使多肽呈比分離它之前(即，原料中)更高濃度或更高純度的狀態(tài)。例如，一個(gè)分離多肽的實(shí)例是使多肽從溶液中沉淀或結(jié)晶，再?gòu)哪敢悍蛛x該沉淀物或晶體。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“有機(jī)溶劑”表示這種溶劑，即，它含有至少一個(gè)碳原子而且它在0℃～50℃的溫度范圍內(nèi)呈流態(tài)。有機(jī)溶劑的非限制性實(shí)例有低級(jí)醇，例如甲醇和乙醇，多元醇，乙腈，己烷和丙酮。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“水混溶性有機(jī)溶劑”表示這種有機(jī)溶劑，即，它在20℃的水中的溶解度至少是1g/L。水混溶性有機(jī)溶劑的非限制性的實(shí)例有甲醇、1-丙醇、2-丙醇、乙腈和己二醇。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“有機(jī)酸”表示這種有機(jī)化合物，即，它具有至少一個(gè)官能團(tuán)，它的離解常數(shù)pKa小于5.0。有機(jī)酸的實(shí)例有甲酸、乙酸、檸檬酸等。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“低級(jí)醇”表示C1-6-醇，其特征在于，它具有1～6個(gè)碳原子和一個(gè)羥基部分。低級(jí)醇中的碳骨架可能是直的或分枝的。低級(jí)醇的非限制性實(shí)例有乙醇、正丙醇、異丙醇和叔丁醇。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“多元醇”表示具有至少兩個(gè)羥基部分的醇。多元醇的非限制性實(shí)例有己二醇(4-甲基-2，4-戊二醇)和新戊醇(2，2-二甲基-1，3-丙二醇)。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“賦形劑”表示加到藥物組合物中而使組合物穩(wěn)定和保存組合物的化合物。典型的賦形劑有緩沖劑、防腐劑和張度調(diào)節(jié)劑。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”表示這種產(chǎn)品，即，它含有活性化合物或其鹽以及藥物賦形劑例如緩沖劑、防腐劑和張度調(diào)節(jié)劑，所述藥物組合物適用于治療疾病或障礙。所以藥物組合物在本領(lǐng)域也稱為藥物制劑。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“緩沖劑”表示這種化合物，即，它被用于溶液中以減小溶液的pH隨時(shí)間變化的傾向，否則由于化學(xué)反應(yīng)會(huì)發(fā)生pH變化。緩沖劑包括化學(xué)品例如磷酸鈉、TRIS、甘氨酸和檸檬酸鈉。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“張度調(diào)節(jié)劑”表示藥物組合物中的化合物，它的作用是調(diào)節(jié)藥物組合物的滲透壓而使?jié)B透壓接近于人血漿的滲透壓。張度調(diào)節(jié)劑包括NaCl、甘油、D-甘露糖醇等。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“藥物上可接受的”表示適合正常藥物應(yīng)用，即，不在患者中引起不利事件。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“人胰島素”表示其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是人們熟知的人激素。人胰島素具有兩條由半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接的多肽鏈，即，A鏈和B鏈。A鏈?zhǔn)?1個(gè)氨基酸的肽，而B鏈則是30個(gè)氨基酸的肽，這兩條鏈通過(guò)三個(gè)二硫鍵連接第一個(gè)在A鏈的位置6和11上的半胱氨酸之間，第二個(gè)在A鏈位置7上的半胱氨酸和B鏈位置7上的半胱氨酸之間，而第三個(gè)在A鏈位置20上的半胱氨酸和B鏈位置19上的半胱氨酸之間。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“多肽”表示由至少十個(gè)通過(guò)肽鍵連接的組成性氨基酸構(gòu)成的化合物。所述組成性氨基酸可選自遺傳密碼編碼的氨基酸組，而且它們可能是不被遺傳密碼編碼的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不被遺傳密碼編碼的天然氨基酸例如有羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、鳥氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)的氨基酸，即，由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基異丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)，Tle(叔丁基甘氨酸)和β-丙氨酸。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“治療用多肽”表示被認(rèn)為具有作為治療劑的潛在用途的多肽。治療用多肽通常被高度純化了，而且它們作為法規(guī)許可方法的部分經(jīng)歷了臨床研究。治療用多肽的實(shí)例有人胰島素、血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素和人生長(zhǎng)激素。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“多肽產(chǎn)品”表示含有多肽的組合物。多肽產(chǎn)品的實(shí)例有結(jié)晶多肽、沉淀多肽和多肽的溶液。
如本文應(yīng)用的涉及母體多肽的術(shù)語(yǔ)“類似物”表示修飾的多肽，其中母體多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代了和/或其中從母體多肽缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和/或其中從母體多肽缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被添加到了母體多肽。這種氨基酸殘基的添加或缺失可在多肽的N端或多肽的C端或多肽內(nèi)發(fā)生。一個(gè)類似物的實(shí)例是Arg34-GLP-1(7-37)，它是一種GLP-1(7-37)多肽，其中，位置34上的Lys被Arg替換了。其它實(shí)例有豬或牛胰島素，兩者都是人胰島素的類似物。
如本文應(yīng)用的涉及多肽的術(shù)語(yǔ)“前體”表示正被產(chǎn)生的多肽的修飾形式。多肽的前體通常是多肽的氨基酸延長(zhǎng)的形式，或是多肽的截短的形式。這些前體的作用可以是增強(qiáng)細(xì)胞表達(dá)，包含純化用親和標(biāo)記物，保護(hù)正被產(chǎn)生的多肽的某些活性基等。
如本文應(yīng)用的涉及母體多肽的術(shù)語(yǔ)“衍生物”表示化學(xué)修飾的母體多肽或其類似物，其中，在母體多肽或其類似物中不存在至少一個(gè)取代基，即，被共價(jià)修飾了的母體多肽。典型的修飾有酰胺、碳水化合物、烷基、?；Ⅴ?、聚乙二醇化(PEGylations)等。人胰島素衍生物的實(shí)例有蘇氨酸甲酯B30人胰島素和NεB29-十四烷酰des(B30)人胰島素。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“親脂取代基”表示這種取代基，即，它含有4～40個(gè)碳原子并且在20℃水中的溶解度在約0.1mg/100ml水～約250mg/100ml水范圍內(nèi)，例如約0.3mg/100ml水～約75mg/100ml水范圍內(nèi)。例如，辛酸(C8)在20℃水中的溶解度是68mg/100ml，癸酸(C10)在20℃水中的溶解度是15mg/100ml，而十八酸(C18)在20℃水中的溶解度是0.3mg/100ml。
如本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“管道和控制系統(tǒng)”表示物質(zhì)設(shè)備(管道和控制閥)與控制操作設(shè)備的管道和閥的軟件。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及再生色譜固定相的方法，其中，將所述色譜固定相與含有至少一種有機(jī)酸和少于約75％w/w的水的再生溶液接觸。
本發(fā)明還涉及再生色譜固定相的方法，其中，將所述色譜固定相與含有至少一種有機(jī)酸和少于約1％w/w的水的再生溶液接觸。
本發(fā)明還涉及再生色譜固定相的方法，其中，將所述色譜固定相與具有至少25％w/w的有機(jī)酸濃度的再生溶液接觸。
一些有機(jī)酸可用于所述方法的再生溶液中。一種優(yōu)選的有機(jī)酸是甲酸。用于再生溶液的另一種有機(jī)酸是乙酸。另一種再生溶液含有兩種有機(jī)酸，例如甲酸和乙酸。
所述再生溶液可進(jìn)一步含有有機(jī)溶劑。優(yōu)選地，有機(jī)溶劑也用于平衡緩沖液或色譜洗脫劑中。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是乙醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是2-丙醇。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑是乙腈。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、1-丙醇和己二醇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是甲酸，而且所述有機(jī)溶劑是乙醇。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是甲酸，而且所述有機(jī)溶劑是乙腈。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是甲酸，而且所述有機(jī)溶劑是2-丙醇。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是甲酸，而且所述有機(jī)溶劑是己二醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是乙酸，而且所述有機(jī)溶劑是乙醇。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是乙酸，而且所述有機(jī)溶劑是乙腈。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是乙酸，而且所述有機(jī)溶劑是2-丙醇。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸是乙酸，而且所述有機(jī)溶劑是己二醇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及再生色譜固定相的方法，其中，將所述色譜固定相與含有至少一種有機(jī)酸和少于0.5％的水、優(yōu)選少于0.1％的水、更優(yōu)選少于0.02％的水、而最優(yōu)選少于0.001％的水的再生溶液接觸。
所述色譜固定相與再生溶液優(yōu)選在色譜柱內(nèi)接觸。這樣，因與再生步驟相關(guān)的停車時(shí)間而損失的生產(chǎn)能力最小。所以，不用再次填充色譜柱就可進(jìn)行再生色譜固定相的操作。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述再生過(guò)程中流化色譜固定相。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在將所述色譜固定相與所述再生溶液接觸之前用水混溶性有機(jī)溶劑替換色譜洗脫劑或平衡緩沖液。優(yōu)選地，所述水混溶性有機(jī)溶劑也存在于色譜洗脫劑或平衡緩沖液內(nèi)。優(yōu)選地，所述水混溶性有機(jī)溶劑也存在于再生溶液內(nèi)。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，將所述色譜固定相與再生溶液在色譜柱外接觸。該操作比在色譜柱內(nèi)進(jìn)行再生操作更麻煩，但是如果在色譜固定相顆粒之間截留了沉淀物質(zhì)，該方法可能還是適用的。在后一種情況下，不用溶解所述物質(zhì)即可從色譜固定相除去沉淀物質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述色譜固定相是RP-HPLC基體。用于RP-HPLC的色譜固定相是機(jī)械上很剛性的物質(zhì)，它們可能是二氧化硅或取代的二氧化硅，例如C4、C6、C8、C10、C12、C16、C18、C30或苯基二氧化硅，或者它可能是壓力穩(wěn)定的取代或未取代的聚合材料。所述色譜固定相，不管是基于二氧化硅的基體還是聚合材料，也可作為具有大孔和中孔的整體棒存在于色譜柱中。用作色譜固定相的適當(dāng)二氧化硅材料是球形顆粒，它具有窄孔徑分布而且粒徑在3μm～100μm，例如5μm～100μm，例如8μm～30μm范圍內(nèi)，例如10μm，13μm，15μm，16μm，18μm和20μm。通常，應(yīng)用的孔徑在60?！?00，例如100，120，150，175，200?；?00。對(duì)于壓力穩(wěn)定的聚合材料來(lái)說(shuō)，孔徑可能從10或更高開始，例如50，100，400，600，1000?；?000。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述壓力穩(wěn)定的聚合材料是Source 30Q或XAD1180。用固定相填充色譜柱，在適當(dāng)檢驗(yàn)填充質(zhì)量以后，用以結(jié)合方式使用的緩沖劑平衡色譜柱。生產(chǎn)規(guī)模色譜柱通常具有15～100cm的直徑，而且這類體系可能具有動(dòng)態(tài)軸向壓縮。對(duì)于少量多肽的生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)柱可能具有例如15cm、20cm或25cm的直徑。對(duì)于大量多肽的生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)柱可能具有例如40cm、60cm、80cm或更大的直徑。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，被再生的色譜固定相是膜、整塊材料、濾料等。
在再生色譜固定相的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將所述色譜固定相與所述再生溶液接觸至少1秒，優(yōu)選至少1分鐘，更優(yōu)選至少5分鐘，例如1分鐘～24小時(shí)，1分鐘～5小時(shí)，1分鐘～2小時(shí)，10分鐘～60分鐘。
在再生色譜固定相的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述色譜固定相與所述再生溶液接觸直到常規(guī)流速下通過(guò)色譜柱長(zhǎng)度的壓力降減小至少10％，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少50％。
在再生色譜固定相的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述色譜固定相與所述再生溶液的接觸是在約0℃～70℃，在5℃～50℃，例如10℃～40℃，例如15℃～30℃，或者18℃～25℃范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行的。
在再生色譜固定相的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述色譜固定相的使用壽命是至少500次色譜循環(huán)，優(yōu)選至少700次色譜循環(huán)，更優(yōu)選至少1000次色譜循環(huán)，最優(yōu)選至少2000次色譜循環(huán)。
在再生色譜固定相的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于每次色譜循環(huán)都將所述方法應(yīng)用于所述色譜固定相，每2次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次，每5次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次，每20次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次，每50次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次，或者每100次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)色譜固定相進(jìn)行再生操作的次數(shù)是至少25次，至少50次，至少100次，至少200次，至少400次或者至少1000次。
在再生色譜固定相的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)論何時(shí)通過(guò)色譜柱長(zhǎng)度的壓力降超過(guò)閾值，就將所述方法應(yīng)用于所述色譜固定相。
本發(fā)明另一方面是生產(chǎn)治療用多肽或其前體的方法，所述方法包括至少一步色譜處理步驟，該步驟中，通過(guò)上述再生方法再生色譜固定相。在生產(chǎn)治療用多肽或其前體的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療用多肽是含有親脂取代基的衍生物。在生產(chǎn)治療用多肽或其前體的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療用多肽是含有連接到賴氨酸殘基的ε-氨基上的親脂取代基的衍生物。在生產(chǎn)治療用多肽或其前體的方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療用多肽選自下組物質(zhì)胰高血糖素、胰高血糖素樣肽1、胰高血糖素樣肽2、exendin-4、TFF肽、人胰島素、其類似物及其衍生物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽選自下組物質(zhì)Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、exendin-4、Lys17Arg30-GLP-2(1-33)、Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰))GLP-2(1-33)和Gly2-GLP-2(1-33)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是exendin-4。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是含有人血清白蛋白或其片斷的融合多肽。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是GLP-1(7-37)或其類似物與人血清白蛋白片斷或其類似物之間的融合多肽。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是exendin-4(1-39)或其類似物與人血清白蛋白片斷或其類似物之間的融合多肽。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是含有免疫球蛋白的Fc部分或其片斷的融合多肽。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是GLP-1(7-37)或其類似物與免疫球蛋白的Fc部分的片斷或其類似物之間的融合多肽。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是exendin-4(1-39)或其類似物與免疫球蛋白的Fc部分的片斷或其類似物之間的融合多肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽選自下組物質(zhì)人胰島素、人胰島素前體、人胰島素類似物、人胰島素類似物前體、GLP-1(7-37)類似物、exendin-4(1-39)類似物、及其衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽選自含有至少一個(gè)甲氧基或乙氧基部分的人胰島素衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽選自下組物質(zhì)蘇氨酸甲酯B30人胰島素，蘇氨酸乙酯B30人胰島素，AspB28人胰島素，蘇氨酸甲酯B30AspB28人胰島素，蘇氨酸乙酯B30AspB28人胰島素，LysB28ProB29人胰島素，MetB-1ArgB0LysB28ProB29人胰島素原，LysB3GluB29人胰島素，GlyA21ArgB31ArgB32人胰島素，des(B30)人胰島素，NεB29-十四烷酰des(B30)人胰島素，NεB29-石膽酰(litocholoyl)-γ-谷氨酰des(B30)人胰島素，NεB29-辛酰des(B30)人胰島素，以及NεB29-辛酰人胰島素。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽選自人血清白蛋白、促紅細(xì)胞生成素、TNF-α、白細(xì)胞介素、IGF-1、IGF-2、人生長(zhǎng)激素、促生長(zhǎng)素抑制素、人胰島淀粉樣多肽(human amylin)及其類似物。
在通過(guò)本發(fā)明的方法再生的色譜固定相上純化的多肽可通過(guò)多肽生產(chǎn)領(lǐng)域已知的各種技術(shù)生產(chǎn)。大于3000道爾頓的多肽通常是通過(guò)發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的，而更小的多肽可通過(guò)化學(xué)肽合成來(lái)生產(chǎn)。決定最適當(dāng)生產(chǎn)方法的其它重要因素還有要生產(chǎn)的多肽的量和多肽的結(jié)構(gòu)，例如二硫鍵和其它修飾。來(lái)自發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)的多肽一般是通過(guò)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，例如細(xì)菌、真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞生產(chǎn)的。所述培養(yǎng)基可以是程度不同地化學(xué)定義的培養(yǎng)基，它含有宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成所需的營(yíng)養(yǎng)物，例如糖、氮源、鹽、維生素和其它生長(zhǎng)因子。一旦在培養(yǎng)基中培養(yǎng)了微生物或細(xì)胞并且任選使它們破裂，培養(yǎng)基就含有所需產(chǎn)品與剩余的培養(yǎng)基組分、宿主細(xì)胞產(chǎn)生的雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)的混合物。宿主細(xì)胞產(chǎn)生的雜質(zhì)主要是多肽、核酸和細(xì)胞碎片。在回收或早期純化步驟中將產(chǎn)品與這些不相關(guān)的雜質(zhì)分離。在最后的純化步驟(精加工)中，廣泛應(yīng)用色譜處理步驟將與產(chǎn)品多肽密切相關(guān)的雜質(zhì)與產(chǎn)品多肽分離。
多肽的合成還可通過(guò)下列方法進(jìn)行Merrifield型化學(xué)的固相合成、溶液相方法、或者本領(lǐng)域已知的半合成方法。在回收和最后純化步驟之間可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。這樣的化學(xué)修飾可通過(guò)前體多肽的水解，其中，多肽上的氨基酸延伸被從多肽切斷。這樣的氨基酸延伸在培養(yǎng)獲得的多肽的情況下可用于增強(qiáng)宿主細(xì)胞的表達(dá)，或者它可用于特異性地純化多肽，例如通過(guò)親和色譜，例如組氨酸標(biāo)記的多肽的IMAC純化?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化還可能是生產(chǎn)多肽衍生物的化學(xué)修飾，例如通過(guò)?；?、聚乙二醇化或酯化。這樣的化學(xué)修飾是本領(lǐng)域熟知的(參見例如WO 98/08871、WO 99/43706、US 5,424286、WO 00/09666、WO 00/66629、WO 01/04156和WO 02/90388)。
本發(fā)明另一方面是上述再生色譜固定相的方法在減小通過(guò)色譜柱長(zhǎng)度的壓力降中的應(yīng)用。
本發(fā)明又一方面是上述再生色譜固定相的方法在生產(chǎn)治療用多肽中的應(yīng)用。
本發(fā)明又一方面是色譜固定相，它已通過(guò)將所述色譜固定相與再生溶液接觸而再生了，所述再生溶液含有至少一種有機(jī)酸和少于約75％w/w的水。本發(fā)明又一方面是色譜固定相，它已通過(guò)將所述色譜固定相與再生溶液接觸而再生了，所述再生溶液含有至少一種有機(jī)酸和少于約1％w/w的水。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述色譜固定相已通過(guò)上述方法再生了。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述色譜固定相已通過(guò)一種方法再生了，所述方法中，所述再生溶液含有少于0.5％的水，優(yōu)選少于0.1％的水，更優(yōu)選少于0.02％的水，最優(yōu)選少于0.001％的水。在又一個(gè)實(shí)施方案中，再生的色譜固定相是二氧化硅，或是取代的二氧化硅物質(zhì)。
本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)一種方法生產(chǎn)的多肽產(chǎn)品，所述方法包括下列步驟a)應(yīng)用通過(guò)本發(fā)明的再生方法生產(chǎn)的色譜固定相純化多肽或其前體，以及b)分離所述多肽或其前體而給出所得的多肽產(chǎn)品。
本發(fā)明又一方面涉及通過(guò)一種方法生產(chǎn)的多肽產(chǎn)品，所述方法中，應(yīng)用按照本發(fā)明的方法再生的色譜固定相。
本發(fā)明又一方面涉及用于實(shí)施本發(fā)明的再生方法的自動(dòng)化色譜處理設(shè)備，它包括管道和控制系統(tǒng)。
本發(fā)明又一方面涉及通過(guò)一種方法制備的藥物組合物，所述方法包括下列步驟a)首先應(yīng)用通過(guò)本發(fā)明的方法再生的色譜固定相純化多肽或其前體，b)然后干燥所述多肽，以及c)最后與藥物上可接受的賦形劑摻和。
本發(fā)明又一方面涉及通過(guò)一種方法制備的藥物組合物，所述方法包括下列步驟a)首先應(yīng)用這種方法再生的色譜固定相純化多肽或其前體，所述方法中，將所述色譜固定相與再生溶液接觸，該再生溶液含有至少一種有機(jī)酸和少于0.5％的水，優(yōu)選少于0.1％的水，更優(yōu)選少于0.02％的水，而最優(yōu)選少于0.001％的水，以及
b)然后干燥所述多肽，以及c)最后與藥物上可接受的賦形劑摻和。
實(shí)施例應(yīng)用關(guān)于下列可商購(gòu)的化學(xué)品和材料的首字母縮略詞HCOOH甲酸EtOH乙醇AcOH乙酸ODDMS十八烷基二甲基取代的二氧化硅顆粒(ODDMS二氧化硅)用于實(shí)施例1～68、70～71、73～74和76的甲酸具有98～100％(根據(jù)生產(chǎn)商)的規(guī)定純度，而且用于實(shí)施例72的甲酸的純度為99.9％。
縮寫CV如色譜學(xué)領(lǐng)域中已知的那樣表示柱體積。
實(shí)施例1～68實(shí)施例1～68的試驗(yàn)的整個(gè)方案如下1)測(cè)定沒有壓力問(wèn)題的柱(新的未用過(guò)的柱)的反壓(back pressure)和谷值高度。
2)引入壓力和性能問(wèn)題。
3)測(cè)定有壓力問(wèn)題的柱的反壓和谷值高度。
4)柱的再生。
5)測(cè)定再生后的柱的反壓和谷值高度。
反壓和谷值高度的測(cè)定將相同類別的硅膠用于這部分所述的所有試驗(yàn)。所述硅膠是ODDMS200，15μm硅膠?；旧蠎?yīng)用相同批號(hào)的硅膠(批號(hào)是205144)(全部柱始于874-)。
將硅膠填入10mm×250mm鋼柱，應(yīng)用DesB30胰島素作為試驗(yàn)物質(zhì)在功能度試驗(yàn)(functionality test)中進(jìn)行測(cè)試，用含有氯化鈣和氯化鉀鹽的水-乙醇混合物(見表1)洗脫。將洗脫時(shí)的反壓以及DesB30胰島素和最近的雜質(zhì)(在胰島素峰的前面)之間的谷值高度用作測(cè)試柱恢復(fù)它的性能情況的試驗(yàn)參數(shù)。
DesB30胰島素的洗脫時(shí)間可能因溫度和其它試驗(yàn)參數(shù)的小變化而受一些試驗(yàn)變化的支配。當(dāng)不同試驗(yàn)中的DesB30胰島素的洗脫時(shí)間相同時(shí)，谷值高度是柱分離性能的理想比較。當(dāng)試驗(yàn)之間的DesB30胰島素的洗脫時(shí)間改變時(shí)，谷值高度是柱分離性能的不太好的量度。所有其它參數(shù)相等時(shí)，保留時(shí)間越長(zhǎng)，谷值高度就會(huì)越低。
表1.功能度試驗(yàn)中應(yīng)用的溶液
功能度試驗(yàn)是在以Unicorn 4.0為控制軟件的ktaexplorer 100A上在23±2℃下進(jìn)行的，并且運(yùn)行下列柱循環(huán)(見表2)表2.功能度試驗(yàn)中的柱循環(huán)(CV是柱體積)
測(cè)試填充了硅膠(批號(hào)205144)的柱，反壓測(cè)定到3.4±0.1MPa。同樣測(cè)定了引入壓力問(wèn)題之前其它柱的反壓。試驗(yàn)表明，如果處理后這些值恢復(fù)了，柱就恢復(fù)了它的性能。
還在引入壓力和性能問(wèn)題前后以及在柱的再生后，對(duì)各個(gè)柱測(cè)定了谷值高度。
壓力和性能問(wèn)題的引入以下列3種方式之一引入壓力和性能問(wèn)題1)在功能度試驗(yàn)中應(yīng)用了柱，但在加載后從系統(tǒng)取出并置于70℃下達(dá)1～16小時(shí)。隨后測(cè)定反壓和谷值高度進(jìn)行功能度試驗(yàn)的其余測(cè)試。
2)在燒杯中將ODDMS硅膠(25g)與DesB30胰島素(0.14g)、0.1M Tris緩沖液(22ml)和乙醇(15ml)在50℃下攪拌1小時(shí)。然后潷去硅膠并填充在鋼柱(10mm×250mm)中。進(jìn)行功能度試驗(yàn)測(cè)定反壓和谷值高度。
還可以在更低溫度下進(jìn)行該方法，但那樣就需要更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。
3)1)和2)的組合。首先，如2)中那樣處理硅膠，但在填充后如1)中那樣處理柱。
下表4中列出了用于各個(gè)柱的方法。
柱的再生(即，壓力和性能問(wèn)題的消除)柱的再生也是在ktaexplorer 100A上進(jìn)行的。該操作的柱循環(huán)可見于下表3中。再生后，再次在功能度試驗(yàn)中檢測(cè)柱并測(cè)定反壓。
表3.再生下的柱循環(huán)。
在22℃和40℃下測(cè)試不同的溶劑(將整個(gè)HPLC系統(tǒng)置于選定的溫度±1℃下的冰箱中)。關(guān)于各個(gè)柱的具體條件示于表4中，官能度試驗(yàn)的結(jié)果示于表5中。
關(guān)于各個(gè)柱的具體試驗(yàn)條件；表4.關(guān)于各個(gè)柱的試驗(yàn)條件
關(guān)于各個(gè)柱的功能度試驗(yàn)結(jié)果表5.按照表4中列出的條件在引入問(wèn)題前后和再生柱以后進(jìn)行的功能度試驗(yàn)測(cè)定的反壓和谷值高度。
RT是DesB30胰島素的保留時(shí)間，而谷值高度(HV)是關(guān)于DesB30胰島素和最近的雜質(zhì)。
實(shí)施例69柱使用壽命-色譜溶劑/洗脫劑。
取代的硅膠的使用壽命可能因應(yīng)用于色譜柱的溶液例如緩沖液和再生溶液對(duì)硅膠的化學(xué)降解而受限制。取代的硅膠的化學(xué)降解可通過(guò)柱出口處硅的出現(xiàn)或者通過(guò)顯示取代作用喪失的硅膠碳含量降低來(lái)觀測(cè)。下列試驗(yàn)表明，在用三種色譜溶液長(zhǎng)時(shí)間沖洗期間柱流出物中硅的出現(xiàn)和硅膠碳含量的減小20％乙醇水溶液，洗脫劑1和洗脫劑2。洗脫劑2的組成是31％w/w乙醇、1.5％w/w KCl、0.40％w/wCaCl2、0.15％w/w三乙醇胺并且應(yīng)用HCl將pH調(diào)節(jié)到pH7.4。洗脫劑1的組成是鹽、緩沖劑、乙醇和pH3.0。
通過(guò)填充色譜柱的標(biāo)準(zhǔn)方法將一批ODDMS硅膠填充入4.0×250mm鋼柱中。然后在開始用色譜洗脫劑連續(xù)沖洗之前用3CV乙醇將柱平衡。然后用色譜洗脫劑(20％EtOH，洗脫劑1或洗脫劑2)將5個(gè)柱分別沖洗1、3、7、12和16天。在適當(dāng)?shù)臎_洗時(shí)間后，再用3CV乙醇平衡每個(gè)柱，從柱中取出硅膠。對(duì)用過(guò)的硅膠的樣品進(jìn)行碳含量分析，對(duì)用過(guò)的再生溶液的樣品進(jìn)行硅含量分析。第0天的結(jié)果是用來(lái)填充柱的硅膠的結(jié)果(碳含量)。
表6.通過(guò)測(cè)定殘余的碳和釋出的硅估測(cè)用典型的色譜洗脫劑長(zhǎng)時(shí)間沖洗期間柱的使用壽命
實(shí)施例70柱的使用壽命-含甲酸的再生溶液。
取代的硅膠的使用壽命可能因應(yīng)用于色譜柱的溶液例如緩沖液和再生溶液對(duì)硅膠的化學(xué)降解而受限制.取代的硅膠的化學(xué)降解可通過(guò)柱出口處硅的出現(xiàn)或者通過(guò)顯示取代作用喪失的硅膠碳含量降低來(lái)觀測(cè)。下列試驗(yàn)表明，在用含甲酸的再生溶液長(zhǎng)時(shí)間沖洗期間柱流出物中硅的出現(xiàn)和硅膠碳含量的減小。所以，與應(yīng)用色譜緩沖液或溶劑的情況相比，含甲酸的再生溶液不再破壞柱基體。
通過(guò)填充色譜柱的標(biāo)準(zhǔn)方法將一批ODDMS硅膠填充入4.0×250mm鋼柱中。然后在開始用甲酸連續(xù)沖洗之前用3CV 100％EtOH將柱平衡。然后用甲酸再生溶劑(100％或80％)將5個(gè)柱分別沖洗1、3、7、12和16天。在適當(dāng)?shù)臎_洗時(shí)間后，再用3CV乙醇平衡每個(gè)柱，從柱中取出硅膠。對(duì)用過(guò)的硅膠的樣品進(jìn)行碳含量分析，對(duì)用過(guò)的再生溶液的樣品進(jìn)行硅含量分析。第0天的結(jié)果是用來(lái)填充柱的硅膠的結(jié)果(碳含量)。
表7.通過(guò)測(cè)定殘余的碳和釋出的硅估測(cè)用含甲酸的溶液長(zhǎng)時(shí)間再生期間柱的使用壽命
實(shí)施例71應(yīng)用共焦激光掃描顯微鏡檢術(shù)測(cè)定Source 30Q陰離子交換劑上的胰島素纖絲目的應(yīng)用共焦激光掃描顯微鏡檢術(shù)的目的是目測(cè)不同的再生溶劑在除去Source 30Q上的胰島素纖絲時(shí)效果如何。利用復(fù)雜的圖像處理軟件能有機(jī)會(huì)測(cè)定各圖片上胰島素纖絲的面積，給出更準(zhǔn)確的判斷而不是目視判斷各圖片。
共焦原理應(yīng)用CLSM的原理是用熒光染料將樣品染色。將染色的樣品置于顯微鏡下并且應(yīng)用激光激發(fā)熒光染料。檢測(cè)從熒光染料發(fā)出的光而形成圖像。共焦激光掃描顯微鏡如同應(yīng)用激光作為光源的常規(guī)共焦顯微鏡。來(lái)自激光的光經(jīng)過(guò)雙色分束器(dichromatic beamsplitter)穿過(guò)顯微鏡的物鏡。雙色分束器是這種儀器，即，能使來(lái)自激光的光向下穿過(guò)物鏡到達(dá)樣品，而從樣品發(fā)出的光通過(guò)雙色分束器并且向上到達(dá)光電倍增管，在這里檢測(cè)到光并且形成圖像。在雙色分束器和光電倍增管之間放置了共焦針孔。共焦針孔起濾光器的作用，阻止從焦點(diǎn)區(qū)出來(lái)的所有的光到達(dá)光電倍增管。這意味著，形成的圖像來(lái)自很窄的聚焦面。通過(guò)調(diào)節(jié)共焦針孔可以上下地移動(dòng)通過(guò)樣品的圖像聚焦面從而沿顯微鏡的光(z)軸產(chǎn)生一系列圖像。這一系列圖像可收集到樣品的3-D圖像中。
Source 30QSource 30Q是一種基于粒徑為30微米的單分散珠粒的強(qiáng)陰離子交換劑。該基體由聚苯乙烯/二乙烯基苯構(gòu)成。Source 30Q在650nm以上的波長(zhǎng)區(qū)給出弱的自身熒光。這說(shuō)明了不用任何染色就可能看見Source 30Q顆粒。
Thioflavin T用來(lái)對(duì)胰島素纖絲染色的染料是已知用于對(duì)淀粉樣蛋白染色的Thioflavin T。Thioflavin T具有寬的發(fā)射光譜，最大發(fā)射在低于490nm和高于530nm的范圍內(nèi)。這說(shuō)明可能辨別來(lái)自胰島素纖絲的光(綠光)和來(lái)自顆粒的自身熒光(紅光)。
對(duì)Source 30Q上的胰島素纖絲染色的方法將0.0385g干燥的Source 30Q放入25～30ml玻璃杯。
將500μl 96％乙醇加到Source 30Q中。
添加4.5ml用NaOH調(diào)節(jié)到pH3的0.05M乙酸。
通過(guò)小心地振蕩玻璃杯而將混合物混在一起。
添加20μl 116.62mM Thioflavin T在Milli-Q-水中的溶液。
將混合物小心地振蕩5min。
現(xiàn)在將樣品染色并且準(zhǔn)備好在顯微鏡下分析。
將約40μl的一小滴混合物放入顯微池(microscopic well)并且放入顯微鏡。
從池的不同位置拍攝各樣品的10個(gè)2D圖。
儀器顯微鏡檢條件物鏡40*；油；NA？激光器氬488nm激光強(qiáng)度100％共焦針孔20μm發(fā)射濾光器(No 2)來(lái)自Chroma的515/30M發(fā)射濾光器(No 3)來(lái)自Chroma的HQ650LP顯微鏡Nikon TH300，裝備了來(lái)自Nikon的PCM2000共焦掃描頭(光電倍增管)。
軟件Nikon EZ2000 Viewer 2.5.77用于圖像處理的軟件AnalySIS 3.00圖像處理根據(jù)每個(gè)樣品的10個(gè)2D圖測(cè)定胰島素纖絲的面積。為了保證以完全相同的方式處理每個(gè)樣品，通過(guò)形成宏指令自動(dòng)進(jìn)行圖像處理。宏指令如下所示。在excel工作表中歸納來(lái)自每個(gè)樣品10張圖的各獨(dú)立纖絲的面積。在條形圖中匯集從每個(gè)樣品歸納的纖絲面積。
測(cè)定纖絲的面積的宏指令Op.Display＝1；docActivate(″picture name″)；DbLoadImage ()；MaximizeContrast ()；ShadingCorrection(N*N average filter size；3；lower limit；1900；upper limit；2000)；BinarizeColorImage(ColorThresholds＝NULL，Phase＝-1)；Invert ()；EdgeEnhance(size；5；percent；70)；SetFrame(Left＝0，Top＝0，Right＝1023，Bottom＝1023)；Detect ()；ParticleResults()；Op.Display＝6；Option.BurnOverlay＝TRUE；SaveAs(FileName)；docActivate(″Sheet*″)；SaveAs(FileName)；Close(AskForSave＝TRUE)；
表8.在應(yīng)用不同的再生溶液再生硅膠前后用過(guò)的Source 30Q硅膠上纖絲的測(cè)定的面積
應(yīng)用純的甲酸或者甲酸和乙醇的混合物觀察到胰島素纖絲的完全除去。甲酸∶水的50∶50混合物沒有完全除去纖絲，盡管該混合物是比氫氧化鈉(1M)更有效的再生溶液。
實(shí)施例72用甲酸在生產(chǎn)規(guī)模再生RP-HPLC柱的標(biāo)準(zhǔn)操作方法。
下述操作方法適用于以生產(chǎn)規(guī)模純化人胰島素的四個(gè)色譜純化步驟中應(yīng)用的兩類柱。
1類柱床高32.5cm1.用約1.5CV 20％w/w乙醇水溶液以4.6CV/h的流速?zèng)_洗柱以便除去緩沖劑鹽2.逆轉(zhuǎn)柱中的流向3.用約1.1CV無(wú)水乙醇以4.5CV/h的流速?zèng)_洗柱4.將1.1CV純的甲酸以2.1CV/h的流速泵送到柱上5.停止流動(dòng)，讓柱與甲酸靜置30分鐘
6.用約1.1CV無(wú)水乙醇以4.5CV/h的流速?zèng)_洗柱7.用約1.1CV 20％w/w乙醇水溶液以4.5CV/h的流速?zèng)_洗柱8.將柱中的流向轉(zhuǎn)回正常流向9.用最少4CV 20％w/w乙醇水溶液以4.6CV/h的流速平衡柱柱現(xiàn)在準(zhǔn)備好供再次使用2類柱床高37.5cm1.用約1.5CV 20％w/w乙醇水溶液以4.6CV/h的流速?zèng)_洗柱以便除去緩沖劑鹽2.逆轉(zhuǎn)柱中的流向3.用約1.0CV無(wú)水乙醇以3.9CV/h的流速?zèng)_洗柱4.將0.92CV純的甲酸以1.9CV/h的流速泵送到柱上5.停止流動(dòng)，讓柱與甲酸靜置30分鐘6.用約1.0CV無(wú)水乙醇以3.9CV/h的流速?zèng)_洗柱7.用約1.0CV 20％w/w乙醇水溶液以3.9CV/h的流速?zèng)_洗柱8.將柱中的流向轉(zhuǎn)回正常流向9.用最少4.0CV 20％w/w乙醇水溶液以4.6CV/h的流速平衡柱柱現(xiàn)在準(zhǔn)備好供再次使用對(duì)于1類柱，每16次運(yùn)行后用甲酸進(jìn)行再生作為預(yù)防作用以阻止組分的積聚、柱反壓的增大和池量(pool volumes)的增大。通過(guò)在色譜純化I步驟中應(yīng)用使用甲酸的再生操作，柱床的使用壽命延長(zhǎng)到2000次運(yùn)行。
對(duì)于2類柱，每60次運(yùn)行后，或者如果觀察到的增大的反壓、增大的池量和雜質(zhì)的積聚，就定期用甲酸進(jìn)行再生。通過(guò)應(yīng)用使用甲酸的再生操作，柱床的使用壽命在色譜純化III步驟中延長(zhǎng)到600次運(yùn)行，而在色譜步驟IV中延長(zhǎng)到900次運(yùn)行。
在色譜純化I、III和IV步驟中應(yīng)用的柱基體由十八烷基二甲基取代的二氧化硅顆粒(ODDMS二氧化硅)構(gòu)成。描述的標(biāo)準(zhǔn)操作方法適用于在生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用的所有類型的取代二氧化硅基體。
該操作方法還用于基于Source Q材料的柱基體的甲酸再生操作方法。
下文示出了對(duì)色譜純化III和IV的效果實(shí)例。
表9.色譜純化III對(duì)池量和反壓的效果
再生使池量減小約21％，反壓減小37％。
圖4A-B示出了再生對(duì)色譜純化III的制備色譜圖的效果。
通過(guò)應(yīng)用甲酸再生，實(shí)現(xiàn)了改良的分離作用和人胰島素峰形(胰島素峰是上圖中始于時(shí)間8.20的大峰，而在下圖中是始于時(shí)間14.02的大峰)。
實(shí)施例73DEAE Sepharose的再生利用純的甲酸(100％HCOOH)再生了一批已用于純化人生長(zhǎng)激素的方法中的大量純化循環(huán)的DEAE Sepharose。在再生前，Sepharose呈棕色，說(shuō)明在硅膠上沉積的物質(zhì)。再生后的Sepharose顏色淺得多。
利用比色計(jì)(Minolta CR-300)將再生過(guò)的Sepharose的樣品與再生前的Sepharose比較以量化色差，參見表10中的結(jié)果。
表10.當(dāng)作為漿料用甲酸的再生溶液再生時(shí)對(duì)DEAE Sepharose再生的評(píng)價(jià)
實(shí)施例74含胰高血糖素聚集體的用過(guò)的硅膠的再生胰高血糖素和胰高血糖素樣肽(GLP-1和GLP-2)特別容易聚集，此時(shí)它們形成纖絲，即，β-片層結(jié)構(gòu)的聚集體。在該實(shí)施例中，進(jìn)行了一個(gè)模型試驗(yàn)，其中，將人胰高血糖素負(fù)載在二氧化硅柱上(如實(shí)施例1～68中所述)。讓胰高血糖素溶液在30℃下的柱中靜置3天以便模擬胰高血糖素的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中遇到的問(wèn)題而引起壓力和性能問(wèn)題。應(yīng)用如實(shí)施例69中所述的洗脫劑2在22℃下以9mL/min的流速，測(cè)得柱上的壓力為3.5MPa。
在應(yīng)用甲酸(100％)的一個(gè)再生循環(huán)后，柱上的壓力減小到2.67MPa，說(shuō)明了甲酸作為再生溶液的效能。
實(shí)施例75柱使用壽命-含0.1M NaOH和60％w/w乙醇水溶液的再生溶液如實(shí)施例70中所述那樣進(jìn)行了該試驗(yàn)，不同的是，該試驗(yàn)中的再生溶液是常用于再生色譜固定相的堿性乙醇。
再生溶液的流速約為0.1mL/min，4天后終止了這些試驗(yàn)，因?yàn)橹系膲毫Χ迹?0MPa。直到柱失靈時(shí)的結(jié)果都示于表11中。
表11.用含0.1M NaOH和60％w/w乙醇水溶液的再生溶液長(zhǎng)時(shí)間再生期間柱使用壽命的評(píng)價(jià)
實(shí)施例76XAD 1180的再生用于從澄清的發(fā)酵液濃縮胰島素前體的反相聚合樹脂XAD 1180的使用壽命由于疏水性雜質(zhì)例如來(lái)自發(fā)酵液的有色化合物、肽和消泡劑的嚴(yán)重積聚而受限制。常規(guī)再生循環(huán)基于用含80％乙醇于0.1M檸檬酸，pH3.0中的再生溶液洗滌，隨后與5％NaOH溶液一起在80℃下加熱。該再生方法不能有效地除去積聚的雜質(zhì)。
通過(guò)采用不同濃度和接觸時(shí)間的乙醇和異丙醇、以靜態(tài)方式進(jìn)行的試驗(yàn)評(píng)價(jià)了從用過(guò)的樹脂除去結(jié)合的消泡劑(Pluronic PE 6100和P2000)并且與甲酸再生進(jìn)行比較(表12)。甲酸處理在除去吸附的雜質(zhì)方面優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)再生溶劑。
表12.不同的再生溶液在從用過(guò)的XAD 1180色譜固定相除去吸附的消泡劑雜質(zhì)中的效率
權(quán)利要求
1.一種再生色譜固定相的方法，其中，將所述色譜固定相與含有至少一種有機(jī)酸和少于約75％w/w的水的再生溶液接觸。
2.一種再生色譜固定相的方法，其中，將所述色譜固定相與含有至少一種有機(jī)酸和少于約1％w/w的水的再生溶液接觸。
3.權(quán)利要求1～2任一項(xiàng)的方法，其中，所述有機(jī)酸的濃度至少約為25％w/w。
4.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)的方法，其中，所述有機(jī)酸是甲酸。
5.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)的方法，其中，所述有機(jī)酸是乙酸。
6.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)的方法，其中，所述再生溶液含有有機(jī)溶劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中，所述有機(jī)溶劑是乙醇。
8.權(quán)利要求6的方法，其中，所述有機(jī)溶劑是2～丙醇。
9.權(quán)利要求6的方法，其中，所述有機(jī)溶劑是乙腈。
10.權(quán)利要求6的方法，其中，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、1-丙醇和己二醇。
11.權(quán)利要求1～10任-項(xiàng)的方法，其中，所述再生溶液含有少于0.5％的水，優(yōu)選少于0.1％的水，更優(yōu)選少于0.02％的水，而最優(yōu)選少于0.001％的水。
12.權(quán)利要求1～11任一項(xiàng)的方法，其中，將所述色譜固定相與所述再生溶液在色譜柱內(nèi)接觸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中，將所述色譜固定相再生而沒有再填充所述色譜柱。
14.權(quán)利要求12的方法，其中，在所述再生過(guò)程中將色譜固定相流化。
15.權(quán)利要求12～14任一項(xiàng)的方法，其中，在將所述色譜固定相與所述再生溶液接觸之前用水混溶性有機(jī)溶劑置換色譜洗脫劑或平衡緩沖液。
16.權(quán)利要求15的方法，其中，所述有機(jī)溶劑也存在于色譜洗脫劑或平衡緩沖液中。
17.權(quán)利要求15～16任一項(xiàng)的方法，其中，所述水混溶性有機(jī)溶劑也存在于再生溶液中。
18.權(quán)利要求1～11任一項(xiàng)的方法，其中，將所述色譜固定相與所述再生溶液在色譜柱外接觸。
19.權(quán)利要求1～18任一項(xiàng)的方法，其中，所述色譜固定相是RP-HPLC基體。
20.權(quán)利要求1～17任一項(xiàng)的方法，其中，所述色譜固定相是二氧化硅或取代的二氧化硅物質(zhì)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中，所述色譜固定相是C16或C18取代的二氧化硅。
22.權(quán)利要求20的方法，其中，所述色譜固定相是C4、C8或苯基取代的二氧化硅。
23.權(quán)利要求20的方法，其中，所述色譜固定相是聚合材料。
24.權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)的方法，其中，將所述色譜固定相與所述再生溶液接觸至少1秒，優(yōu)選至少1分鐘，更優(yōu)選至少5分鐘，例如1分鐘～24小時(shí)，1分鐘～5小時(shí)，1分鐘～2小時(shí)，10分鐘～60分鐘。
25.權(quán)利要求1～13任一項(xiàng)的方法，其中，將所述色譜固定相與所述再生溶液接觸直到常規(guī)流速下通過(guò)色譜柱長(zhǎng)度的壓力降減小至少10％，優(yōu)選至少25％，更優(yōu)選至少50％。
26.權(quán)利要求1～25任一項(xiàng)的方法，其中，所述色譜固定相與所述再生溶液的接觸是在約5℃～50℃，優(yōu)選10℃～40℃，更優(yōu)選15℃～30℃，例如18℃～25℃范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行的。
27.權(quán)利要求1～26任一項(xiàng)的方法，其中，所述色譜固定相的使用壽命是至少500次色譜循環(huán)，優(yōu)選至少700次色譜循環(huán)，更優(yōu)選至少1000次色譜循環(huán)，最優(yōu)選至少2000次色譜循環(huán)。
28.權(quán)利要求1～27任一項(xiàng)的方法，其中，每次色譜循環(huán)都將所述方法應(yīng)用于所述色譜固定相，每2次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次，每5次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次，每20次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次，每50次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次，或者每100次色譜循環(huán)至少應(yīng)用一次。
29.一種生產(chǎn)治療用多肽或其前體的方法，它包括至少一個(gè)色譜處理步驟，其中，通過(guò)權(quán)利要求1～28任一項(xiàng)的方法將色譜固定相再生。
30.權(quán)利要求29的方法，其中，所述治療用多肽是含有一個(gè)親脂取代基的衍生物。
31.權(quán)利要求29的方法，其中，所述治療用多肽選自下組物質(zhì)胰高血糖素、胰高血糖素樣肽1、胰高血糖素樣肽2、exendin-4、TFF肽、人胰島素、它們的類似物和衍生物。
32.權(quán)利要求29的方法，其中，所述多肽或其前體選自下組物質(zhì)Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、exendin-4、Lys17Arg30-GLP-2(1-33)、Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰))GLP-2(1-33)和Gly2-GLP-2(1-33)。
33.權(quán)利要求29的方法，其中，所述多肽或其前體選自下組物質(zhì)蘇氨酸甲酯B30人胰島素，蘇氨酸乙酯B30人胰島素，AspB28人胰島素，蘇氨酸甲酯B30AspB28人胰島素，蘇氨酸乙酯B30AspB28人胰島素，LysB28ProB29人胰島素，MetB-1ArgB0LysB28ProB29人胰島素原，LysB3GluB29人胰島素，GlyA21ArgB31ArgB32人胰島素，des(B30)人胰島素，NεB29-十四烷酰des(B30)人胰島素，NεB29-石膽酰-γ-谷氨酰des(B30)人胰島素，NεB29-辛酰des(B30)人胰島素，以及NεB29-辛酰人胰島素。
34.權(quán)利要求1～33任一項(xiàng)的方法在減小通過(guò)色譜柱長(zhǎng)度的壓力降中的應(yīng)用。
35.權(quán)利要求1～28任一項(xiàng)的方法在生產(chǎn)治療用多肽中的應(yīng)用。
36.通過(guò)將色譜固定相與再生溶液接觸再生的色譜固定相，所述再生溶液含有至少一種有機(jī)酸和少于約1％w/w的水。
37.通過(guò)將色譜固定相與再生溶液接觸再生的色譜固定相，所述再生溶液含有至少一種有機(jī)酸和少于約75％w/w的水。
38.已通過(guò)權(quán)利要求1～33任一項(xiàng)的方法再生的色譜固定相。
39.權(quán)利要求36～38任一項(xiàng)的色譜固定相，其中，所述色譜固定相是二氧化硅或取代的二氧化硅物質(zhì)。
40.通過(guò)一種方法生產(chǎn)的多肽產(chǎn)品，所述方法包括下列步驟a)應(yīng)用權(quán)利要求36～39任一項(xiàng)的色譜固定相純化多肽或其前體，以及b)分離所述多肽或其前體而給出所得的多肽產(chǎn)品。
41.通過(guò)一種方法生產(chǎn)的多肽產(chǎn)品，所述方法中應(yīng)用了權(quán)利要求36～39任一項(xiàng)的色譜固定相。
42.用來(lái)實(shí)施權(quán)利要求1～33任一項(xiàng)的方法的自動(dòng)化色譜處理設(shè)備，它包括管道和控制系統(tǒng)。
43.通過(guò)一種方法制備的藥物組合物，所述方法包括下列步驟a)首先應(yīng)用通過(guò)權(quán)利要求1～33任一項(xiàng)的方法再生的色譜固定相純化多肽或其前體，b)然后干燥所述多肽，以及c)最后與藥物上可接受的賦形劑摻和。
44.通過(guò)一種方法制備的藥物組合物，所述方法包括下列步驟a)首先應(yīng)用通過(guò)權(quán)利要求1的方法再生的色譜固定相純化多肽或其前體，b)然后干燥所述多肽，以及c)最后與藥物上可接受的賦形劑摻和。
45.通過(guò)一種方法制備的藥物組合物，所述方法包括下列步驟a)首先應(yīng)用通過(guò)權(quán)利要求11的方法再生的色譜固定相純化多肽或其前體，b)然后干燥所述多肽，以及c)最后與藥物上可接受的賦形劑摻和。
全文摘要
再生色譜固定相的方法。
文檔編號(hào)B01D15/08GK1771080SQ200480009293
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月8日
發(fā)明者P·拉森, O·舒, E·S·拉斯穆森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司