專(zhuān)利名稱：一種苯并[a]芘降解酶及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)與難降解有機(jī)污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及ー種苯并[a]芘降解酶及其分離方法。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是ー類(lèi)含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的有毒有機(jī)污染物，具有強(qiáng)烈的致癌作用、致崎作用和致突變作用。PAHs能通過(guò)生物累積及食物鏈的傳遞作用對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害，已引起各國(guó)環(huán)境科學(xué)家的高度重視。美國(guó)環(huán)保局早在80年代就已把16種未帶分支的PAHs確定為環(huán)境中的優(yōu)先污染物，我國(guó)也把PAHs列入環(huán)境污染的黑名單中。目前對(duì)環(huán)境中多環(huán)芳烴的治理技術(shù)主要有物理法、化學(xué)法和生物法。物理處理技術(shù)主要存在處理費(fèi)用高與去除不徹底的缺點(diǎn)。在化學(xué)法中國(guó)內(nèi)外有學(xué)者利用有機(jī)溶劑(如乙醇、正己烷、ニ氯甲烷、三氯甲烷、丙酮)及表面活性劑等洗脫環(huán)境中的多環(huán)芳烴，但會(huì)存在二次污染等問(wèn)題。生物法具有操作簡(jiǎn)單、運(yùn)行費(fèi)用低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，隨著多環(huán)芳烴苯環(huán)數(shù)量的増加，其降解速率降低。因此，低分子量的多環(huán)芳烴在環(huán)境中能較快被降解，在環(huán)境中存在的時(shí)間較短，而高分子量的多環(huán)芳烴，例如苯并[a]芘、茚并[1，2， 3-cd]芘等則難于降解，較長(zhǎng)期存在于環(huán)境中。從降解微生物細(xì)胞中提取降解酶來(lái)強(qiáng)化降解已成為去除多環(huán)芳烴污染的ー種重要方法。降解酶在多環(huán)芳烴降解的應(yīng)用中具有降解效率高、作用底物濃度低及環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，由于對(duì)多環(huán)芳烴降解微生物缺乏深入的研究，國(guó)內(nèi)外缺少高壞多環(huán)芳烴降解酶方面的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種苯并[a]芘降解酶及其分離方法。所述苯并[a]芘降解酶由產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp的菌液經(jīng)過(guò)提取與純化得到的。該降解酶在進(jìn)行降解苯并[a]芘時(shí)，適宜PH值為6. 5 8. 5，最適宜pH值為7. 5，當(dāng)pH值小于4及大于10時(shí)容易失活變性，適宜反應(yīng)溫度為30 45°C，最適宜反應(yīng)溫度為35°C，當(dāng)溫度高于50°C易于失活變性，濃度為 lmmol/L的Cu2+、Fe2\ Hg2+離子對(duì)降解酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。分離苯并[a]芘降解酶所用的菌株產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp在2010年3月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該中心位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 3638。從產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp 中分離苯并[a]芘降解酶的具體方案為①向加入198ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2. Oml微量金屬液和0. 2ml維生素c溶液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的菌株產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp ；然后用透氣膜密封瓶ロ，將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)溫度為25 觀で、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)30d后即可得到擴(kuò)增培養(yǎng)后的菌液；②將步驟①中的菌液進(jìn)行超聲波破碎15min ；破碎后的菌液在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；③向由步驟②分離出的菌體中加入30ml去離子水，繼續(xù)進(jìn)行超聲波破碎15min，在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；④向由步驟③分離出的菌體中加入30ml去離子水，繼續(xù)進(jìn)行超聲波破碎15min， 在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；⑤合并由步驟②、③和④所收集的上清液，即可得到苯并[a]芘降解酶粗提液；⑥向由步驟⑤得到的苯并[a]芘降解酶粗提液中加入碾細(xì)的(NH4)2SO4固體至 65 70%飽和度，在轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中振蕩1 池，然后在8000r/min條件下離心15min，分離出沉淀；⑦將由步驟⑥得到的沉淀溶于少量pH值為7. O 7. 2的0. 05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液并裝入透析袋中，將透析袋在pH值為7. O 7. 2的0. 05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液中透析Mh ；將透析后的樣品在8000r/min條件下離心15min， 分離出上清液；⑧將由步驟⑦得到的上清液上到已用pH值為7. O 7. 2的0. 05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液平衡的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱上過(guò)濾，采用pH值為7. O 7. 2內(nèi)含0. 25mol/L氯化鈉的0. 05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的苯并[a]芘降解酶，洗脫速度為20ml/h ；運(yùn)用容積為IOml的試管收集洗脫液，其中每支試管收集洗脫液5ml ；用紫外分光光度計(jì)在吸收波長(zhǎng)為280nm處檢測(cè)洗脫液，收集吸光度大于0. 01的洗脫液；測(cè)定降解酶的活性，選擇活性部分備用。所述步驟①中誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為=NaNO3 :2. 5g/L，NH4Cl :1. 5g ·じ1，KH2PO4
1.5g ·じ1，MgCl2 :0. 2g ·じ1，CaCl2 · 2Η20 :0. 15g ·じ1，苯并[a]芘:0. Olg ·じ1。所述步驟①中微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6H20 :35mg ·じ1，CuCl2 :0. 25mg ·じ1， H3BO3 :6. Omg じ1，MnCl2 ·4Η20 :30mg じ1，Nei2MoO4 ·2H20 :3. Omg じ1，NiCl2 ·2Η20 :2. 5mg じ1， ZnCl2 :2. 5mg ·じ1。所述步驟步驟②、③和④中超聲波破碎的條件為電流35%、脈沖9. Os、處理時(shí)間 15min。本發(fā)明得到的苯并[a]芘降解酶可以有效降解苯并[a]芘，對(duì)于多環(huán)芳烴苯并[a] 芘污染土壌及水體有應(yīng)用潛力。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例進(jìn)ー步說(shuō)明本發(fā)明。材料(1)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的菌株產(chǎn)堿菌 Alcaligenes sp，菌種保藏號(hào)為 CGMCC NO. 3638 ；(2)苯并[a]芘(純度彡 99%, Sigma Aldrich)；
(3) NaCl、(NH4) 2S04 分析純；(4)pH值為7. 0 7. 2的0. 05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液，pH值為 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,9. 0,10. 0 的磷酸緩沖液；(5)誘導(dǎo)培養(yǎng)基1L，其組成及各組分的濃度為=NaNO3 :2. Og/L, NH4Cl :1. Og ·じ1， KH2PO4 1. Og ‘じ1，MgCl2 :0. Ig ·じ1，CaCl2 · 2Η20 :0. 05g ·じ1，苯并[a]芘:0. Olg ·じ1 ；(6)微量金屬液1L，其組成及各組分的濃度為=CoCl2 · 6H20 :35mg ·じ1，CuCl2 0. 25mg じ1，H3BO3 6. Omg じ1，MnCl2 ·4Η20 :30mg じ1，Nei2MoO4 ·2Η20 :3. Omg じ1，NiCl2 ·2Η20
2.5mg ·じ1，ZnCl2 2. 5mg ^L10
苯并[a]芘降解酶活性的檢測(cè)方法以苯并[a]芘降解酶與苯并[a]芘反應(yīng)消耗的苯并[a]芘量來(lái)確定酶的活性。取0.2mL苯并[a]芘降解酶和4. 8mL含有苯并[a]芘濃度為3. 5μ g/L pH值為7. 5的磷酸緩沖液混合，在溫度為35°C條件下反應(yīng)Mh，加入0. 3mL 濃度為2. Omol/L的HCl終止酶反應(yīng)，測(cè)定降解結(jié)束后苯并[a]芘濃度的變化。實(shí)施例向已加入198ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2. Oml微量金屬液和0. 2ml維生素c溶液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的菌株產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp，然后將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)溫度為25 觀で、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)30d，得到擴(kuò)增培養(yǎng)后的菌液。將得到的菌液超聲波破碎15min后在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液。向分離出的菌體中加入30ml去離子水，繼續(xù)進(jìn)行超聲波破碎15min，在8000r/ min條件下離心15min，分離出菌體和上清液，重復(fù)2次。合并3次所收集的上清液，得到苯并[a]芘降解酶粗提液。向苯并[a]芘降解酶粗提液中加入碾細(xì)的(NH4)2SO4固體至65%飽和度，在轉(zhuǎn)速為 100r/min的振蕩器中振蕩1 2h，然后在8000r/min條件下離心15min，分離出沉淀。然后將沉淀溶于少量PH值為7. O 7. 2的0. 05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液并裝入透析袋中，將透析袋在PH值為7. O 7. 2的0. 05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液中透析Mh。將透析后的樣品在8000r/min條件下離心15min，分離出上清液。將上清液上到已用PH值為7. O 7. 2的0. 05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液平衡的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱上過(guò)濾，采用pH值為7. O 7. 2內(nèi)含0. 25mol/L氯化鈉的0. 05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的苯并[a]芘降解酶，洗脫速度為20ml/h。運(yùn)用容積為IOml的試管收集洗脫液，其中每支試管收集洗脫液 5ml。用紫外分光光度計(jì)在吸收波長(zhǎng)為280nm處檢測(cè)洗脫液，收集吸光度大于0.01的洗脫液。分別用pH 值為 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,9. 0,10. 0 的含有苯并[a]芘
濃度為3. 5 μ g/L磷酸緩沖液與0. 2mL的苯并[a]芘降解酶配成總體積為5. OmL的反應(yīng)體系，在30°C條件下反應(yīng)M小吋，加入0. 3mL濃度為2. 0mol/L的HCl終止酶反應(yīng)。同時(shí)分別設(shè)定不加酶的控制試驗(yàn)，取降解率的最大值為100計(jì)算各處理的相對(duì)酶活力，以確定降解酶的最適宜反應(yīng)PH值。結(jié)果表明，降解酶在pH值為3.0 10.0之間對(duì)苯并[a]芘均有不同程度的降解，其適宜的PH值為6. 5 8. 5，最適宜pH值為7. 5，當(dāng)pH值小于4及大于10 時(shí)容易失活變性，在最適宜PH值條件下反應(yīng)M小時(shí)對(duì)苯并[a]芘的降解率為72.4%。在pH值為7. 5條件下，將含有苯并[a]芘濃度為3. 5 μ g/L磷酸緩沖液與0. 2mL 的苯并[a]芘降解酶配成體積為5. OmL的反應(yīng)體系，分別在10°C、20°C、25°C、30°C、35°C、 40°C、45°C、50°C條件下反應(yīng)M小時(shí)，然后加入0. 3mL濃度為2. 0mol/L的HCl終止酶反應(yīng)。 同時(shí)分別設(shè)定不加酶的控制試驗(yàn)，取降解率的最大值為100計(jì)算各處理的相對(duì)酶活力，以確定降解酶的最適宜反應(yīng)溫度。結(jié)果表明，降解酶在溫度為10 50°C之間對(duì)苯并[a]芘均有不同程度的降解，其適宜的溫度為30 45°C，最適宜溫度為35°C，當(dāng)溫度高于50°C易于失活變性，在最適宜溫度條件下反應(yīng)M小時(shí)對(duì)苯并[a]芘的降解率為75. 6%。分別向8份pH值為7. 5含有苯并[a]芘濃度為3. 5 μ g/L磷酸緩沖液中加入Cu2+、Zn2+、Fe2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Mg2+、Hg2+，使離子的濃度為 lmmol/L，然后加入 0. 2mL 的苯并[a] 芘降解酶配成總體積為5. OmL的反應(yīng)體系，在30°C條件下反應(yīng)M小吋，加入0. 3mL濃度為 2. Omol/L的HCl終止酶反應(yīng)。同時(shí)分別設(shè)定不加酶和不加金屬離子的控制試驗(yàn)，取降解率的最大值為100計(jì)算各處理的相對(duì)酶活力，以確定各離子對(duì)降解酶活性的影響。結(jié)果表明， 濃度為lmmol/L的Cu2+、Fe2\ Hg2+離子對(duì)酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種苯并[a]芘降解酶，其特征在干，該苯并[a]芘降解酶由產(chǎn)堿菌Alccligenes sp 的菌液經(jīng)過(guò)提取與純化得到的，產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.的菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 3638。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述苯并[a]芘降解酶，其特征在干，該苯并[a]芘降解酶在進(jìn)行降解苯并[a]芘時(shí)，適宜pH值為6. 5 8. 5，最適宜pH值為7. 5，當(dāng)pH值小于4及大于10 時(shí)容易失活變性，適宜反應(yīng)溫度為30 45°C，最適宜反應(yīng)溫度為35°C，當(dāng)溫度高于50°C易于失活變性，濃度為lmmol/L的Cu2+、Fe2\ Hg2+離子對(duì)降解酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種苯并[a]芘降解酶及其分離方法。所述苯并[a]芘降解酶由產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp的菌液經(jīng)過(guò)提取與純化得到的，該產(chǎn)堿菌的菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.3638。該降解酶在進(jìn)行降解苯并[a]芘時(shí)，適宜pH值為6.5～8.5，最適宜pH值為7.5，當(dāng)pH值小于4及大于10時(shí)容易失活變性，適宜反應(yīng)溫度為30～45℃，最適宜反應(yīng)溫度為35℃，當(dāng)溫度高于50℃易于失活變性，濃度為1mmol/L的Cu2+、Fe2+、Hg2+離子對(duì)酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。本發(fā)明提供的苯并[a]芘降解酶可以有效降解苯并[a]芘，對(duì)于多環(huán)芳烴苯并[a]芘污染土壤及水體有應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102559620SQ20111043591
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者丁愛(ài)中, 李帥冉, 杜勇超, 王鴻婷, 豆俊峰 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)