本發(fā)明屬于土壤修復的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用綠木霉和堿蓬聯(lián)合修復重金屬污染土壤的方法。

背景技術(shù)：

土壤重金屬污染是全球面臨的重大環(huán)境問題之一，cd因其較強的生物毒性和強烈的“三致”作用，而受到人們廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)重金屬污染的治理方法多為物理、化學法。如化學沉淀法、離子交換法、反滲透法、萃取法、活性炭吸附法等，它們各有優(yōu)點，但也存在著投資大、能耗高、易造成二次污染、操作困難等缺點。

與傳統(tǒng)重金屬污染修復方法相比，植物修復法具有環(huán)境友好、不產(chǎn)生二次污染、修復成本低廉等優(yōu)點，使得植物修復法成為重金屬污染修復研究的熱點。作為一種鹽生植物，堿蓬不僅在鹽分引起滲透壓和離子脅迫的氧化應(yīng)激方面顯示出特有的適應(yīng)性，在金屬離子毒性上也擁有相對的各種生理解毒機制，因此可廣泛用于中堿性土壤的重金屬污染修復中。同其它重金屬富集植物一樣，堿蓬也存在著生物量小、生長緩慢、單位面積上植物對重金屬的吸收和積累總量少等瓶頸問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對生產(chǎn)實踐中的實際問題和需求，提出了利用綠木霉和堿蓬聯(lián)合修復重金屬污染土壤的方法，為尋找一種微生物與堿蓬聯(lián)合修復的方式，提高堿蓬對中堿性重金屬污染土壤的修復效率，以期盡快恢復中堿性重金屬污染土壤的生產(chǎn)能力。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種利用綠木霉和堿蓬聯(lián)合修復重金屬污染土壤的方法，包括以下步驟：

1)將綠木霉菌株f7定殖在堿蓬根際，構(gòu)建得到綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體；

2)將所述綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體移栽在重金屬污染土壤中進行修復；

3)待定植120～136d后，收獲堿蓬植株地上部分，完成土壤修復。

優(yōu)選的，所述步驟1)的定殖的方法包括堿蓬苗與綠木霉的定殖方法和堿蓬種子與綠木霉的定殖方法。

優(yōu)選的，所述堿蓬苗與綠木霉的定殖方法包括以下步驟：所述制備的綠木霉菌株f7孢子懸液加入到堿蓬苗的根際土壤中，然后用無菌水進行澆灌堿蓬苗，得到綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體。

優(yōu)選的，所述堿蓬苗高度為10～15cm。

優(yōu)選的，所述堿蓬種子與綠木霉的定殖方法包括以下步驟：取消毒后的堿蓬種子浸泡于綠木霉菌株f7孢子懸液后，在土層深度為1.0～2.0cm處種植并用無菌水進行澆灌保持土壤濕潤，長至苗高10～15cm，得到綠木霉f7-堿蓬互生載體。

優(yōu)選的，所述堿蓬種子浸泡的時間優(yōu)選為1h～2h。

優(yōu)選的，堿蓬種子的消毒方法為1％次氯酸鈉溶液浸泡10～15min。

優(yōu)選的，所述綠木霉菌株f7孢子懸液的活菌濃度為1×10⁶～1×10⁷個孢子/ml。

優(yōu)選的，所述綠木霉f7-堿蓬互生載體中堿蓬根際f7菌達到2×10³cfu/g以上。

優(yōu)選的，所述修復過程保持土壤含水量為最大田間持水量的60％～70％。

優(yōu)選的，所述金屬污染的重金屬為cu、cd、zn或pb。

本發(fā)明提供了一種利用綠木霉和堿蓬聯(lián)合修復重金屬污染土壤的方法，包括以下步驟：1)將綠木霉菌株f7定殖在堿蓬根際，構(gòu)建得到綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體；2)將所述綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體定植在重金屬污染土壤中進行修復；3)待定植120～136d后，收獲堿蓬植株地上部分，完成土壤修復。本發(fā)明采用綠木霉f7-堿蓬互生載體處理重金屬污染土壤，提高了銅鎘鋅鉛復合污染土壤的修復效率，微生物與植物之間存在協(xié)同促進修復效果的現(xiàn)象；同時綠木霉f7-堿蓬互生載體提高土壤微生物量，改善植物的根際微生態(tài)環(huán)境；綠木霉f7-堿蓬互生載體處理重金屬污染土壤，具有良好的生態(tài)效應(yīng)，適用于重金屬復合污染土壤的修復。

附圖說明

圖1為實施例1中不同處理下修復136d后堿蓬地上部生物量；

圖2為實施例1中修復136d后堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb含量；

圖3為實施例1中修復136d后堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb累積量；

圖4實施例2中不同處理下修復120d后堿蓬地上部生物量；

圖5為實施例2中修復120d后堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb含量；

圖6為實施例2中修復120d后堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb累積量。

保藏信息

綠木霉，trichodermavirens，菌株編號：f7jx993849，該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏單位名稱為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2015年6月29日，保藏編號為cgmccno.3.17613。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種利用綠木霉和堿蓬聯(lián)合修復重金屬污染土壤的方法，包括以下步驟：

1)將綠木霉菌株f7定殖在堿蓬根際，構(gòu)建得到綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體；

2)將所述綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體移栽在重金屬污染土壤中進行修復；

3)待定植120～136d后，收獲堿蓬植株地上部分，完成土壤修復。

將綠木霉菌株f7定殖在堿蓬根際，構(gòu)建得到綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體。

本發(fā)明中，所述定殖的方法優(yōu)選包括堿蓬苗與綠木霉的定殖方法和堿蓬種子與綠木霉的定殖方法。所述堿蓬苗與綠木霉的定殖方法優(yōu)選包括以下步驟：所述制備的綠木霉菌株f7孢子懸液加入到堿蓬苗的根際土壤中，然后用無菌水進行澆灌堿蓬苗。所述堿蓬苗高度優(yōu)選為10～15cm。所述綠木霉菌株f7孢子懸液的活菌濃度優(yōu)選為1×10⁶～1×10⁷個孢子/ml。

本發(fā)明中，所述堿蓬種子與綠木霉的定殖方法優(yōu)選包括以下步驟：取消毒后的堿蓬種子浸泡于綠木霉菌株f7孢子懸液后，在土層深度為1.0～2.0cm處種植并用無菌水進行澆灌保持土壤濕潤，長至苗高12cm，構(gòu)建得到綠木霉f7-堿蓬互生載體。所述堿蓬種子浸泡的時間優(yōu)選優(yōu)選為1h～2h。堿蓬種子的消毒方法優(yōu)選為1％次氯酸鈉溶液浸泡10～15min。所述綠木霉菌株f7孢子懸液的活菌濃度優(yōu)選為1×10⁶～1×10⁷個孢子/ml。所述綠木霉f7-堿蓬互生載體中堿蓬根際f7菌的菌體濃度優(yōu)選達到2×10³cfu/g以上。

得到綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體后，本發(fā)明將所述綠木霉菌株f7-堿蓬互生載體移栽在重金屬污染土壤中進行修復。

本發(fā)明中，所述移栽至重金屬污染的土壤的深度優(yōu)選為20～30cm，更優(yōu)選為25cm。所述移栽的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的移栽方法即可。

本發(fā)明中，所述修復過程優(yōu)選保持土壤含水量為最大田間持水量的60％～70％。

土壤修改后，本發(fā)明待移栽120～136d后，收獲堿蓬植株地上部分，完成土壤修復。

本發(fā)明中，所述移栽的時間優(yōu)選為125～130d，最優(yōu)選為128d。

本發(fā)明中，所述收獲堿蓬植株地上部分的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的收獲方法即可。

本發(fā)明中，所述金屬污染的重金屬為cu、cd、zn或pb。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種利用綠木霉和堿蓬聯(lián)合修復重金屬污染土壤的方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

實施例1

供試土壤：為平度市某鎮(zhèn)農(nóng)田土壤，其基本理化性質(zhì)為：ph6.62(土水比1：2.5)，有機質(zhì)16.6g/kg，陽離子交換量19.8cmol/kg，總銅含量53.5mg/kg，總鎘含量1.08mg/kg，總鋅含量184mg/kg，總鉛含量45.2mg/kg。

供試堿蓬種子，采自于野外。

供試菌株：綠木霉(trichodermavirens)菌株f7jx993849，保藏編號：cgmccno.3.17613。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖(pda)培養(yǎng)基，稱取馬鈴薯200克，洗凈切塊，加去離子水煮沸30min后，過濾出上清液，加入葡萄糖20克，用去離子水定容至1000ml，121℃滅菌20min。固體培養(yǎng)基，加瓊脂15～20克。

綠木霉f7孢子懸液制備：將綠木霉f7菌種在pda斜面上進行活化，約6d后產(chǎn)孢子，加入6ml無菌水，輕輕將瓊脂表面的孢子刮下，將孢子懸浮液置于已滅菌100ml三角瓶內(nèi)，瓶中預(yù)先放置數(shù)粒無菌玻璃珠，充分震蕩后用滅菌的脫脂棉進行過濾，并用無菌水重洗濾渣2～3次。用血球計數(shù)板測定孢子濃度，并稀釋至1×10⁶個孢子/ml的孢子懸液。

綠木霉f7-堿蓬互生載體構(gòu)建：選取飽滿的堿蓬種子，用1％次氯酸鈉溶液浸泡種子15min。取消毒好的種子用去離子水清洗種子5～7次，每次5min；之后浸泡于濃度為1×10⁶個孢子/ml的孢子懸液中2h，取出浸泡的種子后在土層下約1.5cm種植，用無菌水進行澆灌保持土壤濕潤，至苗高12cm，經(jīng)檢測堿蓬根際f7菌達到2×10³cfu/g以上，構(gòu)建了綠木霉f7-堿蓬互生載體；

盆栽驗：盆栽試驗設(shè)置兩個處理，處理一：ck，為不接種綠木霉f7的堿蓬對照；處理二：接種綠木霉f7的堿蓬。每處理做四次重復。盆內(nèi)徑寬30cm，長90cm，每盆中裝入風干后過2mm篩的土樣15kg，加入蒸餾水至土壤田間持水量，保持土壤含水量平衡1周后將上述步驟所得的堿蓬移種至盆中。每盆6棵。栽種行距是15cm，株距是30cm，相當于22.2株/m²土地，以利于分枝的生長。在修復過程中，保持土壤含水量為最大田間持水量的65％左右。植物生長136d后，用不銹鋼剪刀減去地上部，測定植株鮮重。用去離子水沖洗后，105℃殺青20min，70℃烘至恒重，粉碎過100目篩。保留部分根際鮮土供土壤微生物數(shù)量指標分析用。

不同處理下修復136d后堿蓬地上部生物量見圖1。從圖1中可以看出，綠木霉f7處理組堿蓬地上部和地下部的生物量顯著大于對照組。綠木霉f7處理組堿蓬地上部和地下部的干重分別比對照高37.6％和38.6％。說明綠木霉f7能夠顯著提高堿蓬生物量。

堿蓬銅鎘鋅鉛含量的測定：堿蓬草樣品采用微波消解法(濃hno3與30％h2o2體積比為7:1)進行消化，隨后采用icp-ms測定cu、cd、zn和pb含量，消化以及測定過程中以國家標準物質(zhì)(gbw07603gsv-2)為內(nèi)標控制樣品分析質(zhì)量。接種綠木霉f7對堿蓬銅鎘cu、cd、zn和pb含量和累積量的影響分別見圖2、圖3。

圖2為修復136d后堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb含量，與未施加綠木霉f7的對照相比，綠木霉f7處理均可以顯著增加堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb含量。綠木霉f7處理組堿蓬地上部的cu、cd、zn、pb含量分別高于對照組25.1％，16.4％，14.3％和16.1％；地下部分別高于對照組17.8％，11.7％，13.4％和23.1％。

圖3為修復136d后堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb累積量，與未施加綠木霉f7的對照相比，綠木霉f7處理均可以顯著增加堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb累積量。綠木霉f7處理組堿蓬地上部的cu、cd、zn、pb累積量分別高于對照組72.2％，60.1％，57.3％和59.7％；地下部分別高于對照組80.9％，71.5％，74.1％和89％。說明綠木霉f7可以顯著提高堿蓬對重金屬污染土壤的修復效率。

采用稀釋涂布平板法測定堿蓬根系土壤中細菌、放線菌和真菌的數(shù)量。綠木霉f7處理組堿蓬根系土壤與對照土壤微生物數(shù)量的變化如表1所示。可以看出，接種綠木霉f7對增加土壤微生物的數(shù)量，改善微生態(tài)環(huán)境起著明顯的作用。與對照組相比，綠木霉f7處理組堿蓬根系土壤中細菌、放線菌和真菌的數(shù)量分別增加了2.53倍、4.25倍和42.3倍。

表1綠木霉f7處理組與對照組堿蓬根際土壤微生物數(shù)量(個/g干土)

實施例2

供試土壤：為平度市某鎮(zhèn)農(nóng)田土壤，其基本理化性質(zhì)為：ph7.08(土水比1：2.5)，有機質(zhì)14.9g/kg，陽離子交換量18.6cmol/kg，總銅含量67.5mg/kg，總鎘含量4.15mg/kg，總鋅含量418mg/kg，總鉛含量276mg/kg。

供試堿蓬種子，采自于野外。

供試菌株：綠木霉(trichodermavirens)菌株f7jx993849，保藏編號：cgmccno.3.17613。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖(pda)培養(yǎng)基，稱取馬鈴薯200克，洗凈切塊，加去離子水煮沸30min后，過濾出上清液，加入葡萄糖20克，用去離子水定容至1000ml，121℃滅菌20min。固體培養(yǎng)基，加瓊脂15～20克。

綠木霉f7孢子懸液制備：將綠木霉f7菌種在pda斜面上進行活化，約6d后產(chǎn)孢子，加入6ml無菌水，輕輕將瓊脂表面的孢子刮下，將孢子懸浮液置于已滅菌100ml三角瓶內(nèi)，瓶中預(yù)先放置數(shù)粒無菌玻璃珠，充分震蕩后用滅菌的脫脂棉進行過濾，并用無菌水重洗濾渣2～3次。用血球計數(shù)板測定孢子濃度，并稀釋至1×10⁷個孢子/ml的孢子懸液。

綠木霉f7-堿蓬互生載體構(gòu)建：取上述制備的f7孢子懸液加入到苗高12cm人工種植的堿蓬根際土壤周圍并用無菌水進行澆灌，3d一次，持續(xù)21d，經(jīng)檢測堿蓬根際f7菌達到2×10³cfu/g以上，構(gòu)建了綠木霉f7-堿蓬互生載體；

盆栽驗：盆栽試驗設(shè)置兩個處理，處理一：ck，為不接種綠木霉f7的堿蓬對照；處理二：接種綠木霉f7的堿蓬。每處理做四次重復。盆內(nèi)徑寬40cm，長75cm，每盆中裝入風干后過2mm篩的土樣15kg，加入蒸餾水至土壤田間持水量，保持土壤含水量平衡1周后將上述步驟所得的堿蓬移種至盆中。每盆6棵。栽種行距是20cm，株距是25cm，相當于19.9株/m²土地，以利于分枝的生長。在修復過程中，保持土壤含水量為最大田間持水量的65％左右。植物生長120d后，用不銹鋼剪刀減去地上部，測定植株鮮重。用去離子水沖洗后，105℃殺青20min，70℃烘至恒重，粉碎過100目篩。保留部分根際鮮土供土壤微生物數(shù)量指標分析用。

綠木霉f7對堿蓬生物量的影響見圖4。

從圖4中可以看出，綠木霉f7處理組堿蓬地上部和地下部的生物量顯著大于對照組。綠木霉f7處理組堿蓬地上部和地下部的干重分別比對照高23.5％和32.4％。說明綠木霉f7能夠顯著提高堿蓬生物量。

堿蓬銅鎘鋅鉛含量的測定：堿蓬草樣品采用微波消解法(濃hno3與30％h2o2體積比為7:1)進行消化，隨后采用icp-ms測定cu、cd、zn和pb含量，消化以及測定過程中以國家標準物質(zhì)(gbw07603gsv-2)為內(nèi)標控制樣品分析質(zhì)量。接種綠木霉f7對堿蓬銅鎘cu、cd、zn和pb含量和累積量的影響分別見圖5、圖6。

圖5為修復120d后堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb含量，與未施加綠木霉f7的對照相比，綠木霉f7處理均可以顯著增加堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb含量。綠木霉f7處理組堿蓬地上部的cu、cd、zn、pb含量分別高于對照組36.3％，33.2％，26.5％和24.1％；地下部分別高于對照組25.5％，35.7％，24.2％和21.7％。

圖6為修復120d后堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb累積量，與未施加綠木霉f7的對照相比，綠木霉f7處理均可以顯著增加堿蓬地上部和地下部的cu、cd、zn、pb累積量。綠木霉f7處理組堿蓬地上部的cu、cd、zn、pb累積量分別高于對照組68.3％，64.5％，56.3％和53.2％；地下部分別高于對照組66.1％，79.7％，64.4％和61.1％。說明綠木霉f7可以顯著提高堿蓬對重金屬污染土壤的修復效率。

采用稀釋涂布平板法測定堿蓬根系土壤中細菌、放線菌和真菌的數(shù)量。綠木霉f7處理組堿蓬根系土壤與對照土壤微生物數(shù)量的變化如表2所示?？梢钥闯觯臃N綠木霉f7對增加土壤微生物的數(shù)量，改善微生態(tài)環(huán)境起著明顯的作用。與對照組相比，綠木霉f7處理組堿蓬根系土壤中細菌、放線菌和真菌的數(shù)量分別增加了2.36倍、4.76倍和38.5倍。

表2綠木霉f7處理組與對照組堿蓬根際土壤微生物數(shù)量(個/g干土)

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。