本發(fā)明涉及重金屬防治領(lǐng)域，尤其涉及一種提取重金屬抗性菌株分泌多肽治理重金屬污染土壤的方法。
背景技術(shù)：
重金屬污染指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染。主要由采礦、廢氣排放、污水灌溉和使用重金屬超標(biāo)制品等人為因素所致。因人類活動導(dǎo)致環(huán)境中的重金屬含量增加，超出正常范圍，直接危害人體健康，并導(dǎo)致環(huán)境質(zhì)量惡化。2011年4月初，我國首個“十二五”專項規(guī)劃——《重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃》獲得國務(wù)院正式批復(fù)，防治規(guī)劃力求控制5種重金屬。
與大氣和水污染相比，土壤修復(fù)顯得更加困難。農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤重金屬污染防治專家組成員、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院教授蘇德純表示，不僅土壤污染危害嚴(yán)重，并且與一些有機(jī)污染物不同，土壤中的重金屬無法降解，與土壤分離難度非常大，修復(fù)非常困難。
在國內(nèi)已申請的相關(guān)專利中，專利《一種重金屬污染土壤的微生物修復(fù)方法》（申請?zhí)枺?01110122739.6，公開日：2011-11-16）公開了一種利用球形紅細(xì)菌制劑配合淹水治理土壤的方法，其工作原理主要為利用球形紅細(xì)菌在富水厭氧環(huán)境下大量繁殖后吸附重金屬，再經(jīng)由水滲入地下降低土壤中的重金屬濃度，但其在治理過程中土壤不能用于種植作業(yè)，經(jīng)濟(jì)成本高，另一方面，菌種過于單一，普適性差，適用范圍小，能治理的重金屬種類及程度均較低；專利《重金屬污染土壤微生物修復(fù)劑及其應(yīng)用》（申請?zhí)枺?01410682558.2，公開日：2015-04-22）公開了一種采用枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母作為有效成份的重金屬污染土壤治理劑，該發(fā)明的生物修復(fù)劑可以吸附一定比例的重金屬，并可在土壤中存留一段時間，但熱帶假絲酵母屬厭氧菌類，在干燥通風(fēng)的土壤中無法長期存活，而枯草芽孢桿菌作為需氧菌則無法在濕性土壤中長久存活，兩種有效菌種生存環(huán)境相沖突，另一方面，有效菌株類太少，治理效率低下，并且由于每種微生物都有其局限，因此其治理土壤的效果既不長效、也不全面。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明旨在提供一種針對性強(qiáng)、適用范圍廣、治理效率高的提取重金屬抗性菌株分泌多肽治理重金屬污染土壤的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種提取重金屬抗性菌株分泌多肽治理重金屬污染土壤的方法，包括重金屬抗性菌株的篩選、抗性菌株的培養(yǎng)、目標(biāo)多肽的提取、土壤的治理四個步驟，其特征在于：
所述重金屬抗性菌株的篩選包括以下步驟：
①重金屬含量的測量；
②根據(jù)步驟①測量出的超標(biāo)重金屬種類，選擇對應(yīng)的含菌廢舊重金屬或含菌重金屬礦渣；
③將步驟②選擇的廢舊重金屬或重金屬礦渣上的微生物提取后對廢舊重金屬或重金屬礦渣進(jìn)行滅菌處理，再將滅菌后的廢舊重金屬或重金屬礦渣以重金屬總重占培養(yǎng)基營養(yǎng)質(zhì)總重20g/kg-40g/kg的投加量加入芽孢桿菌屬細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)固體培養(yǎng)基；
④采用平板劃線法將步驟③獲得的培養(yǎng)基劃分為4個區(qū)，在第一區(qū)即接種區(qū)移植步驟③提取的微生物，在室溫下進(jìn)行培養(yǎng)直至第4區(qū)即目標(biāo)區(qū)出現(xiàn)5株以上菌株，反復(fù)操作至少一次后最終獲得目標(biāo)重金屬抗性菌株，該菌株為芽孢桿菌屬細(xì)菌；
抗性菌株的培養(yǎng)具體為：采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基對篩選出的重金屬抗性菌株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35℃-40℃，培養(yǎng)時間1-2天；
目標(biāo)多肽的提取具體為：將培養(yǎng)后的抗性菌株移植入標(biāo)準(zhǔn)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度35℃-40℃，以100r/min-150r/minin的速率搖瓶1.5-3天，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液以4500-6000r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心處理，離心處理時間為30min-40min，離心后發(fā)酵液的上清液即為目標(biāo)多肽溶液；
所述土壤的治理具體為：將提取的目標(biāo)多肽溶液以目標(biāo)土壤重量計1g/kg-3g/kg的添加量均勻灑入目標(biāo)土壤，然后將目標(biāo)土壤耕犁、翻混，以12h-24h為一個治理周期進(jìn)行反復(fù)治理，直至測量土壤中的重金屬離子含量達(dá)標(biāo)為止。
與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明由于采用了上述方案，具有以下優(yōu)點：事先進(jìn)行測量后有目的地進(jìn)行對應(yīng)重金屬的抗性菌株培養(yǎng)，由于芽孢桿菌屬細(xì)菌種類繁多且多肽分泌量大，因此為目標(biāo)微生物的最佳選擇；由于經(jīng)過針對性的篩選和純化，最終獲得的目標(biāo)微生物必是對應(yīng)重金屬的抗性菌株，所謂抗性菌株的抗性原理即為這類菌株表面的多肽能與目標(biāo)重金屬形成沉淀后固后，不會讓其進(jìn)行胞體危害菌株本身的生存，抗性越強(qiáng)反映其表面多肽越多、對對應(yīng)重金屬沉淀能力越強(qiáng)，因此從這類菌株上提取的多肽極具針對性；由于多肽與重金屬的反應(yīng)很快，等同于化學(xué)反應(yīng)，而多肽也不會對污境造成污染，形成沉淀后的重金屬也不會再危害作物與人體，也不會重新變?yōu)橛坞x態(tài)危害環(huán)境，因此可以快速地達(dá)到治理重金屬污染土壤的目的，又由于多肽在富水環(huán)境下更易與游離的重金屬離子結(jié)合沉淀，因此本發(fā)明最適宜的治理環(huán)境為濕潤土壤。
具體實施方式
實施例1：
一種提取重金屬抗性菌株分泌多肽治理重金屬污染土壤的方法，包括重金屬抗性菌株的篩選、抗性菌株的培養(yǎng)、目標(biāo)多肽的提取、土壤的治理四個步驟，其中：
所述重金屬抗性菌株的篩選包括以下步驟：
①重金屬含量的測量，本實施例中超標(biāo)重金屬包括Pb、Cu、Zn、Cd四種；
②選擇Pb、Cu、Zn、Cd的含菌廢舊重金屬或含菌重金屬礦渣；
③將步驟②選擇的廢舊重金屬或重金屬礦渣上的微生物提取后對廢舊重金屬或重金屬礦渣進(jìn)行滅菌處理，再將滅菌后的廢舊重金屬或重金屬礦渣以重金屬總重占培養(yǎng)基營養(yǎng)質(zhì)總重20g/kg-40g/kg的投加量加入芽孢桿菌屬細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)固體培養(yǎng)基；
④采用平板劃線法將步驟③獲得的培養(yǎng)基劃分為4個區(qū)，在第一區(qū)即接種區(qū)移植步驟③提取的微生物，在室溫下進(jìn)行培養(yǎng)直至第4區(qū)即目標(biāo)區(qū)出現(xiàn)5株以上菌株，反復(fù)操作至少一次后最終獲得目標(biāo)重金屬抗性菌株，該菌株為芽孢桿菌屬細(xì)菌；
抗性菌株的培養(yǎng)具體為：采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基對篩選出的重金屬抗性菌株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35℃-40℃，培養(yǎng)時間1-2天；
目標(biāo)多肽的提取具體為：將培養(yǎng)后的抗性菌株移植入標(biāo)準(zhǔn)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度35℃-40℃，以100r/min-150r/minin的速率搖瓶1.5-3天，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液以4500-6000r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心處理，離心處理時間為30min-40min，離心后發(fā)酵液的上清液即為目標(biāo)多肽溶液；
所述土壤的治理具體為：將提取的目標(biāo)多肽溶液以目標(biāo)土壤重量計1g/kg-3g/kg的添加量均勻灑入目標(biāo)土壤，然后將目標(biāo)土壤耕犁、翻混，以12h-24h為一個治理周期進(jìn)行反復(fù)治理，直至測量土壤中的重金屬離子含量達(dá)標(biāo)為止。
本實施例在實驗土壤里進(jìn)行實地效果驗證，情況如下：取重慶市某重金屬污染土壤作為實驗土壤，對土壤內(nèi)的Pb、Cu、Zn、Cd分別進(jìn)行5次測量后取平均值，其中Pb含量以重量計為89.23mg/kg，Cu含量以重量計為95.14mg/kg，Zn含量以重量計為234.96mg/kg，Cd含量以重量計為1.49 mg/kg；按本實施例實施方式實施后12h，再以同樣方式進(jìn)行檢測，結(jié)果為：Pb含量以重量計為7.34mg/kg，Cu含量以重量計為8.77mg/kg，Zn含量以重量計為21.35mg/kg，Cd含量以重量計為0.17 mg/kg；重新投加一次多肽后12h，再以同樣方式進(jìn)行檢測，結(jié)果為：Pb含量以重量計為2.55mg/kg，Cu含量以重量計為3.02mg/kg，Zn含量以重量計為9.17mg/kg，Cd含量以重量計為0.03 mg/kg。
國家標(biāo)準(zhǔn)為：Pb（鉛）含量以重量計不大于35mg/kg，Cu（銅）含量以重量計不大于35mg/kg，Zn（鋅）含量以重量計不大于100mg/kg，Cd（鎘）含量以重量計不大于0.20 mg/kg。
本發(fā)明的工作原理為：
事先進(jìn)行測量后有目的地進(jìn)行對應(yīng)重金屬的抗性菌株培養(yǎng)，由于芽孢桿菌屬細(xì)菌種類繁多且多肽分泌量大，因此為目標(biāo)微生物的最佳選擇；由于經(jīng)過針對性的篩選和純化，最終獲得的目標(biāo)微生物必是對應(yīng)重金屬的抗性菌株，所謂抗性菌株的抗性原理即為這類菌株表面的多肽能與目標(biāo)重金屬形成沉淀后固后，不會讓其進(jìn)行胞體危害菌株本身的生存，抗性越強(qiáng)反映其表面多肽越多、對對應(yīng)重金屬沉淀能力越強(qiáng)，因此從這類菌株上提取的多肽極具針對性；由于多肽與重金屬的反應(yīng)很快，等同于化學(xué)反應(yīng)，而多肽也不會對污境造成污染，形成沉淀后的重金屬也不會再危害作物與人體，也不會重新變?yōu)橛坞x態(tài)危害環(huán)境，因此可以快速地達(dá)到治理重金屬污染土壤的目的，又由于多肽在富水環(huán)境下更易與游離的重金屬離子結(jié)合沉淀，因此本發(fā)明最適宜的治理環(huán)境為濕潤土壤。
本發(fā)明尤其適用于富水、溫潤土壤或洼地。
對所公開的實施例的上述說明，僅為了使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。