專利名稱：嗪草酮降解菌和基于該菌的土壤生物修復(fù)菌劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種嗪草酮農(nóng)藥降解菌及基于該菌制備的土壤生物修復(fù)菌劑，其是利用微生物的技術(shù)降解化學(xué)農(nóng)藥殘留，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
背景技術(shù)：
嗪草酮是德國(guó)拜耳公司于1971年開發(fā)的三氮苯類除草劑，主要用于大豆田等防除闊葉和禾本科雜草。這類除草劑具有除草速度快、對(duì)人畜低毒等優(yōu)點(diǎn)，但由于長(zhǎng)期使用或使用不當(dāng)，對(duì)敏感作物容易產(chǎn)生藥害，不僅影響高等植物生長(zhǎng)，而且會(huì)對(duì)地表、地下水、土壤和動(dòng)物等產(chǎn)生一定的危害。其中有些品種如嗪草酮在土壤中的殘留時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)后茬甜菜、 蔬菜等作物易產(chǎn)生藥害。同時(shí)嗪草酮是一種內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，對(duì)高等動(dòng)物具有異常的生理效應(yīng)，當(dāng)嗪草酮進(jìn)入生物體內(nèi)殘留、富集到一定程度時(shí)就會(huì)產(chǎn)生生物毒性。因此，研究解決嗪草酮?dú)埩舳竞栴}對(duì)擴(kuò)大它在生產(chǎn)上應(yīng)用，減少對(duì)后茬作物及環(huán)境造成的污染具有重要意義。目前大量研究證明利用微生物的代謝途徑可以消除農(nóng)藥殘留，而且是一種很好的環(huán)境生物修復(fù)技術(shù)，其中投加高效降解菌株是生物修復(fù)中最常見最有效的一種方法。嗪草酮在土壤中的消解是由于遷移和降解兩個(gè)過程結(jié)合所致，微生物降解農(nóng)藥殘留依靠自然力量，不產(chǎn)生二次污染。通過篩選高效嗪草酮降解菌株，將其經(jīng)過發(fā)酵加工成菌劑，應(yīng)用于農(nóng)藥殘留降解，從而達(dá)到消除土壤、水體、農(nóng)產(chǎn)品中嗪草酮?dú)埩簟?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種嗪草酮農(nóng)藥殘留降解菌，其分類命名為蠟樣芽孢桿菌NI (Bacillus cereus NI),該菌株是一株革蘭氏染色反應(yīng)陽(yáng)性菌,在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(地址是中國(guó)湖北省武漢市武昌珞珈山，郵編430072)的保藏編號(hào)是 CCTCC NO M2011163o 保藏日期2011 年 5 月 9 日。該降解菌菌株在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)為直徑5 7mm，圓形，表面粗糙， 扁平，不規(guī)則稍有光澤，白色，半透明，細(xì)菌細(xì)胞體為桿狀，末端方，成短或長(zhǎng)鏈，氧化酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，V. P試驗(yàn)為陽(yáng)性，葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)為陽(yáng)性，該菌株16SrDNA的Genbank登陸號(hào)為 HQ451884。所述平板培養(yǎng)基的配方是NaCl 5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、瓊脂15 20g，NaHP04
I.50g，加IOOOmL蒸餾水，調(diào)pH為7。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基于上述NI菌株的土壤生物修復(fù)菌劑，其由如下步驟制備I)在前面所述的嗪草酮降解菌NI的斜面試管菌種中，用接種環(huán)沾少許菌體接種于平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48h后；然后再用接種環(huán)沾少許菌體接種于LB培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；所述LB培養(yǎng)基是將IOg NaCl、5g酵母粉和5g胰蛋白胨，加入到IOOOmL蒸餾水配制而成，調(diào)pH為7. O;2)將上述步驟培養(yǎng)好的菌種接入種子瓶，用量為10 15mL菌種/IOOOmL種子瓶培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，每IOOmL種子瓶培養(yǎng)基組成按重量百分比是蔗糖O. 3 O. 5%, MgSO4 · 7H20 O. 04 O. 08 %、K2HPO4 O. 15 O. 2 %、NaCl O. 08 O. I %、KH2PO4 O. 05 O. 07%、酵母膏O. 015 O. 02%，余量為水，調(diào)ρΗ7· O ；3)將上述步驟培養(yǎng)好的菌種，加入到由豆柏、麥麩、木屑、穩(wěn)定劑硅藻土組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用量為15 20mL菌種/IOOOg發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)把15 20mL的營(yíng)養(yǎng)液加入到IOOOg發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C下進(jìn)行通風(fēng)發(fā)酵48h，并將發(fā)酵物在30°C下進(jìn)行通風(fēng)干燥， 粉碎后進(jìn)行包裝，即得到降解菌NI菌株的土壤生物修復(fù)菌劑；每IOOg發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按重量百分比是豆柏55 60%、麥麩15 20%、木屑10 15%、穩(wěn)定劑娃藻土 4 8% ;每IOOmL營(yíng)養(yǎng)液組成按重量百分比是鹿糖O. 5 O. 7 %，KH2PO4 O. 08 O. I %， MgSO4 · 7H20 O. 08 O. I %, K2HPO4 O. 18 O. 2%, NaClO. I I. 2%，余量為水，pH 自然;本發(fā)明的另一個(gè)方面，是提供一種包含嗪草酮農(nóng)藥殘留降解菌NI (Bacillus cereus NI)的固體菌劑在土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用。具體實(shí)驗(yàn)如下，首先稱取土壤lOOOg，加入由嗪草酮原藥制成的水溶液，使土壤中嗪草酮的濃度為20mg/kg (即配制成被嗪草酮污染的土壤)，將含有NI菌株的土壤生物修復(fù)菌劑按重量百分比為10%施于土壤中，充分混勻，放于30°C的黑暗培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定嗪草酮在土壤中的殘留。結(jié)果參見圖I。選取甜菜種子為供試作物。分別配制含嗪草酮濃度為lmg/kg、10mg/kg、20mg/kg 的含藥土壤(每盆IOOOg 土壤)，使含水量為20%左右，將NI菌株的土壤生物修復(fù)菌劑按重量百分比為10%比例散施在土壤中充分混合，同時(shí)分別設(shè)不加菌、不加嗪草酮做為對(duì)照處理，取清水浸種催芽萌發(fā)一致的甜菜種子，播種于不同處理土壤中，每盆10粒，置于25°C 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，適時(shí)噴水保濕，測(cè)量不同處理甜菜的株高、根長(zhǎng)。結(jié)果參見圖2、圖3。本發(fā)明的有益效果如下I、本發(fā)明提供了一種嗪草酮的降解菌，土壤降解實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)嗪草酮降解率可達(dá) 68.19%。該菌劑具有生產(chǎn)成本低、降解效果好、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。適合于消除土壤中的農(nóng)藥殘留，對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境和食品安全具有重要意義。2、生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，以甜菜做為供試作物，嗪草酮濃度為lmg/kg、10mg/kg、 20mg/kg的含藥土壤中分別施加該菌劑后，根長(zhǎng)分別提高15%、18^^21%,株高分別提高 8%、25%、39%。




圖I :N1菌劑對(duì)土壤中嗪草酮降解的影響曲線；
圖2 N1菌劑對(duì)甜菜苗高的影響曲線；
圖3 N1菌劑對(duì)甜菜根長(zhǎng)的影響曲線；
圖4 :不同pH條件下NI菌株對(duì)嗪草酮的降解曲線； 圖5 :不同溫度條件下NI菌株對(duì)嗪草酮的降解曲線； 圖6 :不同初始濃度下NI菌株對(duì)嗪草酮的降解曲線；
圖7 :氯喃磺隆誘導(dǎo)作用對(duì)菌株NI對(duì)嗪草酮的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :嗪草酮降解菌的富集、分離、純化及菌懸液的制備取5g 土壤樣品(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)試驗(yàn)站多年使用嗪草酮試驗(yàn)田)加入盛有IOOmL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，從配制的濃度為1000mg/L的嗪草酮溶液中取2mL直接加到三角瓶中作為微生物生長(zhǎng)的唯一氮源(20mg/L)，在搖床上培養(yǎng)2d(30°C，160r/min)后轉(zhuǎn)接至含嗪草酮50mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d后,然后在含濃度為100mg/L的嗪草酮平板培養(yǎng)基上接入上述培養(yǎng)2d的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基0. lmL，涂布后于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，挑出單菌落在平板培養(yǎng)基上重復(fù)移種劃線3 4次進(jìn)行純化，將純化后NI菌株用接種環(huán)沾取少許接種于50mL的LB液體培養(yǎng)基中，30°C、160r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)28h，取適量菌液離心，棄去上清液，用等量磷酸緩沖溶液洗滌沉淀，用50mL的磷酸緩沖溶液懸浮，得NI菌懸液備用。所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配方按重量百分比是蔗糖3g，KH2PO4 0. 5g，MgSO4 · 7H20
0.4g，K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸餾水，pH 自然。從上述純化好的菌株中獲得一株嗪草酮降解菌，該降解菌為蠟樣芽孢桿菌 NKBacillus cereus NI)的菌株。其保藏編號(hào)是CCTCC NO :M2011163。該降解菌菌株革蘭氏陽(yáng)性，在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)為直徑5 7_，圓形，表面粗糙，扁平，不規(guī)則，稍有光澤，白色，半透明，細(xì)菌細(xì)胞體為桿狀，末端方，成短或長(zhǎng)鏈，氧化酶試驗(yàn)是為陽(yáng)性，V. P 試驗(yàn)為陽(yáng)性，葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)為陽(yáng)性。該菌株16SrDNA的Genbank登陸號(hào)為HQ451884。實(shí)施例2:降解條件I、pH對(duì)菌株NI降解嗪草酮的影響按體積百分比為5%接菌量，將實(shí)施例I制備的NI菌懸液接入嗪草酮濃度為 20mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為5. 0,6. 0,6. 5,7,7. 5,8. 0,9. O,在 30 V、160rpm搖床振蕩培養(yǎng)，分別在24、48、72、96、120h測(cè)定嗪草酮的含量。所述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配方按重量百分比是鹿糖3g，KH2PO4 0. 5g, MgSO4 ·7Η20 0. 4g， K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸餾水，pH 自然。pH對(duì)菌株降解嗪草酮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)pH為7.0時(shí)，120h降解率最高達(dá)到 78. 43%，隨著pH值升高或降低，嗪草酮降解效率逐漸下降。表明該菌能適應(yīng)中性的培養(yǎng)基。結(jié)果參照?qǐng)D4。2、溫度對(duì)菌株NI降解嗪草酮的影響溫度實(shí)驗(yàn)中，選用五種不同溫度20、25、30、35、401，在嗪草酮濃度為20mg/L無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按體積百分比為5%接入實(shí)施例I制備的NI菌懸液，160rpm搖床震蕩培養(yǎng)，分別在24、48、72、96、120小時(shí)取樣測(cè)定嗪草酮的含量。所述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配方按重量百分比是鹿糖3g，KH2PO4 0. 5g, MgSO4 ·7Η20 0. 4g， K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸餾水，pH 自然。在20_40°C培養(yǎng)條件下，分別測(cè)定菌株NI對(duì)嗪草酮的降解率。菌株NI降解嗪草酮的最適溫度為30°C，120h降解率可達(dá)到79. 48%。但是20°C的時(shí)候，菌株N80對(duì)嗪草酮降解率只有51. 73%，40°C時(shí)降解率為59. 68%。表明低溫或高溫影響菌株對(duì)嗪草酮的降解能力。結(jié)果參照?qǐng)D5。3、嗪草酮的初始濃度對(duì)菌株NI降解嗪草酮的影響在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入嗪草酮溶液，使其終濃度分別為5mg/L、10mg/L、20mg/L、 50mg/L、80mg/L、100mg/L，以體積百分比為5%的接菌量接入實(shí)施例I制備的NI菌懸液， 30°〇、160印111搖床震蕩培養(yǎng)，分別在24、48、72、96、12011取樣，測(cè)定嗪草酮的降解率。結(jié)果參見圖6和表I。表I :N1菌株降解嗪草酮一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程
初始濃度 (mg/L)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程半衰期(d)相關(guān)系數(shù)(r)降解速率常數(shù)5LnC = 0.2444t+ 1.82523.70.98210.244410LnC = 0.3556t +2.65302.90.98780.355620LnC = 0.3919t +3.37362.70.99550.391950LnC =0.2204 t +4.13274.10.99170.2204實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嗪草酮初始濃度5mg/L時(shí)，嗪草酮降解率達(dá)到61. 2% ;嗪草酮初始濃度20mg/L時(shí)，嗪草酮降解率達(dá)到73. 49% ;嗪草酮初始濃度高于50mg/L時(shí)，生物降解速度隨嗪草酮濃度的提高而有所下降，當(dāng)濃度是100mg/L時(shí)，降解率只有45%。當(dāng)嗪草酮初始濃度為5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L時(shí),符合農(nóng)藥降解動(dòng)力學(xué)方程。從表I中可以看出， 當(dāng)嗪草酮濃度為20mg/L時(shí)降解速率常數(shù)是O. 3919。半衰期是2. 7天，所以20mg/L是最佳降解濃度。所述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配方按重量百分比是蔗糖3g，KH2PO4 O. 5g, MgSO4 ·7Η20 O. 4g， K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸餾水，pH 自然。4、誘導(dǎo)作用對(duì)嗪草酮降解的影響將菌株NI分別接種在硝酸銨濃度為20mg/L、嗪草酮濃度為20mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，分別將培養(yǎng)48h的菌液按體積百分比為5%定量接種于嗪草酮濃度為20mg/ L無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30°C、160rpm搖床振蕩培養(yǎng)，分別在24、48、72、96小時(shí)后取樣，測(cè)定嗪草酮濃度。所述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配方按重量百分比是蔗糖3g，KH2PO4 O. 5g, MgSO4 ·7Η20 O. 4g， K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸餾水，pH 自然。菌株NI在在含有硝酸銨的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，將其分別接種到含有嗪草酮的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時(shí)，嗪草酮的降解能力顯著下降，僅為15.7%，而經(jīng)過嗪草酮誘導(dǎo)后菌株培養(yǎng)48，嗪草酮降解率達(dá)到79. I %。這說(shuō)明底物嗪草酮對(duì)其菌株NI降解活性具有誘導(dǎo)作用，在不含有嗪草酮的環(huán)境中長(zhǎng)期培養(yǎng)，所獲得的菌株則可能會(huì)喪失其對(duì)嗪草酮的降解代謝活性，說(shuō)明降解菌NI以嗪草酮為唯一氮源。結(jié)果參照?qǐng)D7。綜上研究表明，環(huán)境溫度和pH值對(duì)NI菌株的降解特性影響較大，當(dāng)pH值為7. O、 溫度為30°C時(shí)，NI菌株對(duì)嗪草酮的降解率最高，超過這個(gè)范圍，降解率明顯下降。研究發(fā)現(xiàn)，NI菌株的降解能力由嗪草酮誘導(dǎo)而產(chǎn)生,嗪草酮誘導(dǎo)的最適合濃度為20mg/L。在此條件下，48h降解率可達(dá)79. I %。當(dāng)氯嘧磺隆初始濃度達(dá)到50mg/L以上時(shí)，菌株降解嗪草酮能力逐漸下降。這是由于嗪草酮降解達(dá)到一定濃度后會(huì)強(qiáng)烈抑制菌體生長(zhǎng)或是對(duì)底物的代謝，也是由菌株的生理結(jié)構(gòu)及特性所決定。當(dāng)嗪草酮初始濃度為5mg/L、10mg/L、20mg/L、 50mg/L時(shí),符合農(nóng)藥降解動(dòng)力學(xué)方程。菌株NI對(duì)嗪草酮的降解能力是符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。實(shí)施例3 :菌劑制備試驗(yàn)在嗪草酮降解菌NI的斜面試管菌種中用接種環(huán)沾少許菌體接種于平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48h后，再用接種環(huán)沾少許菌體接種于LB培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。所述平板培養(yǎng)基的配方按重量百分含量是NaCl 5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、瓊脂 15g，NaHPO4 I. 50g，加入IOOOmL蒸餾水；所述LB培養(yǎng)基是=NaCl 10g、酵母粉5g、胰蛋白胨 5g，加入IOOOmL蒸餾水，pH為7. O ;將培養(yǎng)好的菌種IOmL接入種子瓶，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期； IOOOmL 的種子瓶培養(yǎng)基為蔗糖 5g、MgSO4 · 7H20 O. 8g、K2HPO4 2g、NaCl lg、KH2PO4 0. 5g、 酵母膏0. 2g，加入IOOOmL水，培養(yǎng)基的ρΗ7· O ；將上述培養(yǎng)好的菌種15mL加入到由豆柏、麥麩、木屑、穩(wěn)定劑(娃藻土)組成的 IOOOg的發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)加入15mL的營(yíng)養(yǎng)液，在30°C下進(jìn)行通風(fēng)發(fā)酵48h，將發(fā)酵物在 30°C下進(jìn)行通風(fēng)干燥，粉碎后進(jìn)行包裝，包裝制成產(chǎn)品，即得到基于上述NI菌株的土壤生物修復(fù)菌劑。IOOOg發(fā)酵培養(yǎng)基配方是豆柏600g、麥麩200g、木屑150g、穩(wěn)定劑(硅藻土)50g ； IOOOmL 營(yíng)養(yǎng)液配方是蔗糖 5g、KH2PO4 O. 8g，MgSO4 · 7H20 O. 8g，K2HPO4 2g，NaCl lg、余量為水，pH自然。實(shí)施例4 :生物修復(fù)降解菌菌劑的生物修復(fù)作用對(duì)敏感作物影響甜菜種子作為供試作物，選取經(jīng)清水浸種催芽萌發(fā)一致的甜菜種子備用。配制嗪草酮溶液放入花盆中(每盆IOOOg 土)，加入適量的水，使含水量為20%左右，將實(shí)施例2 制備的NI菌劑施在土壤中。處理一取風(fēng)干土(過20目篩)I. Okg,加入適量的水，使含水量為20%。處理二 分別取風(fēng)干土(過20目篩)I. 0kg，加入嗪草酮溶液，充分拌勻后制成嗪草酮濃度分別為lmg/kg、10mg/kg、20mg/kg的含藥土壤,再加入重量百分比為10%的基于上述NI菌株的生物修復(fù)菌劑，混勻。處理三取風(fēng)干土(過20目篩)I. 0kg，加入嗪草酮溶液，充分拌勻后制成嗪草酮濃度分別為lmg/kg、10mg/kg、20mg/kg的含藥土壤。從已經(jīng)浸種催芽的種子中選取萌發(fā)度一致的甜菜種子，播種于不同處理土壤中， 在25°C溫室中培養(yǎng)7d。同時(shí)觀察記錄不同處理土壤株高、根長(zhǎng)。降解菌固體菌劑的生物修復(fù)作用對(duì)敏感作物的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含藥土壤施用菌劑后可以明顯提高甜菜株高、根長(zhǎng)。當(dāng)土壤中嗪草酮濃度分別為lmg/kg、10mg/kg、20mg/ kg時(shí)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的菌劑后，甜菜的株高和根長(zhǎng)明顯高于未施用菌劑處理培養(yǎng)的甜菜，株高分別提高10%、35%、63%，根長(zhǎng)分別提高19%、35%、47%，表明NI菌劑對(duì)土壤中嗪草酮有較好的降解作用，提高甜菜株高、根長(zhǎng)。同時(shí)土壤中嗪草酮的殘留對(duì)甜菜的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，施用NI菌劑后甜菜的藥害作用明顯減輕，加菌處理含藥土壤中甜菜株高、根長(zhǎng)均明顯高于未加菌處理植株。表明NI菌劑對(duì)甜菜的生長(zhǎng)有明顯的解除藥害的作用。結(jié)果參照?qǐng)D2和圖3。
權(quán)利要求
1.一種嗪草酮農(nóng)藥殘留降解菌,其分類命名為臘樣芽孢桿菌NI (Bacillus cereus NI)，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的保藏編號(hào)是CCTCC NO :M2011163，該降解菌菌株在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)為直徑5 7mm，圓形，表面粗糙，扁平，不規(guī)則稍有光澤，白色，半透明，細(xì)菌細(xì)胞體為桿狀，末端方，成短或長(zhǎng)鏈，氧化酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，V.P試驗(yàn)為陽(yáng)性，葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)為陽(yáng)性。
2.一種包含權(quán)利要求I所述的嗪草酮農(nóng)藥殘留降解菌的土壤生物修復(fù)菌劑。
3.如權(quán)利要求2所述的土壤生物修復(fù)菌劑的制備方法，其步驟如下1)在嗪草酮降解菌NI的斜面試管菌種中，用接種環(huán)沾少許菌體接種于平板培養(yǎng)基上， 30°C培養(yǎng)48h后；然后再用接種環(huán)沾少許菌體接種于LB培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期； 所述LB培養(yǎng)基是將IOg NaCl、5g酵母粉和5g胰蛋白胨，加入到IOOOmL蒸餾水中配制而成， 調(diào)pH為7. O ;2)將上述步驟培養(yǎng)好的菌種接入種子瓶，用量為10 15mL菌種/IOOOmL種子瓶培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，IOOmL的種子瓶培養(yǎng)基的重量百分含量是蔗糖O. 3 O. 5%、 MgSO4 · 7H20 O. 04 O. 08 %、Κ2ΗΡ040· 15 O. 2 %、NaCl O. 08 O. I %、KH2PO4 O. 05 O.07%、酵母膏O. 015 O. 02%，余量為水，調(diào)pH為7. O ;3)將上述步驟培養(yǎng)好的菌種，加入到由豆柏、麥麩、木屑、穩(wěn)定劑硅藻土組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用量為15 20mL菌種/IOOOg發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)把15 20mL的營(yíng)養(yǎng)液加入到 IOOOg發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C下進(jìn)行通風(fēng)發(fā)酵48h，并將發(fā)酵物在30°C下進(jìn)行通風(fēng)干燥，粉碎后進(jìn)行包裝，即得到降解菌NI菌株的土壤生物修復(fù)菌劑；每IOOg發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按重量百分比是豆柏55 60 %、麥麩15 20%、木屑 10 15%、穩(wěn)定劑娃藻土 4 8% ;每IOOml營(yíng)養(yǎng)液組成按重量百分比是蔗糖O. 5 O. 7 %，KH2PO4O. 08 O. I %， MgSO4 · 7H20 O. 08 O. I %, K2HPO4 O. 18 O. 2%, NaClO. I I. 2%，余量為水，pH 自然;
4.一種包含權(quán)利要求I所述的嗪草酮農(nóng)藥殘留降解菌的土壤生物修復(fù)菌劑在土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的一種包含嗪草酮農(nóng)藥殘留降解菌的土壤生物修復(fù)菌劑在土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用，其特征在于按重量百分比為10%的比例，將土壤生物修復(fù)菌劑散施于種植有作物的土壤中。
6.如權(quán)利要求5所述的一種包含嗪草酮農(nóng)藥殘留降解菌的土壤生物修復(fù)菌劑在土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用，其特征在于作物是甜菜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種嗪草酮農(nóng)藥殘留降解菌，其分類命名為蠟樣芽孢桿菌N1(Bacillus cereus N1)，該菌株是一株革蘭氏染色反應(yīng)陽(yáng)性菌，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的保藏編號(hào)是CCTCC NOM2011163，及應(yīng)用該菌制備的土壤生物修復(fù)菌劑及應(yīng)用。嗪草酮農(nóng)藥殘留降解菌為從生產(chǎn)嗪草酮農(nóng)藥廠排水口淤泥中通過富集培養(yǎng)分離得到的一株對(duì)嗪草酮有較強(qiáng)降解能力的菌株，該菌株以嗪草酮為唯一氮源生長(zhǎng)，在液體培養(yǎng)基中通過嗪草酮誘導(dǎo)增加菌體活性，提高對(duì)嗪草酮的降解能力。該菌劑的制備方法簡(jiǎn)單，成本較低，施用方便，可以散施在土壤上，在土壤中的降解效果可達(dá)到68.19％，有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102604872SQ20121008691
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者侯志廣, 張 浩, 王巖, 趙曉峰, 逯忠斌, 高鶴南 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)