專利名稱：模板捕獲與歸一化亞微升反應(yīng)的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及準備和進行小規(guī)模反應(yīng)的方法和裝置，特別是使用核酸模板的小規(guī)模循環(huán)反應(yīng)與等溫反應(yīng)。
背景技術(shù)：
由聯(lián)邦政府提供資金支持的人類基因組計劃的最初目的是在2005年以前按十倍覆蓋度完成人基因組序列。由于步伐有戲劇性加快，最近已經(jīng)提出了部分草稿。
不過，在人類基因組計劃完成之后，對迅速、廉價的DNA測序的需求將戲劇性地增長而不是減少。
例如，非人類生物基因組的測序逐漸受到關(guān)注，包括細菌、植物和動物。更重要的是，急速增長的分子病理學(xué)與藥物基因組學(xué)(pharmacogenomics)領(lǐng)域?qū)⑿枰獙€別患者進行多基因測序。分子病理學(xué)涉及通過鑒別特定基因的突變診斷人類疾病，經(jīng)常是一種預(yù)后制劑。藥物基因組學(xué)涉及了解存在于所有人群中的等位差異如何影響個體對藥物的治療反應(yīng)和對副作用的敏感性。隨著對個別患者基因測序的需求的增長，對測序能力的要求也將如此。需求將從僅存在于得到充裕資金支持的學(xué)術(shù)研究中心與基因組公司中的大型、集中式、高通量的DNA測序設(shè)施轉(zhuǎn)移為能夠安裝在多數(shù)醫(yī)院與診所的小型、不太復(fù)雜、中等通量的基因測序系統(tǒng)。市場上對這種測序技術(shù)的轉(zhuǎn)移將鼓勵減少試劑成本并且使樣本加工步驟盡可能簡單與連貫。
在二十世紀七十年代后期，Sanger等人開發(fā)了用于DNA序列分析的酶鏈終止方法，該方法生產(chǎn)DNA片段的嵌套集合，它們在遍及序列各處的每個核苷酸上具有普通的起始點和隨機的終止點。LloydSmith、Lee Hood和其他人修正了Sanger的方法，在測序反應(yīng)中使用四種熒光標(biāo)記物，能夠進行單譜帶分離。這導(dǎo)致第一代自動DNA測序儀的誕生，它們使用聚丙烯酰胺平板凝膠進行分離。最近，熒光能量-轉(zhuǎn)移染劑已經(jīng)用于制備染劑組合，它們使信號增強2至10倍，并且簡化光學(xué)構(gòu)造。
自動熒光毛細管陣列電泳(CAE)DNA測序儀似乎是代替平板凝膠的一致性技術(shù)。毛細管凝膠電泳加速測序產(chǎn)物的分離，具有戲劇性減少樣本體積需要的潛力。96通道式毛細管電泳儀MegaBACETM在商業(yè)上可從Molecular Dynamics(Sunnyvale，CA)獲得，采用激光誘導(dǎo)熒光(LIF)聚焦熒光掃描儀，在90分鐘內(nèi)每支毛細管檢測平均約625個堿基，循環(huán)時間為兩小時。聚焦空間濾波導(dǎo)致信噪比更高，因為在用光電倍增管(PMT)進行信號檢測之前消除了來自周圍材料的多余反射和熒光。因此，每條測序譜帶可以獲得亞原子摩爾(subattomole)水平的敏感度。聚焦成像對采用毛細管電泳的微片分析系統(tǒng)來說也是特別重要的，其中玻璃或塑料微片的背景熒光可以大大高于熔融石英毛細管的。毛細管陣列電泳系統(tǒng)將滿足基因組學(xué)界最初對DNA分析的很多通量需求。不過，這種小體積樣本制備方法仍然顯著妨礙了提高通量和降低成本。
盡管熒光DNA測序儀提高了DNA序列獲取的通量，不過它們也把通量的瓶頸從序列獲取轉(zhuǎn)移回到樣本制備上。響應(yīng)于此，已經(jīng)開發(fā)了用于制備測序模板和轉(zhuǎn)座子促進的DNA測序的快速方法，同磁珠捕獲方法一樣取消了離心。已經(jīng)篩選了嗜熱性Archae DNA聚合酶，并進行了遺傳工程加工，以提高逼真度，確保高溫下的穩(wěn)定性，延長長度，改變對二脫氧核苷酸和熒光類似物的親合性。這些改進已經(jīng)降低試劑成本，簡化樣本制備，提高數(shù)據(jù)精度，增加可讀長度。
測序?qū)W界還已經(jīng)開發(fā)了更高通量的方法，用于制備DNA模板、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)和DNA測序反應(yīng)。利用96與384孔微量滴定板、多通道移液器和實驗室機器人工作站，樣本制備已經(jīng)逐漸多樣化和自動化。一般來說，這些工作站模擬技術(shù)人員所進行的操作，具有最小的工作體積，約一微升，即使獨立式多通道移液器用于操作更小體積也是如此。
關(guān)于在毛細管系統(tǒng)上進行DNA鳥槍式測序的典型原尺寸樣本制備方法開始于溶解噬菌體噬斑或細菌集落，以分離亞克隆的DNA。在有些情況下，可能需要PCR擴增亞克隆的DNA插入片段，使其在樣本中的濃度呈指數(shù)增加。接著，加入外切核酸酶I(ExoI)和北極蝦堿性磷酸酶(SAP)，進行酶清除反應(yīng)，以除去干擾循環(huán)測序的引物和過量dNTP。ExoI用于降解單鏈引物為dNMP，但不消化雙鏈產(chǎn)物。SAP轉(zhuǎn)化dNTP為dNP，將dNTP濃度從用于PCR反應(yīng)的200μM減少至用于熒光測序的小于0.1μM。反應(yīng)是在37℃下進行的，然后加熱至65℃，不可逆地使ExoI和SAP變性。
因為PCR擴增能夠生產(chǎn)過量的循環(huán)測序用模板DNA，所以可以在循環(huán)測序之前將ExoI/SAP處理過的PCR樣本稀釋五倍。這減少污染物的濃度至導(dǎo)致較少干擾毛細管電泳分析的范圍內(nèi)。加入循環(huán)測序試劑，通常為具有熒光標(biāo)記染劑的引物或終止子，使反應(yīng)進行熱循環(huán)，驅(qū)動所標(biāo)記片段的線性擴增。最后，循環(huán)后，對樣本進行后期加工，通常為乙醇沉淀或旋轉(zhuǎn)過濾，重新懸浮在甲酰胺、另一種變性劑或水中，將樣本電動注射至毛細管電泳系統(tǒng)中。
這種工作流程導(dǎo)致MegaBACETM系統(tǒng)性能的戲劇性提高，相似的工作流程目前似乎也是選擇其他毛細管電泳系統(tǒng)的方法。采用來自人基因組隨機亞克隆體或表達序列標(biāo)記(EST)的單一噬斑與集落的真實樣本，這種以線性聚丙烯酰胺為分離基質(zhì)的工作流程已將200個堿基對以上的樣本的成功率從約60％提高至85-90％，已將平均可讀長度從約400提高至大于600個堿基。此外，還已證實這種方法是相當(dāng)穩(wěn)健的。
盡管上述樣本制備方法已經(jīng)大大增加了通量，不過試劑成本仍占測序成本的大部分。毛細管電泳僅需要亞原子摩爾的樣本，但是目前樣本是按皮摩爾范圍制備的。減少反應(yīng)體積將因此降低DNA測序成本，仍可提供足夠的分析材料。不過，反應(yīng)體積的實質(zhì)性減少僅在這樣的情形中才能實現(xiàn)，即能夠開發(fā)令人滿意的方法，用于操作樣本和試劑并使它們反應(yīng)。理想的是，這樣一種方法將是自動化的，一次生產(chǎn)多份樣本。而且，這樣一種方法整合為一種模塊將是可取的，能夠與另外的組分銜接，例如毛細管電泳與檢測器，用于分離和分析。
已經(jīng)設(shè)計了若干種裝置，以幫助實現(xiàn)樣本制備的自動化。例如，美國專利No.5,720,923描述了這樣一種系統(tǒng)，其中小循環(huán)反應(yīng)發(fā)生在直徑小至1mm的試管內(nèi)。隨后使試管受到由熱傳導(dǎo)部件所產(chǎn)生的熱循環(huán)，以進行所需反應(yīng)。在單一試管內(nèi)可以加工多份樣本，即抽取少量樣本，各自被不與樣本混合的液體分離在試管內(nèi)。借助泵使流體沿試管移動。這些特征結(jié)合在這樣一種系統(tǒng)中，它自動地清潔試管，移動含有帶樣本小孔的樣本托盤，使試管與樣本托盤中的小孔接觸。
美國專利No.5,785,926公開了用于傳送少量樣本的系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中，至少一支毛細管用于傳送少量樣本。與計算機控制馬達連接的精確線性傳動裝置充當(dāng)氣壓活塞，用試管等分和分散液體。用光傳感器監(jiān)測樣本量，它檢測毛細管節(jié)段內(nèi)液體的存在。系統(tǒng)包括含有待沉積液體的流體站和用于定位傳送毛細管的定位裝置。
美國專利No.5,897,842公開了利用熱循環(huán)自動化樣本制備的系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中，將反應(yīng)混合物用泵注入毛細管。試管的一端用來自聯(lián)合泵的壓力密封，另一端用壓在試管上的阻擋層密封。泵也起到在試管內(nèi)移動流體的作用。一旦兩端被密封，使試管受到熱循環(huán)。在這種系統(tǒng)中，機器人轉(zhuǎn)移裝置移動樣本制備站和熱循環(huán)站之間的試管，在樣本制備站中泵將反應(yīng)混合物組分加載到試管中。
在上面所討論的系統(tǒng)中，有必要首先將樣本、例如測序用DNA模板與試劑混合在一起，然后將混合物引入反應(yīng)室內(nèi)。這種中間混合步驟不可避免地需要額外的試劑與樣本加工步驟，導(dǎo)致浪費。例如，如果獨立的微量吸移管用于將樣本和試劑分散在混合室內(nèi)，少量樣本和試劑將殘留在各吸移管內(nèi)，反應(yīng)混合物將殘留在混合室內(nèi)。在高通量的系統(tǒng)中，這種浪費和提供新的或適當(dāng)清潔的吸移管與混合室的成本迅速增長。對分散含有低濃度反應(yīng)組分的相對大體積液體的需求經(jīng)常加劇浪費的程度，這種需求是補償分散小體積高濃度液體的不精確性的策略。通常，在形成反應(yīng)混合物之后，僅有少部分是分析所需的，其余棄去。
因而，存在對這樣一種手段的需求，借助該手段，能夠向反應(yīng)室內(nèi)引入所要分析的生物樣本，無需首先將樣本與進行反應(yīng)所必要的試劑混合。
美國專利No.5,846,727公開了親合性捕獲方法，其中模板DNA被固定在玻璃毛細管內(nèi)部，該試管充當(dāng)熱循環(huán)用反應(yīng)室。首先準備毛細管，將生物素分子固定在毛細管的內(nèi)表面，然后用與生物素緊密結(jié)合的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白裝柱。所要測序的模板DNA通過PCR與生物素部分共價連接，然后暴露于毛細管內(nèi)部的抗生物素蛋白。這導(dǎo)致模板通過生物素-抗生物素蛋白-生物素鍵而固定在毛細管壁上。洗去未結(jié)合的模板后，加入測序試劑，使毛細管內(nèi)容物受到熱循環(huán)，激活測序反應(yīng)。如此說來，沒有必要在加載毛細管之前混合模板DNA與測序試劑。
不過，剛剛描述過的方法需要生物素通過PCR與模板DNA連接，迫使甚至在測序反應(yīng)之前建立和進行反應(yīng)。這種必要的預(yù)備步驟增加了與獲取序列數(shù)據(jù)有關(guān)的時間和成本。此外，DNA的固定實際上是不可逆的，因為生物素-抗生物素蛋白鍵是如此之強，只有使抗生物素蛋白變性的試劑才能斷裂它，這種處理也將使反應(yīng)中的所有其他蛋白質(zhì)組分變性。其結(jié)果是，模板DNA必須保持與毛細管內(nèi)表面結(jié)合。因為DNA在溶液中不是游離的，反應(yīng)組分擴散至內(nèi)壁需要額外的時間，在那里它們才能與DNA相互作用。此外，當(dāng)需要回收毛細管時，有必要經(jīng)由抗生物素蛋白的變性除去模板DNA，洗滌，然后重新在毛細管內(nèi)裝入抗生物素蛋白，所有這些增加了時間和試劑成本。
因而，本領(lǐng)域繼續(xù)存在對這類方法的需求，即向反應(yīng)室內(nèi)引入分子，無需最初的樣本-試劑混合步驟，無需將親合性捕獲部分附加于樣本中的所有分子，其中的模板固定是可逆的。按這種方法，試劑成本將最小化，加工速度將最大化。
毛細管陣列電泳系統(tǒng)和毛細管電泳微片分析系統(tǒng)能夠檢測亞原子摩爾的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物。與平板凝膠相比，這種異乎尋常的敏感性是以忍受在測序反應(yīng)中與模板DNA理想值的偏差為代價的。例如，如果測序反應(yīng)中的模板DNA過少，那么熒光標(biāo)記的引物延長產(chǎn)物收率過差。這導(dǎo)致用激光掃描反應(yīng)產(chǎn)物時的信號強度減弱。這妨礙了分析來自適當(dāng)進行的光譜分離的色譜的軟件應(yīng)用，導(dǎo)致比平均序列可讀長度更短；將不得不重復(fù)反應(yīng)或者將丟失序列信息。
由于毛細管過載，過多的模板DNA還導(dǎo)致太多的問題。盡管熒光標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物有適當(dāng)收率，不過如果模板過量，它在電動注射期間與測序產(chǎn)物競爭進入毛細管。大型模板DNA分子的存在能夠?qū)е旅毠茈娏鞯恼w減少或突然下降，這可以有多種表現(xiàn)方式。過載能夠?qū)е滦盘枏姸葴p弱，色譜中可譯熒光強度峰出現(xiàn)晚，反應(yīng)產(chǎn)物的分辨率差，這是因為熒光發(fā)射是寬泛和擴散的。所有這些影響引起可讀長度縮短，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量下降。
過載的問題通常這樣解決，稀釋測序反應(yīng)物，或者小心地滴定向測序反應(yīng)中引入的模板DNA量。盡管這兩種解決方案在原理上都是簡單的，不過前者需要重復(fù)進行反應(yīng)分析，后者在高通量系統(tǒng)中利用常規(guī)手段難以實現(xiàn)。這些手段包括檢測與樣本中DNA結(jié)合的熒光染劑數(shù)量并與標(biāo)準濃度曲線比較，或者測量在260nm波長下的紫外光吸收度，它能夠轉(zhuǎn)化為DNA濃度的絕對量度。因而，本領(lǐng)域繼續(xù)存在對這類方法的需求，即滴定利用高通量毛細管電泳系統(tǒng)分析的測序反應(yīng)用模板DNA的數(shù)量，其中最小化成本和最大化速度是決定性的。
另外存在對這樣一種自動化系統(tǒng)的需求，它能夠以高平行方式進行小規(guī)模熱循環(huán)反應(yīng)。該系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)允許循環(huán)反應(yīng)的快速準備，試劑的消耗最小。減少反應(yīng)所需試劑的量與減少反應(yīng)所需時間結(jié)合，將大大減少循環(huán)反應(yīng)準備的整體成本。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供新穎的用于向反應(yīng)室內(nèi)引入少量核酸的方法，例如待測序的模板DNA，該方法不必預(yù)先混合核酸與試劑生成反應(yīng)混合物。
本發(fā)明的進一步目的是提供可用于向反應(yīng)室內(nèi)引入少量核酸的方法，該方法無需使用與核酸或反應(yīng)室連接的親合性捕獲部分。
本發(fā)明的進一步目的是提供向反應(yīng)室內(nèi)引入少量核酸的方法，該方法無需使核酸與反應(yīng)室壁不可逆地結(jié)合。
本發(fā)明的另一個目的是提供可用于得到預(yù)定近似量的反應(yīng)用核酸的方法，例如待測序的模板DNA，該方法無需測定從中抽取DNA的溶液中的核酸濃度。本發(fā)明的特定目的是提供滴定用于測序反應(yīng)的模板DNA量的方法，所述反應(yīng)是利用高通量毛細管陣列電泳系統(tǒng)進行分析的，其中最小化成本和最大化速度是決定性的。
本發(fā)明的進一步目的是提供一種自動化系統(tǒng)，它能夠以非常平行的方式進行小規(guī)模熱循環(huán)反應(yīng)。
按照本發(fā)明，提供了一種方法，按照該方法，直接而可逆地將預(yù)定和可再現(xiàn)量的核酸從具有廣泛核酸濃度差異的溶液中捕獲到反應(yīng)室表面上，在那里直接進行亞微升反應(yīng)，或者計量洗脫至第二室內(nèi)備用。按照發(fā)明的其他方面，提供了可用于進行本發(fā)明方法的裝置和系統(tǒng)。
本發(fā)明在部分程度上基于核酸與某些材料表面的可飽和而可逆結(jié)合的新用途。這種可再現(xiàn)、可飽和而可逆的結(jié)合用于控制向隨后的反應(yīng)釋放核酸模板的質(zhì)量，無需先行測定從中捕獲核酸的溶液中的核酸濃度。在特定的實施方式中，毛細管的內(nèi)表面用于進行核酸捕獲，允許核酸模板被直接捕獲在室內(nèi)，在那里進行隨后的反應(yīng)。
因而，在第一方面，本發(fā)明提供向酶反應(yīng)引入預(yù)定大約質(zhì)量的核酸的方法，包含從過量的核酸中將預(yù)定大約質(zhì)量的核酸飽和地直接捕獲到進行所述酶反應(yīng)的室的內(nèi)表面上，然后除去過量核酸。
本發(fā)明的方法特別可用于亞微升的DNA測序反應(yīng)。因而，在另一方面，本發(fā)明提供進行DNA測序反應(yīng)的方法，包含直接在底物上固定模板DNA，然后使模板DNA與進行DNA測序反應(yīng)的反應(yīng)混合物接觸。在有關(guān)方面中，本發(fā)明進一步提供用上述方法進行的DNA測序反應(yīng)的產(chǎn)物，和得自DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物的DNA序列。
在另一方面，本發(fā)明提供在溶液中檢驗?zāi)０錎NA序列的方法，其中該溶液已經(jīng)或者需要接觸作為空間可尋址陣列一部分的第一種底物，該方法包含直接在第二種底物上固定模板DNA，其中所述模板DNA是這樣被固定的使第二種底物與模板DNA的溶液接觸足以使DNA變?yōu)楣潭ɑ臅r間，然后使所述模板DNA與進行所述DNA測序反應(yīng)的反應(yīng)混合物接觸，其中要與所述第一種和第二種底物接觸的模板DNA溶液的組成是本質(zhì)上相同的。
本發(fā)明進一步提供有利地采用本發(fā)明的毛細管類實施方式進行高通量反應(yīng)的系統(tǒng)。在這方面發(fā)明的一種實施方式中，該系統(tǒng)使用一種毛細管盒，它包含一些平行排列的毛細管節(jié)段。試管節(jié)段延伸穿過底物，一般是按均勻間距定位的。毛細管盒既可以用于計量試劑，也可以作為進行反應(yīng)的反應(yīng)室。
本發(fā)明的系統(tǒng)可用于準備測序反應(yīng)，不過也可以用于非常平行地準備細胞溶解、質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、滾環(huán)擴增反應(yīng)、為發(fā)現(xiàn)藥物或化合物活性篩選化合物文庫、蛋白質(zhì)消化/測序、ELISA、放射免疫測定和其他化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)或測定。
附圖的簡要說明鑒于下列詳細說明并結(jié)合附圖，本發(fā)明的上述與其他目的和優(yōu)點將顯而易見，其中近似的特征始終指近似的部分，其中

圖1是用于制備循環(huán)測序反應(yīng)產(chǎn)物的完整系統(tǒng)略圖，該系統(tǒng)能夠有利地利用本發(fā)明的方法；圖2是闡述循環(huán)反應(yīng)生產(chǎn)步驟的流程圖，利用本發(fā)明的方法能夠有利地改進第一步；圖3A是用在本發(fā)明高通量實施方式中的毛細管盒的透視圖；圖3B是圖3A毛細管盒的透視圖，插在本發(fā)明方法的高通量系統(tǒng)中的毛細管盒夾持器內(nèi)；圖3C是能夠有利地利用本發(fā)明方法的撓性毛細管盒；圖3D闡述圖3C的毛細管盒，它彎成曲形，以便毛細管末端是曲形；圖3E是含有通道的微片裝置，功能上等價于根據(jù)本發(fā)明的毛細管，用于樣本準備，包括核酸的直接、可逆固定；圖4A闡述用于本發(fā)明的分配頭，用于從圖3毛細管盒中分配液體；
圖4B顯示圖4A排氣分配頭的內(nèi)部橫截面；圖4C顯示分配頭封閉的圖4A分配頭；圖5A闡述能夠用于從圖3A毛細管盒中分配流體的離心機頂視圖；圖5B闡述夾持擺動式微量反應(yīng)板桶的圖5A轉(zhuǎn)子臂的橫斷面，其中含有插在微量滴定板內(nèi)的毛細管盒；圖6顯示基于空氣的熱循環(huán)裝置略圖，其中圖3B所示毛細管盒和夾持器插在溫度循環(huán)裝置內(nèi)，用于進行平行反應(yīng)，該反應(yīng)能夠有利地利用本發(fā)明的模板捕獲和歸一化方法；圖7A顯示具有完整毛細管盒密封膜的基于空氣的熱循環(huán)器內(nèi)部橫斷面，它能夠有利地為本發(fā)明的模板捕獲方法所利用；圖7B顯示圖7A的基于空氣的熱循環(huán)器的透視細節(jié)，蓋子升起以闡述有毛細管盒插入其中的室；圖7C顯示盒室的橫斷面，其中毛細管盒插在圖7A熱循環(huán)器的內(nèi)室內(nèi)；圖8A是可用于本發(fā)明方法的高通量性能的毛細管盒洗滌站正視圖；圖8B是圖8A毛細管盒洗滌站的側(cè)視圖，洗滌歧管下降，洗滌罐上升；圖8C是圖8A與8B毛細管洗滌站的進一步視圖，洗滌歧管上升，洗滌罐下降；圖8D是洗滌歧管的內(nèi)橫斷面；圖8E是洗滌站的管道設(shè)備略圖；圖8F是洗滌罐的頂部透視圖；圖9顯示關(guān)于實施例1測序分析的成功百分比對可讀長度窗的直方圖；圖10是實施例2反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖；圖11顯示關(guān)于實施例3測序分析的成功百分比對可讀長度窗的直方圖；圖12A顯示按全體積制備的電泳分離PCR產(chǎn)物的掃描凝膠圖象；
圖12B顯示按納規(guī)模(nanoscale)體積(500nL)制備的電泳分離PCR產(chǎn)物的掃描凝膠圖象；圖13是測序混合物分析的電泳圖，該混合物是這樣制備的，按500nL體積進行PCR，按全體積進行清除反應(yīng)，然后按500nL進行循環(huán)測序反應(yīng)；圖14是關(guān)于產(chǎn)物的等溫反應(yīng)信號強度對比圖，這些產(chǎn)物是在試管、毛細管和利用表面結(jié)合的毛細管內(nèi)制備的；圖15是解釋準備毛細管的工藝的流程圖，其中可逆地直接地固定核酸；圖16闡述本發(fā)明方法的一個實施方式；圖17A顯示在測序之前測序PCR產(chǎn)物與反應(yīng)混合物混合的結(jié)果；圖17B顯示首先混合PCR模板與硫氰酸鈉、在毛細管內(nèi)表面上結(jié)合DNA、用80％乙醇洗滌DNA、然后測序的結(jié)果；圖18代表按照模板捕獲原始記錄的保留的DNA質(zhì)量；圖19顯示可讀長度對起始DNA質(zhì)量的圖，比較通過預(yù)混合DNA與測序試劑所制備的樣本(▲)和通過模板捕獲所制備的樣本(●)；圖20顯示所述起始量(○)M13mp18的模板結(jié)合、1.5％瓊脂糖凝膠電泳、SYBR綠染劑染色和Fluorimager儀成像之后的PCR反應(yīng)產(chǎn)物；圖21代表增加模板濃度所得相對信號強度；圖22代表增加模板濃度所得相對信號強度，顯示峰高度隨著模板濃度增加而增加；圖23A和23B顯示具有甘油儲備液的納規(guī)模直接循環(huán)測序所得561堿基的Phred 20得分的痕跡；圖24是來自四個納規(guī)模單一堿基延長反應(yīng)的MegaBACETM痕跡，沒有模板捕獲，證明痕跡2的雜合性。
發(fā)明的詳細說明為了可以充分理解本文所述發(fā)明，陳述下列詳細說明。
本發(fā)明在部分程度上基于核酸被某些材料可飽和而可逆結(jié)合的新用途，以控制向隨后的反應(yīng)釋放核酸模板的質(zhì)量，無需先行測定從中捕獲核酸的溶液中的核酸濃度。在特定的實施方式中，毛細管的內(nèi)表面用于進行核酸捕獲，允許核酸模板被直接捕獲在室內(nèi)，在那里進行隨后的反應(yīng)。
本發(fā)明的優(yōu)點本文所述發(fā)明特別涉及用于進行DNA測序反應(yīng)的用途，尤其在采用毛細管電泳的高通量樣本加工系統(tǒng)中，本發(fā)明的方法和裝置特別有利于此。不過，技術(shù)人員將清楚、下文也將詳細描述的是，本發(fā)明可以用在進行多種類型生物化學(xué)與化學(xué)反應(yīng)的過程中，這些反應(yīng)使用DNA以及RNA作為底物。
正如下文所詳細公開的，本發(fā)明提供用于直接在反應(yīng)室、例如玻璃毛細管或其功能等價物的內(nèi)表面上可逆固定核酸的方法。固定和其他加工步驟之后，核酸容易為化學(xué)、生物化學(xué)或酶反應(yīng)所利用，這些反應(yīng)是在毛細管內(nèi)部進行的?；蛘?，可以從毛細管中洗脫和排出核酸，目的是分配控制量的核酸備用。
為了利用非常靈敏的毛細管電泳系統(tǒng)成功地分析DNA測序反應(yīng)，例如MegaBACETM系統(tǒng)(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)，重要的是在反應(yīng)中使用一致的預(yù)定量的模板DNA，以便模板的量即不過低也不過高。通過采用具有一致DNA結(jié)合能力的毛細管，有可能“歸一化”所有反應(yīng)中的模板DNA用量，從而確保所有反應(yīng)都是從相似量的模板開始的。盡管歸一化可以按其他方式完成，不過毛細管的使用通過減少為確保一致性所必要的步驟，導(dǎo)致時間有驚人的節(jié)約。
盡管核酸結(jié)合是玻璃表面的固有性質(zhì)，不過人們將領(lǐng)會到，捕獲表面可以經(jīng)過修飾而改變其結(jié)合能力或結(jié)合選擇性。例如，為了捕獲非修飾的DNA，主要結(jié)合力是疏水性力、電荷-電荷(靜電)力和氫鍵。因而，為了捕獲非修飾的DNA，通過在溶液相中的反應(yīng)可以向捕獲表面加入乙烯基，通過CVD可以加入丙胺基，通過已知反應(yīng)可以加入其他胺，優(yōu)選為叔胺，以最大化電荷-電荷相互作用。在其他替代選擇中，可以使oligo d(T)與胺化表面共價連接，增加poly(A)mRNA的捕獲?？梢栽诠璞砻媾c官能團之間加入通式Cn的間隔基團。對每種情況來說，通過改變官能團的濃度，可以改變特征和/或結(jié)合能力。
本發(fā)明的另外一個優(yōu)點是它可用于減少與進行核酸反應(yīng)有關(guān)的加工步驟數(shù)目和進行核酸反應(yīng)所需的核酸與試劑量，尤其在高通量的樣本加工系統(tǒng)中。例如，關(guān)于DNA測序反應(yīng)，有必要在進行激活反應(yīng)的熱循環(huán)之前，使模板DNA與反應(yīng)混合物結(jié)合，該反應(yīng)混合物包含測序引物、DNA聚合酶、二脫氧核苷酸、dNTP、緩沖劑、鹽和水。通常，這涉及如下準備20μl反應(yīng)，在試管內(nèi)等分反應(yīng)混合物，然后加入200ng模板DNA。通常棄去用于等分DNA的吸移管尖，以避免DNA儲備液的污染。然后進行各組分的混合、熱循環(huán)和分析。
按照本發(fā)明的一個實施方式，向毛細管填充DNA溶液，導(dǎo)致5ng模板可逆固定在毛細管內(nèi)部。若干加工步驟之后，然后向毛細管填充500nl反應(yīng)混合物，這導(dǎo)致模板從試管內(nèi)部洗脫至混合物中。然后密封毛細管，熱循環(huán)，隨后用高靈敏度毛細管電泳系統(tǒng)分析反應(yīng)產(chǎn)物。因為毛細管同時充當(dāng)受毛細作用填充的移液器，和反應(yīng)室，所以不必用專用吸移系統(tǒng)單獨等分模板DNA溶液或反應(yīng)混合物。唯一必要的是提供各自的儲備液，向其中浸入毛細管以填充之。這節(jié)約了加工步驟和材料，例如一次性移液器尖。還節(jié)約了試劑，否則將在加工步驟期間被帶走而不被引入反應(yīng)中。
還將顯而易見的是，在毛細管中進行的測序反應(yīng)可以在僅為1/10至1/40的反應(yīng)體積中完成，因此試劑成本僅為1/10至1/40。
綜上，這些優(yōu)點減少加工、增加速度、減少成本。在高通量樣本加工系統(tǒng)的設(shè)計中，毛細管或其功能等價物可以平行排列，其方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，以增加能夠同時加工的反應(yīng)的數(shù)目。采用本文所述發(fā)明各種實施方式所享有的益處與所加工的樣本數(shù)成比例增加。
核酸在反應(yīng)室內(nèi)的可逆、直接固定圖15是流程圖，圖16是顯示與本發(fā)明實施方式有關(guān)的步驟的略圖，由此核酸被可逆地固定于反應(yīng)室、例如玻璃毛細管的內(nèi)表面。按這種方式準備的反應(yīng)室然后能夠用于與核酸進行測序反應(yīng)，與核酸進行另一種類型的酶反應(yīng)或生物化學(xué)反應(yīng)，或者用于分配預(yù)定量的核酸到底物上，例如微量滴定板的小孔，或者分配到分析儀器中，例如毛細管電泳裝置。
關(guān)于圖15和圖16，在步驟1中從適合的來源制備核酸樣本，然后在步驟2中，在含有離液序列高的離子的溶液81中溶解核酸80。在步驟3中，向反應(yīng)室填充核酸-離液劑溶液，在步驟4中恒溫充分時間，以允許核酸80與反應(yīng)室12內(nèi)表面82可逆結(jié)合。在步驟5中除去核酸-離液劑溶液，然后在步驟6中洗滌、在步驟7中干燥反應(yīng)室。此時反應(yīng)室是可用的。部件12指毛細管，或更廣義的反應(yīng)室，包括毛細管和在功能上與其等價的結(jié)構(gòu)。部件80指DNA，或更廣義的核酸，包括DNA和RNA及其衍生物。
過程開始于從適合的來源獲得核酸，即圖15步驟1。核酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或這些分子的衍生形式。按照本領(lǐng)域熟知的方法(參見《分子生物學(xué)流行協(xié)議》John Wiley & Sons，Inc.，2000，F(xiàn)red M.Ausubel等編，ISBN 0-471-50338-X)，可以從各種活體生物或依賴活體細胞的自我復(fù)制系統(tǒng)分離和純化核酸。細胞可以是真核細胞，包括人類與非人類哺乳動物的細胞、非哺乳動物的動物細胞、植物細胞和真菌細胞。另外，真核細胞可以是自由生活的單細胞生物，例如阿米巴蟲(amoebae)或其他寄生物。細胞也可以是原核細胞，包括細菌和古細菌。核酸也可以從病毒獲得，包括RNA與DNA病毒，和感染動物細胞、植物細胞、真菌細胞和細菌細胞的病毒。核酸也可以是按照本領(lǐng)域熟知的化學(xué)合成方法生產(chǎn)的。
從適當(dāng)來源獲得模板核酸之后，將核酸、即圖16的80再懸浮和/或溶解在含有離液劑的溶液、即圖16的82中，即圖15的步驟2。離液劑的濃度可取地是足夠高的(例如約0.5M至8.0M)，以進行核酸的可逆結(jié)合，但是不至于高到導(dǎo)致核酸或離液劑本身在所有為實施發(fā)明而使溶液受到的條件下從溶液中沉淀出來的程度。
離液劑是這樣一種物質(zhì)，由于該物質(zhì)對水的局部結(jié)構(gòu)具有破壞作用，它影響分子從非水相到水相的分配。離液劑是離液序列高的離子的鹽，非常可溶于水溶液。在水溶液中的濃度足夠高時，由這類鹽所提供的離液序列高的離子導(dǎo)致核酸喪失二級或三級結(jié)構(gòu)，雙鏈核酸熔化(也就是鏈分離)。假設(shè)離液序列高的離子是通過破壞水中存在的氫鍵網(wǎng)絡(luò)而具有這些作用的，導(dǎo)致核酸的變性形式比典型水性環(huán)境中存在的更加有序的結(jié)構(gòu)(例如雙螺旋)是更加熱力學(xué)穩(wěn)定的。
正如前人Vogelstein等《美國國家科學(xué)院院報》76，615-619(1979)和Chen and Thomas《生物化學(xué)年鑒》101，339-341(1980)所述，在足夠高濃度離液序列高的離子(例如約0.5M至約8.0M)的存在下，核酸將可逆地結(jié)合某些物質(zhì)，例如二氧化硅。核酸與二氧化硅結(jié)合的機理可能涉及離液序列高的離子對帶負電二氧化硅表面上的水結(jié)構(gòu)的破壞作用，允許陽離子(例如Na+或K+)介導(dǎo)的鹽橋形成在它與核酸鏈的帶負電磷酸鹽骨架之間。為了進行核酸與二氧化硅的結(jié)合，可以使用單獨的離液劑或者兩種或多種離液劑的混合物。鹽橋不是永久性鍵，當(dāng)該鍵附近的離子濃度降低時可被破壞。如此說來，可以用水或其他適合的低離子強度水性緩沖液將核酸從二氧化硅或類似材料中洗脫。
離液序列高的離子包括胍鎓、碘化物、高氯酸鹽和三氯乙酸鹽。離液序列高的鹽包括高氯酸鈉、高氯酸鉀、溴化鈉、溴化鉀、碘化鈉、碘化鉀、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀、硫氰酸胍、異硫氰酸鈉、異硫氰酸鉀、鹽酸胍、異硫氰酸胍、氯化鋰、三氯乙酸鈉和三氯乙酸鉀。其他具有離液性質(zhì)的物質(zhì)包括二甲基亞砜(DMSO)、脲和四胺鹵化物，包括氯化四乙胺。
在離液劑溶液中溶解核酸之后，將核酸-離液劑溶液、即圖16的83引入到反應(yīng)室、即圖16的12中，即圖15的步驟3。
為了降低用于進行測序反應(yīng)的試劑成本，反應(yīng)室的容量通常將是非常小的，可取地從約1-1000納升(nl)，更可取地從約10-500nl，最可取地從約100-500nl。
在多數(shù)環(huán)境中，反應(yīng)室可以是這樣構(gòu)造的，利用毛細作用被動地引入溶液。毛細作用是這樣一種現(xiàn)象，當(dāng)液體與固體(例如管側(cè))接觸時，引起液體上升，在毛細管、也就是直徑非常小的管子內(nèi)最為明顯。毛細作用取決于由表面張力和管側(cè)濕潤所產(chǎn)生的力。如果液體對(濕潤)固體的粘附力超過液體內(nèi)的內(nèi)聚力(表面張力)，那么液體將沿管子上升，也就是它將上升至流體靜力水平以上?；蛘撸梢韵蚍磻?yīng)室內(nèi)主動引入溶液，例如借助利用正或負大氣壓的泵。
利用毛細作用在反應(yīng)室內(nèi)填充核酸-離液劑溶液是最簡單和最經(jīng)濟的，在這種情況下毛細管充當(dāng)反應(yīng)室。如果毛細管的內(nèi)徑是已知的并且表面橫截面是均勻的，那么管子的容量是容易計算的，與其長度成正比。因而，根據(jù)計算切割所需給定長度的管子，可以得到給定總?cè)萘康拿毠芊磻?yīng)室。不過按照流體動力學(xué)定律，必須加以小心的是溶液的密度不是如此之大，它的表面張力如此之低，管子直徑不夠小，以致溶液柱不能克服重力，從而不能填充管子。
在填充期間，管子一端浸在核酸-離液劑溶液、圖16的83中，溶液的體積通常過量于填充任意管子的總體積。如此說來，管子是在一步之內(nèi)填充的，減少了在入口處形成氣泡的機會。毛細管的另一端必須是開放的，或者能夠允許空氣從正在填充的管子中逃逸。
反應(yīng)室外部接近于高薄壁圓筒的形狀并不是強制性的，毛細管即是如此。對技術(shù)人員來說將顯而易見的是，能夠按各種方式制造毛細管的功能等價物。遍及說明書各處的術(shù)語毛細管應(yīng)當(dāng)被理解為不僅代表普遍稱之為毛細管的結(jié)構(gòu)，而且代表任何在功能上與之等價的結(jié)構(gòu)。例如，可以形成隧道、通道或凹槽，其結(jié)構(gòu)使得能通過毛細作用向其填充流體，或者通過直接施用一定的力，例如正或負壓、或離心力。隧道、通道或凹槽可以通過機械、化學(xué)、熱或其他技術(shù)人員已知的方式而形成。通道或隧道可以通過從基體中除去材料而形成，例如使用鉆尖、激光或化學(xué)浸蝕。
如圖3E所述，底物72、例如任意形狀和尺寸的玻片的表面中的凹槽或通道78可以用鋸切制，或者通過激光燒蝕或化學(xué)浸蝕而形成，產(chǎn)生被稱為屑片或微片70的結(jié)構(gòu)。例如，通過本領(lǐng)域已知的光刻工藝可以形成硅片中的凹槽，利用氫氟酸可以浸蝕成玻片中的凹槽。
如果凹槽或相似的凹溝78是在底物72表面形成的，那么通常有利的將是用蓋子74覆蓋之，以形成封閉的空間。覆蓋凹槽或凹溝78確保了流體相互作用的最大表面積，從而促進毛細作用，最小化污染物接觸反應(yīng)劑的機會，產(chǎn)生一層蒸汽屏障，以確保在反應(yīng)溫度有任何升高的期間，例如在熱循環(huán)期間，反應(yīng)汽化的趨勢被最小化了。
蓋子74的構(gòu)成材料可以等同于或不同于切制凹槽的底物72，可以利用本領(lǐng)域已知的各種方式蓋上蓋子。例如，蓋子74可以用環(huán)氧、氰基丙烯酸酯或其他類型膠水粘在底物上。通過熱或光的施用，熔化蓋子和底層材料直至它們?nèi)诤?，可以焊接蓋子。蓋子74還可以被機械固定在適當(dāng)位置，例如用夾子，或者甚至被磁固定。
構(gòu)成反應(yīng)室的材料有利地是這樣一種材料，在足夠高濃度的離液序列高的離子的存在下，模板DNA或其他核酸可逆地和可飽和地與之結(jié)合。反應(yīng)室經(jīng)常是由玻璃構(gòu)成的，尤其在成型為毛細管時。從各廠商處可以容易得到一定內(nèi)徑范圍的高質(zhì)量玻璃毛細管，包括Polymicro Technologies(Phoenix，Arizona，USA)。
如果由脆性、親水性材料構(gòu)成，象玻璃，那么可能有利的是用一種聚合材料、例如聚酰亞胺涂在毛細管外部。聚酰亞胺涂層提供了保護層，保護毛細管不磨損和不因彎曲而斷裂。聚酰亞胺還在毛細管外表面上形成疏水層，有助于在將毛細管浸入反應(yīng)混合物進行填充時防止水性反應(yīng)混合物的粘著；這有助于防止試劑的浪費。其他潛在的涂層是丙烯酸酯、聚硅氧烷、含氟聚合物和鋁。
可以使用很多類型的玻璃，包括堿-硼硅酸鹽玻璃、氧化鋁-硅酸鹽玻璃、鋇燧石玻璃、鋇-硼酸鹽玻璃、硼硅酸鹽玻璃、包含B2O3的硼酸鹽玻璃、包含GeO2的鍺酸鹽玻璃、硫?qū)俨Ａ?、包含SiO2的硅酸鹽玻璃、石英玻璃、熔融石英玻璃、合成熔融石英玻璃、石英(結(jié)晶性SiO2)、熔融石英(無定形SiO2)、摻雜合成熔融石英(摻雜有痕量元素，例如鍺、氟、硼、磷和鈦)、鑭玻璃、光學(xué)玻璃、磷酸鹽玻璃和鈉鈣玻璃。
或者，反應(yīng)室可以由金屬或非金屬構(gòu)成，這些材料象玻璃一樣，可以形成毛細管或圓片。適合的純金屬和合金金屬包括鎂、鋁、鈦、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、鎵、鋯、鈮、鉬、鈀、金、銀、鈷、鈮、銦、銠、錫、鋼、不銹鋼和青銅。適合的純非金屬和合金非金屬包括硅、鍺、砷和砷化鎵。
反應(yīng)室還可以由碳的多種同素異形體構(gòu)成，包括石墨、金剛石、C60和有關(guān)同素異形體，例如包含納管(nanotube)，或者由有機化合物構(gòu)成，例如塑料。關(guān)于這些材料，可能必要的是以這樣一種方式衍生碳或塑料，這將支持在離液序列高的離子的存在下核酸與塑料的可逆結(jié)合。
在反應(yīng)室、例如玻璃毛細管、即圖16的12填充核酸-離液劑溶液83之后，將溶液在一定條件下保溫一定時間，以便溶液中至少有一部分DNA可逆地與反應(yīng)室或管子內(nèi)表面、即圖16的82結(jié)合，即圖15步驟4。在其他實施方式中，可以進行不可逆結(jié)合。
不希望受到理論約束的是，正如上文所討論的，據(jù)信如果內(nèi)表面是含有SiO2(二氧化硅)的玻璃，那么在足夠高濃度離液序列高的離子的存在下，核酸最有可能經(jīng)由磷酸鹽主鏈與二氧化硅生成鹽橋類型的鍵。通常，允許在約室溫(約24℃)下進行結(jié)合，但是在認為適當(dāng)時可以選擇其他溫度，只要結(jié)合的有效性不受顯著妨礙，并且只要DNA和離液劑都不從溶液中沉淀出來。
在核酸-離液劑溶液中的核酸具有與反應(yīng)室或管子內(nèi)表面82結(jié)合的機會之后，然后除去含有未結(jié)合DNA和離液劑的溶液、即5，將內(nèi)表面用洗滌溶液洗滌、即6，然后通過干燥除去洗滌溶液中的殘留液體痕跡、即7。
通過各種手段從反應(yīng)室內(nèi)除去更大比例的核酸-離液劑溶液，包括施加正或負空氣壓力，或者通過離心以排除溶液。
洗滌除去過量的、未結(jié)合的核酸、離液劑和任意可能污染核酸的雜質(zhì)，以純化所結(jié)合的核酸。重要的是除去離液劑，因為這些離子能夠嚴重干擾大多數(shù)隨后的化學(xué)與生物化學(xué)反應(yīng)，即使在非常低的濃度下也是如此。洗滌可以按各種方式進行。例如，通過毛細作用可以填充毛細管，然后按與除去核酸-離液劑溶液相似的方式排除洗滌溶液?；蛘?，通過泵送洗滌溶液可以填充和排空反應(yīng)室。使用足量洗滌溶液，以從本質(zhì)上消除所有污染物的存在。洗滌后，從反應(yīng)室或管子中除去洗滌溶液。
洗滌溶液的組成是經(jīng)過選擇的，以便它不會通過洗脫而除去任意實質(zhì)性部分的、已經(jīng)開始與反應(yīng)室或管子內(nèi)表面結(jié)合的核酸，通常是一種醇與純水的溶液。適合的醇包括小分子量的醇，即甲醇、乙醇和異丙醇。醇的濃度是足夠高的，以便核酸的洗脫最小化，優(yōu)選為至少50％，更優(yōu)選為至少60％，最優(yōu)選為至少70％體積/體積。通常，乙醇的使用濃度大于約70％-80％體積/體積。
洗滌溶液還可以包含一種鹽，優(yōu)選為緩沖液的形式，例如乙酸鹽緩沖液或tris-EDTA緩沖液(例如含有10mM Tris-HCl和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0)。鹽可以具有緩沖pH的作用，以便pH在約6.5-8.5的范圍內(nèi)，還具有使DNA與反應(yīng)室或管子內(nèi)表面之間的結(jié)合作用在洗滌期間穩(wěn)定的作用。
經(jīng)?？扇〉氖峭ㄟ^干燥從殘留在反應(yīng)室或毛細管內(nèi)的任意小體積洗滌溶液中除去本質(zhì)上所有液體痕跡。盡管液體的有些低濃度組分、例如乙醇不趨于顯著干擾隨后的生物化學(xué)反應(yīng)，不過更高的濃度可能有干擾。干燥可以這樣進行，使反應(yīng)室或管子受到足夠高真空的作用，以便液體汽化而被帶走?；蛘?，可以在壓力下迫使干燥空氣、例如空氣、氮或氬穿過反應(yīng)室或管子，以促進液體的蒸發(fā)?？梢约訙馗稍餁怏w，以進一步促進蒸發(fā)。
干燥后，反應(yīng)室現(xiàn)在攜帶被可逆固定的核酸，可以立即用于進行與核酸的生物化學(xué)反應(yīng)，或者貯存在適當(dāng)條件下備用。按照上文討論的步驟所準備的反應(yīng)室能夠有利地用于歸一化用在平行反應(yīng)中的核酸的量，分配預(yù)定量的DNA或RNA到底物上，進行納規(guī)模DNA測序反應(yīng)以及很多其他類型的與DNA和RNA的反應(yīng)。不過，正如將為技術(shù)人員所清楚的，這些特定應(yīng)用不應(yīng)被視為限制這類反應(yīng)室的用途范圍。
本發(fā)明在自動化系統(tǒng)中的用途毛細管形式的反應(yīng)室可以如圖15所述進行加工和單一使用，但是經(jīng)常有利的將是按平行方式聯(lián)合多個毛細管，以便能夠增加樣本通量，特別是在自動化系統(tǒng)中。為此，適宜將毛細管組織為毛細管盒；每只毛細管盒的毛細管密度越大，潛在的樣本通量越大。例如未決美國申請No.09/577,199所述儀器可以用于自動化圖1所述加工步驟，以及任何隨后的與進行與固定化核酸的反應(yīng)有關(guān)的步驟，包括毛細管填充、排空、洗滌、干燥和/或熱循環(huán)。以這種方式使用，毛細管盒變?yōu)樽詣踊?、固定體積的平行移液器，允許通過毛細作用同時從樣本平板小孔向所有毛細管填充。
毛細管盒15如圖3A所示。毛細管盒由延伸整個底物10的大量毛細管構(gòu)成。優(yōu)選的是毛細管盒具有至少一行八支毛細管，并且毛細管的間距相等。所示毛細管盒具有底物10，96支毛細管排列成8×12，管子的間距與96孔微量滴定板的小孔間距相匹配。
毛細管12延伸整個底物10，優(yōu)選地是均勻排列的。毛細管是等長的，并且按基本上平行的取向延伸整個底物，以便毛細管12的相對兩端各自是共面的，并且由毛細管12末端所限定的平面是基本上平行于底物10的。毛細管的間距可以是均勻的和經(jīng)過選擇的，以匹配微量平板上小孔的中心-到-中心間距。例如在標(biāo)準的96孔微量平板上，毛細管將按9mm的中心到中心間距排列，在384孔微量平板上，毛細管12將按4.5mm的中心到中心間距排列。與1536孔微量平板或甚至更高孔密度的平板相容的、更高密度的毛細管格式也應(yīng)當(dāng)是可能的。毛細管12優(yōu)選地被固定在底物內(nèi)，以便從底物10一側(cè)延伸的毛細管12長度短于底物10對側(cè)上的毛細管長度。在底物短端上的毛細管12長度可以與微量平板中的小孔深度相匹配，以便短端的長度短于微量平板中的小孔深度。這種特征使毛細管盒能夠被插到微量平板中，以便底物10靠在多孔平板的頂口上，底物一側(cè)上的毛細管可以延伸到多孔平板中，但不觸及底部。例如，在96孔微量平板中，毛細管可以被這樣布置在底物上，以便從底物延伸的毛細管短端可以被插到微量平板的小孔中，但是毛細管不觸及小孔底部。這確保了分配在小孔內(nèi)的液體避開毛細管，以防止重新進入毛細管。
毛細管盒底物10可以由玻璃纖維板或其他剛性或半柔韌性材料制成。毛細管12可以被插入底物中的等距小洞內(nèi)，用粘合劑固定。在一種實施方式中，底物的長度和寬度類似于標(biāo)準96孔微量滴定板的長度和寬度。這對使為操作微量滴定板而設(shè)計的自動化系統(tǒng)適用于毛細管盒進行了簡化。
用在生物化學(xué)反應(yīng)中的核酸量的精確控制和歸一化在試圖與核酸進行生物化學(xué)反應(yīng)時，精確知道核酸的輸入量對反應(yīng)的成功來說經(jīng)常是決定性的。這允許實驗者正確計算其他反應(yīng)組分、例如酶的適當(dāng)比例。例如，正如背景一節(jié)所討論的，如果在用毛細管電泳系統(tǒng)分析的測序反應(yīng)中使用過多的模板DNA，經(jīng)常導(dǎo)致測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量差。通過測量260nm下的吸光度，或者測量相對標(biāo)準曲線的染劑結(jié)合量，儲備樣本中的核酸濃度是相對容易測定的。不過，這兩種方法都用掉一部分樣本，都不容易在高通量樣本加工系統(tǒng)中實現(xiàn)。所幸本發(fā)明可用于精確控制用于各種應(yīng)用的核酸量。
如果在反應(yīng)室內(nèi)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)期間，核酸-離液劑溶液允許與反應(yīng)室或管子內(nèi)表面保持接觸足夠時間，并且如果核酸在溶液中的濃度是足夠高的，那么有可能用核酸飽和反應(yīng)室或毛細管內(nèi)表面上可利用的結(jié)合位置。這被稱為可飽和的結(jié)合。只要溶液中的核酸量在恒溫之前超過反應(yīng)室內(nèi)表面的結(jié)合能力，確定的、最大量的核酸將被固定，而與最初溶液中的核酸量無關(guān)。如此說來，如果溶液中的核酸濃度超過最小值，那么沒有必要知道實際濃度；所結(jié)合的核酸量將僅由反應(yīng)室的結(jié)合能力決定。因此，如果被可飽和地結(jié)合的毛細管內(nèi)的核酸被洗脫到已知體積的液體中，那么該液體中的核酸濃度和量是可知的，并且精度高。
因而，基于毛細管或其他反應(yīng)室構(gòu)造的結(jié)合能力，有可能使用本發(fā)明來獲得、或測量出精確已知的、少的、一致量的核酸。例如，如果需要用10ng核酸進行反應(yīng)，那么僅需獲得核酸結(jié)合能力共計10ng的毛細管或其他反應(yīng)室。然后，向毛細管填充核酸-離液劑溶液，其中的核酸和離液劑的濃度都是足夠高的，以支持在合理時間內(nèi)的可飽和結(jié)合。恒溫后，完成排空、洗滌和干燥步驟，實驗者確信毛細管含有10ng核酸，核酸可以洗脫分配，或者保留在毛細管內(nèi)備用。
通常，結(jié)合能力、或可與內(nèi)表面可飽和結(jié)合的核酸量是憑經(jīng)驗測定的。例如，按照本領(lǐng)域已知的方法，將已知量的供試核酸用放射性核素標(biāo)記，例如35S、33P或32P。標(biāo)記后，測定被標(biāo)記核酸的比活性，以確立每質(zhì)量單位或濃度單位核酸、每分鐘的蛻變比例。然后將被標(biāo)記核酸按預(yù)定濃度溶于含有離液序列高的離子的溶液。然后試驗標(biāo)準的反應(yīng)室，它是普遍供應(yīng)品的代表。例如，切割預(yù)定長度的玻璃毛細管，填充被標(biāo)記核酸-離液劑溶液。經(jīng)過足夠時間以發(fā)生可飽和結(jié)合后，排空毛細管，洗滌。然后，測量保留在管子內(nèi)部的放射性量，借助標(biāo)記比活性的知識轉(zhuǎn)化為核酸的量。這種因子然后能夠用于計算保留在從相同批次切割的任意長度毛細管內(nèi)的核酸量，只要在所有隨后的實驗中使用相似的結(jié)合條件即可。
使用本發(fā)明精確獲得預(yù)定量核酸的優(yōu)點是歸一化隨后使用的核酸量。如果有必要加工很多樣本，這種優(yōu)點尤為顯著。例如，在本領(lǐng)域的目前狀態(tài)下，在制備用于測序的不同模板DNA時，確保模板的濃度相等是不現(xiàn)實的。因而，按照現(xiàn)有方法，有必要歸一化不同的模板DNA樣本，即單獨測定每份制備物中的DNA濃度，每份和每個樣本都要稀釋DNA至適當(dāng)濃度。這對毛細管電泳來說尤為重要，因為該技術(shù)對毛細管被模板DNA過載是敏感的。對模板DNA歸一化的需要增加了大量時間和成本，以利用這種系統(tǒng)獲得高質(zhì)量DNA序列數(shù)據(jù)，或者需要研究者接受失敗率增加。
不過，本發(fā)明允許非常迅速的歸一化，以最小化起始模板濃度上的差異。為了歸一化不同模板至預(yù)定濃度，僅需提供功能上等價的毛細管(每種模板一支)和模板DNA-離液劑溶液，前者具有已知的可飽和DNA結(jié)合能力，后者具有足夠高的DNA與離子濃度，以便毛細管內(nèi)的所有DNA結(jié)合位置都在合理的時間階段內(nèi)被占據(jù)。排空和洗滌后，所有毛細管將含有大約相等數(shù)量的模板DNA，因而是歸一化的。
正如將為技術(shù)人員所顯而易見的是，如果不需要飽和反應(yīng)室內(nèi)部所有可能的核酸結(jié)合位置，那么有可能控制被可逆結(jié)合的核酸量。這是可能的，因為結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)取決于大量變量，包括核酸濃度、平均核酸分子大小、溶液pH、離液序列高的離子濃度、反應(yīng)室內(nèi)表面上可利用的結(jié)合位置數(shù)和溫度。因而，根據(jù)經(jīng)驗分析，技術(shù)人員有可能確立結(jié)合條件，導(dǎo)致預(yù)定量核酸的一致的、可預(yù)期的、可逆的結(jié)合，不會飽和反應(yīng)室內(nèi)部所有可利用的核酸結(jié)合位置。
關(guān)于毛細管電泳的DNA測序本發(fā)明的優(yōu)點有益地用于進行DNA測序反應(yīng)，特別是用高靈敏性毛細管電泳系統(tǒng)進行分析，例如MegaBACETM。為了使用本發(fā)明進行DNA測序，模板DNA必須被固定在毛細管或其功能等價物內(nèi)。模板DNA是組成堿基序列有待測定的DNA。模板DNA可以是單鏈的或雙鏈的，其中兩條互補性DNA鏈是雜合在一起的，按照沃森-克里克堿基對互補性規(guī)則，一條鏈序列的知識可以用于推斷另一條鏈中的堿基序列。
模板DNA通常是直接從自我復(fù)制的遺傳系統(tǒng)獲得的，在宿主內(nèi)生長的，向該宿主內(nèi)克隆有待測序的DNA片段。或者，通過利用聚合酶鏈反應(yīng)或功能等價的線性或指數(shù)性擴增過程擴增特定的DNA序列，可以從任意來源獲得模板。
自我復(fù)制的遺傳系統(tǒng)包括附加型元件，例如含有復(fù)制起點的質(zhì)?；蚴删w(例如λ或M13)，二者分別在轉(zhuǎn)化或感染之后都能夠在細菌內(nèi)部復(fù)制，例如大腸桿菌。隱匿模板DNA的質(zhì)粒是這樣獲得的，打開已經(jīng)復(fù)制到足夠高副本數(shù)的細菌，從上清液分離質(zhì)粒。收集在溶解宿主細菌之后釋放到細菌培養(yǎng)上清液內(nèi)的噬菌體，通過打開噬菌體粒子分離DNA。還有可能在哺乳動物細胞內(nèi)生長含有哺乳動物復(fù)制起點的附加型物質(zhì)，然后按照Hirt法分離DNA。
由于質(zhì)?；蚱渌郊有虳NA的分子質(zhì)量與基因組DNA相比有實質(zhì)性差異，使用毛細管作為反應(yīng)室提供了一種方便的方法，通過這種方法，當(dāng)二者都在溶解細菌或其他類型細胞之后釋放時，迅速從污染性基因組DNA純化質(zhì)粒DNA。簡言之，將質(zhì)粒與基因組DNA的混合物結(jié)合在離液序列高的離子溶液中。將需要向其中固定質(zhì)粒的毛細管浸在該溶液中。質(zhì)粒由于質(zhì)量小，隨著填充容易通過毛細管內(nèi)徑，從而與玻璃壁發(fā)生相互作用，建立鹽橋而固定下來。相反，基因組DNA由于分子質(zhì)量極大，排除在毛細管小內(nèi)徑之外，因而通過尺寸排阻與質(zhì)粒分離。
如上所述，無需克隆步驟也能夠得到模板DNA，即直接從適當(dāng)?shù)膩碓磾U增DNA片段，例如病毒，原核細胞、包括細菌，或真核細胞、包括哺乳動物、其他動物或植物。
在模板DNA、即圖16的80直接被可逆固定于玻璃毛細管12內(nèi)表面82之后，按照本發(fā)明的方法，向毛細管填充測序反應(yīng)混合物84，進行DNA測序反應(yīng)。該反應(yīng)是按照本領(lǐng)域熟知的工藝進行的，由此DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物被熒光染劑所標(biāo)記。本領(lǐng)域既定的是Sanger二脫氧核苷酸鏈終止工藝。簡言之，允許與模板DNA分子序列互補的引物與模板雜交。然后通過讀取模板堿基序列，DNA聚合酶延長引物，即向成長中的引物3’末端加入dNTP。不過，缺乏相應(yīng)dNTP的羥基特征的二脫氧核苷酸三磷酸防止向成長中的鏈進一步加入堿基。結(jié)果是鏈終止了。鏈終止后的色譜圖允許實驗者推斷模板中的堿基序列。將終止后的反應(yīng)產(chǎn)物用熒光標(biāo)記，即使熒光團與被延長的引物綴合，或者使熒光團與所有二脫氧終止子綴合，當(dāng)摻入在成長中的DNA鏈中時，導(dǎo)致引物延長的終止。
近些年來使用與能量傳遞染劑偶聯(lián)的熒光團系統(tǒng)，由光受體染劑和熒光發(fā)射染劑構(gòu)成，該系統(tǒng)的使用提高了激光掃描測序系統(tǒng)的性能。每種二脫氧終止子都是用兩種染劑標(biāo)記的。這些染劑之一熒光素吸收由測序儀激光產(chǎn)生的入射激光中的光能，經(jīng)由無輻射能量傳遞方式轉(zhuǎn)移所收集的能量至受體染劑。四種鏈終止子ddG、ddA、ddT和ddC各自具有與熒光素供體偶聯(lián)的不同受體染劑。受體染劑、例如若丹明110、若丹明-6-G、四甲基若丹明和若丹明X然后發(fā)射特征波長的光。用鑒別哪種核苷酸導(dǎo)致終止事件的儀器檢測熒光。能量傳遞系統(tǒng)的使用導(dǎo)致受體染劑的激發(fā)比直接被激光激發(fā)更有效，導(dǎo)致靈敏度更高。作為熒光標(biāo)記二脫氧終止子的替代選擇，標(biāo)記測序引物也是可能的。如果使用這種系統(tǒng)，通過與引物綴合供體染劑和受體染劑，還可以使用能量傳遞染劑。與引物綴合的供體染劑實例是5-羧基熒光素(FAM)，與引物綴合的受體染劑實例，關(guān)于胞嘧啶是若丹明110，關(guān)于腺嘌呤是6-羧基若丹明(REG)，關(guān)于鳥嘌呤是N，N，N’，N’-四甲基-5-羧基若丹明(TAMRA)，關(guān)于胸腺嘧啶是5-羧基-X-若丹明(ROX)。與能量傳遞染劑偶聯(lián)的熒光團系統(tǒng)更詳細地公開在美國專利Nos.5,688,648、5,707,804、5,728,528、5,853,992、5,869,255和6,028,190中，所有它們都全文引用在此作為參考文獻。
浸入充滿反應(yīng)混合物的貯器85，通過毛細作用填充含有固定化模板DNA 80的毛細管、即圖16的12。反應(yīng)混合物84含有適當(dāng)濃度的進行測序反應(yīng)的全部組分，包括水、鹽、緩沖劑、引物、DNA聚合酶、dNTP和二脫氧終止子。不希望受到理論約束的是，目前假設(shè)隨著水性混合物沿毛細管上升，固定了的DNA很可能再水合。此外，因為混合物中的鹽離子強度是相對較低的，導(dǎo)致DNA固定的鹽橋被水分子破壞，DNA從毛細管內(nèi)表面上洗脫，擴散到反應(yīng)混合物中?；蛘?另外，DNA在熱循環(huán)反應(yīng)期間解吸。無論哪種機理，DNA與混合物的物理混合對反應(yīng)的進行來說都不是必要的。
一旦毛細管被填充，將末端密封，以防止內(nèi)含液體的汽化，然后進行熱循環(huán)，以活化測序反應(yīng)的多輪，目的是生成熒光標(biāo)記產(chǎn)物供分析之用。毛細管的密封和熱循環(huán)可以按多種方式進行，這對技術(shù)人員來說將是顯而易見的。常見的情況是，如果需要平行進行多個測序反應(yīng)，實驗者可以使用高通量儀器，例如公開在美國未決申請No.09/577,199中，全文引用在此作為參考文獻。所公開的儀器提供了密封排列為毛細管盒格式的多支毛細管和進行毛細管內(nèi)含測序反應(yīng)混合物的熱循環(huán)的手段。
測序反應(yīng)完成后，從毛細管中排出反應(yīng)產(chǎn)物，通常準備進行毛細管電泳分析。
通常，將反應(yīng)產(chǎn)物排出到底物上，或者排出到某種形式的液體容器內(nèi)，例如微量滴定皿的孔，毛細管電泳系統(tǒng)從中可以采集產(chǎn)物樣本進行分析。不過，技術(shù)人員將承認，有可能直接從反應(yīng)毛細管中排出反應(yīng)產(chǎn)物到電泳毛細管內(nèi)。從反應(yīng)毛細管中排出反應(yīng)產(chǎn)物可以通過施加離心力、用電動方式、通過施加正或負氣壓或者通過本領(lǐng)域已知的其他手段。
此外，可以將反應(yīng)產(chǎn)物排出到適合于其他類型分析方法的底物上，例如MALDI(矩陣輔助式激光解吸作用/電離作用)或SELDI(表面增強型激光解吸作用/電離作用)底物，用于質(zhì)譜分析。
在熒光標(biāo)記的測序反應(yīng)產(chǎn)物的電泳期間，激光掃描攜帶產(chǎn)物的毛細管中的窗口，激發(fā)熒光團。捕獲熒光團所發(fā)射的光，轉(zhuǎn)化為強度和光頻率數(shù)據(jù)，儲存在計算機存儲器中。完成掃描和讀數(shù)后，計算機匯編代表所有被掃描系統(tǒng)檢出的反應(yīng)產(chǎn)物的色譜圖。用解譯色譜圖的計算機軟件處理色譜圖中的數(shù)據(jù)，推斷起始模板DNA中的核苷酸堿基序列。然后將序列輸出儲存在計算機數(shù)據(jù)文件中，既可以在隨機訪問存儲器中，也可以在專用長期存儲設(shè)備上，例如軟盤、ZIP磁盤、JAZ磁盤、硬盤、CD-ROM、計算機磁帶等。為了方便數(shù)據(jù)終端用戶，含有序列數(shù)據(jù)的計算機文件可以儲存在計算機服務(wù)器上，可以被遠程客戶計算機訪問。當(dāng)文件被傳遞時，它表現(xiàn)為與載波有關(guān)的數(shù)據(jù)信號，通過銅或光纖電話線路、有線電視線路或通過無線電波傳送。
一旦被排空，回收毛細管，用于新核酸樣本的固定，例如有待測序的DNA模板。管子的回收需要洗滌除去前面反應(yīng)的有害痕跡，包括反應(yīng)產(chǎn)物、反應(yīng)混合物組分和被固定的核酸。
通常，洗滌溶液是低離子強度的水性洗滌溶液，以便任何殘留的被固定的核酸都將趨于洗脫和帶走。重蒸餾水是有效的。洗滌溶液可以加熱，以增加洗滌的有效性，每一洗滌周期的洗滌次數(shù)和/或洗滌溶液體積可以酌情改變，以最大化洗滌有效性?？梢酝ㄟ^毛細作用向毛細管填充洗滌溶液，然后利用與排出反應(yīng)產(chǎn)物相同的方法排空。如果洗滌是通過電動泵進行的，那么洗滌溶液必須含有某種最小濃度的離子?；蛘撸梢允褂脵C械泵驅(qū)動洗滌溶液穿過毛細管。
洗滌還可以通過機械毛細管盒洗滌器來完成，這公開在2000年5月23日提交的共同擁有、未決美國專利申請No.09/577,199中，全文引用在此作為參考文獻。
設(shè)計用來洗滌排列在毛細管盒內(nèi)的多支毛細管的毛細管洗滌裝置的設(shè)計公開在美國未決申請No.09/577,199中，全文引用在此作為參考文獻。
水洗滌之后，利用通常包含高濃度乙醇的醇洗滌液除去大多數(shù)水和其他洗滌溶液組分的痕跡。然后典型的是通過向毛細管中通入干熱空氣進行干燥，然后即可貯存或再利用。
對有些應(yīng)用來說，重要的是在毛細管內(nèi)基本上沒有從前面的反應(yīng)殘留核酸。一種實例是PCR，由此舊的殘留模板DNA可能被指數(shù)擴增，引起新反應(yīng)的污染。在這類情況下，回收過程可以包含有效破壞核酸痕跡的步驟。這類手段包括向毛細管填充含有外切核酸酶的溶液，保溫為消化所有核酸所必需的時間。其他手段包括核酸的化學(xué)降解，例如用強酸性或堿性溶液洗滌；與漂白劑接觸；用電離輻射照射毛細管；或者高溫烘烤。破壞殘留的核酸之后，通常用標(biāo)準溶液洗滌毛細管。
將證實用毛細管盒進行平行處理有用的一種但決不是唯一的應(yīng)用是DNA、經(jīng)常是PCR產(chǎn)物序列的確認，用于高通量從頭測序，例如用于發(fā)現(xiàn)單一核苷酸多態(tài)性(SNP)。關(guān)于SNP的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法和儀器使“深度”測序成為可能，其中對大量個體的相同基因或遺傳基因座進行測序，序列差異可鑒別存在于測序種群中的多態(tài)性。其中，有些SNP將被證明與顯著表型有關(guān)，例如疾病的素因、存在或進展?jié)摿Α?br> 將證實用毛細管盒進行平行處理有用的另一種應(yīng)用是DNA、經(jīng)常是PCR產(chǎn)物序列的確認，打算在底物上點樣形成微陣列(microarray)。這類微陣列在基礎(chǔ)與應(yīng)用研究中的用途正在增加，通常由玻片上的DNA斑點矩形陣列構(gòu)成，每個斑點具有不同的已知的DNA序列。實驗者然后取一種被標(biāo)記樣本、即RNA或DNA，檢測被標(biāo)記核酸與點于陣列中的DNA之間的雜交事件。如此說來，實驗者能夠推斷被標(biāo)記核酸的同一性和/或部分或完整序列。
為了確保利用微陣列所生成的數(shù)據(jù)的完整性，有必要可靠知道斑點DNA序列的同一性。重排和其他樣本操作程序引入格式錯誤，必須檢出。此外，PCR經(jīng)常用于生成所要點樣的DNA。正如本領(lǐng)域所熟知的，隨著它擴增模板，Taq和其他熱穩(wěn)定性聚合酶在每一千對中引入一定數(shù)量錯誤的堿基對。如果已經(jīng)引入錯誤，必須檢出它們，并且棄去已擴增的產(chǎn)物。通常，這需要大量加工步驟，區(qū)分于與PCR產(chǎn)物點樣有關(guān)的那些。不過，本發(fā)明一個實施方式的使用大大增加序列測定和確認的效率。
通常將所要點樣的DNA樣本按預(yù)定濃度溶于包含離液序列高的離子的溶液，例如硫氰酸鈉。溶解DNA是因為它要固定在微陣列玻片表面上的方式類似于在毛細管內(nèi)部固定核酸。通常，將不同的DNA-離液劑溶液等分在384孔容量微量滴定皿的小孔內(nèi)，貯存以備向微陣列上點樣。在點樣之前，與自動點樣系統(tǒng)有關(guān)的機器人拾起微量滴定皿，置于一定位置，由此點樣針或筆能夠一次浸入多個小孔內(nèi)，通常為12個。
本發(fā)明能夠適合于在同一384孔皿的多個小孔內(nèi)對DNA進行取樣和測序，用作點樣筆的DNA來源。顯然，還能夠適合于從超過384個小孔的皿中取樣。因為所要測序的DNA來自所要點樣的同一樣本，所以避免了大量與來自不同樣本的DNA測序有關(guān)的加工步驟。這導(dǎo)致時間和原料成本有實質(zhì)性節(jié)約。按照本發(fā)明的這種實施方式，將玻璃毛細管排列成毛細管盒，模式和毛細管內(nèi)尺寸與皿的一行/列或多行/列小孔相同。關(guān)于最大容量，將總計384支毛細管按等同于皿本身的模式和尺寸排列。在點樣之前，按照本發(fā)明的方法向毛細管盒填充DNA-離液劑溶液(通常為硫氰酸鈉)。在固定和加工DNA樣本之后，對它們進行測序。如果任意模板不能給出正確的序列，點樣儀器的操作者知道不點樣該DNA，或者如果點樣的話，也知道與相應(yīng)斑點處雜交有關(guān)的數(shù)據(jù)是關(guān)于所不需要的序列的，應(yīng)當(dāng)從所得數(shù)據(jù)組中除去。
與可逆固定核酸的生物化學(xué)反應(yīng)的替代選擇本發(fā)明反應(yīng)混合物組配可以用于多種類型反應(yīng)的組配。用于組配PCR反應(yīng)混合物的同一基本方法可以適合于組配循環(huán)測序混合物、滾環(huán)擴增反應(yīng)混合物、酶測定、化學(xué)反應(yīng)或其他反應(yīng)混合物。
分配預(yù)定量的核酸正如易為顯而易見的是，實驗者不必進行與固定在毛細管內(nèi)部的核酸的反應(yīng)。出于各種原因，可以優(yōu)選的是將被固定的核酸從毛細管內(nèi)表面洗脫，在不同的反應(yīng)室內(nèi)與之進行反應(yīng)或者在毛細管外按某種其他方式加工核酸。在這類情形中，有可能使用毛細管作為移液器來分配預(yù)定近似質(zhì)量的核酸在由實驗者所選擇的底物上的固定體積液體中，因此得到預(yù)定近似濃度。為此，向毛細管填充洗脫液，洗脫本質(zhì)上所有可逆固定的核酸。此后分配洗脫液與核酸的溶液，通常在底物上或內(nèi)。向其上轉(zhuǎn)移反應(yīng)混合物的底物可以是多孔微量滴定板的小孔、平面底物的特定區(qū)域或?qū)敕治鲂酒男】住７磻?yīng)物還可以被分配在溶液內(nèi)，供進一步的化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)。
如上所述，如果多支毛細管排列成毛細管盒，該毛細管盒成為多通道的平行移液器，并且有可能同時分配大量歸一化的核酸樣本?？梢苑峙湓谖⒘康味?、微芯片和其他反應(yīng)室內(nèi)，供進一步的反應(yīng)。另外，核酸可以被直接分配在毛細管陣列電泳微芯片的貯器內(nèi)，或MALDI或SELDI靶上，或適合用在其他分析方式中的底物上或內(nèi)。
不同方法可以用于從毛細管排出或分配液體。正如將為技術(shù)人員所領(lǐng)會的是，這些方法不僅能夠用于分配被洗脫的核酸溶液，而且能夠用于從被填充的毛細管除去液體，而與目的無關(guān)，例如在反應(yīng)后除去反應(yīng)產(chǎn)物，或者除去洗滌溶液。
分配單一毛細管或排列成毛細管盒格式的多支相似毛細管中的內(nèi)容物的一種方法利用離心機通過離心力分配流體。離心力均勻作用于毛細管盒內(nèi)的所有毛細管，以便毛細管獨立地分配它們的內(nèi)容物到位于排出流體的毛細管口下方的底物上。如果底物是微量滴定皿的小孔，被分配的液體將被離心力拖至小孔底部。關(guān)于離心機和有關(guān)轉(zhuǎn)子與盛放毛細管盒的桶的設(shè)計公開在美國未決申請No.09/577,199中，全文引用在此作為參考文獻。
分配毛細管內(nèi)含液體的第二種方法是通過利用排氣裝置。關(guān)于設(shè)計用來分配排列成毛細管盒的多支毛細管的液體內(nèi)容物的排氣裝置的設(shè)計公開在美國未決申請No.09/577,199中，全文引用在此作為參考文獻。
或者，毛細管內(nèi)容物可以被直接分配到小孔、或分析裝置(圖3E的70)的樣本港口(圖3E的76)內(nèi)，例如電泳芯片。如圖3E所示，分析芯片將具有分析泳道78的陣列，可與它們各自的樣本入口或港口76流通。多支毛細管可以排列成毛細管盒格式，以便毛細管間距與芯片中的樣本入口76間距相匹配。例如，16支毛細管按2×8平行排列的毛細管盒可以進入分析芯片的16個小孔。
作為實例，圖3C所述毛細管盒包括延伸穿過撓性條11的毛細管12。撓性條11可以單獨或者與其他這類條結(jié)合使用。本質(zhì)上呈直線的毛細管可以通過彎曲撓性條11形成弧形而改變其取向。圖3D闡述撓性條11彎曲后允許毛細管12配合按環(huán)狀模式布置在底物上的輸入港口。如果使用適當(dāng)?shù)碾姌O陣列或其他分配方法，毛細管12中的液體然后可以被電動注射或其他方式從毛細管12分配到分析芯片70的港口76中。通過把撓性條11壓在曲形物上例如曲形金屬塊上，可以使撓性條11固定成曲形取向。這可以借助結(jié)合在自動樣本制備系統(tǒng)中的自動條移動器進行。
毛細管盒可以通過排氣或其他分配手段而被分配，優(yōu)選地選擇分配手段以最小化飛濺和氣泡形成。在分配制備好的反應(yīng)混合物到小孔76進行分析之前，可以向每個分析微芯片小孔76中加入少量稀釋液。當(dāng)分配毛細管盒時，稀釋液將稀釋樣本孔76中的樣本。在毛細管盒中制備的亞微升體積反應(yīng)混合物、例如DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物混合物能夠容易地與分析芯片整合，用于測序或其他分析方法。
洗脫液優(yōu)選為低離子強度的水溶液，更優(yōu)選為水或低離子強度緩沖液，pH通常在6.5與8.5之間，大約在該pH下核酸材料是穩(wěn)定的和基本上完整的。1X濃度的TE緩沖液(10mM Tris-HCl、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0)和蒸餾水或去離子水是特別優(yōu)選用于本發(fā)明的洗脫溶液。上述的洗脫溶液優(yōu)選形式的低離子強度將趨于破壞在核酸與包含毛細管內(nèi)表面的材料之間所建立起來的鹽橋，確保核酸被洗脫到溶液中。其他適用于本發(fā)明的洗脫溶液將是易為本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的。
按照本發(fā)明的方法，與玻璃毛細管內(nèi)表面結(jié)合的核酸是可飽和的。在適當(dāng)?shù)臈l件下，有可能高度精確地控制固定在任意特定毛細管內(nèi)部的核酸量。因而，如果核酸被洗脫到水溶液中并分配，能夠知道溶液中的核酸濃度，以及任意特定體積該溶液中的核酸總量。例如，如果毛細管的結(jié)合能力是10ng DNA，并且被洗脫到500n1洗脫液中，那么溶液的濃度是0.02克/升，摩爾濃度則取決于DNA分子的分子質(zhì)量。如果分配全部500nl，那么液滴含有10ng DNA。
正如將為技術(shù)人員所理解的是，由于不同毛細管之間的微小差異，可被固定和洗脫的核酸量在兩支毛細管之間、甚至在同一管子的反復(fù)使用之間都不是恒等的，盡管是非常一致的。出于這個原因，洗脫到洗脫液中的核酸的預(yù)定量或質(zhì)量是近似的量或質(zhì)量。優(yōu)選地，在本文中，預(yù)定的近似質(zhì)量應(yīng)當(dāng)表示在相似的毛細管之間、或者在同一毛細管的反復(fù)使用之間，所有其他條件是相同的，預(yù)期被固定或分配的質(zhì)量與實際被固定或分配的質(zhì)量之間的誤差不大于10％，更優(yōu)選為5％，更優(yōu)選為2％，最優(yōu)選地不超過1％誤差。
通常，本發(fā)明的分配功能將通過在特定毛細管內(nèi)固定飽和量核酸并分配全部體積而得以利用。因而，為了控制所分配的核酸量與濃度，實驗者將選擇具有預(yù)定結(jié)合能力和體積的毛細管。不過，正如上文所討論的，實驗者可以憑經(jīng)驗確定使預(yù)定不飽和量的被固定核酸結(jié)合的條件。因此，利用這些條件，可以固定不飽和預(yù)定量的核酸，然后從毛細管洗脫，允許實驗者隨意分配任意給定量的核酸。
在毛細管已經(jīng)可逆結(jié)合預(yù)定量的不飽和或飽和核酸這兩種情形下，如果實驗者利用為技術(shù)人員所熟悉的方法控制從毛細管排出的核酸-洗脫液的量，那么關(guān)于該體積的知識允許分配精確量的核酸。例如，可以通過機械泵送或電動泵送排出控制量的流體。
下列實施例闡述本發(fā)明方法的用途，是能夠用所公開方法進行的很多不同類型生物化學(xué)或酶反應(yīng)的代表。這些反應(yīng)包括1)染劑-引物DNA測序，2)染劑-終止子DNA測序，3)PCR擴增，4)PCR擴增、酶純化和DNA測序，和5)一般的酶反應(yīng)。下列實施例僅供例證，決非限制。
實施例1用毛細管電泳分析的染劑-引物DNA測序在由96支未涂覆的2.8cm長、150μm I.D.、360μm O.D.熔融二氧化硅毛細管組成的毛細管盒內(nèi)進行染劑-引物測序反應(yīng)。染劑-引物測序反應(yīng)是這樣進行的，用發(fā)射特異性引物擴增模板DNA，相當(dāng)于ddT、ddA、ddC和ddG終止的反應(yīng)。模板的擴增是在每支毛細管內(nèi)以單一反應(yīng)方式進行的，然后匯集到公共的小孔內(nèi)，用于反應(yīng)后的加工和分析。
顏色-特異性引物是基于M13-40 FWD引物(5’-FAM-GTTTTCCCAGT*CACGACG-3’)的，以5-羧基熒光素(FAM)作為供體染劑，以與所示胸腺嘧啶(T*)連接的終止-特異性氟作為受體染劑。如下標(biāo)記胸腺嘧啶ddC-終止反應(yīng)用FAM(C-FAM)，ddA反應(yīng)用6-羧基若丹明(A-REG)，ddG反應(yīng)用N，N，N’，N’-四甲基-5-羧基若丹明(G-TMR)，ddT反應(yīng)用5-羧基-X-若丹明(T-ROX)。100次染劑-引物測序反應(yīng)用總混合物是這樣制備的，混合65μL反應(yīng)緩沖液(220mMTris-HCl，pH9.5，33.2mM MgCl2)、100μL染劑-引物溶液(1μM T-ROX，1μM G-TMR，0.5μM A-REG或0.5μM C-FAM)、100μL相應(yīng)的脫氧與二脫氧核苷酸混合物(0.94mM dATP，dCTP，dTTP，7-去氮雜-dGTP，與3.1μM二脫氧核苷酸)、10μL酶(32單位/μL ThermoSequenase)和225μL濾過去離子水。將該溶液等分在96孔試劑平板中，然后與模板DNA混合。一般的混合流程需要使用兩組毛細管盒和384孔“混合板”。將第一組毛細管盒(轉(zhuǎn)移毛細管盒)浸入模板DNA溶液(20ng/μLM13mp18)，然后倒置在384孔“混合板”頂部上，使毛細管的短端插入小孔。將倒置的轉(zhuǎn)移毛細管盒和混合板放入臺頂離心機內(nèi)。加入平衡板，以平衡轉(zhuǎn)子，在3,000xg下離心5秒鐘。離心作用均勻分配轉(zhuǎn)移毛細管盒內(nèi)容物到384孔平板的個別小孔內(nèi)。離心步驟后，將轉(zhuǎn)移毛細管盒轉(zhuǎn)移到毛細管盒洗滌器410中清洗，混合板用于隨后的離心步驟，以加入試劑。
為了加入試劑，將第二組毛細管盒(反應(yīng)毛細管盒)浸入含有測序試劑(如前段所述制備)的小孔，倒置在相同384孔平板的相同小孔上。將反應(yīng)毛細管盒和混合板放入離心機，在3,000xg下自旋5秒鐘，從離心機中取出。此時每孔含有500nL模板DNA和500nL測序試劑，形成最終的反應(yīng)混合物。然后將第二組毛細管盒(用于加入試劑)浸入混合板中的1μL混合物，向反應(yīng)毛細管盒的毛細管填充500nL。
將毛細管盒插入基于空氣的熱循環(huán)器內(nèi)室，如本文圖7A-C所述，在那里是這樣密封毛細管節(jié)段末端的，將毛細管末端壓在可變形膜264a和264b上。95℃2秒、55℃2秒和72℃60秒的30次循環(huán)后，打開熱循環(huán)器，取出毛細管末端，脫離與可變形膜的接觸。取出毛細管盒，放置在96孔“匯集板”頂部，使毛細管短端插入小孔。將毛細管盒和混合板放入離心機，加入平衡板。反應(yīng)產(chǎn)物被離心力(～2500xg)分配到含有40μL80％異丙醇的微量滴定板中。最初的反應(yīng)后，如本文所述洗滌毛細管。在四組獨立的毛細管盒中進行四次染劑-引物反應(yīng)，并且將四組反應(yīng)產(chǎn)物匯集到96孔匯集微量滴定板小孔中之后，隨后將樣本在3000xg下離心30分鐘。小心地倒置自旋以潷去醇，將樣本再次懸浮在5μL ddH2O中，用于電動注射，和用MegaBACETM毛細管陣列電泳進行分析。
用MegaBACETM進行DNA測序片段的分析，這是一種96支毛細管陣列電泳儀器(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)，使用掃描聚焦激光誘導(dǎo)的熒光檢測。在62cm長、75μm I.D.、200μm O.D.熔融二氧化硅毛細管中進行分離，工作分離距離為40cm。通過乙烯基與毛細管表面的格利雅偶聯(lián)和丙烯酰胺聚合減少電滲流。向毛細管填充3％線性聚丙烯酰胺的新鮮溶液(MegaBACETMLong Read Matrix，Amersham LifeSciences，Piscataway，NJ)，在高壓作用下泵送穿過毛細管，從陽極室到達陰極室96孔緩沖板的各孔內(nèi)。每孔填充100μL Tris-TAPS運行緩沖液(30mM Tris，100mM TAPS，1mM EDTA，pH 8.0)。平衡基質(zhì)達20分鐘，然后在180V/cm下預(yù)電泳5分鐘。在樣本注射之前，陰極毛細管末端和電極用重蒸餾水(ddH2O)沖洗，以除去殘留的LPA，然后進行樣本注射。
按照指定條件，從96孔微量滴定板以恒定電壓電動注射DNA測序樣本；關(guān)于500nL樣本的一種優(yōu)選注射條件是在2kV電壓下注射40秒。注射后，毛細管末端用水沖洗，將緩沖板放置在陰極室內(nèi)，開始進行電泳。分離通常在8kV下進行120分鐘。利用LabBench軟件(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)進行計算機控制的儀器自動化和數(shù)據(jù)收集。具體注射和運行條件因所要分析的反應(yīng)混合物而異。
所述亞微升染劑-引物循環(huán)測序方法的可再現(xiàn)性如圖9所示。該直方圖顯示不同可讀長度箱中的樣本百分率，顯示該方法的可再現(xiàn)性高。所測序的DNA插入片段有80％以上具有600個堿基以上的可讀長度。總之，這種96份樣本板得到55,000個高質(zhì)量“Phred 20”堿基，平均可讀長度為605個堿基。
實施例2用毛細管電泳微芯片分析的染劑-引物DNA測序在另一種分析實例中，在相同毛細管盒內(nèi)進行的染劑-引物反應(yīng)是這樣分析的，直接注射到16通道微型構(gòu)造的“基于芯片的”分析儀內(nèi)，詳細描述參見S.Liu，H.Ren，Q.Gao，D.J.Roach，R.T.LoderJr.，T.M.Armstrong，Q.Mao，I.Blaga，D.L.Barker和S.B.Jovanovich《美國國家科學(xué)院院報》5-00。16通道芯片是這樣構(gòu)成的，粘合兩層玻璃圓片，頂層圓片具有50um深100um寬的通道，用標(biāo)準微型構(gòu)造法浸蝕而成。浸蝕模式是兩個8通道組的組合，各自共用一個陽極貯器。十六個陰極貯器按4.5mm等距排成一線，十六個樣本貯器和十六個廢液貯器也是如此。鉆孔穿過頂層浸蝕圓片，形成這些貯器。來自連接主分離通道的樣本貯器和廢液貯器的通道支管構(gòu)成十六只250μm長的雙T注射器。在檢測區(qū)中相鄰?fù)ǖ乐g的距離(中心到中心)是600μm。兩個對準孔用于對準芯片與檢測器。
本例中，如上所述進行被ddT終止的染劑-引物反應(yīng)，分配到含有1.5μL ddH2O的微芯片的樣本孔內(nèi)。分別向廢液與陰極貯器施加50與10伏特電壓進行樣本注射，通常達60秒，同時研磨樣本與陽極貯器。在樣本注射之后，立即向陽極貯器施加2,000伏特電壓，向樣本與廢液貯器施加140伏特電壓，進行分離，同時研磨陰極貯器。相應(yīng)的分離場強度約為227V/cm。收集激光誘導(dǎo)的熒光，使之?dāng)?shù)字化，加工成電泳圖，如圖10所示。電泳圖示范在所述毛細管盒系統(tǒng)中進行的反應(yīng)的微芯片分析。
實施例3染劑-終止子循環(huán)測序與醇沉淀純化在毛細管陣列電泳之前使用毛細管盒系統(tǒng)和醇沉淀進行凈化，示范染劑-終止子循環(huán)測序。本例中，測序反應(yīng)混合物是這樣制備的，混合400μL測序試劑(動態(tài)ET終止子試劑盒，Amersham PharmaciaBiotech，Part 81600)與100μL 5pmol/μL M13-28 FWD引物(5’-TGT AAAACG ACG GCC AGT-3’)。向96孔“試劑”板分布5μL等分試樣的反應(yīng)混合物。按與實施例1所述相同的步驟系列進行模板DNA與測序試劑的混合，轉(zhuǎn)移毛細管盒用于轉(zhuǎn)移500nL DNA樣本，反應(yīng)毛細管盒用于轉(zhuǎn)移500nL測序試劑從試劑板到混合板小孔。然后向該同一反應(yīng)毛細管盒通過毛細作用填充模板/試劑混合物。
將毛細管盒轉(zhuǎn)移到基于空氣的熱循環(huán)器內(nèi)，在熱循環(huán)器內(nèi)的可變形膜之間密封毛細管。用95℃ 2秒、55℃ 2秒和60℃ 60秒的30次循環(huán)實現(xiàn)熱循環(huán)。熱循環(huán)之后，從循環(huán)室取出毛細管盒，用離心力(3000xg)分配毛細管內(nèi)容物到含有40μL 80％乙醇的96孔平板中。將樣本在3000xg下離心30分鐘。小心地倒置自旋以潷去醇，將樣本再次懸浮在5μL ddH2O中，用于電動注射，和用MegaBACETM毛細管陣列電泳進行分析。用醇沉淀法凈化染劑-終止子反應(yīng)，該技術(shù)的可再現(xiàn)性和在“真實世界”模板中的應(yīng)用以圖11表示，這是成功百分率對可讀長度的直方圖。圖11示范用M13亞克隆插入片段獲得優(yōu)異的可讀長度和成功率，該片段是從小鼠細菌人工染色體的亞克隆文庫制備的。
實施例4染劑-終止子循環(huán)測序與尺寸排阻純化在另一種實例中，如實施例3所述在500nL毛細管中進行染劑-終止子反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物被離心力分配到15μL ddH2O中。將15μL樣本轉(zhuǎn)移到含有45μL水合Sephadex G-50的濾板。將樣本在910xg下通過Sephadex基質(zhì)離心5分鐘，在清潔的96孔注射板中收集fluent。將樣本電動注射到MegaBACETM內(nèi)，無需進一步脫水或加工。關(guān)于16份樣本，所得平均可讀長度為650個堿基，證明亞微升染劑-終止子測序與尺寸排阻純化的相容性。
實施例5質(zhì)粒插入片段DNA的PCR擴增本項技術(shù)使用所公開的系統(tǒng)進行插入片段DNA(例如來自DNA文庫的亞克隆插入片段)的PCR擴增。PCR反應(yīng)混合物是這樣制備的，混合5μL 10μM M13-40 FWD引物(5’GTT TTC CCA GTC ACG AC 3’)和5μL 10μM-40 REV引物(5’GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG 3’)與25μL10x GeneAmp緩沖液、15μL 25mM MgCl2、5μL AmpliTaq Gold、2.5μL1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和67.5μL ddH2O。將該混合物按相等體積分在十六支0.20ml管子內(nèi)。
利用所述雙毛細管盒和混合板法混合模板DNA與PCR雞尾酒，引發(fā)反應(yīng)。將轉(zhuǎn)移毛細管盒浸入亞克隆文庫的甘油儲備溶液，被離心力分配到384孔平板的小孔內(nèi)。第二組“反應(yīng)”毛細管盒用于通過離心力轉(zhuǎn)移500nL PCR雞尾酒到相同小孔內(nèi)。隨后將反應(yīng)毛細管盒的毛細管浸入模板DNA與PCR試劑的組合混合物，通過毛細作用填充毛細管。擴增是這樣進行的，將毛細管放置在循環(huán)室內(nèi)，熱循環(huán)的活化步驟是95℃ 12分，然后是64℃ 4.5分和95℃ 5秒的30次循環(huán)。
用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并對比由在0.20ml管子內(nèi)進行的全體積(25μL)反應(yīng)所擴增的相同亞克隆體。納規(guī)模毛細管盒樣本被離心力分配到4.5μL ddH2O中。利用小體積移液器手工轉(zhuǎn)移全體積反應(yīng)的等體積試樣。向各為5μL的樣本中加入1μL 6x負載染劑，將樣本定量轉(zhuǎn)移到瓊脂糖凝膠的小孔中。使用0.7％瓊脂糖凝膠和1X Tris-乙酸鹽-EDTA緩沖液pH 8.0進行瓊脂糖凝膠電泳。在15V/cm下分離樣本達40分鐘，用Sybr Green II(Molecular Probes，Eugene，OR)染色，用兩維熒光掃描儀(FluorImager，Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)成像。所掃描的凝膠圖象顯示在圖12A和圖12B中。可以看到，按全體積(圖12A)和500nL體積(圖12B)制備的樣本具有相同的分子量分布。本例證明，納規(guī)模樣本制備可以用于PCR反應(yīng)，產(chǎn)物可以用傳統(tǒng)的大規(guī)模分析方法進行分析，例如瓊脂糖凝膠電泳。
實施例6PCR擴增和循環(huán)測序利用本發(fā)明制備循環(huán)測序樣本的優(yōu)選方式是在毛細管盒和有關(guān)器械中制備納規(guī)模PCR樣本，進行大規(guī)模ExoI/SAP反應(yīng)，然后在毛細管盒和有關(guān)器械中進行循環(huán)測序。從甘油儲備亞克隆體進行PCR擴增，示范用于DNA測序的納規(guī)模PCR模板制備物。甘油儲備亞克隆體是在毛細管盒內(nèi)通過PCR和有關(guān)硬件擴增的，如實施例5所述。PCR擴增后，毛細管內(nèi)容物被離心分配到96孔平板的小孔內(nèi)，其中含有4.5μL7.5mU蝦堿性磷酸酶(SAP)和37.5mU外切核酸酶I(ExoI)。PCR產(chǎn)物和ExoI/SAP溶液在37℃下培養(yǎng)5分鐘，以消化未摻入的引物和脫磷酸化未摻入的核苷酸。最初的培養(yǎng)之后，加熱溶液至72℃達15分鐘，使酶滅活。
將ExoI/SAP處理的PCR產(chǎn)物用轉(zhuǎn)移毛細管盒和離心分配作用等分到新鮮的384孔混合板。將染劑-終止子測序試劑的等分試樣用另一組毛細管盒、即反應(yīng)毛細管盒和離心分離作用加入到500nL純化PCR產(chǎn)物中。然后將毛細管盒浸入1μL反應(yīng)混合物，填充反應(yīng)毛細管盒的毛細管。按照實施例3擴增模板，如上所述分配到40μL 80％乙醇中和純化。利用電動注射，用MegaBACETM進行測序反應(yīng)的分析。圖13顯示來自亞克隆模板的六個堿基的部分，稱為測序電泳圖，該模板是通過納規(guī)模PCR擴增從甘油儲備溶液和通過納規(guī)模循環(huán)測序制備的。在毛細管盒中進行PCR，隨后轉(zhuǎn)移反應(yīng)混合物到微量板，本系統(tǒng)可以簡化從納規(guī)模(小于1μL體積)到納規(guī)模反應(yīng)體積以上的轉(zhuǎn)變。本系統(tǒng)還可以簡化從大規(guī)模(大于1μL體積)到納規(guī)模反應(yīng)體積的轉(zhuǎn)變，利用ExoI/SAP反應(yīng)在毛細管盒中進行循環(huán)測序顯示了這一點。
實施例7在亞微升毛細管盒中進行的等溫酶反應(yīng)用β-半乳糖苷酶催化的β-D-β-半乳糖苷酶水解為熒光團試鹵靈的熒光酶測定法示范所述系統(tǒng)用于進行酶反應(yīng)的用途。在96支毛細管盒的毛細管內(nèi)和對照全體積反應(yīng)中進行β-半乳糖苷酶催化的試鹵靈-β-D-半乳糖苷酶(RBG)水解，其中β-Gal水解RBG。
從5ml緩沖液(100mM Tris-HCl，20mM KCl，2mM MgCl2)和5mg RBG制備RBG的35μM儲備溶液，劇烈渦旋，通過0.40微米濾器過濾溶液，然后加入等體積緩沖液。然后從儲備溶液制備RBG的稀釋曲線。在0.20ml管子內(nèi)準備各為10μL的RBG溶液，向其中加入200ug β-半乳糖苷酶，簡單混合后，通過毛細作用填充毛細管盒。將毛細管盒放置在空氣循環(huán)器內(nèi)，在37℃下2分鐘后，取出毛細管盒，從毛細管離心出內(nèi)容物到含有5μL 1M碳酸鈉的384孔掃描板中。隨后向掃描板的小孔填充50μL ddH2O。按平行方式，將0.2ml管子在37℃下培養(yǎng)2分鐘，加入1M碳酸鈉終止全體積反應(yīng)。將在0.20ml管子內(nèi)進行的酶反應(yīng)所得對照等分試樣加入到掃描板上。
簡單地向毛細管盒填充β-半乳糖苷酶的20μg/ml溶液，以結(jié)合毛細管表面，然后除去過量液體，利用所述毛細管盒洗滌歧管干燥毛細管盒，用該系統(tǒng)還示范β-半乳糖苷酶的固相捕獲。β-半乳糖苷酶結(jié)合后，通過毛細作用向毛細管填充RBG溶液。使反應(yīng)在37℃下進行2分鐘，在掃描板內(nèi)分配到1M碳酸鈉中，并用水稀釋，進行分析。
一旦所有三套反應(yīng)(全體積、毛細管盒和帶有固相捕獲的毛細管盒)已被加入到掃描板中后，用熒光平板讀數(shù)器(Typhoon，MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)讀取平板。在0.2ml管子中進行的標(biāo)準曲線(管子反應(yīng))、在沒有固相捕獲的毛細管盒中進行的反應(yīng)(毛細管反應(yīng))和在帶有固相捕獲的毛細管盒中進行的反應(yīng)(毛細管與結(jié)合反應(yīng))的結(jié)果總結(jié)在圖14中。圖14顯示關(guān)于管子反應(yīng)的預(yù)期信號對底物濃度和關(guān)于在毛細管盒中進行的預(yù)混合酶反應(yīng)與毛細管結(jié)合β-半乳糖苷酶測定的信號數(shù)據(jù)點。
本例起到闡述所述系統(tǒng)進行一定范圍的通用酶活性與抑制作用測定的相容性的作用。另外還證明，固相捕獲能夠應(yīng)用于蛋白質(zhì)和酶以及DNA。最后顯示，所述系統(tǒng)能夠應(yīng)用于等溫反應(yīng)。
實施例8模板純化本例證明本發(fā)明方法的有效性，它能夠用于純化模板DNA，除去干擾測序反應(yīng)的污染物，還證明高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)的獲得。
利用與熔融二氧化硅毛細管內(nèi)表面的直接可逆結(jié)合，模板捕獲凈化PCR產(chǎn)物為DNA測序模板。利用ET染劑-終止子循環(huán)測序法，在150μm內(nèi)徑毛細管中進行500nl體積序列反應(yīng)，在MegaBACETM上分析，利用2kV、30s注射。圖17A顯示在測序之前與反應(yīng)混合物混合的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果。圖17B顯示首先混合PCR模板與硫氰酸鈉，使DNA與毛細管內(nèi)表面結(jié)合，用80％乙醇洗滌DNA，然后測序的結(jié)果。
核酸歸一化實施例下列實施例證明本發(fā)明方法的有用性和有效性，用于歸一化被直接與可逆固定在毛細管內(nèi)部的核酸的量。
實施例9對M13、質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物DNA的模板歸一化作用圖18代表模板捕獲方案之后所保留的DNA質(zhì)量。關(guān)于M13(▲)、質(zhì)粒(●)和PCR產(chǎn)物(■)，所結(jié)合的DNA量保持恒定在高于40ng起始模板。
模板DNA是這樣制備的，通過M13mp18和PUC19 DNA的限制消化，分別生成線性單鏈與線性雙鏈DNA。利用[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶，將這些模板以及800bp PCR產(chǎn)物(標(biāo)準擴增條件)用32P進行末端標(biāo)記。將被標(biāo)記的DNA接種到相同類型的未標(biāo)記模板內(nèi)，生成關(guān)于被接種DNA溶液的校準曲線。將儲備DNA與10M硫氰酸鈉混合，裝入500nl熔融二氧化硅毛細管，進行模板結(jié)合。培養(yǎng)10分鐘，用80％乙醇洗滌后，將毛細管置于閃爍液中，量化。圖18顯示關(guān)于三種來源模板DNA的限定性歸一化。
實施例10對可讀長度的模板捕獲歸一化作用圖19顯示關(guān)于通過預(yù)混合DNA與測序試劑所制備的樣本(▲)和通過模板捕獲所制備的樣本(●)的可讀長度對起始DNA質(zhì)量的圖。歸一化作用是突出的，因為關(guān)于模板捕獲樣本所得可讀長度幾乎是恒定的，而關(guān)于預(yù)混合樣本，在高于20ng起始DNA發(fā)生模板過載和可讀長度減少。
混合儲備M13mp18 DNA與10M硫氰酸鈉，裝入500nl熔融二氧化硅毛細管，進行模板結(jié)合。培養(yǎng)10分鐘，用80％乙醇洗滌，向毛細管填充與M13-40FWD測序引物預(yù)混合的ET終止子。制成體積為10μl的預(yù)混合試劑，裝入清潔的樣本制備毛細管中。如前所述進行基于空氣的循環(huán)測序，然后是乙醇沉淀和MegaBACETM分析，條件是2kV、30秒注射、8kV、120分鐘運轉(zhuǎn)時間。
實施例11模板捕獲聚合酶鏈反應(yīng)與歸一化在所示起始量的M13mp18的模板結(jié)合之后進行PCR反應(yīng)。與M13-100 FWD和M13-400 REV引物的標(biāo)準PCR擴增反應(yīng)是在500nl毛細管盒中進行的，條件是95℃ 10秒、55℃ 10秒和72℃ 120秒。反應(yīng)產(chǎn)物被離心分配到加載緩沖液中，轉(zhuǎn)移到1.5％瓊脂糖凝膠中。將產(chǎn)物用SYBR Green染劑染色，用Fluorimager儀成像，如圖20所示。
實施例12對峰高度與遷移時間的模板捕獲歸一化作用和關(guān)于預(yù)混合樣本的峰高度與遷移時間對峰高度與遷移時間的模板捕獲歸一化作用。圖21代表用遞增模板濃度所得相對信號強度，表示為峰79、峰308和峰604(電泳色譜圖中早期、中期和晚期ddT-終止的峰)的強度。峰強度增加至40ng/μl后穩(wěn)定，峰高度確認了歸一化作用和模板捕獲技術(shù)的飽和水平。第一峰的遷移時間在不同模板濃度下是相對穩(wěn)定的。
關(guān)于預(yù)混合樣本的峰高度與遷移時間。圖22顯示峰高度隨著模板濃度增加而增加，由于測序樣本過載而達到最大值。過量模板DNA抑制電動注射，減少樣本運行中的電流，所以增加樣本穿過毛細管的遷移時間。
實施例13對克隆體的甘油儲備液直接進行納規(guī)模的循環(huán)測序如果能夠排除涉及從所克隆的細菌細胞DNA制備測序樣本的很多步驟中的一些，就能夠簡化關(guān)于DNA測序的樣本制備。典型的毛細管電泳分析中，使細菌細胞生長、溶解，進行PCR擴增，然后是ExoI/SAP凈化，再循環(huán)測序。本發(fā)明提供簡化工作流程的方法，對克隆體的甘油儲備液直接進行循環(huán)測序。將等體積甘油儲備液和10M NaSCN吸入96通道500nl毛細管盒。在美國未決申請No.09/577,199所公開的空氣循環(huán)器內(nèi)，在60℃下進行五分鐘結(jié)合，其全文引用在此作為參考文獻。在美國未決申請No.09/577,199所公開的毛細管盒洗滌器內(nèi)，將毛細管盒用80％乙醇洗液洗滌，用流動的氮干燥。然后通過毛細作用向毛細管盒填充引物、ET終止子預(yù)混合物與水的1∶4∶5混合物，在空氣循環(huán)器內(nèi)循環(huán)。關(guān)于ET終止子的循環(huán)方案如上實施例1所述。離心(在4℃和3220g下30分鐘)分配樣本到含有80％乙醇的微量滴定板中，進行乙醇沉淀。潷析和在50g下倒置自旋30秒以除去乙醇后，將樣本再次懸浮在5ul水中。然后將樣本注射到MegaBACETM中，條件是2kV、30秒注射，然后是8kV、140分鐘分離。用序列分析儀軟件(Molecular Dynamics)分析數(shù)據(jù)，然后處理，以測定Phred 20堿基召集分(calling scores)。圖23A和B顯示用這種方法所得痕跡，Phred 20分為561個堿基。本例證明本發(fā)明對細菌的冷凍甘油儲備液直接測序的應(yīng)用。對技術(shù)人員來說將顯而易見的是，該方法可應(yīng)用于生長在瓊脂平板或類似固體生長培養(yǎng)基上的細菌集落的測序，與平板是新鮮的還是干燥的無關(guān)。
實施例14基因型形成與核酸的納規(guī)模單堿基延長本發(fā)明可用于進行納規(guī)模的基因型形成反應(yīng)。
單堿基延長(SBE)反應(yīng)是在96通道毛細管盒中進行的。單堿基延長分析由DNA引物的單堿基延長組成，該引物立即終止于所要訪問的堿基之前。制備25ul PCR反應(yīng)物，含有5ng/ul基因組人DNA、1μM正向與反向引物、緩沖劑、MgCl2和AmpliTaq Gold。PCR循環(huán)是96℃12分，再94℃ 20秒、60℃ 20秒和72℃ 30秒的35次循環(huán)，然后是72℃ 2分。向25μL PCR產(chǎn)物中加入9單位SAP和45單位Exo I而進行ExoI/SAP凈化。將反應(yīng)物在37℃下培養(yǎng)45分鐘，然后加熱至95℃達15分鐘使ExoI/SAP酶變性。
關(guān)于全體積對照反應(yīng)，向10μl ExoI/SAP處理的PCR產(chǎn)物中加入9μl SBE預(yù)混合物，含有熒光標(biāo)記的二脫氧終止子、DNA聚合酶、緩沖溶液和1μl 2μM引物。關(guān)于500nl毛細管盒中的反應(yīng)，通過毛細作用加載樣本。
通過96℃ 10秒、50℃ 5秒、60℃ 30秒的25次循環(huán)進行單堿基延長反應(yīng)。關(guān)于全體積對照樣本，熱循環(huán)是在MJ Research四元組(一種熱循環(huán)機)內(nèi)進行的，或者關(guān)于毛細管盒樣本，熱循環(huán)是在空氣循環(huán)器內(nèi)進行的，該循環(huán)器公開在美國未決申請No.09/577,199中，全文引用在此作為參考。將樣本分配到水中，注射到MegaBACETM中，進行分析。
圖24證明，基于毛細管的反應(yīng)能夠正確地鑒別單核苷酸的多態(tài)性。痕跡1、3和4得自在被訪問堿基處純合的樣本。痕跡2得自在被訪問堿基處雜合的樣本，證明利用納規(guī)模反應(yīng)能夠檢測等位基因的多態(tài)性。信號本質(zhì)上與全體積反應(yīng)所得結(jié)果相同。
從PCR到SBE的全部過程都是利用毛細管盒完成的。
如本申請所述毛細管中的模板捕獲用于這種納規(guī)模單堿基延長反應(yīng)的改進版本，提供甚至更好的結(jié)果。
對技術(shù)人員將顯而易見的是使用逆轉(zhuǎn)錄酶和熒光標(biāo)記核糖核苷酸進行的信使RNA的單堿基延長允許使用mRNA作為基因組DNA的替代選擇形成基因型。
實施例15納規(guī)模的基因型形成與被擴增片段長度的多態(tài)性本發(fā)明的方法可用于進行納升體積的AFLP(被擴增片段長度的多態(tài)性)反應(yīng)。為了進行AFLP反應(yīng)，將基因組DNA用限制酶對消化。使片段與接頭連接，擴增成某一長度的擴增片段，反應(yīng)按某一取向進行，這由所用兩種限制酶決定，或者，利用簡并引物直接通過PCR擴增。用毛細管電泳分析被擴增的片段。AFLP分析法用于生成基因組的“表現(xiàn)形式”，也稱為擴增子，具有可變的片段以及恒定的片段。擴增子用于評價生物種群的多樣性，或繪制生物的基因組圖，其中幾乎沒有序列和標(biāo)記物信息可供利用。
實施例16納規(guī)模的基因型形成與直接顯示分析本發(fā)明的方法可用于進行納升體積的直接顯示分析。為了進行直接顯示分析反應(yīng)，將互補DNA用限制酶對消化。使片段與接頭連接，擴增某一長度的片段，反應(yīng)按某一取向進行，這取決于所用兩種限制酶，或者，利用簡并引物直接通過PCR擴增。用毛細管電泳分析被擴增的片段。直接顯示分析法用于生成轉(zhuǎn)錄組(transcriptosome)的“表現(xiàn)形式”，具有可變的片段以及恒定的片段。直接顯示分析用于評價生物之間表達水平的定量變化或由環(huán)境或生理作用引起的差異。
實施例17通過微衛(wèi)星分析進行納規(guī)?；蛐托纬杀景l(fā)明的方法可用于通過微衛(wèi)星分析進行納升體積的基因型形成。為了通過微衛(wèi)星分析反應(yīng)進行基因型形成，用標(biāo)記物系列進行基因組DNA的PCR擴增，例如PE Applied Biosystems Linkage MappingSets。例如，利用四色分析法，在約30分鐘內(nèi)分析96份人樣本的12種基因型系列。三種顏色用于四套引物，第四種顏色提供內(nèi)部尺寸標(biāo)準。
根據(jù)引物系列廠商的建議進行PCR設(shè)置和熱循環(huán)。
聚合酶鏈反應(yīng)混合物的一個實例如下成分 體積10X Gold緩沖液1.50μlMgCl2(25mM) 1.50μldNTP混合物(2.5mM) 1.50μl引物混合物1.00μlAmpliTaq Gold 0.12μl無菌蒸餾水1.38μl7.00μlDNA(5ng/μl) 8.00μl15.0μl每孔引物混合物含有正向與反向引物，各自的最終濃度為5μM。
熱循環(huán)器程序的一個實例如下溫度 時間 循環(huán)次數(shù)95℃ 12分 1次94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒 10次89℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒 20次72℃ 10分 1次匯集將密封后的PCR樣本托盤貯存在-20℃下。
首先，匯集各1μl PCR產(chǎn)物，然后加入水使最終體積達到約15至20μl。然后，透析樣本。在0.1X TE中進行透析15分鐘，然后將所匯集的PCR樣本加載到MegaBACETM中。
加載為加載到MegaBACETM上，制備樣品，如下所述成分 體積脫鹽后的PCR匯集物2.00ulET400-R尺寸標(biāo)準 0.25ul甲酰胺加載溶液 2.75ul總加載體積 5.00ul實施例18與核酸的納規(guī)模酶反應(yīng)本發(fā)明有利地用于與核酸進行納升體積的納規(guī)模酶反應(yīng)。將核酸固定在按照本發(fā)明方法準備的反應(yīng)室中，例如玻璃毛細管。向毛細管填充反應(yīng)混合物，混合物包含一種或多種不同的酶，例如限制酶。
典型的限制酶消化是在總計20μl的體積中進行的，其中包括0.2至1.5μg底物DNA和2-10倍過量于DNA的限制酶。在反應(yīng)管內(nèi)混合反應(yīng)緩沖液、酶、水和DNA，在37℃下培養(yǎng)1至4小時。按照本發(fā)明，使模板DNA與毛細管內(nèi)表面結(jié)合。然后通過毛細作用向毛細管抽入限制酶(例如Hind III)在1 x KGB緩沖液(100mM谷氨酸鉀、25mM Tris-乙酸鹽，pH 7.5、10mM硫酸鎂、50μg/ml牛血清白蛋白和1mM β-巰基乙醇)中的預(yù)混合物。將反應(yīng)物在37℃下培養(yǎng)指定時間，然后將內(nèi)容物分配在凝膠加載緩沖液中，用于瓊脂糖凝膠尺寸分級，或者分配到含有10mM EDTA的溶液中。
其他包含不同酶的反應(yīng)也是可能的。這些酶包括但不限于甲基化酶、DNA依賴性DNA聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、RNA依賴性DNA聚合酶、DNA依賴性RNA聚合酶、磷酸酶、激酶、外切核酸酶(例如Sl或綠豆核酸酶)、其他核酸酶、核糖核酸酶、或DNA或RNA連接酶。對大多數(shù)這些反應(yīng)來說，控制核酸與酶的比例是反應(yīng)過程成功的關(guān)鍵。
本申請的使用有益地減少與濃度依賴性與核酸的酶反應(yīng)有關(guān)的誤差，以及減少寶貴的酶的消耗。此外，通過洗滌，本發(fā)明方法的使用有效消除殘留離子，例如乙酸銨、EDTA和氯化鋰，以及其他污染物，例如干擾酶活性的多糖。
實施例19直接從微陣列點樣板測序為了確保利用微陣列所生成的數(shù)據(jù)的完整性，有必要確信知道被點樣DNA序列的同一性。PCR經(jīng)常用于生成所要點樣的DNA，正如本領(lǐng)域所熟知的，Taq和有關(guān)熱穩(wěn)定性聚合酶隨著擴增模板，在每千對中引入一定數(shù)量錯誤堿基對。如果錯誤已被引入，必須檢出它們，棄去其中被擴增產(chǎn)物或數(shù)據(jù)。通常，這需要大量獨立于與PCR產(chǎn)物點樣有關(guān)的加工步驟。不過，本發(fā)明實施方式的使用大大增加序列確認的效率。
利用本發(fā)明的方法實現(xiàn)一系列微陣列點樣樣本序列的確認如下。
從人基因組DNA模板的平均500bp的PCR產(chǎn)物制備微陣列點樣樣本。將產(chǎn)物用標(biāo)準鹽酸胍鎓玻璃濾板加工法純化，與等體積10M硫氰酸鈉混合。將樣本排列在微量滴定板(“點樣板”)中，用于隨后向微陣列玻片點樣。
為了確認PCR產(chǎn)物序列和微陣列雜交玻片上的位置排列，進行測序反應(yīng)將96支毛細管盒末端浸入點樣板，使DNA與毛細管內(nèi)表面結(jié)合。用80％乙醇洗滌后，向毛細管填充測序混合物，其中含有緩沖劑、聚合酶、染劑標(biāo)記的二脫氧核苷酸和濃度為1x的測序引物。熱循環(huán)(95℃ 5秒、55℃ 5秒和60℃ 60秒的30次循環(huán))后，通過乙醇沉淀純化測序反應(yīng)物，用MegaBACETM分析。
本例中，60份樣本得到經(jīng)過證實的序列，平均可讀長度為335個堿基(最大450bp)。通過直接對點在陣列上的相同制備物和來源進行測序，我們解決了PCR產(chǎn)物的位置或同一性上的含糊性。
實施例20PCR產(chǎn)物的直接測序，無需預(yù)先除去PCR核苷酸和引物本發(fā)明的方法已經(jīng)用于在測序之前簡化PCR產(chǎn)物的純化。通常，在循環(huán)測序之前需要使用外切核酸酶I(ExoI)和北極蝦堿性磷酸酶(SAP)進行PCR產(chǎn)物的酶純化，以除去引物和過量dNTP。不過，因為模板結(jié)合是尺寸依賴性的，反而能夠這樣從模板中除去未摻入引物和剩余核苷酸使模板與毛細管進行差別結(jié)合，然后洗滌除去核苷酸和引物。這種方法避免PCR產(chǎn)物的酶凈化，大大簡化總的工作流程。
作為證明，對含有小鼠亞克隆插入片段的M13 DNA的96 PCR產(chǎn)物直接測序，無需在PCR擴增后進行酶純化。
使用含有小鼠基因組DNA的亞克隆插入片段(約2000bp)的M13模板進行PCR擴增反應(yīng)。M13模板預(yù)先通過聚乙二醇沉淀和洗滌劑溶劑化(Thermomax)制備，稀釋200倍，重新排列在96孔微量滴定板中。
將該溶液的2μl等分試樣轉(zhuǎn)移到用下列組分制備的PCR擴增混合物中2.5μL 10X GeneAmp緩沖劑，0.2μL 25mM每種dNTP，0.5μL 10μMM13-40FWD(GTT TTC CCA GTC ACG AC)，0.5μL 10μM M13-40REV引物(GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG)，1.5μL 25mM氯化鎂，0.5μL 5U/μLAmpliTaq聚合酶和17.3μL水?；旌稀⒚芊馄桨搴?，進行熱循環(huán)反應(yīng)，在95℃ 10秒、55℃ 10秒和72℃ 2分下循環(huán)三十次。PCR擴增后，取出5μL等分試樣，在獨立的96孔平板中與5μL 10M硫氰酸鈉混合。
將96支毛細管盒的毛細管浸入離液劑-PCR產(chǎn)物混合物中，然后填充毛細管盒。在60℃下培養(yǎng)5分鐘后，在真空下拖入80％乙醇穿過毛細管，除去殘留的離液劑、未結(jié)合的緩沖組分和DNA。用氣流干燥內(nèi)表面1分鐘后，將毛細管浸入測序混合物中，其中含有ET終止子反應(yīng)混合物的1x溶液和正向測序引物M13-21FWD(TGT AAA ACG ACG GCCAGT)。
在氣-熱循環(huán)中密封毛細管末端，進行循環(huán)測序。反應(yīng)在95℃ 5秒、55℃ 5秒和60℃ 60秒下循環(huán)30次。利用離心力分配循環(huán)測序產(chǎn)物到含有40μL 80％乙醇的微量滴定板中。在3000xg下離心30分鐘后，潷去乙醇，將形成顆粒的DNA再次懸浮在5μL ddH2O中，用MegaBACETM分析樣本。
關(guān)于這96份樣本，實現(xiàn)了550個堿基的平均可讀長度，通過率為83％，總計44000個堿基。該程序已被重復(fù)5000份樣本以上，證明優(yōu)于全體積與酶純化反應(yīng)。
本文提到的所有專利、專利申請和其他出版物都全文引用在此作為參考，如同各自被單獨和具體引用在此作為參考文獻。盡管描述了本發(fā)明優(yōu)選的例證性實施方式，不過本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會到，本發(fā)明可以通過所述實施方式以外的方式加以實施，所述實施方式僅供闡述絕非限制。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書的限定。
權(quán)利要求
1.進行DNA測序反應(yīng)的方法，包含將模板DNA直接固定在底物上，然后使所述模板DNA與進行所述DNA測序反應(yīng)的反應(yīng)混合物接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述模板DNA是雙鏈DNA。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述模板DNA是單鏈DNA。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中所述模板DNA是按照聚合酶鏈反應(yīng)制備的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述模板DNA是這樣被固定的使該底物與該模板DNA的溶液接觸足以使該DNA被固定的時間。
6.權(quán)利要求1的方法，進一步包含除去該溶液，其中所述除去步驟發(fā)生在所述固定步驟之后。
7.權(quán)利要求6的方法，進一步包含洗滌該底物，其中所述洗滌步驟發(fā)生在所述除去步驟之后。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述洗滌除去雜質(zhì)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述洗滌是使用含有至少約70％乙醇的乙醇溶液進行的。
10.權(quán)利要求7的方法，進一步包含干燥該底物，其中所述干燥步驟發(fā)生在所述洗滌步驟之后。
11.權(quán)利要求6的方法，進一步包含從該底物洗脫該DNA，其中所述洗脫步驟發(fā)生在所述除去步驟之后。
12.權(quán)利要求7的方法，進一步包含使與該反應(yīng)混合物接觸的該模板DNA進行至少一次熱循環(huán)。
13.權(quán)利要求12的方法，進一步包含分配該DNA測序反應(yīng)的產(chǎn)物，其中所述分配步驟發(fā)生在反應(yīng)已經(jīng)進行之后。
14.權(quán)利要求1或5的方法，其中所述模板DNA固定是通過與所述底物的可飽和結(jié)合進行的。
15.權(quán)利要求5的方法，其中所述DNA模板溶液包含通過非共價相互作用進行在底物上直接固定模板DNA的物質(zhì)。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述非共價相互作用是靜電相互作用。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述物質(zhì)是離液劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述離液劑選自下組脲、高氯酸鈉、高氯酸鉀、溴化鈉、溴化鉀、碘化鈉、碘化鉀、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀、硫氰酸胍、異硫氰酸鈉、異硫氰酸鉀、鹽酸胍、異硫氰酸胍、氯化鋰、三氯乙酸鈉、二甲基亞砜、四胺鹵化物、氯化四乙胺和三氯乙酸鉀。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑混合物包含寡核苷酸引物、DNA聚合酶和脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述試劑混合物從底物洗脫DNA。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述試劑混合物進一步包含有限濃度的二脫氧核苷酸三磷酸。
22.權(quán)利要求21的方法，其中每種所述二脫氧核苷酸三磷酸是與熒光團結(jié)合的。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述引物是與DNA模板至少一條鏈中許多連續(xù)排列的核苷酸互補的。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述引物是與熒光團結(jié)合的。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述熒光團是能量傳遞熒光團。
26.權(quán)利要求19的方法，其中所述DNA聚合酶是熱穩(wěn)定的。
27.權(quán)利要求19的方法，進一步包含使與反應(yīng)混合物接觸的模板DNA進行至少一次熱循環(huán)。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物是封閉通道的至少一個內(nèi)部表面。
29.權(quán)利要求28的方法，進一步包含用流體填充所述封閉通道。
30.權(quán)利要求28的方法，進一步包含密封該封閉通道，防止其中所含有的流體流出。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述底物是玻璃。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述底物是金屬。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所述底物是非金屬。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所述封閉通道是由毛細管形成的。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所述封閉通道是由一個凹溝形成的，在該凹溝的至少部分上設(shè)置有蓋子，其中所述蓋子封閉所述通道。
36.利用權(quán)利要求1、5、6、7、11、12、13、15、19或28任意一項方法進行的DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物。
37.從權(quán)利要求36的所述DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物衍生的DNA序列。
38.權(quán)利要求37的DNA序列，體現(xiàn)在計算機可讀介質(zhì)中。
39.計算機數(shù)據(jù)信號，體現(xiàn)在載波中，其中該計算機數(shù)據(jù)信號包含權(quán)利要求37的DNA序列。
40.獲得預(yù)定近似質(zhì)量核酸的方法，包含將所述核酸直接固定在底物上，其中所述底物可飽和地結(jié)合所述核酸。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述核酸是RNA。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述核酸是DNA。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述DNA是雙鏈DNA。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述DNA是單鏈DNA。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述DNA是通過聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生的。
46.權(quán)利要求42的方法，其中所述DNA是從真核細胞、原核細胞、原始細胞、病毒或噬菌體分離的。
47.權(quán)利要求42的方法，其中所述DNA是按照化學(xué)合成過程產(chǎn)生的。
48.權(quán)利要求40的方法，其中所述核酸是用在酶反應(yīng)中的。
49.權(quán)利要求42的方法，其中所述DNA是用在酶反應(yīng)中的。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述反應(yīng)是DNA測序反應(yīng)。
51.分配預(yù)定近似質(zhì)量核酸的方法，包含將所述核酸直接固定在第一底物上，其中所述底物可飽和地結(jié)合所述核酸；和將所述核酸轉(zhuǎn)移到第二底物上。
52.權(quán)利要求51的方法，進一步包含從所述底物洗脫該核酸。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述核酸是RNA。
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述核酸是DNA。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述DNA是雙鏈DNA。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述DNA是單鏈DNA。
57.權(quán)利要求51的方法，其中按大約1-1000納升的流體體積將所述核酸轉(zhuǎn)移到所述第二底物上。
58.權(quán)利要求51的方法，其中按大約1-500納升的流體體積將所述核酸轉(zhuǎn)移到所述第二底物上。
59.權(quán)利要求51的方法，其中按大約1-100納升的流體體積將所述核酸轉(zhuǎn)移到所述第二底物上。
60.權(quán)利要求51的方法，其中按大約1-10納升的流體體積將所述核酸轉(zhuǎn)移到所述第二底物上。
61.權(quán)利要求40或51的方法，其中該核酸是這樣被固定的使該底物與該核酸的溶液接觸足以使該核酸被固定的時間。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述核酸溶液包含通過非共價相互作用進行在底物上直接固定核酸的物質(zhì)。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述非共價相互作用是靜電相互作用。
64.權(quán)利要求62的方法，其中所述物質(zhì)是離液劑。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述離液劑選自下組脲、高氯酸鈉、高氯酸鉀、溴化鈉、溴化鉀、碘化鈉、碘化鉀、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀、硫氰酸胍、異硫氰酸鈉、異硫氰酸鉀、鹽酸胍、異硫氰酸胍、氯化鋰、三氯乙酸鈉、二甲基亞砜、四胺鹵化物、氯化四乙胺和三氯乙酸鉀。
66.權(quán)利要求61的方法，進一步包含除去該溶液，其中所述除去步驟發(fā)生在所述固定步驟之后。
67.權(quán)利要求66的方法，進一步包含洗滌該底物，其中所述洗滌步驟發(fā)生在所述除去步驟之后。
68.權(quán)利要求67的方法，進一步包含干燥該底物，其中所述干燥步驟發(fā)生在所述洗滌步驟之后。
69.權(quán)利要求40或51的方法，其中所述底物是封閉通道的至少一壁。
70.權(quán)利要求69的方法，進一步包含用流體填充所述封閉通道。
71.權(quán)利要求69的方法，其中所述底物是玻璃。
72.權(quán)利要求69的方法，其中所述底物是金屬。
73.權(quán)利要求69的方法，其中所述底物是非金屬。
74.權(quán)利要求69的方法，其中所述封閉通道是由毛細管形成的。
75.權(quán)利要求69的方法，其中所述封閉通道是由一個凹溝形成的，在該凹溝的至少部分上設(shè)置有蓋子，其中所述蓋子產(chǎn)生防止流體交流的隔片。
76.獲得預(yù)定近似質(zhì)量經(jīng)過尺寸選擇的DNA的方法，包含對所要歸一化的DNA進行尺寸選擇；和將所述經(jīng)過尺寸選擇的DNA直接固定在底物上，其中所述底物可飽和地結(jié)合所述核酸。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所要獲得的所述DNA是質(zhì)?；蚋郊有虳NA。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述尺寸選擇是這樣進行的，從封閉通道內(nèi)徑排除基因組DNA。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述封閉通道是毛細管。
80.權(quán)利要求78或79的方法，其中所述固定是這樣進行的使所述封閉通道或毛細管的至少一壁與包含DNA和離液劑的溶液接觸。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述離液劑選自下組脲、高氯酸鈉、高氯酸鉀、溴化鈉、溴化鉀、碘化鈉、碘化鉀、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀、硫氰酸胍、異硫氰酸鈉、異硫氰酸鉀、鹽酸胍、異硫氰酸胍、氯化鋰、三氯乙酸鈉、二甲基亞砜、四胺鹵化物、氯化四乙胺和三氯乙酸鉀。
82.權(quán)利要求1、5、6、7、10、15、16、17、18、28、34、35、40、41、42或50任意一項的底物，在其上固定所述核酸或所述DNA。
83.向酶反應(yīng)引入預(yù)定近似質(zhì)量核酸的方法，包含從過量核酸可飽和地捕獲預(yù)定近似質(zhì)量核酸，直接捕獲到要進行所述酶反應(yīng)的反應(yīng)室的內(nèi)表面上，然后除去所述過量核酸。
84.權(quán)利要求83的方法，其中在除去過量核酸之后向所述反應(yīng)室內(nèi)引入酶反應(yīng)混合物。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含一種選自下組的酶聚合酶、DNA聚合酶、SequenaseTM、Thermo Sequenase IITM、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定性聚合酶、連接酶、激酶、磷酸酶、限制酶、內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、拓撲異構(gòu)酶、末端轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶和甲基化酶。
86.在溶液中檢驗?zāi)０錎NA序列的方法，其中所述溶液已經(jīng)或者需要與作為空間可訪問陣列一部分的第一底物接觸，該方法包含將模板DNA直接固定在第二底物上，其中所述模板DNA是這樣被固定的使該第二底物與該模板DNA的溶液接觸足以使該DNA被固定的時間，然后使所述模板DNA與進行所述DNA測序反應(yīng)的反應(yīng)混合物接觸，其中要與所述第一和第二底物接觸的該模板DNA溶液的組成是本質(zhì)上相同的。
全文摘要
提供了使用核酸準備納規(guī)模反應(yīng)的方法。核酸被可飽和而可逆地捕獲在反應(yīng)室、通常為毛細管的內(nèi)部表面上。除去過量核酸,在毛細管內(nèi)直接進行反應(yīng)?；蛘?將可飽和結(jié)合的核酸洗脫,分配計量的核酸,用于隨后在獨立的反應(yīng)室內(nèi)的反應(yīng)。還提供了用于進行本發(fā)明方法的裝置和設(shè)計用來有利地利用該方法進行高通量核酸測序反應(yīng)的系統(tǒng)。
文檔編號B01L3/00GK1373813SQ00812870
公開日2002年10月9日 申請日期2000年8月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月2日
發(fā)明者A·哈德, S·喬瓦諾維克 申請人:分子動力學(xué)公司