本發(fā)明涉及兩株非脫羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)在無機鹽培養(yǎng)基中高效降解正十六烷的應(yīng)用。該菌株可以在不同條件下發(fā)揮好氧降解底物的能力，代謝終產(chǎn)物為CO₂和H₂O，通過搖瓶實驗為其在土壤和沉積物環(huán)境中烷烴修復(fù)的可行性提供理論基礎(chǔ)。

背景技術(shù)：

原油在開采、運輸及儲存過程中常發(fā)生原油泄漏事件，致使大量石油烴進(jìn)入海洋、土壤環(huán)境，造成水體污染、土壤污染鹽漬化及生物毒害等問題受到極大關(guān)注。石油烴組分復(fù)雜，具有疏水性強且毒性大的特點，主要包含烷烴、芳香烴和鹵代芳烴，其中烷烴含量占50％-95％是主要的污染物，例如石油中的石蠟基輕質(zhì)油主要成分就是直鏈C16-C36，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)16.5％，黏度較大易在水體、土壤植物表面形成油膜，影響生物的呼吸和蒸騰作用。正十六烷(簡稱C16)作為直鏈烷烴重要組分之一，常被用作測定柴油燃燒質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，常溫下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、難揮發(fā)、疏水性強使得其難以自然降解，對環(huán)境造成持久性污染。關(guān)于石油烴的降解主要利用生物法，依靠環(huán)境中較活躍的微生物對污染物轉(zhuǎn)化和降解。

目前為止，已發(fā)現(xiàn)能降解石油中直鏈烷烴常見的微生物主要有假單胞菌屬(pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節(jié)桿菌屬(Archrobacter)、諾卡式菌屬(Nocardia)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、戈登氏菌屬(Gordonia)及放線菌屬(Actinomycetes)等。從含油活性污泥中篩出的非脫羧勒克菌屬(Leclercia adecarboxylata)具有降解石油烴的報道只有Sarma發(fā)現(xiàn)其能降解多環(huán)芳烴芘，而本發(fā)明則是首次發(fā)現(xiàn)該菌具有高效降解正十六烷的能力。直鏈烷烴最常見的好氧代謝途徑是單末端氧化，即烷烴末端甲基被氧化轉(zhuǎn)變成對應(yīng)的醇，接著依次氧化為對應(yīng)的醛和脂肪酸。脂肪酸經(jīng)β-氧化生成小分子乙酸，烷烴逐步被分解完畢。還有部分微生物代謝直鏈烷的途徑是次末端氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)橹俅?，依次氧化為酮和酯，同時酯易裂解為伯醇和脂肪酸，后續(xù)途徑同上。Rittman發(fā)現(xiàn)，代謝直鏈烷烴的微生物的途徑主要是單末端氧化，次末端則是次要的。

非脫羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)國內(nèi)有關(guān)報道，初見于臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，其為腸桿菌科的一種，對抗菌藥物還具有一定的耐藥性；該菌已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心得到保藏，為公眾可獲得的菌種。關(guān)于該菌具有生物修復(fù)污染環(huán)境的研究，只見于國內(nèi)學(xué)者馬娟利用該菌修復(fù)受壬基酚污染的水體環(huán)境，以及國外學(xué)者Sarma利用該菌高效降解多環(huán)芳烴芘，前者降解機理十分復(fù)雜，后者為開環(huán)氧化。上述降解機制均不能應(yīng)用于直鏈烷烴的降解。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，基于非脫羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)具有單末端氧化正十六烷的特性，提供其在降解正十六烷中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種非脫羧勒克菌在降解正十六烷中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，上述應(yīng)用具體如下：將OD值為0.6～0.8的非脫羧勒克菌富集液接種至正十六烷體積濃度為0.05％-1％的無機鹽培養(yǎng)基(MSM)中，非脫羧勒克菌富集液與培養(yǎng)基的體積比為1：9；在37℃，160rpm/min搖床中培養(yǎng)7d。

所述MSM中pH為5～9，成分包含KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，NH₄Cl0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，KCl 0.01g/L，NaCl 5～150g/L，微量元素液1vol％，所述微量元素液的組分如下：CaCl₂ 0.01g/L，F(xiàn)eCl₃ 0.5g/L，CuSO₄ 0.38g/L，ZnSO₄1.15g/L，MnSO₄ 1.69g/L，溶劑為水。

本發(fā)明的有益效果在于：

1.該菌株在正十六烷環(huán)境下，可誘導(dǎo)并刺激該菌產(chǎn)生如表面活性劑類物質(zhì)的中間產(chǎn)物，最終降解產(chǎn)物為CO₂和H₂O，且具有很好的經(jīng)濟性、環(huán)境友好性；擴大生產(chǎn)并收集該產(chǎn)物可與其他菌種聯(lián)合用于含油污染環(huán)境修復(fù)，增大菌與油接觸面積促進(jìn)降解過程。

2.該菌株屬于好氧異養(yǎng)微生物，影響該菌代謝因素較容易控制，得到最佳降解條件后可實際用于污染源修復(fù)，操作性簡便。

附圖說明

圖1中A14、B45分別為兩株非脫羧勒克菌在不同底物濃度條件下，7d底物的去除曲線。

圖2中A14、B45分別為兩株非脫羧勒克菌在0.3％正十六烷環(huán)境中，不同NaCl濃度條件下，7d底物的去除曲線。

圖3中A14、B45分別為兩株非脫羧勒克菌在0.3％正十六烷環(huán)境中，不同pH條件下，7d底物的去除曲線。

圖4中A14、B45在上述最優(yōu)條件下反應(yīng)16d，時間與OD600和正十六烷降解率的圖。

圖5中A14、B45在上述最優(yōu)條件下反應(yīng)16d，時間與細(xì)胞干重的曲線圖。

圖6中A14、B45在上述最優(yōu)條件下反應(yīng)16d，時間與底物濃度變化的曲線圖。

圖7為A14的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。

圖8為B45的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。

具體實施方式

實施例1：非脫羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)的篩選。

以正十六烷為唯一碳源和能源，將1ml活性污泥加入100ml MSM培養(yǎng)基(正十六烷體積濃度0.01％)，37℃160rpm/min培養(yǎng)7d，吸取1ml發(fā)酵液上清液至含正十六烷的MSM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此方法連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，期間逐步提高正十六烷濃度至0.05％，經(jīng)5次馴化得到的發(fā)酵液較十分渾濁，即存在正十六烷菌。馴化液濃度稀釋成10^-4倍后，涂布于LB培養(yǎng)基固體平板，置于37℃恒溫箱中，菌落長出后進(jìn)行劃線分離，多次純化后得到A14和B45兩株菌，置于甘油中-80℃冷藏。A14和B45在牛肉膏蛋白胨平板上呈乳黃色，近圓形，中央略突起，表面光滑且濕潤，革蘭氏染色陰性；提取DNA后經(jīng)PCR擴增，產(chǎn)物片段長度分別為1401bp(SEQ ID NO.1)和1395bp(SEQ ID NO.2)，在Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對表明，兩株菌與非脫羧勒克菌屬(Leclercia adecarboxylata)有99％以上同源性。應(yīng)用MEGA5.0軟件采用Neighbor-Joining法繪制16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，對比同源性，并結(jié)合形態(tài)特征，A14和B45菌初步鑒定為非脫羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)，分別與Leclercia adecarboxylata strain NBRC 102595和Leclercia adecarboxylata strainCIP 82.92相似度最高。

實驗例2：菌株對正十六烷耐受性的實驗

取實驗室已純化好經(jīng)甘油保存的A14、B45分別接種至100ml已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3g/L，胰蛋白胨粉10g/L，NaCl 15g/L)中活化培養(yǎng)12h，搖床設(shè)置溫度為37℃、轉(zhuǎn)速160r/min。在30ml無機鹽培養(yǎng)基中{每1L體系中含KH₂PO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 1g，NH₄Cl 0.5g，MgSO4 0.5g，KCl 0.01g，NaCl 15g/L，微量元素液1％(CaCl₂ 0.01g，F(xiàn)eCl₃0.5g，CuSO₄ 0.38g，ZnSO₄ 1.15g，MnSO₄ 1.69g蒸餾水1L)，pH為6.2}移入3ml活化后(OD₆₀₀＝0.6)的菌液，正十六烷濃度設(shè)為5個梯度0.05％、0.1％、0.3％、0.6％和1％(v/v)，溫度設(shè)為37℃，轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)7d后正己烷萃取發(fā)酵液中正十六烷，萃取液脫水后取1ml用于GC測剩余濃度，計算降解率。

實驗結(jié)果如圖1所示。隨著底物濃度增高，菌的降解能力逐漸降低。當(dāng)起始濃度為0.05％時，反應(yīng)7d后經(jīng)檢測底物幾近降解完全；濃度提高至0.1％時，A14、B45降解率分別為83.3％和78.5％；當(dāng)濃度為0.3％時，菌適應(yīng)此濃度環(huán)境需要一定時間，相比于降解低濃度C16降解率明顯降低，測得降解率分別為45.25％、49.65％。濃度≥0.6％時，菌降解率分別為33.7％、42.85％，與0.3％濃度降解效果相比，A14降解率降低趨勢要快于B45，說明此濃度環(huán)境下后者適應(yīng)更快。C16濃度為1％時，液面有形成較厚油膜，限制了氧的傳遞，抑制微生物代謝活動。此環(huán)境下，A14和B45降解率依然有22.1％和19.77％，該菌對底物均有較好耐受性,但高濃度C16對菌體毒害較大。

實驗例3：鹽度影響C16降解的實驗

配制初始C16濃度0.3％的無機鹽培養(yǎng)基(成分同實例1)，保持生長條件不變，NaCl濃度設(shè)為5、15、25、35、45、100、150g/L七個梯度，調(diào)節(jié)pH至6.2，向30ml培養(yǎng)體系中移入3ml活化后(OD₆₀₀＝0.6)的菌液，37℃，160r/min培養(yǎng)7d后正己烷萃取發(fā)酵液中正十六烷，萃取液脫水后取1ml用于GC測剩余濃度，計算降解率。

實驗結(jié)果如圖2所示。A14、B45在NaCl濃度為15g/L時有最高降解率分別為45.25％和49.65％，A14在NaCl濃度分別為5、15、25、35g/L時的降解率依次該菌耐鹽度具有廣譜性，A14降解率分別為35.55％、45.25％、31.7％、25.3％；B45降解率分別為30.85％、49.65％、33.55％、26.4％。當(dāng)濃度≥45g/L時，各菌降解率急劇下降，高鹽環(huán)境下由于鹽析作用使得微生物的脫氫酶、氧化酶活性降低，同時溶液滲透壓勢必增高，致使細(xì)胞脫水造成原生質(zhì)分離，影響菌體代謝活動。極高鹽度環(huán)境下即100g/L和150g/L，測得OD₆₀₀值極低，A14降解率分別為6.05％和2.5％，B45降解率分別為4.45％和1％，推測非脫羧勒克菌具有一定的耐鹽能力，高鹽環(huán)境下對正十六烷仍有降解效果。

實驗例4：pH影響C16降解的實驗

配制初始C16濃度0.3％的無機鹽培養(yǎng)基(成分同實例1)，該菌最適NaCl濃度為15g/L，調(diào)整pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0五個梯度，向30ml培養(yǎng)體系中移入3ml活化后(OD₆₀₀＝0.6)的菌液，37℃，160r/min培養(yǎng)7d后正己烷萃取發(fā)酵液中正十六烷，萃取液脫水后取1ml用于GC測剩余濃度，計算降解率。

實驗結(jié)果如圖3所示。A14和B45分別在pH為7.0和6.0時降解率最高，分別為52.47％和51.4％，較最佳NaCl濃度下的降解率分別提高了7.22％和1.75％。各pH下，A14的降解率分別為28.46％、41.3％、52.47％、25.2％、16.33％；B45的降解率分別為22.45％、51.4％、43.49％、28.51％、13.99％。pH是影響菌體生長的重要因素，過低或過高pH將改變細(xì)胞膜的通透性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及物質(zhì)的電離性從而控制菌體對C16的利用，造成微生物生長速率的變化，進(jìn)而影響菌的降解率。不同的微生物有不同的最適pH值范圍，A14適應(yīng)pH范圍較廣；B45降解率受pH變化影響較大，在弱酸環(huán)境(pH＝5-6)，pH與降解率呈正相關(guān)，當(dāng)pH值逐漸上升，降解率不斷減小且酸性環(huán)境(pH＝5-7)降解效果優(yōu)于堿性環(huán)境(pH＝7-9)。

實驗例5：菌株A14和B45代謝16d正十六烷實驗

配制初始C16濃度0.3％的無機鹽培養(yǎng)基(成分同實例1)，最適NaCl濃度為15g/L，pH為7.0，向30ml培養(yǎng)體系中移入3ml活化后的A14菌液(OD₆₀₀＝0.6)；B45培養(yǎng)基pH為6.0，其余條件同上，37℃，160r/min培養(yǎng)16d，每隔2d測一次OD₆₀₀、細(xì)胞干重及正十六烷降解率。發(fā)酵液稀釋一倍并以空白培養(yǎng)基為對照，600nm波長下紫外分光光度法測細(xì)菌OD₆₀₀；發(fā)酵液4℃，13000r/min離心10min后的沉淀加入一定量無菌生理鹽水，經(jīng)生理鹽水洗過后菌體再次離心，重復(fù)離心，移去上清至60℃烘箱干燥12h，稱量菌體干重；正己烷萃取發(fā)酵液中正十六烷，萃取液脫水后取1ml用于GC測剩余濃度，計算降解率。

實驗結(jié)果如圖4所示。菌株對C16的降解率呈逐漸增加的趨勢，在第16d時各菌對C16的降解率依次為93.74％，87.79％，初始底物質(zhì)量濃度由2.32g/L降至0.145，0.283g/L，降解效果較好，所測OD₆₀₀得知A14、B45從第12d起開始進(jìn)入穩(wěn)定期，OD₆₀₀曲線和降解率變化趨勢大致相同，顯示出菌體的生長和底物的消耗是一個相關(guān)過程。

Logistic方程廣泛運用于對生長于條件限制性環(huán)境中微生物對數(shù)期，穩(wěn)定期生長狀態(tài)的分析，方程式經(jīng)變型后為式(1)其中：X_t為t時刻菌體干重，g/L；X₀為初始菌體干重，g/L；μ_m為各菌最大比生長速率，d^-1；X_max整個反應(yīng)階段菌的最大干重量，g/L。

$In\frac{X_t}{X_{\max }-X_t}={\mathrm{\μ}}_{m}t-In(\frac{X_{\max }}{X_0}-1)---\left(1\right)$

X_max和t時刻X值可測得，通過非線性二乘法對原始數(shù)據(jù)按Logistic方程擬合發(fā)現(xiàn)相關(guān)性良好，求得斜率μ_m和后，計算出A14、B45的X₀分別為0.288g/L，0.529g/L。A14直線方程為y＝-1.689+0.1375x(r²＝0.75006)，生長動力學(xué)方程B45直線方程為y＝-1.05+0.066x(r²＝0.85246)，生長動力學(xué)方程

根據(jù)C16剩余濃度與時間的關(guān)系作非線性擬合，發(fā)現(xiàn)底物降解符合一般生化反應(yīng)都遵循的一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律?？梢杂梅匠?2)來表示，其中C_t是t時刻C16濃度，g/L；C₀是初始C16濃度，g/L；K是降解速率常數(shù)，d^-1；求得半衰期t_1/2＝(In2)/K,d

C_t＝C₀e^-Kt (2)

非脫羧勒克菌對C16降解復(fù)合一級反應(yīng)動力學(xué)，且線性相關(guān)性較高，A14和B45的降解速率常數(shù)分別為0.118d^-1、0.103d^-1，半衰期分別為5.874d，6.729d，A14的降解能力要強于B45。一級動力學(xué)方程分別為C_t＝2.633e^-0.118t(r²＝0.91625)，C_t＝2.635e^-0.103t(r²＝0.91673)。

非脫羧勒克菌作為首次發(fā)現(xiàn)可高效降解長鏈烷烴正十六烷的菌株，本發(fā)明只作了較為簡單的關(guān)于正十六烷降解特性的分析，其大批量生產(chǎn)、制成固定化菌劑用于實際受石油污染環(huán)境的修復(fù)的可行性還有待與深入研究。GC圖譜發(fā)現(xiàn)C16的保留時間大約在6.97min，發(fā)酵液中C16峰面積相比于空白樣有明顯減小，該菌降解效果較好，由圖推測產(chǎn)物十六醇、十六醛及十六酸的出峰時間大約在7.72min，8.49min及8.75min，出峰間隔時間與文獻(xiàn)接近，推測代謝C16的途徑可能也是單末端氧化。圖7和圖8為兩株非脫羧勒克菌的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。