一株微小桿菌及其有效溶藻成分在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株微小桿菌及其有效溶藻成分3-芐-2,5-二酮哌嗪在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。從太湖水體中分離獲得了一株具有顯著溶藻活性的微小桿菌(Exiguobacterium?sp.)GLY-3109，保藏號(hào)為CGMCC?No.8980，并且從其代謝產(chǎn)物中分離純化并鑒定出其有效溶藻成分3-芐-2,5-二酮哌嗪，該溶藻物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻9110的半數(shù)致死量LD50為4.8μg/mL?？捎糜谛滦蜕餁⒃鍎┑难邪l(fā)和生產(chǎn)，最終應(yīng)用于湖泊藍(lán)藻水華的控制。
【專利說(shuō)明】一株微小桿菌及其有效溶藻成分在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境微生物領(lǐng)域，特別涉及一株具有溶藻活性的微小桿菌(Exiguobacterium sp.) GLY-3109和分泌的有效溶藻成分3-節(jié)-2，5-二酮哌嗪及其在藍(lán)藻水華控制中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]在海洋、湖泊和水庫(kù)中，藍(lán)藻可以形成水華和赤潮，從而影響和改變水的理化性質(zhì)，并且能直接和間接引起食藻動(dòng)物的大量死亡。特別是對(duì)于以湖泊水和水庫(kù)水為水源的飲用水生產(chǎn)，藻類的危害更為嚴(yán)重。因此探索控制藍(lán)藻生物量和抑制藍(lán)藻水華發(fā)生的有效途徑是非常必要的。
[0003]目前有一些水華治理方法，如物理法(機(jī)械除藻、電磁場(chǎng)除藻、超聲除藻)，化學(xué)法(投入Cu2+殺藻)等。但這些方法或者成本很高難以推廣，或者會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成次生破壞，均不太理想。由于物理方法和化學(xué)方法存在上述缺陷，而生物方法因其環(huán)保、經(jīng)濟(jì)等潛在優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越多的關(guān)注。針對(duì)藍(lán)藻的溶藻細(xì)菌(algicidal bacteria)是一類可以直接(菌藻細(xì)胞接觸)或者間接(分泌胞外物質(zhì))抑制滅殺藍(lán)藻的細(xì)菌統(tǒng)稱，它們是淡水生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)減少藍(lán)藻的生物量，維持生態(tài)平衡具有重要作用。
[0004]因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于篩選高效溶藻細(xì)菌或分離富集溶藻細(xì)菌代謝產(chǎn)生的高效溶藻活性物質(zhì)，以開發(fā)微生物殺藻劑，用以安全和高效的控制藍(lán)藻水華問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中物理方法和化學(xué)方法處理成本太高或容易造成二次污染的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是尋找高效溶藻細(xì)菌及分離富集溶藻細(xì)菌代謝產(chǎn)生的高效溶藻活性物質(zhì)，用以安全和高效的控制藍(lán)藻水華問題。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一株具有溶藻活性的微小桿菌及其代謝產(chǎn)物在藍(lán)藻水華控制中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供了一株具從太湖水體中分離獲得的有溶藻活性的微小桿菌(Exiguobacterium sp.) GLY-3109,該菌的形態(tài)為桿狀，1.1 ~1.2 μ mX 1.4 ~3.2 μ m,革蘭氏陽(yáng)性，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。兼性厭氧。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落平坦，淡橙色，色素不擴(kuò)散。嗜堿，能在pH6.5~11.5生長(zhǎng)?？梢岳闷咸烟恰⒄崽?、半乳糖和一些其他糖產(chǎn)酸，主要產(chǎn)物是乳酸、乙酸和甲酸。該菌株接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性?？梢赃€原硝酸鹽，水解明膠、淀粉和酪素。最適生長(zhǎng)溫度37°C。經(jīng)16srRNA基因序列分析和同源性比較，得知該菌株與GenBank中某微小桿菌菌株有99%的同源性，故鑒定為微小桿菌屬細(xì)菌，命名微小桿菌GLY-3109菌株。
[0008]該菌種已經(jīng)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC N0.8980，保藏日期為2014年3月28日。保藏機(jī)構(gòu)地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，郵編:100101，電話:86-10-64807355。該菌種的16srRNA基因在GenBank中的登錄號(hào)是KC688875。
[0009]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述微小桿菌GLY-3109在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
[0010]進(jìn)一步地，本發(fā)明微小桿菌GLY-3109在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用方式可以是通過其發(fā)酵產(chǎn)物，包括發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮物、發(fā)酵液粗提物或發(fā)酵液提取物。
[0011]微小桿菌GLY-3109發(fā)酵產(chǎn)物的制備步驟如下:
[0012]I)、發(fā)酵微小桿菌GLY-3109菌株，獲得發(fā)酵液；
[0013]2)、用萃取劑萃取發(fā)酵液，獲得萃取液；
[0014]3)、將萃取液蒸干，獲得粗提物；
[0015]4)、將粗提物溶于水后過濾；
[0016]5)、將步驟4)過濾后的濾液進(jìn)一步提純得到多組分或單一組分的有效溶藻物質(zhì)，即為發(fā)酵液提取物。
[0017]優(yōu)選地，步驟I)中，發(fā)酵條件為，微小桿菌GLY-3109接種于pH7.0的滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C、220rpm環(huán)境條件下發(fā)酵48h。
[0018]優(yōu)選地，步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯，萃取體系中乙酸乙酯與發(fā)酵液的體積比為1:1，混合后，放入振蕩器中振蕩24h，分離出的上層乙酸乙酯溶液即微小桿菌GLY-3109發(fā)酵液的萃取液。
[0019]優(yōu)選地,步驟3)中，過濾為使用0.22 μ m孔徑濾膜過濾。
[0020] 優(yōu)選地，步驟4)中，進(jìn)一步提純手段為柱層析，具體為:將濾液通過半制備柱，用HPLC進(jìn)行初步純化，得到溶藻成分；將得到的溶藻成分通過分析柱，用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到具有溶藻活性的有效成分ES-1。
[0021 ] 微小桿菌GLY-3109的代謝產(chǎn)物中有效的溶藻成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過LC-MS和GC-MS分析獲得。
[0022]有效溶藻成分ES-1的分子尚子峰為205.0970,樣品分子量為204.0007,分子式為C11H12N2O2，可信度為99.15%;對(duì)ES-1進(jìn)行GC-MS分析，與GC-MS數(shù)據(jù)庫(kù)中3-芐-2，5- 二酮哌嗪的相似度(similarity index)為 936.958,大于 850。
[0023]進(jìn)一步地，將樣品ES-1的LC-MS和GC-MS結(jié)果進(jìn)行綜合分析，有效的溶藻成分ES-1是所述微小桿菌GLY-3109的代謝產(chǎn)物3-芐-2，5- 二酮哌嗪，其具有結(jié)構(gòu)式(I)。
[0024]

【權(quán)利要求】
1.一株具有溶藻活性的微小桿菌(Exiguobacterium sp.) GLY-3109,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC N0.8980，保藏日期為2014年3月28臼。
2.如權(quán)利要求1所述的微小桿菌GLY-3109在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的微小桿菌GLY-3109的發(fā)酵產(chǎn)物在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
4.具有結(jié)構(gòu)式(I)所示結(jié)構(gòu)的化合物在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
5.一種溶藻菌劑，其特征在于，所述溶藻菌劑中包含權(quán)利要求1所述的微小桿菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109。
6.一種溶藻藥劑，其特征在于，所述溶藻藥劑中包含權(quán)利要求1所述的微小桿菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109的發(fā)酵產(chǎn)物,所述發(fā)酵產(chǎn)物為發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮物、發(fā)酵液粗提物或發(fā)酵液提取物。
7.一種控制藍(lán)藻水華的方法，包括如下步驟: 1)、發(fā)酵權(quán)利要求1所述的微小桿菌GLY-3109，獲得發(fā)酵液； 2)、用萃取劑萃取發(fā)酵液，獲得萃取液； 3)、將萃取液蒸干，獲得粗提物； 4)、將粗提物溶于水后過濾； 5)、將步驟4)過濾后的濾液進(jìn)一步提純得到多組分或單一組分的有效溶藻物質(zhì)，即為發(fā)酵液提取物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟I)中，發(fā)酵條件為，微小桿菌GLY-3109接種于PH7.0的滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C、220rpm環(huán)境條件下發(fā)酵48h。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯，乙酸乙酯與發(fā)酵液的體積比為1:1。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟4)中，所述進(jìn)一步提純手段為:將濾液通過半制備柱，用HPLC進(jìn)行初步純化，得到溶藻成分；將得到的溶藻成分通過分析柱，用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到單一組分的有效溶藻成分。
【文檔編號(hào)】C02F1/50GK104130960SQ201410360194
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】楊虹, 耿夢(mèng)馨, 郭星亮 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)