本發(fā)明涉及利用微生物進(jìn)行水環(huán)境治理領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種開放海域或較深淡水水域、河口等沉積物污染的修復(fù)方法。

背景技術(shù)：

海洋有機(jī)污染，特別是海洋石油溢油及石油污染問題一直是影響海洋環(huán)境和海洋生態(tài)的重要問題，目前對(duì)于海洋石油污染，特別是突發(fā)性溢油事故的應(yīng)急處理，主要針對(duì)溢油發(fā)生初期的海洋表層海水，采用物理攔截、回收、化學(xué)分散劑等方式進(jìn)行應(yīng)急處置。但是對(duì)于海底溢油或者隨水體運(yùn)動(dòng)沉降至海底沉積物中的石油污染，目前還沒有很好的物理、化學(xué)處理方法，沉積物中石油降解微生物的環(huán)境自凈和人為導(dǎo)入石油降解微生物是目前解決海洋沉積物石油污染的主要方式。

目前對(duì)于河流沉積物有機(jī)污染的治理已經(jīng)有比較成功的工程實(shí)施案例，主要是利用物理、化學(xué)、生物的方式，采用沉積物翻耕及相關(guān)修復(fù)試劑的投放的方式。但是目前海洋沉積物石油污染微生物修復(fù)大多處在理論研究和小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室模擬海洋環(huán)境實(shí)驗(yàn)層面，大規(guī)模的近海沉積物石油污染微生物修復(fù)的示范和工程還很少。這一方面是由于海洋環(huán)境特殊，海上施工對(duì)于天氣、海況、施工船只及海上操作經(jīng)驗(yàn)要求嚴(yán)格，現(xiàn)在大部分針對(duì)海洋的有機(jī)污染特別是石油污染修復(fù)，工程示范主要集中于灘涂區(qū)域，缺少開放海域沉積物污染的微生物修復(fù)方法及應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種開放海域或較深淡水水域、河口等沉積物污染的修復(fù)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種開放海域沉積物污染的修復(fù)方法，將菌株經(jīng)沸石負(fù)載并絮凝劑包覆，而后將包覆后菌劑投放至待處理水域，進(jìn)而修復(fù)水域內(nèi)沉積物石油及有機(jī)污染物；

所述菌株為醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌中的一種或幾種的混合；其中，醋酸鈣不動(dòng)桿菌已于2010年6月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCCNo.3887；惡臭假單胞菌已于2010年11月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCC No.4311；沙福芽孢桿菌已于2016年9月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCC No.13059。

所述修復(fù)開放海域中石油污染沉積物時(shí)采用的菌株為醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌中的一種或幾種。

所述沉積物修復(fù)主要針對(duì)有機(jī)污染嚴(yán)重的開放海域或較深淡水水域、河口，即近海及河口沉積物，包括石油污染、抗生素污染、雌激素污染等。

所述修復(fù)開放海域中抗生素污染沉積物時(shí)采用的菌株為醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌總菌量控制在1×10⁹CFU/ml-5×10⁹CFU/ml之間，并且3株菌株按菌株個(gè)數(shù)2∶2∶1的比例混合；

所述修復(fù)開放海域中石油污染沉積物時(shí)采用的菌株為醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌總菌量控制在1×10⁹CFU/ml-5×10⁹CFU/ml之間，并且3株菌株按菌株個(gè)數(shù)3∶2∶4的比例混合；

所述菌株菌液與以沸石進(jìn)行混合，而后再加入聚谷氨酸進(jìn)行包覆，經(jīng)包覆后加入至天然纖維材質(zhì)包裝，待用。

所述菌液與沸石按1∶1-2∶1質(zhì)量比混合；

所述7％聚谷氨酸與上述菌液的質(zhì)量比為1∶10。所述天然纖維材質(zhì)為麻袋，每包產(chǎn)品量為5-10kg。

所述沸石為粒徑在1-5毫米。

具體步驟如下：

(1)土著降解微生物：污染修復(fù)微生物的選擇應(yīng)避免外來物種的引入，以修復(fù)海域沉積物中的土著菌種作為菌種來源，以待修復(fù)的污染物(石油或其他有機(jī)物)作為唯一碳源，通過富集培養(yǎng)和分離培養(yǎng)，篩選能夠高效降解待修復(fù)污染物的微生物菌株；

其中，菌株為醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌中的一種或幾種的混合；其中，醋酸鈣不動(dòng)桿菌已于2010年6月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCC No.3887；惡臭假單胞菌已于2010年11月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCC No.4311；沙福芽孢桿菌已于2016年9月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCC No.13059。

上述中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

(2)微生物菌株的組合：充分發(fā)揮生物之間的協(xié)同作用，通過正交實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)比例進(jìn)行不同菌株濃度分配，得到最佳降解效果的菌株組合比例；

其中，醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌總菌量控制在1×10⁹CFU/ml-5×10⁹CFU/ml之間，并且3株菌株按菌株個(gè)數(shù)2∶2∶1的比例混合；

醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌總菌量控制在1×10⁹CFU/ml-5×10⁹CFU/ml之間，并且3株菌株按菌株個(gè)數(shù)3∶2∶4的比例混合。

(3)沸石負(fù)載及包覆：以1-5毫米粒徑的沸石作為吸附材料，對(duì)單一或組合菌株進(jìn)行吸附，為減少菌株投放過程中的損失、減緩菌株在海洋沉積物中的釋放速度，需對(duì)吸附菌株的沸石進(jìn)行絮凝劑(絮凝劑為聚谷氨酸)的包裹；

上述采用沸石其粒徑越小吸附效率越高，但沉降速度越慢，投放逸散越大；沸石吸附菌液后控水濾液，沸石含水率在50-70％時(shí)，采用7％的聚谷氨酸包裹。

(4)菌劑投放包裝：采用小包裝的天然纖維材質(zhì)包裝(如麻袋)，包裝大小需要根據(jù)水深進(jìn)行判斷(1-5千克)；

(5)菌劑投放：投放過程采用傳送帶拋投的方式，根據(jù)海域面積及石油污染情況進(jìn)行傳送帶間距設(shè)置及拋投速度的確定；

(6)跟蹤監(jiān)測：投放后，需對(duì)修復(fù)效果進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，根據(jù)修復(fù)海域水溫及污染情況進(jìn)行跟蹤監(jiān)測時(shí)間的確定(1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月)。

上述最終投放微生物菌株需要通過安全評(píng)估，保證大規(guī)模投放不會(huì)對(duì)海域造成生物污染和二次污染。

獲得的菌劑包裝必須為純天然可降解材質(zhì)，保證不會(huì)向修復(fù)海域引入難降解污染物，材質(zhì)的快速降解能夠保證污染物降解菌的釋放效果。

獲得菌劑投放過程中，可配合水下監(jiān)視監(jiān)控系統(tǒng)，進(jìn)行拋投效果的確定；水下監(jiān)視監(jiān)控系統(tǒng)需保證充足照明，拋投過程中沉積物的擾動(dòng)會(huì)影響觀測效果。

跟蹤監(jiān)測主要目標(biāo)為：海域沉積物及上覆水的石油烴含量、海域沉積物及上覆水的微生物細(xì)菌密度、海域沉積物中的沸石顆粒。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明方法通過篩選獲得土著降解的菌株，將獲得菌株進(jìn)行負(fù)載、絮凝、包埋而后應(yīng)用海域進(jìn)行修復(fù)，采用本發(fā)明的修復(fù)方式能夠最大程度的保證修復(fù)菌株到達(dá)指定海底沉積物，且能夠保證菌株的修復(fù)效果；菌劑在投放時(shí)不需要復(fù)雜儀器設(shè)備，且能夠保證投放效果和修復(fù)效果。綜上所述，本發(fā)明方法是一種科學(xué)、合理、高效、安全，且操作較簡單、適用于水深2-50米的開放水域的沉積物污染修復(fù)，具體為：

土著降解微生物的篩選是污染修復(fù)微生物的篩選和使用，應(yīng)避免外來物種的引入，以修復(fù)海域沉積物中的土著菌種作為菌種來源，以待修復(fù)的污染物(石油或其他有機(jī)物)作為唯一碳源，通過富集培養(yǎng)和分離培養(yǎng)，篩選能夠高效降解待修復(fù)污染物的微生物菌株；

本發(fā)明菌株篩選采集于待修復(fù)區(qū)域的沉積物樣品，從沉積物樣品中篩選土著降解菌株，進(jìn)而可以有效避免外來物種的引入，避免造成大規(guī)模的生物污染，破壞海洋生態(tài)；對(duì)于單一菌株，需要進(jìn)行生物急性毒性試驗(yàn)，評(píng)估其安全性，對(duì)于有明顯致死效應(yīng)的菌株，應(yīng)該在產(chǎn)品中剔除。不同菌株的組合可以采用96孔板法，可有效減少菌株組合時(shí)工作量和工作時(shí)間。同時(shí)通過菌株間的協(xié)同作用獲得復(fù)合菌株，對(duì)環(huán)境中多種有機(jī)污染進(jìn)行降解和修復(fù)，如石油、抗生素污染等，另外多種菌株復(fù)合投放，更有利于形成生物膜，增加菌株成活概率和污染物降解效果。

將上述獲得菌株經(jīng)負(fù)載、絮凝、包埋獲得菌劑，吸附材料選擇可根據(jù)水深進(jìn)行選擇，沸石適用于較深水域的沉積物修復(fù)，且沸石粒徑應(yīng)在1毫米以上，確保菌劑能夠快速沉降至海底，以減少菌劑在下落過程中，在水體中的損失；采用絮凝劑的團(tuán)聚和包埋，也可減少菌劑投放時(shí)的損失。絮凝劑選擇需要考慮pH及生物可降解性，由于微生物生長條件的限制，絮凝劑工作時(shí)的pH應(yīng)維持在5-8之間，特殊噬酸或噬堿微生物可根據(jù)微生物的最適生長條件，確定絮凝劑；綠色可降解的絮凝劑，不僅能夠使菌劑團(tuán)聚，還能為微生物提供一定碳源，保證修復(fù)微生物的生長。菌劑包裝采用純天然可降解材質(zhì)，保證不會(huì)向修復(fù)海域引入難降解污染物，材質(zhì)的快速降解能夠保證污染物降解菌的釋放效果。具體分包重量需要根據(jù)水深和水流情況進(jìn)行確定，具體分包標(biāo)準(zhǔn)是在保證菌包的投放范圍(偏移范圍)內(nèi)，盡量選擇較小的包裝，但菌包沉降至海底沉積物的偏移范圍與菌包大小和水流速度直接相關(guān)，確定菌包大小前可通過數(shù)值模擬進(jìn)行判斷。

上述本發(fā)明獲得菌包投放過程應(yīng)保證操作施工的安全性，小包裝菌包海面拋灑可最大程度的保證安全性，傳送帶的輸送，可減少人力支出，加快投放速度和投放均勻度。另外，在菌劑投放過程中，可配合水下監(jiān)視監(jiān)控系統(tǒng)，進(jìn)行拋投效果的確定；水下監(jiān)視監(jiān)控系統(tǒng)需保證充足照明，拋投過程中沉積物的擾動(dòng)會(huì)影響觀測效果。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同菌株混合比例的石油降解效率對(duì)比圖

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的海域沉積物石油污染修復(fù)效果評(píng)估結(jié)果圖(其中A為石油中C₁₂-C₂₇修復(fù)效果；B為輕重?zé)N比值下降情況；C為石油中多環(huán)芳烴修復(fù)效果)。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的單菌株與復(fù)合菌種對(duì)呋喃唑酮的降解效果對(duì)比圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的載體吸附前后呋喃唑酮的降解效率對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實(shí)施例。

本發(fā)明方法主要針對(duì)水深在2-50米的海水/淡水水域，對(duì)沉積物的石油污染及其他有機(jī)污染有很好的修復(fù)效果，該方法系統(tǒng)完整且操作方法簡單、沉積物修復(fù)效果顯著、無二次污染且海上施工安全性較高，特別適合特殊功能性海域，如石油開采區(qū)、水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)等，能夠指導(dǎo)海洋沉積物污染修復(fù)工程的實(shí)施。

本發(fā)明采用的菌株從待修復(fù)區(qū)域的沉積物樣品中獲得土著降解菌株，其有效避免外來物種的引入，避免造成大規(guī)模的生物污染，破壞海洋生態(tài)；菌劑吸附材料(例如沸石等)選擇可根據(jù)水深進(jìn)行選擇，沸石適用于較深水域的沉積物修復(fù)，且沸石粒徑應(yīng)在1毫米以上，確保菌劑能夠快速沉降至海底，以減少菌劑在下落過程中，在水體中的損失；采用絮凝劑的團(tuán)聚和包埋，也可減少菌劑投放時(shí)的損失。

其中，絮凝劑選擇需要考慮pH及生物可降解性，由于微生物生長條件的限制，絮凝劑工作時(shí)的pH應(yīng)維持在5-8之間；綠色可降解的絮凝劑，不僅能夠使菌劑團(tuán)聚，還能為微生物提供一定碳源，保證修復(fù)微生物的生長。

并在在獲得菌劑時(shí)采用純天然可降解材質(zhì)進(jìn)行包裝，保證不會(huì)向修復(fù)海域引入難降解污染物，材質(zhì)的快速降解能夠保證污染物降解菌的釋放效果。具體分包重量需要根據(jù)水深和水流情況進(jìn)行確定，具體分包標(biāo)準(zhǔn)是在保證菌包的投放范圍(偏移范圍)內(nèi)，盡量選擇較小的包裝，但菌包沉降至海底沉積物的偏移范圍與菌包大小和水流速度直接相關(guān)，確定菌包大小前可通過數(shù)值模擬進(jìn)行判斷。

上述獲得菌劑菌包投放過程應(yīng)保證操作施工的安全性，小包裝菌包海面拋灑可最大程度的保證安全性，傳送帶的輸送，可減少人力支出，加快投放速度和投放均勻度。另外，在菌劑投放過程中，可配合水下監(jiān)視監(jiān)控系統(tǒng)，進(jìn)行拋投效果的確定；水下監(jiān)視監(jiān)控系統(tǒng)需保證充足照明，拋投過程中沉積物的擾動(dòng)會(huì)影響觀測效果。

修復(fù)后的跟蹤監(jiān)主要針對(duì)海域沉積物及上覆水的有機(jī)污染含量、海域沉積物及上覆水的微生物細(xì)菌密度、海域沉積物中的沸石顆粒三個(gè)方面進(jìn)行效果的評(píng)估。

實(shí)施例1高效石油降解菌的篩選及組合

以煙臺(tái)海域沉積物中的微生物作為高效石油降解菌來源，篩選對(duì)石油污染具有很好降解效果的土著菌株，并按最大降解效果比例進(jìn)行菌液混合，吸附于沸石表面，并用被膜劑包裹，最終進(jìn)行分包投放，完成渤海指定海域沉積物石油污染的生物修復(fù)。

(1)菌株篩選：稱取2g石油污染的海水沉積物樣品分別加入盛有海水培養(yǎng)基和淡水培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃，180r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)3d后，移取1mL培養(yǎng)液接入篩選培養(yǎng)基中，30℃，180r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)5d后，移取1mL培養(yǎng)液接入新的篩選培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)5d，共重復(fù)3次。經(jīng)3個(gè)周期培養(yǎng)后取培養(yǎng)液，梯度稀釋后分別涂布于海水固體培養(yǎng)基和淡水固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)12-24h，挑選不同形態(tài)單一菌落進(jìn)行劃線、純化培養(yǎng)，直至得到無雜菌的單一菌落。

(2)微生物菌株：醋酸鈣不動(dòng)桿菌(T32)、惡臭假單胞菌(SP1)、沙福芽孢桿菌(Bb)。最終篩選出對(duì)石油7日降解效率高于50％的菌株三株，經(jīng)鑒定分別為醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌。

(3)最大降解效果比例：按照水平正交實(shí)驗(yàn)中的比例進(jìn)行菌株組合，采用96孔板方式進(jìn)行不同組合比例的石油降解效果對(duì)比，選擇最佳降解比例。經(jīng)試驗(yàn)，醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌的最佳組合比例為3∶2∶4。(附圖1)

步驟(1)中的培養(yǎng)基配方為：

海水培養(yǎng)基：Trypton 5g，Yeast Extract 1g，F(xiàn)e₂(PO4)₃ 0.01g，加入陳海水至1L，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2。海水固體培養(yǎng)基：海水培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入20g瓊脂。

淡水培養(yǎng)基：Trypton 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，加入蒸餾水至1L，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2。淡水固體培養(yǎng)基：淡水培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入20g瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：2g原油(蓬萊溢油事故的石油)加入1L MM培養(yǎng)基中。

MM培養(yǎng)基：NH₄NO₃ 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO₄ 0.2g，螯合態(tài)鐵溶液1mL(FeSO₄·7H₂O 0.246g，EDTA二鈉0.331g，dH2O up to 100mL)，微量元素溶液1mL(Na₂MoO₄·2H₂O 0.01g，MnCl₂0.02g，CoCl₂·6H₂O 0.0002g，ZnSO₄·7H₂O 0.01g，CuSO₄·5H₂O 0.02g，ddH2O up to 100mL，2％wt/vol K₂CO₃調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2)，ddH₂O up to1L，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2。

步驟(3)中，具體實(shí)驗(yàn)方法：

A.取一定量的原油，分別溶于一定量的石油醚、正己烷和1∶1的石油醚正己烷混合液中，制成0.5％的石油萃取物溶液，離心過濾，將混合均勻的石油溶液注入96孔板中，每孔加300ul，通風(fēng)處中過夜，使有機(jī)溶劑揮發(fā)，石油留在孔板側(cè)壁和底部。

B.3種菌種取出，分別活化，擴(kuò)大培養(yǎng)(擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為步驟(1)中的海水培養(yǎng)基)，約培養(yǎng)至OD＝1，8000r常溫離心1min，收集菌體，用MM培養(yǎng)基重懸沖洗，離心沖洗三遍，以MM重懸，而后按菌落個(gè)數(shù)比為1∶1∶1、1∶2∶2、1∶3∶3、1∶4∶4、2∶1∶2、2∶2∶1、2∶3∶4、2∶4∶3、3∶1∶3、3∶2∶4、3∶3∶1、3∶4∶2、4∶1∶4、4∶2∶3、4∶3∶2、4∶4∶1不同的比例將上述重懸的菌液混合，并用MM補(bǔ)足300ul，空白MM作為對(duì)照，每種比例重復(fù)三次，放入培養(yǎng)箱中，28攝氏度培養(yǎng)。

C.7天后取出孔板，低溫烘干，分別以石油醚、正己烷和1∶1的石油醚正己烷混合液復(fù)溶孔板中的石油，并于225nm波長下測定各孔板的紫外吸光度，確定石油的降解效率(參見圖1)。

其中石油醚萃取物代表長鏈?zhǔn)蜔N，正己烷萃取物代表短鏈?zhǔn)蜔N，混合萃取物即為混合石油烴，通過對(duì)三種不同石油烴的最適合降解比例的研究，可以針對(duì)不同類型的石油污染物進(jìn)行不同比例菌株的混合，以達(dá)到最佳效果，即，針對(duì)污染物為短鏈?zhǔn)蜔N成分，菌株菌落個(gè)數(shù)比為1∶2∶2；針對(duì)污染物為長鏈?zhǔn)蜔N成分，菌株菌落個(gè)數(shù)比為4∶3∶2；針對(duì)污染物為混合石油烴成分，菌株菌落個(gè)數(shù)比為3∶2∶4。大部分石油污染均為混合石油烴污染。

實(shí)施例2海域沉積物石油污染微生物修復(fù)

對(duì)渤海海域沉積物石油污染進(jìn)行修復(fù)。

(1)修復(fù)菌株：醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌和沙福芽孢桿菌。

(2)菌株發(fā)酵及混合：三種菌株分別進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，發(fā)酵后菌液分別濃度為2-3OD。發(fā)酵后醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌按照菌株菌落各數(shù)比3∶2∶4進(jìn)行菌液混合，混合菌液中總菌量約為1×10⁹CFU/ml，混合后于4攝氏度冷庫冷藏保存。

(3)菌液的吸附與包裹：混合后的菌液按菌液與沸石質(zhì)量比2∶1進(jìn)行混合吸附，吸附時(shí)間為2小時(shí)，混合后于過水篩空水，待吸附菌液的沸石含水率為60％-70％后，噴入7wt％聚谷氨酸溶液，并不斷混拌，直至沸石成團(tuán)且無流動(dòng)液體，制成石油修復(fù)菌劑，并置于內(nèi)附防水不透氣膜的噸袋中4℃保存。所述7％聚谷氨酸與上述混合菌液的質(zhì)量比為1∶10。

(4)菌劑分包及投放：根據(jù)水深(25-30米)、水流(0.1-0.6m/s)情況，進(jìn)行數(shù)值模擬，確定菌包大小為5kg，以天然易降解的麻袋作為包裝材料，快速進(jìn)行分包后，每20袋小包裝統(tǒng)一包裝在內(nèi)附防水不透氣膜的噸袋內(nèi)，便于運(yùn)輸。分包結(jié)束，立刻進(jìn)行海上投放。

(5)修復(fù)后的跟蹤監(jiān)測：菌劑投放結(jié)束后一個(gè)月，進(jìn)行一次修復(fù)效果監(jiān)測評(píng)估，主要的監(jiān)測項(xiàng)目有海域沉積物及上覆水的石油烴含量、海域沉積物及上覆水的微生物細(xì)菌密度、海域沉積物中的沸石顆粒等，通過修復(fù)后效果評(píng)估，大部分修復(fù)站位的石油降解效率在50％以上，石油含量較高的部分站位降解效率可高達(dá)70-80％。(參見圖2)

步驟(4)中海上投放方法采用傳送帶拋投法，根據(jù)船體寬度及菌劑投放量設(shè)置傳送帶間隔：

傳送帶：長9.6m，每隔1.6m進(jìn)行標(biāo)記；

傳送帶間隔：3m；

傳送帶數(shù)量：3條；

輸送機(jī)帶速：0.8m/s；

船速：3節(jié)(根據(jù)實(shí)際情況可進(jìn)行調(diào)整)(約1.5m/s)；

投放速度：每2秒一袋；

船只間隔9m往返航行。

步驟(5)中修復(fù)后的跟蹤監(jiān)測結(jié)果顯示：對(duì)于修復(fù)后初次采集樣品，本底石油含量較高的站位5、6，修復(fù)效果最好，正構(gòu)烷烴含量分別降解了65.0％和39.6％。受微生物降解的影響，其中輕重?zé)N比值LMW/HMW相對(duì)于修復(fù)前總體呈減小趨勢。組合菌對(duì)C15-C27前的烷烴利用較好，降解率較高，達(dá)18.05-89.50％；對(duì)高碳數(shù)鏈烷烴n-C28-n-C36的烷烴利用效果較差，降解效率低。多環(huán)芳烴與正構(gòu)烷烴類似，其中本底石油含量較高的站位5和6修復(fù)效果最好，多環(huán)芳烴含量分別降解了48.54％和78.62％，其它點(diǎn)位降解率為25％-52％。(圖2)

實(shí)施例3海水中呋喃唑酮類抗生素污染的微生物修復(fù)

通醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌及沙福芽孢桿菌的組合菌劑，對(duì)海水中呋喃唑酮類抗生素抗生素具有很好的降解效果。

(1)微生物菌株：醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌；

(2)菌株的組合：按照三水平三因素正交試驗(yàn)進(jìn)行濃度比例將醋酸鈣不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌、沙福芽孢桿菌三種菌株濃度比例為2∶2∶1混合，最終以總菌量為1×10⁸接種于含有500ppm呋喃唑酮的無機(jī)鹽蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以未接種降解菌株的含有呋喃唑酮的無機(jī)鹽蛋白胨液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。在不同的時(shí)間點(diǎn)取出500ul的培養(yǎng)液，13，000rpm離心5min，收集上清液。以HPLC檢測并計(jì)算不同菌株組合的呋喃唑酮降解效率。

(3)載體吸附對(duì)降解效率的影響：以沸石作為載體，篩選降解效果最好的菌株比例，各菌株單獨(dú)培養(yǎng)后按比例混合，以粒徑1-2mm的沸石吸附，吸附后加入至含有不同濃度的呋喃唑酮的無機(jī)鹽蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以未以載體吸附菌株的含有呋喃唑酮的無機(jī)鹽蛋白胨液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。在不同的時(shí)間點(diǎn)取出500ul的培養(yǎng)液，13，000rpm離心5min，收集上清液。以HPLC檢測并計(jì)算不同菌株組合的呋喃唑酮降解效率。

步驟(2)中無機(jī)鹽蛋白胨培養(yǎng)基的配方為：Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，NaCl 3g/L，MgSO₄ 0.3g/L，Tryptone 2.5g/L；調(diào)節(jié)pH6.0-8.0，121℃條件下滅菌30分鐘。

步驟(2)、(3)中高效液相色譜檢測條件為：液相色譜儀：skyrayLC-310液相色譜系統(tǒng)；色譜柱:WATERC18柱250mm×416mm,粒度5μm；檢測條件為流動(dòng)相,V(乙腈):V(乙酸水溶液)[V(乙酸)：V(水)＝1：1000]＝55：45；進(jìn)樣量為20μL；溫度為25℃；紫外檢測器檢測參數(shù)為檢測波長365nm。

結(jié)果證明，菌株的組合優(yōu)化和沸石載體吸附可大幅度提高呋喃唑酮的降解效率。(圖3，圖4)

通過以上實(shí)例，已經(jīng)充分證明了本方法的可行性、有效性及便捷性，能夠以最少的成本，達(dá)到最好的海洋沉積物石油修復(fù)效果，該方法同樣適用于海洋其他有機(jī)污染的修復(fù)，只需篩選針對(duì)不同污染物的高效降解微生物即可。我國很多功能性海域/水域受污染十分嚴(yán)重，但是真正的海洋/淡水沉積物修復(fù)的案例并不多，也缺乏相應(yīng)的指導(dǎo)方法。本方法很好的補(bǔ)充了這方面的不足。